X JORNADA FARMACÊUTICA E V AMOSTRA DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS EM PCR EM TEMPO REAL: OTIMIZANDO CUSTOS E PRODUTIVIDADE

(1)

X JORNADA FARMACÊUTICA E V

AMOSTRA

Sueli Massumi Nakatani

Laboratório Central do Estado – LACEN-PR Maio de 2010

DESENVOLVIMENTO DE

METODOLOGIAS EM PCR EM TEMPO

REAL: OTIMIZANDO CUSTOS E

(2)

Laboratório Central do Estado -PR



Seção de Biologia Molecular -1997

Programa do MS DST/AIDS



Quantificação da carga viral do HIV

(3)

Laboratório Central do Estado -PR



Seção de Biologia Molecular -1997

Programa do MS DST/AIDS



Quantificação da carga viral do HIV

(4)

(5)

(6)

Benefícios

 Aumento da sensibilidade / Especificidade  Automatização

 Detecção na fase exponencial  Protocolo único

 Tempo de execução menor  Sem processamento pós-PCR

(7)

Evolução da PCR

(8)

EVOLUÇÃO DA PCR

• Inicialmente, a PCR é exponencial

– O produto (P) aumenta exponencialmente com o número de ciclos (n)

• A quantidade de produto de PCR depende do número de cópias de molde (M) presentes no início da reação

– Se no início houver duas vezes mais molde, se deve obter duas vezes mais produto

P = M (1+E)

n

Onde: P = Produto M = Molde E = Eficiência

(9)

Amplificação por PCR

• Para duas vezes mais molde no início,

existe duas vezes mais produto de

PCR, na fase exponencial.

• Para 4X Molde, existe 4X mais

produto de PCR, etc.

(10)

Amplificação por PCR

Eficiência

• Mas....a reação de PCR NÃO é 100%

eficiente

– Normalmente a eficiência é de 80-90%

– Produtos de PCR menores amplificam com uma eficiência maior

_{P = M (1+E)}

n

Onde:

P = Produto M = Molde

E = Eficiência n = ciclos

(11)

• Os produtos de PCR não podem

dobrar para sempre

• Limites

– Quantidade de primer

– Atividade da Taq Polimerase

• Uma vez atingido o plato...

– Não há mais aumento na quantidade de produto

• Detecção “end point”

– Número fixo de ciclos e depois se verifica a presença de produto em gel de agarose

AMPLIFICAÇÃO POR PCR

Fase de Plato

(12)

Problemas na detecção no ponto final

•Precisão baixa

•Baixa sensibilidade

•Range < 2 logs

•Baixa resolução

•Não automatizado

•Baseado somente no tamanho

•Resultados não expressam em números

•O corante brometo de etídeo não é

quantitativo

(13)

(14)

Fases da PCR

Área de detecção real time PCR

Área de de detecção no PCR tradicional

(15)

Amplificação por PCR

Detecção “end point”

(16)

Como quantificar a quantidade

inicial de molde ???

• Use os dados da fase exponencial

– Quantidade de produto é proporcional a quantidade de molde inicial

– Neste caso, é necessário avaliar o produto de PCR a cada ciclo

• Usar Fluorescência

A fluorescência deve ser proporcional quantidade de produto

• Use uma máquina que verifique a

fluorescência em cada ciclo (Real Time-PCR)

(17)

(18)

Real Time PCR

Syber Green

• Vantagem: – Barato – Flexível • Desvantagem: – Pouco específico

– Todo e qualquer produto formado contribuirá para o aumento da

fluorescência

– Primer dimers são um problema

– Necessita de uma

otimização para que não haja formação de

(19)

Real Time PCR

Syber Green

• Corante não-específico • Equivalente ao brometo

de etídio

– Se liga a dupla fita de DNA • A quantidade de fluorescência é proporcional a quantidade de DNA • Intensificação da emissão de fluorescência quando ligado à fita

(20)

Real Time PCR

Taqman probes

• Sonda marcada com um

fluoróforo (reporter ) e um quencher

A sonda se liga ao produto de PCR durante a fase de annealing

o reporter emite

fluorescência que é captada pelo quencher

• A atividade exonucleásica

5’-3’ da Taq polimerase hidroliza a sonda e

permite que o reporter se afaste do quencher Amplicon Amplicon Emission EXTENSION ANNEALING Excitation 5’-3’ exonuclease Reporter Quencher

(21)

Real Time PCR

Taqman probes

• O acúmulo de reporter livre é proporcional a quantidade de produto de PCR • A fluorescência é captada na fase de extensão • Vantagem – Alta especificidade Amplicon Amplicon Emission EXTENSION ANNEALING Excitation 5’-3’ exonuclease Reporter Quencher

