Ciência Animal 25 (2): 13-47, 2015
CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS: PRINCIPAIS SUBSTÂNCIAS REGULADORAS, VIAS DE SINALIZAÇÃO E AVANÇOS NAS ESPÉCIES MURINA,
BOVINA, OVINA E CAPRINA
(In vitro culture of preantral follicles: main regulatory factors, signaling pathways and advances in murine, bovine, ovine and caprine)
Gerlane Modesto da SILVA1*, Ivina Rocha BRITO1, Valdevane Rocha ARAÚJO1, José Roberto Viana SILVA2, Ana Paula Ribeiro RODRIGUES1, José Ricardo de FIGUEIREDO1
1 Laboratório de Manipulação de Oócitos e folículos pré-antraias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza - CE, Brasil. 2
Núcleo de Biotecnologia de Sobral (NUBIS), Universidade Federal do Ceará, Sobral - CE, Brasil
RESUMO
A regulação da foliculogênese é um processo complexo regulado por vários fatores intra e extraovarianos. A resposta das células ovarianas ao estímulo produzido por esses fatores depende da transdução de sinais no interior das células através de várias vias de sinalização. A interação entre as diversas vias de sinalização celular e a descoberta constante de novas vias demonstram a complexidade desse processo. A presente revisão se propõe a descrever os principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Em adição, uma análise crítica dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos levando-se em consideração as substâncias presentes nos meios de cultivo utilizados e as prováveis vias de sinalização celular empregadas é apresentada na presente revisão.
Palavras-chave: Foliculogênese, receptores, sinalização celular.
ABSTRACT
Folliculogenesis is regulated by a complex process, which involves several intra- and extra-ovarian factors. The response of the extra-ovarian cells to those factors depends on the signal transduction inside the cells through several signaling pathways. The interaction of different signaling pathways and discovery of new pathways demonstrate the complexity of folliculogenesis. Therefore, this review will highlight the main regulatory factors that control folliculogenesis, their receptors and sharing signaling pathways. Moreover, a critical analysis about the main results from in vitro follicle culture studies in murine, bovine, caprine, and ovine, focusing on the medium supplements and the interactions of their signaling pathways will be presented.
Key-words: Folliculogenesis, receptors, cell signaling.
________________________________ *Endereço para correspondência:
INTRODUÇÃO
A resposta celular a estímulos externos como nutrientes, hormônios, fatores de crescimento e estresse, requer a propagação de sinais correspondentes através de vias moleculares de sinalização (Zielinski et al., 2009). O desenvolvimento de folículos ovarianos in vitro e a elucidação da foliculogênese podem ser beneficiados pelo conhecimento molecular dessas vias. A intervenção terapêutica através do uso de anticorpos específicos para receptores ou compostos de baixo peso molecular que interfiram na ativação de moléculas sinalizadoras podem promover a sobrevivência, a proliferação e a maturação dos folículos ovarianos. Além disso, o conhecimento em nível molecular dos constituintes das vias de sinalização celular acompanhado do esclarecimento dos sistemas de redes de sinalização celular pode ainda contribuir para a elucidação da foliculogênese.
Apesar dessas perspectivas, e das moléculas dessas vias de sinalização já serem conhecidas, o entendimento das redes de sinalização é incipiente e descrições cada vez mais precisas dos diversos mecanismos de sinalização são acompanhados da reconstrução de cada vez mais vias e mais redes de interação entre elas (Herskowitz, 1995; Hunter, 2000). Isso ocorre devido a complexidade dessas vias de sinalização celular que não são vias isoladas de informação, mas sim interagem de várias maneiras formando redes sofisticadas de informação que respondem a diversos estímulos, muitas vezes opostos. Essa ligação pode envolver componentes que são comuns entre vias, bem como circuitos de feedback positivo e negativo (Hunter, 2000). Além disso, a resposta a um sinal depende da duração do limiar de ativação e do sinal (Marshall, 1995) adicionando ainda outro nível de complexidade ao sistema.
Dentre as principais vias estudadas atualmente destacam-se: adenilato ciclase, MAPK/Erk, PI3K/Akt, fosfolipase C, JAKS/ STATS, SMADS e vias nucleares. Os fatores de crescimento e hormônios reguladores da foliculogênese atuam se ligando a diferentes tipos de receptores que ativam uma ou mais dessas vias levando a respostas relacionadas a ativação, sobrevivência, proliferação e maturação folicular.
A presente revisão fará uma discussão geral acerca dos principais fatores reguladores da foliculogênese, seus receptores e as vias de sinalização celular destacando pontos de interação entre elas. Por fim será feita uma análise dos principais resultados obtidos com o cultivo in vitro de folículos ovarianos murinos, bovinos, caprinos e ovinos. Nesse tópico serão identificadas as vias de sinalização celular com base nas susbtâncias presentes no meio de cultivo e as interações dessas vias na tentativa de compreender melhor os resultados obtidos.
RECEPTORES DOS PRINCIPAIS
FATORES EXTRA E
INTRA-OVARIANOS ENVOLVIDOS NA
FOLICULOGÊNESE
a) Tipos de receptores
Os receptores são proteínas ou glicoproteínas presentes na membrana plasmática (transmembranários), na membrana das organelas ou no citosol celular (nucleares), que se unem especificamente às suas moléculas sinalizadoras (hormônios e fatores de crescimento), também denominadas ligantes. A união de uma molécula sinalizadora a seus receptores específicos desencadeia uma série de reações no interior das células, cujo resultado final depende não somente do estímulo recebido, mas de outros fatores, como a situação metabólica da célula, a presença de
patógenos, etc. Baseados na estrutura molecular e na natureza dos mecanismos de transdução de sinal com ativação de cascatas intracelulares, classicamente pode-se distinguir quatro tipos de receptores:1) receptores acoplados a canais iônicos; 2) receptores acoplados à proteína G; 3) receptores acoplados a enzimas; 4) receptores nucleares (Leite et al., 2012), sendo os três últimos o foco desta revisão.