(22)

Real Time PCR

Hibridization probes

• FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) utilizando hybridization probes adjacentes

• Probes são marcados

• A fluorescência é captada na fase de anneling FITC Red 640 FRET Emission P Excitation Amplicon 94o_C 55o_C 72o_C

(23)

Real Time PCR

Molecular

Beacons

 Hybridisation probes

em forma de “loop”

 Quando não anelado

ao DNA, a estrutura em loop mantém o reporter e quencher próximos. Não há fluorescência  Durante o annealing, o reporter e quencher são separados e a fluorescência emitida é proporcional a quantidade de produto Amplicon Excitation ANNEALING

(24)

(25)

(26)

Quais os passos necessários

para o desenvolvimento de

um teste de PCR em tempo

(27)

Desenho dos primers e sondas

SONDA PRIMER

Escolha do gene de interesse Escolha do gene de interesse Amplicons de 50-150bp

Amplicons de 50-150bp Conteúdo G/C de 20-80% Conteúdo G/C de 20-80%

Evitar repetição consecutiva da mesma base Repetições de mais do que 4 Gs devem ser evitadas

TM 68-70ºC TM-58-60ºC

Nenhum G na extremidade 5’

Selecionar a fita que contenha mais Cs do Gs

Os 5 nucleotídeos da extremidade 3’ não Devem ter mais de que dois Gs ou Cs

(28)

SONDA-FLUORÓFORO-QUENCHER

O desenho da sonda depende do sistema escolhido TaqMan, Fret

Concentração da sonda 150-300nM

A seleção dos fluoróforos deve ser compatíveis com equipamento

Escolha adequada do quencher –preferencial para NEF-MGB

Selecionar fluoróforos com alto coeficiente de excitação

Sistema Multiplex- verificar se não há sobreposição dentro do mesmo espectro de ação

(29)

QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA

1- Realização da curva padrão

Plasmídeo

Diluição de amostra

2- Correlacionar com valores previamente

conhecidos

(30)

DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃO

DE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B

1-Escolha da região do genoma de interesse Região S

2- Desenho dos primers e sondas 3- Método de extração

4- Padronização da curva

5- Curva padrão com Painel Internacional Opti Quant® (Acrometrix)

6- Análises Estatísticas de validação -Precisão

-Especificidade

-limite de detecção

-Coeficiente de variação

(31)

DESENVOLVIMENTO DE QUANTIFICAÇÃO

DE CARGA VIRAL DO VÍRUS DA HEPATITE B

(32)

Comparação entre Cobas TaqMan e

TaqMan LACEN-PR para HBV

(33)

Comparação entre Cobas Amplicor e

TaqMan LACEN-PR para HBV

(34)

Comparação entre Cobas Amplicor e

Cobas TaqMan para HBV

(35)

Custo Benefício Entre qPCR e Método

Comercial

(36)

GENOTIPAGEM DO VHC

ESTABELECE O TEMPO DE

TRATAMENTO

(37)

MÉTODOS DE GENOTIPAGEM

LiPA – hibridização reversa (Stuyver, 1993)

Trugene – seqüenciamento da região 5’UTR

(38)

(39)

ANÁLISE DA REGIÃO NS5B

(40)

DESENHO DOS PRIMERS PRODUTO DE 688pb

(41)

EXTRAÇÃO DO RNA KIT NUCLISENS MINIMAG

(42)

RT PCR DETECÇÃO

(43)

RT PCR DETECÇÃO

(44)

PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130 RT PCR DETECÇÃO

(45)

PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130 ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS BIOEDIT CODONCODE SEQSCAPE RT PCR DETECÇÃO

(46)

PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE PCR QUANTIFICAÇÃO DO DNA PURIFICADO DILUÍDO 20NG SEQÜENCIAMENTO ABI 3130 ANÁLISES DAS SEQÜÊNCIAS BIOEDIT CODONCODE SEQSCAPE RT PCR DETECÇÃO

(47)

(48)

(49)

limite de detecção

 Sensibilidade analítica painel da Optiquant gen 1b  Sensibilidade relativa amostras clínicas gen 3a gen 2b gen 1a 250 UI/ml 125 UI/ml 250 UI/ml 500 UI/ml

(50)

9 amostras RNA VHC Não detectável

194 amostras

Genótipo 1 36 amostrasGenótipo 2 80 amostrasGenótipo 3 Total 319 amostras 310 amostras RNA VHC detectável 190 amostras

detectadas 31 amostrasdetectadas 80 amostrasdetectadas

(51)

Comparação dos métodos de seqüenciamento

e PCR em tempo real para a genotipagem do

(52)

(53)

Comparação dos métodos de genotipagem por

PCR em tempo real e LiPA

(54)

Números de amostras com subtipos discordantes, indefinidos ou resultados incompletos pelo LiPA (5'UTR) quando comparados

com genotipagem por PCR em tempo real da região NS5B do VHC

(55)

Valores por reação para cada teste de

genotipagem por PCR em tempo real

(56)

Algoritmo sugerido para laboratório de

saúde pública para a realização da

genotipagem do VHC por PCR em tempo

real

(57)

Algoritmo sugerido para laboratório de

saúde pública para a realização da

genotipagem do VHC por PCR em tempo

real

(58)

Algoritmo sugerido para laboratório de

saúde pública para a realização da

genotipagem do VHC por PCR em tempo

real

R$ 42,28

(59)

Algoritmo sugerido para laboratório de

saúde pública para a realização da

genotipagem do VHC por PCR em tempo

real

R$ 42,28

R$ 59,56

(60)

Cytomegalovirus

pneumonite encefalite gastroenterite Cório-retinite hepatite

(61)

30dias 100dias >100dias Herpes virus Varicella zoster Cytomegalovirus HHV-6 Epstein-Barr virus Neutropenia Mucosite GVHD agudo ↓imunidade celular GVHD agudo e crônico

RISCO DE INFECÇÃO TMO

Vírus respiratório

Fase I Fase II Fase III

↓ imunidade celular e

humoral

(62)

STATUS SOROLÓGICO

D+/R-

_D+/R+

D-/R+

(63)

Pesquisa Quantitativa do Cytomegalovirus

Gene ien – expressa na replicação viral

Controle interno plasmidial

(64)

(65)

Identificação do Mycobacterium tuberculosis

por PCR em Tempo Real

•Dificuldades na identificação de M. tuberculosis de amostras diretas em amostras extra pulmonares

•Presentes em baixa densidade e em baixo número em bacteremias intermitentes (Kiehn, T. JCM, 1986)

(66)

Amostras Sensibilidade Especificidade VPP% VPP% Escarro 72,7 97,5 91,4 90,7 LBA 82,1 97,4 89,4 82,1 Urina 11.1 95,2 14,2 93,7 Líquor 5,8 100 100 95,1 Sangue 0 100 0 96,1 Lavado gástrico 66,6 100 100 90 NAUCK, R,2004

Sensibilidade, Especificidade, Valor preditivo positivo e

negativo de amostras pulmonares e extrapulmonares

Amostras Pulmonares : 3817 amostras

(67)

Identificação do Mycobacterium tuberculosis por

PCR em Tempo Real

Desenvolvimento da detecção do M. tuberculosis conforme

(68)

PCR convencional : 4,5% qPCR : 8,2%

Identificação do Mycobacterium tuberculosis

por PCR em Tempo Real

Amostras de 139 LCRs:

3 detectadas por PCR convencional 7 detectadas por PCR Tempo Real

(69)

•PCR em Tempo Real (Triplex) para a detecção de Neisseria meningitidis, Streptococcus

pneumoniae e Haemophilus influenzae

•N.meningitidis gene ctrA-transporte de cápsula polissacarídica

•Streptcoccus pneumoniae gene lytA responsável pela produção de autolisina •Haemophilus influenzae gene bexA

responsável pela expressão da cápsula polissácarídica

(70)



Aumentar a sensibilidade da identificação

bacteriana



Implantação no LACEN-PR através da

CGLAB-MS e Instituto Adolf Lutz



Implantado em Janeiro de 2008

(71)

Padronização

(72)

Padronização

Meningites Bacterianas

0 100 200 300 400 Cultura Látex qPCR

Comparação entre Latex e PCR em tempo real

Nº am os tr as L CR Posi6vo Nega6vo 40 369 56 351 112 299

(73)

Padronização

Comparação entre Latéx e PCR em Tempo Real

em amostras de soro

0 13 25 38 50

Latex PCR em tempo real posi6vo nega6vo

(74)

Padronização

Diagnóstico da Gripe Pandêmica H1N1

Pesquisa por PCR em Tempo Real

Protocolo do CDC:

4 genes:

Gene da Matriz

Nucleoproteína

Hemaglutinina

RnaseP

(75)

Padronização

(76)

Padronização

(77)

Padronização

(78)

PERSPECTIVAS

(79)