• Receptores acoplados a canais iônicos
Também conhecidos como receptores ionotrópicos, estes receptores estão envolvidos na rápida sinalização sináptica entre células nervosas e outras células-alvo eletricamente excitáveis, como células musculares (Leite et al., 2012).
• Receptores acoplados à proteína G
Todos os receptores acoplados à proteína G pertencem a uma grande família de proteínas que atravessam a membrana celular várias vezes. Esses receptores são compostos por um grande domínio extracelular N-terminal, sete domínios transmembranários e um domínio C-terminal intracelular acoplado à proteína G (Salesse et al., 1991; Dubocovich et al., 2010). A proteína G é uma GTPase formada por três subunidades designadas (pelo tamanho decrescente) α (alfa), β (beta) e γ (gama). A unidade α possui um sítio de ligação com o difosfato de guanosina (GDP) ou trifosfato de guanosina (GTP). A ativação dos receptores altera a conformação da proteína G, induzindo a troca de uma molécula de GDP por GTP no sítio catalítico localizado na subunidade Gα. Isso desencadeia a dissociação da subunidade Gα (que está ligada ao GTP) do dímero Gβγ e do receptor. Ambas, Gα-GTP e Gβγ, podem então ativar diferentes cascatas de sinalização e proteínas efetoras (Fig. 1) (Hoelz et al., 2013).
Os hormônios folículo estimulante (FSH), luteinizante (LH), tireotrófico (TSH) e a melatonina utilizam esse tipo de receptor. Apesar desses hormônios possuírem o mesmo tipo de receptor, a união dos ligantes ao domínio extracelular é específica para cada hormônio (Salesse et al., 1991). A localização dos seus receptores varia entre as categorias foliculares, seus tipos celulares e espécies animais conforme observado na Tab.1.
FSH
De forma geral os receptores de FSH (FSHR) já foram detectados em folículos pré-antrais em crescimento (primário e secundário) e folículos antrais em murinos, bovinos, caprinos e ovinos (Camp et al., 1991; Roy, 1993; Tisdall et al, 1995; Xu et al., 1995; Saraiva et al., 2010). Apesar da ligação do FSH ao seu receptor ser restrita às células da granulosa, estudos mais recentes demonstraram a presença destes receptores também em oócitos, sugerindo um efeito adicional do hormônio no ovário (Méduri et al., 2002; Barros et al., 2013).
LH
Os receptores para LH (LHR) já foram identificados em folículos pré-antrais em desenvolvimento em murinos, bovinos e caprinos e em folículos antrais também em ovinos (Xu et al., 1995; Gelety, Magoffin, 1997; Abdennebi et al., 1999; Saraiva et al., 2012). As células da granulosa adquirem seus próprios receptores para LH em meados da fase final de desenvolvimento folicular sob influência do FSH (Erickson e Hsueh, 1978), sendo predominantemente expressos na subpopulação de células murais (Peng et al., 1991). Além disso, sabe-se que as células da teca expressam receptores para LH (Adashi, 1994; Gougeon, 1996). Posteriormente, são encontrados receptores também nas células
luteínicas e do cúmulus (MacFarland et al., 1989).
TSH
O receptor de TSH está localizado na glândula tireóide e sua ativação estimula a produção dos hormônios T3 e T4 a partir da tireoglobulina (Almeida, 2004). Estes últimos serão descritos posteriormente nessa revisão.
Melatonina
Em mamíferos, são descritos dois principais tipos de receptores de melatonina acoplados à membrana celular: MT1 e MT2. Em adição, foi relatada a existência de um terceiro receptor de melatonina, MT3, relacionado a locais de ligação nucleares (Vincent et al., 2010). Receptores para a melatonina já foram encontrados em folículos pré-antrais em crescimento e antrais em murinos e caprinos (Soares et al., 2003; Barros et al., 2013). No ovário, o RNAm para os receptores MT1 e MT2 foram identificados em células da granulosa ovarianas (Niles et al., 1999; Soares et al., 2003; Barros et al., 2013). Isto sugere que este hormônio pode ter uma ação sobre a esterodoigênese dessas células e sobre a função folicular (Webley et al., 1986; Tamura et al., 1998).
• Receptores acoplados a enzimas
Em geral esses receptores compartilham uma estrutura comum, que consiste de um grande domínio extracelular de ligação com o ligante (hormônio ou fator de crescimento), conectado ao domínio intracelular através de uma única hélice transmembrana. A grande maioria são receptores com atividade enzimática instrínseca, como os receptores tirosina quinase (TKR) ou serina/treonina-quinase (STKR). Nesse caso a transdução de sinais geralmente envolve a dimerização de receptores após a fixação do ligante ao domínio extracelular, seguida da
autofosforilação de resíduos de tirosina ou serina/treonina. Os resíduos de fosfotirosina ou fosfoserina/treonina atuam como aceptores dos domínios de homologia com SRC2 (SH2) de várias proteínas intracelulares, permitindo o controle de muitas funções celulares (Silva et al., 2009).
Por outro lado, alguns receptores acoplados a enzimas quinases, como os receptores de citocinas, carecem de atividade enzimática intrínseca. Quando ativados, eles se associam e ativam uma tirosina quinase citosólica (JAK), que fosforila o dímero do receptor, levando, posteriormente, à ativação de uma família de fatores de transcrição (STATS) (Shiu & Bleecker, 2001).
São receptores do tipo tirosina quinase: fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF), insulina, fator de crescimento semelhante a insulina I e II (IGFs I e II, respectivamente), Kit Ligand (KL) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A Tab. 2 resume a identificação tanto dessas proteínas como de seus receptores por categoria folicular nas espécies murina, bovina, caprina e ovina.
Insulina
O receptor de insulina é uma proteína composta por duas subunidades α (massa molecular 135 kDa) e duas subunidades β (massa molecular 95 kDa) unidas por uma ponte dissulfídica (Lawrence et al., 2007). A subunidade α inibe a atividade tirosina-quinase da subunidade β. A ligação da insulina à subunidade α permite que a subunidade β adquira atividade quinase, levando a alteração conformacional e fosforilação do substrato do receptor de insulina. Esse receptor interage com uma série de proteínas intracelulares, desencadeando uma cascata complexa de reações de
fosforilação e desfosforilação (Cheatham & Kahn, 1996).
A insulina pode atuar por meio dos receptores específicos de insulina, que estão amplamente distribuídos nos ovários, pelos receptores do IGF-I ou ainda por receptores híbridos, que contêm combinação das subunidades α e β dos receptores de insulina e IGF-I (Yarak et al., 2005).
Em bovinos e caprinos, os receptores de insulina já foram detectados em folículos pré-antrais em crescimento e antrais (Shimizu et al., 2008; Chaves et al., 2012). Estes receptores são amplamente distribuídos em todos os compartimentos ovarianos, incluindo células da granulosa, células da teca, estroma e oócito (Myers et al. 1991; Sirotkin et al., 1998; Louhio et al., 2000).
EGF
O receptor de EGF (EGFR) e seus múltiplos ligantes são considerados os maiores reguladores de diversos processos reprodutivos (Schneider & Wolf, 2008). O sistema EGF compreende oito ligantes e quatro receptores. Como ligantes, pode-se citar: o próprio EGF, fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina (HB-EGF), anfiregulina (AR), betacelulina (BTC), epiregulina (EPR), neuregulina (NRG 1-4) e epigen (Strachan et al., 2001; Schneider & Wolf, 2008). Como receptores podem ser citados o EGF-R (ErbB1; HEEGF-R1), ErbB2 (neu; HEEGF-R2), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4) (Schneider & Wolf, 2008). Vários ligantes da superfamília EGF podem interagir com o EGF-R (ErbB1), ErbB3 e ErbB4, com diferentes especificidades para cada receptor, resultando em distintos efeitos celulares (Riese & Stern, 1998; Jones et al., 1999; Normanno et al., 2003). Ao EGF-R podem se ligar o EGF, TGF-α, EPR, AR, HB-EGF, BTC e epigen (Riese et al., 1996;
Strachen et al., 2001). O ErbB2 não possui ligantes conhecidos (Klapper et al., 1999), enquanto o ErbB3 não possui atividade quinase intrínseca, parecendo atuar apenas como correceptor (Guy et al., 1994).
Quanto à localização do ligante, o EGF já foi descrito em todas as categorias foliculares em murinos e caprinos, bem como seu receptor (Garnett et al., 2002; Silva et al., 2006). O RNAm para a proteína e o EGFR tem sido identificado no oócito e nas células da granulosa de folículos iniciais (primordiais, primários e secundários) e em estádios mais avançados de desenvolvimento (antrais), em diferentes espécies (Chabot et al., 1986; Feng et al., 1987; Lonergan et al., 1996; Gall et al., 2004; Silva et al., 2006).
FGF-2
Os FGFs compõem uma família de pelo menos 25 membros (FGF 1-25; Katoh & Katoh, 2005), tendo sido apenas 23 membros descritos em mamíferos (Itoh & Ornitz, 2004). Os eventos celulares mediados pelos FGFs acontecem via ativação de sete principais receptores em suas isoformas: FGFR1 (isoformas B/C), FGFR2 (isoformas B/C), FGFR3 (isoformas B/C) e FGFR4. A interação ligante-receptor é coordenada pela conjugação desse complexo com heparina ou proteoglicana, conferindo maior estabilidade à ligação e dimerização dos FGFRs. A sinalização intracelular do complexo FGF-FGFR-heparina é mediada pelo recrutamento de diversas proteínas sinalizadoras, culminando na ativação da via intracelular Ras/Raf/ MAP quinase (Eswarakumar et al., 2005). Essa revisão se deterá somente ao FGF-2, também conhecido como fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), pois é o membro da família melhor estudado no contexto da foliculogênese (Castilho et al., 2013).
O FGF-2 apresenta alta afinidade aos receptores FGFR-1 (isoformas IIIB e IIIC); FGFR-2 (isoforma IIIC); FGFR-3 (isoforma IIIC) e FGFR-4 (Powers et al., 2000). O FGF-2 já foi localizado em folículos primordiais de murinos, bovinos e caprinos, folículos pré-antrais em crescimento de murinos e bovinos e antrais de caprinos e bovinos. Seu receptor está presente em todas as categorias foliculares de murinos, bem como folículos antrais em bovinos (Shikone et al., 1992; Wordinger et al., 1993; Van Wezel et al., 1995; Nilsson et al., 2001; Almeida et al., 2012). Quanto ao tipo celular, o FGF-2 já foi localizado em todas as células foliculares, enquanto seus receptores estão localizados essencialmente nas células da granulosa e da teca (Shikone et al., 1992; Wordinger et al., 1993; Van Wezel et al., 1995; Nilsson et al., 2001; Almeida et al.,2012).
IGF-I e IGF-II
O sistema IGF consiste em dois ligantes (IGF-I e IGF-II), uma família de seis proteínas de ligação de IGF de alta afinidade (IGFBPs 1-6) associadas a enzimas de degradação IGFBP (referidas coletivamente como proteases) e dois receptores de superfície (IGFR-I e IGFR-II) (Monget et al., 2002). O receptor IGFR-I se liga preferencialmente ao IGF-I e o IGFR-II ao IGF-II. Além disso, por serem similares à insulina, os IGF-I e IGF-II podem se ligar aos receptores de insulina com aproximadamente 10% de afinidade (Yarak et al., 2005).
Tanto o IGF-I e II como seus receptores já foram identificados em folículos pré-antrais em crescimento e antrais murinos e bovinos. Em adição, o IGF-II foi identificado também em folículos ovinos. Quanto aos tipos celulares, a localização dos ligantes e seus receptors ocorrem essencialmente em células da granulosa e da teca (Monniaux & Pisselet,
1992; Spicer et al., 1994; Wandji et al., 1998; Armstrong et al., 2000).
KL
O KL, também conhecido como fator de células tronco ou fator de crescimento de mastócitos, exerce seu efeito biológico através da ligação e ativação de receptores do tipo tirosina quinase denominados c-Kit (Lemmon et al., 1997). No ovário, a expressão do RNAm para o KL já foi demonstrada nas células da granulosa de diversas espécies, incluindo humanos (Hoyer et al., 2005), roedores (Manova et al., 1993; Ismail et al., 1996), ovinos (Tisdall et al., 1999) e caprinos (Silva et al., 2006; Celestino et al., 2010). Em camundongas (Manova et al., 1993) e ovelhas (Tisdall et al., 1999), a expressão do KL foi detectada nas células da granulosa em todos os estágios do desenvolvimento folicular. Similarmente, em ovários de fetos humanos, a presença dessa proteína foi identificada nas células da granulosa tanto de folículos pré-antrais quanto de folículos antrais iniciais (Hoyer et al., 2005). Já em caprinos, a proteína e o RNAm para o KL e para o seu receptor foram verificados em todas as categorias foliculares e ainda no corpo lúteo, no epitélio ovariano e no tecido medular do ovário (Silva et al., 2006).
VEGF
A família VEGF é composta de vários membros: fator de crescimento placentário, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E. VEGF-A é o subtipo mais estudado e tem sido detectado em folículos pré-antrais de várias espécies de mamíferos (Araújo et al., 2011). Dois receptores do tipo tirosina quinase se ligam ao VEGF-A com alta afinidade: FLT1 (também conhecido como VEGFR1) e KDR (também denominado VEGFR2). Tem sido observado que o sucesso na
transdução dos sinais depende da formação de um complexo de VEGF, seus receptores e heparina. (VEGF–heparina–receptor) (Gitay-Goren et al., 1992).
VEGF-A e seus receptores têm sido detectados em folículos primordiais caprinos, pré-antrais em crescimento de murinos, bovinos e caprinos e antrais de bovinos, caprinos e ovinos (Koos, 1995; Berisha et al., 2000; Yang & Fortune, 2007; Bruno et al., 2009; Sharma & Sudan, 2010; Chowdhury et al., 2010).
Receptores para proteínas da superfamília de fatores de crescimento transformante -β (TGF-β) têm atividade intrínseca de serina/treonina quinase.
Superfamília dos fatores de
crescimento transformante β
Os principais fatores desta família que exercem funções no controle dos processos reprodutivos são as proteínas morfogenéticas ósseas dos tipos 2 (BMP-2), 4 (BMP-4), 6 (BMP-6), 7 (BMP-7), 15 (BMP-15), o fator de diferenciação do crescimento-9 (GDF-9), a ativina-A, a inibina, o hormônio anti-Mülleriano (AMH) e o própiro TGF-β. É provável que a maioria dos membros da superfamília de TGF-β, com a exceção da inibina, exerçam os seus efeitos biológicos através da formação de complexos heteroméricos com os receptores do tipo I e do tipo II na superfície da célula descritos na Tab. 3 (Lebrun et al., 1997; Miyazono et al., 1997).
BMP-2 e BMP-4
Para exercer suas funções biológicas, as BMP-2 e -4 inicialmente se ligam com receptores do tipo II induzindo a sua ativação. Em seguida, o BMPR-II ativado promove o recrutamento e a transfosforilação do receptor tipo IA (BMPR-IA ou ALK3) ou IB (BMPR-IB ou ALK6) (Tab. 3). A interação entre os
receptores induz a fosforilação de mensageiros intracelulares (SMADs) que são dimerizadas com a Smad-4 (co-Smad) e deslocados para o núcleo, onde regulam a expressão de genes específicos (Massagué & Wotton, 2000).
As BMP-2 e BMP-4 já foram detectadas nas células da teca e oócitos de folículos antrais bovinos (Glister et al., 2004; Fatehi et al., 2005). Seus receptores BMPR-IA e BMPR-IB estão presentes em todas as categorias foliculares de caprinos e ovinos (Souza et al., 2002; Silva et al., 2004a). Já o BMPR-II, já foi detectado em folículos pré-antrais e antrais de bovinos (Wilson et al., 2001; Glister et al., 2004; Fatehi et al., 2005), caprinos (Silva et al., 2004) e ovinos (Wilson et al., 2001; Souza et al., 2002).
BMP-6
Para exercer suas funções biológicas, a BMP-6 inicialmente se liga a receptores do tipo II: BMPR-II ou receptores de ativina-IIA ou -IIB. Após a ativação do receptor do tipo II, ocorre o recrutamento de receptores do tipo I, ou seja, com o receptor de ativina-IA (ALK-2) ou receptor de BMPR-IB (ALK-6).
A BMP-6 é produzida por oócitos, células da granulosa e da teca em diferentes espécies (ratas: Erickson & Shimasaki, 2003; vacas: Glister et al., 2004; ovelhas: Juengel & McNatty, 2005). Em bovinos, a BMP-6 foi encontrada em folículos antrais, enquanto que em caprinos e ovinos em folículos pré-antrais e antrais (Glister et al., 2004; Silva et al., 2009). Além disso, o RNAm para os receptores da BMP-6 é expresso em oócitos e células da granulosa de folículos caprinos (Silva et al., 2004) e de várias outras espécies de mamíferos: murinos (Shimasaki et al., 1999; Elvin et al., 2000; Erickson & Shimasaki, 2003), ovinos (Souza et al., 2002; McNatty et al., 2005) e bovinos (Glister & Knight, 2002).
BMP-7 e BMP-15
A BMP-7 exerce suas funções biológicas interagindo com o receptor de ativina-IIA, IIB ou BMPR-II que, após a ativação, recruta o receptor de ativina-IA (ALK-2) ou receptor de BMP-IB (ALK-6). A BMP-7 é produzida pelas células da teca de folículos secundários e antrais (Shimasaki et al., 2004).
Já a BMP-15, primeiramente liga-se ao receptor BMPR-IB (ALK-6), e posteriormente ocorre o recrutamento do receptor BMP tipo II (Shimasaki et al., 2004). Em alguns mamíferos já estudados, como roedores, ovinos e humanos, a BMP-15 é expressa a partir de oócitos de folículos primários (Juengel & Mcnatty, 2005). Já para a espécie caprina, a proteína BMP-15 foi encontrada nos oócitos de todos os tipos de folículos e células da granulosa de folículos primários, secundários e antrais, mas não em folículos primordiais. Os RNAm para BMP-15, IA, BMPR-IB e BMPR-II foram detectados nos folículos primordiais, primários, secundários, bem como no oócito e células da granulosa de folículos antrais caprinos (Silva et al., 2004a).
Fator de crescimento transformante
β (TGF-β)
Em mamíferos, a subfamília TGF-β é composta por três isoformas, denominadas TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3. Os receptores para TGF-β são divididos em tipo I (TβRI ou ALK5) e tipo II (TβRII), sendo aparentemente expressos em muitos tipos celulares. Já o RNAm para TGF-β e a proteína têm sido observados nas células da teca e da granulosa, bem como em oócitos de algumas espécies (Nilsson et al., 2003; Bristol & Woodruff, 2004).
GDF-9
O efeito biológico do GDF-9 ocorre após ligação com dois tipos de receptores,
ou seja, BMPR-II e TβR-I (ALK-5 - Vitt et al., 2002; Mazerbourg et al., 2004). O GDF-9 é majoritariamente expresso e secretado pelo oócito (Chang et al., 2002). Seus receptors já foram detectados em oócitos, células da granulosa e da teca de folículos pré-antrais e antrais bovinos, caprinos e ovinos (Wilson et al., 2001; Souza et al., 2002; Glister et al., 2004; Juengel et al., 2004; Silva et al., 2004a; Fatehi et al., 2005).
Ativina A e inibina
A ativina-A é formada por duas subunidades βA (βA-βA) de inibina e exerce suas ações biológicas por meio da ligação, inicialmente, com receptores de ativina do tipo IIA (ActR-IIA) ou IIB (ActR-IIB). Em seguida, ocorre a formação de um complexo com o receptor de ativina IB (ActR-IB/ALK-4, Pangas et al., 2002). A expressão das proteínas e dos RNAm para ativina-A e seus receptores foi demonstrada em oócito e células da granulosa de folículos pré-antrais e antrais em diferentes espécies (ovinos: Tisdall et al., 1994; bovinos: Hulshof et al., 1997; Izadyar et al., 1998; caprinos: Silva et al., 2004b). Seus receptores já foram descritos em folículos pré-antrais e antrais bovinos, caprinos e ovinos nos diferentes tipos celulares foliculares (Glister et al. 2004; J.L. juengel, unpublished data; Silva et al., 2004b).
A inibina já foi detectada em folículos primordiais e pré-antrais em crescimento em murinos, ovinos e caprinos e em folículos antrais dessas espécies, bem como em bovinos. Seus receptores já foram encontrados em todas as categorias foliculares em murinos e caprinos (Smitz & Cortvrindt, 1998; Silva et al., 2006; Leitão et al., 2013).
AMH
Similar aos demais fatores da família TGF-β, o AMH inicialmente liga-se
a receptores do tipo II (AMHR-II) e forma um complexo com receptores do tipo I, ActR-IA (ALK2), BMPR-IA (ALK3) ou BMPR-IB (ALK6), que são fosforilados. O AMH é expresso em células da granulosa de folículos primários até antrais pequenos, exceto em folículos primordiais. Essa afirmação suporta o conceito de que folículos em crescimento exercem um feedback negativo sobre os folículos primordiais. Seus receptores já foram descritos em folículos pré-antrais e antrais bovinos, ovinos e caprinos (Wilson et al., 2001; Souza et al., 2002; Glister et al. 2004; Silva et al., 2004).
A Tab. 4 resume a localização por categoria folicular dos fatores da superfamília TGF- β (ligante e receptor) em murinos, bovinos, caprinos e ovinos.
Se enquadram como receptores de citocinas os receptores do hormônio do crescimento (GH) e do fator inibidor de leucemia (LIF).
GH
No organismo, o receptor de GH (GHR) se apresenta na forma de dímero e exibe alterações conformacionais quando ligado ao GH, permitindo a transfosforilação dos hemirreceptores e, consequentemente, das proteínas responsáveis pela sinalização intracelular (Brown et al., 2005). A molécula de GH possui dois sítios de ligação na sua estrutura, cada um deles vai se ligar de modo sequencial a duas moléculas de GHR (Carter-Su et al., 1996). Trabalhos sugerem que alguns GHR possam também sinalizar por meio da dissociação da membrana plasmática e translocação para o núcleo, dirigindo-se à maquinaria transcripcional (Swanson & Kopchick, 2007). Conway-Cambel et al. (2007) demonstraram que o GHR nuclear está correlacionado com o alto status proliferativo tanto in vivo quanto in
vitro. Seus receptores já foram detectados
em folículos pré-antrais e antrais de murinos, bovinos, caprinos e ovinos (Carlsson et al., 1993; Eckery et al., 1997; Kölle et al., 1998; Frota et al., 2010).
LIF
Os receptores do LIF pertencem à superfamília de receptores de citocina classe I e são formados por 2 subunidades glicoprotéicas. A primeira subunidade possui baixa afinidade constituindo o receptor de membrana do LIF (LIFR), também conhecido pelos nomes α, LIF-β, gp190 ou CD118 (grupo de diferenciação 118). A outra unidade tem uma função sinalizadora-transdutora e é conhecida como gp130, a qual é compartilhada por todos os membros da superfamília interleucina-6 (Vernallis et al., 1997; Auernhammer & Melmed, 2000; Abir et al., 2004). A dimerização dessas duas unidades resulta na formação de um receptor de alta afinidade (Abir et al., 2004), que quando ligado ao LIF gera o complexo LIF-LIF-R-gp130 (Gearing et al., 1991; Kristensen et al., 2005). O LIF já foi identificado em folículos primordiais e pré-antrais em crescimento (Nilsson et al., 2002b).
A Tab. 5 resume a localização por categoria folicular do GHR e LIF (ligante e receptor) em murinos, bovinos, ovinos e caprinos.
• Receptores nucleares
Diferentemente dos receptores descritos anteriormente, os receptores nucleares não estão inseridos em membranas, mas sim presentes na fase solúvel da célula (citosol ou núcleo). Os membros da superfamília de receptores nucleares são proteína modulares que compartilham regiões comuns denominadas A/ B (domínio N-terminal), C, D (domínio da dobradiça), e E / F (domínio C-terminal), assim como uma elevada homologia de sequência. Essas regiões participam da
formação de domínios independentes, mas funcionalmente integrados. O domínio N-terminal (região A/B) é envolvido em interações tanto inter como intra moleculares, bem como na ativação da transcrição gênica. O domínio de ligação com o DNA (DBD ou região C) permite a dimerização do receptor e sua ligação a sequências específicas do DNA. O domínio da dobradiça (região D) exerce um papel na dimerização do receptor e na ligação de proteínas de choque térmico chaperonas (Hsp). O domínio de ligação com o ligante (LBL, região E/F ou C-terminal) compreende o sítio de ligação com o hormônio e atua sinergicamente ao domínio N-terminal regulando a transcrição gênica (Mosselman et al., 1996; Nilsson et al., 2001; Claessens & Gewirth, 2004; Kumar et al., 2004). Esses receptores contêm duas regiões denominadas domínios de ativação de transcrição (AF-1 e AF-2) importantes para a atividade transcricional dependente de ligante. As regiões AF-1 e AF-2, interagem com um grande número de co-ativadores transcricionais que podem ativar a transcrição de forma independente ou, na maioria dos casos, em sinergia com outro promotor celular (McEwan, 2004). Possuem receptores nucleares os hormônios tireoidianos e esteróides.
Hormônios tireoidianos
Os receptores dos hormônios tireoideanos (TRs) são codificados por dois genes que, uma vez expressos, originam dois receptores da tireoide (TRα e TRβ). O splicing alternativo ou o uso de diferentes promotores geram múltiplas isoformas que incluem as isoformas α (TRα1, TRα2) e β (TRβ1, TRβ2). A expressão dos RNAm para os TRs varia de acordo com o desenvolvimento e com a diferenciação celular (Laudet & Gronemeyer, 2002), sendo os RNAm do TRα1, TRα2 e TRβ1 expressos em quase todos os tecidos (Baxter
et al., 2004), inclusive no ovário (Costa et al., 2010).
Estradiol
Para o estradiol, duas moléculas de receptores foram identificadas, ERα e ERβ, que são codificadas por dois genes distintos. A existência destes dois subtipos pode explicar em parte a ação seletiva do estrogênio em diferentes tecidos-alvo e no mesmo tecido em diferentes estados fisiológicos (Conneely, 2001). Estudos em várias espécies confirmaram a distribuição diferencial destes dois receptores no ovário. Erβ foi detectado principalmente em células da granulosa, enquanto o Erα foi localizado em células tecais, glândulas intersticiais, células do estroma e epitélio germinativo (Rosenfeld et al., 2001; Van Den Broeck et al., 2002; Berisha et al., 2002; Amrozi et al., 2004; D’Haeseleer et al., 2006).
Progesterona
O receptor da progesterona (PR) tem pelo menos 3 isoformas, todas provenientes do mesmo gene (Bramley, 2003; Mulac-Jericevic & Conneely 2004). Em tecido bovino, todas as três isoformas (A, PR-B e PR-C) foram detectadas. As isoformas PR-A e PR-C podem ter uma influência inibitória na atividade transcricional da isoforma PR-B (Conneely, 2001; Mulac-Jericevic & Conneely 2004).
A Tab. 6 resume a localização por categoria folicular da triiodotironina (T3), tiroxina (T4), estradiol e progesterona (ligante e receptor) em murinos, bovinos, ovinos e caprinos.
A Fig. 2 resume a localização dos fatores extra e intraovarianos reguladores da foliculogênese e seus receptores em folículos ovarianos pré-antrais e antrais nas espécies caprina, ovina e bovina.
VIAS DE SINALIZAÇÃO DOS
FATORES EXTRA E
INTRAOVARIANOS
Em geral, após a ligação com o receptor, a ativação de componentes específicos das cascatas de sinalização varia dependendo do estímulo. Contudo, a arquitetura geral dessas vias inclui a ativação de enzimas quinases intracelulares. Estas fosforilam outras proteínas desencadeando uma cascata de sinalização que chegará ao núcleo celular estimulando a transcrição de moléculas, culminando com a resposta celular. Existem diversas vias de sinalização celular descritas na literatura.
1) Via adenilato ciclase
A via dependende de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), também conhecida como via da adenilato ciclase, é a principal cascata de sinalização dos receptores acoplados à proteína G. Como citado anteriormente, o complexo GTP-Gα se dissocia das subunidades β e γ (Gβ-γ), se liga e ativa uma enzima denominada adenilato ciclase. Esta enzima é responsável pela conversão de ATP em cAMP, o qual é um segundo mensageiro responsável pela ativação da proteína quinase A. Uma vez ativada, a proteína quinase A induz a ativação de outras proteínas e diversos fatores transcripcionais que regulam a expressão gênica determinando a resposta celular (Hillier et al., 1996).
2) Via MAPK/Erk
A via MAPK/Erk é ativada por vários tipos de receptores incluindo os receptores do tipo tirosina quinase. Após a ligação do fator com o receptor, são ativados adaptadores (Shc, GRB2, Crk, etc.) que possibilitam a ativação de pequenas proteínas (Ras, Rap1), as quais ativam uma cascata composta de quinases: MAPKKK (Raf), MAPKK (MEK1/2), e MAPK (Erk). Um dímero de Erk ativado pode regular
alvos no citosol e também se transloca para o núcleo onde fosforila uma grande variedade de fatores de transcrição que regulam a expressão gênica (Lowenstein et al., 1992; Liebmann et al., 2001).
3) Via PI3K/Akt
A cascata PI3K/Akt é ativada por receptores acoplados à proteína G, tirosina quinase e citocinas. O complexo ligante-receptor estimula a enzima fosfoinositídeo 3-quinase ou fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) a produzir trifosfato de fosfatidioinositol 3,4,5 (PI (3,4,5) P3). Este último estimula a quinase AKT responsável por conduzir o sinal ao núcleo celular. Tem sido demonstrado que a AKT pode interagir com moléculas SMAD regulando também essa via de sinalização (Carpenter et al., 1993).
4) Via fosfolipase C
Muitos receptores respondem à ação de hormônios e fatores de crescimento pela ativação de uma fosfodiesterase de membrana chamada Fosfolipase C, que também é ativada a partir da transdução do sinal por proteínas G. A ativação da fosfolipase C libera dois fragmentos: o 1, 4, 5 fosfatidilinositol trifosfato (IP3) a partir da forma difosfato (PIP2), um fosfolípido que está localizado na membrana plasmática e o diacilglicerol (DAG). Estas duas moléculas têm ações sinérgicas com as moléculas de segundos mensageiros. O IP3 liga-se aos receptores do retículo endoplasmático, causando uma rápida liberação de cálcio das reservas intracelulares, permitindo a formação do complexo cálcio-calmodulina que é um mediador de variadas ações enzimáticas. O IP3 é um sinal químico de curta vida, sendo rapidamente desfosforilado em PIP2 e PIP que são inativos como mensageiros secundários. Já o DAG parece atuar como co-fator da proteína quinase C (PKC). Os
dois segundos mensageiros (IP3 e DAG) atuam sinergicamente para causar a fosforilação de proteínas necessárias para os efeitos intracelulares. A PKC ativada pode estimular também a via MAPK (Patterson et al., 2005).
5) Via JAKS/ STATS
A ligação dos fatores aos receptores de citocinas pode desencadear a ativação de enzimas associadas à eles (JAKS), as quais fosforilam a si mesmas e ao receptor. A fosforilação dessas enzimas leva à ativação da proteína STATS e de adaptadores das vias MAPK, PI3K/AKT, além de outras vias de sinalização celular. Dímeros de proteínas STATS fosforiladas se deslocam até o núcleo e regulam a transcrição gênica (Bromberg, 2002; Haura et al., 2005).
6) Via SMADS
A união ligante-receptor serina/treonina quinase ativam SMADS ativadas por receptores (R-SMADS: SMAD2 e SMAD3 específicas para os TGF-βs, ativinas e GDF-9; ou SMAD1, SMAD5 e SMAD8 específicas para as BMPs) que se ligam à um mediador (SMAD4) e esse complexo é translocado ao núcleo regulando a transcrição. SMADS inibitórias (SMAD 6 e SMAD 7) regulam essa via competindo pela SMAD 4 ou bloqueando a fosforilação das R-SMADS pelo receptor (Nakao et al., 1997; Hata et al., 1998; Massague, 1998; Pierreux et al., 2000; Shi & Massague, 2003; Myers & Pangas, 2010). Além de ativar a via das SMADS, os receptores de citocinas uma vez ativados podem estimular as vias MAPK e PI3K (Iwasaki et al., 1999; Piek et al., 1999; Kimura et al., 2000).
7) Vias nucleares
Já a ligação do hormônio com o receptor nuclear leva à dissociação de moléculas repressoras (ex: histonas
deacetilases) e interação com moléculas promotoras (ex: acetiltransferases) que ativam a maquinaria transcripcional (Rosenfeld & Glass, 2001). A Fig. 3 resume as principais vias de sinalização utilizadas pelos hormônios e fatores de crescimento abordados nessa revisão. Note-se que algumas substâncias utilizam as mesmas vias de sinalização, além de muitas dessas vias serem interligadas estimulando vias secundárias. É importante ressaltar que foram abordadas somente as vias estimulatórias havendo diversas proteínas e segundos mensageiros que compõem as vias inibitórias responsáveis pela regulação desses mecanismos. Todos esses aspectos demonstram a complexidade da regulação da foliculogênese.
A interação entre as diferentes vias de sinalização pode explicar o sinergismo ou antagonismo de dois ou mais fatores extra e/ou intraovarianos durante o cultivo
in vitro de folículos pré-antrais. As
concentrações utilizadas, as combinações de substâncias e o momento de adição podem influenciar as diferentes respostas observadas. A seguir será feita uma análise crítica dos principais resultados obtidos no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais em murinos, bovinos, caprinos e ovinos que utilizam meios de cultivo de composição variada.
MELHORES RESULTADOS OBTIDOS
NO CULTIVO IN VITRO DE
FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS
O’brien et al. (2003) obtiveram os melhores resultados até o presente momento com a produção de embriões e o nascimento de camundongos viáveis (59 crias) a partir de oócitos de folículos primordiais cultivados in vitro. Nas demais espécies abordadas na presente revisão o avanço se restringiu apenas a formação de antro em bovinos (Gutierrez et al., 2000) e a produção de um pequeno e variável número
de embriões em caprinos (Saraiva et al., 2010; Magalhães et al., 2011; Silva et al., 2014) e ovinos (Arunakumari et al., 2010; Luz et al., 2012) a partir de folículos secundários crescidos in vitro.
1. Murinos
No trabalho de O’brien et al. (2003) foi ultizado um sistema de cultivo em dois passos. Inicialmente, o ovário inteiro foi cultivado na presença de soro (10% de soro fetal bovino) e os complexos granulosa-oócito obtidos após 14 dias (folículos secundários) foram isolados e cultivados na presença de FSH recombinante humano (0,05 ng/mL), EGF (1 ng/mL) e insulina (5 µg/mL) por mais 8 dias. Em seguida, os complexos granulosa-oócito foram mantidos em cultivo por mais 6 dias na presença apenas de insulina.
O soro utilizado na primeira etapa do cultivo é um produto biológico indefinido, composto por substâncias ativas, tais como aminoácidos (Kim et al., 1993; Keskintepe et al., 1995), substratos energéticos, vitaminas (Takahashi et al., 1992), peptídeos, proteínas, hormônios, fatores de crescimento e outros compostos (Mingoti, 1999). A utilização dessa substância apresenta resultados controversos na literatura (Hulshof et al., 1995; Telfer et al., 2000; Mitchell et al., 2002; Demeestere et al., 2005) em função da sua constituição indefinida, a variabilidade de acordo com a partida, além de ser passível de contaminação por agentes microbianos (Freitas, 2004). Entretanto, no estudo de O’brien et al. (2003) ele foi eficiente em promover o desenvolvimento de folículos secundários utilizando o sistema de cultivo de órgão inteiro. Esse sistema, que é possível apenas em murinos devido à pequena dimensão do ovário, possibilitou a manutenção de toda a arquitetura ovariana e interações entre os
tipos celulares o que pode ter contribuído para a obtenção dos folículos secundários.
Os folículos secundários obtidos na primeira etapa foram cultivados na presença dos fatores extraovarianos como o FSH (0,05 ng/mL) e a insulina (5 µg/mL), e intraovariano como o EGF (1 ng/mL). Estudos anteriores já demonstraram que a concentração plasmática de FSH em camundongos pode chegar até 2000 ng/mL (Murr et al., 1973; Michael et al., 1980; Parkening et al., 1980; Hill et al., 2010). Contudo, nesse estudo foi utilizada uma concentração bem inferior. A utilização de concentrações superiores aos níveis plasmáticos de EGF (0,28 a 0,5 ng/mL; Tsutsumi et al., 1987; Kasayama et al., 1989; Ozawa et al., 1991) e insulina (300 pg/mL; Hill et al., 2010) podem ter superestimulado as vias de sinalização celular comuns aos três fatores utilizados (a PKC, a MAPK e a PI3K como observado na Fig. 3), compensando a baixa concentração de FSH. Além disso, o FSH também estimula a via PKA.
Na última etapa do cultivo, o meio foi simplificado e passou a conter apenas insulina. Essa metodologia demonstrou que o próprio folículo foi capaz de produzir durante os últimos 6 dias de cultivo as substâncias necessárias a sua sobrevivência e crescimento sendo fornecido a eles apenas a insulina, aminoácidos essenciais, vitaminas, sais e outros compostos presentes no meio de base.
2. Bovinos
Gutierrez et al. (2000) descreveu pela primeira vez a formação de antro após um sistema de cultivo de longa duração (28 dias) de folículos secundários bovinos (166 ± 2,15 µm). Nesse sistema, a insulina (10 ng/mL) estava presente no meio de base e foram adicionados ao meio, FSH bovino (1 ng/mL), EGF (0,5 ng/mL) e IGF I (1 ng/mL) isoladamente ou associados ao
FSH. Todos os tratamentos estimularam o crescimento follicular e a formação de antro.
Nesse trabalho foram utilizados 2 hormônios de origem extraovariana (insulina e FSH) e dois fatores de crescimento de origem intraovariana (EGF e IGF-I). Segundo Akbar et al. (1974), a concentração plasmática de FSH em bovinos varia entre as fases do ciclo estral (estro = 78 ng/mL, varia entre 60 a 106 ng/mL; fase folicular: 66 ng/mL, varia entre 44 a 100ng/mL; e fase luteal: 64 ng/mL, varia entre 26 a 1060 ng/mL). Esses resultados demonstram que a concentração utilizada por Gutierrez et al (2000) foi inferior à concentração plasmática. De forma similar, o EGF foi adicionado ao meio em concentração inferior a detectada no fluido folicular de porcas e camundongas, que é cerca de 1 ng/mL (Hsu et al., 1987) e 10 ng/mL (Demeestere et al., 2005), respectivamente. O IGF-I também foi adicionado em concentração inferior a determinada anteriormente no plasma de bovinos (250 a 465 ng/mL; Hayden et al., 1993; Ryu et al., 2003). Já a insulina foi adicionada em concentração superior à concentração plasmática observada em bovinos (0,5 a 1,4 ng/mL) (McAtee & Trenkle, 1971; Hayden et al.; 1993). Apesar da insulina compartilhar as mesmas vias de sinalização do FSH, EGF e IGF-I (a PKC, a MAPK e a PI3K), exceto para a via PKA estimulada apenas pelo FSH, essas concentrações parecem não ter sido suficientes em promover o desenvolvimento completo dos folículos bovinos tornando-os aptos a maturar e produzir embriões in
vitro.
Enquanto para a espécie murina a foliculogênese dura em média 21 dias, como citado anteriormente, na espécie bovina esse período se extende por meses (Lussier et al., 1987). Gupta et al. (2008) relataram a produção de embriões de
búfalos após um cultivo in vitro de folículos secundários por aproximadamente 100 dias, demonstrando a necessidade de um período de cultivo in vitro mais extenso. No estudo de Gutierrez et al. (2000), o tempo de 28 dias provavelmente não foi suficiente para produzir oócitos maturos, aptos à produção
in vitro de embriões. Portanto, a produção
de embriões a partir de folículos pré-antrais representa o desafio atual na espécie bovina.
3. Caprinos
Embriões caprinos foram obtidos a partir de folículos secundários (>150 µm) cultivados in vitro em meio contendo insulina (10 µg/mL), FSH recombinante bovino em concentrações crescentes (100 ng/mL até o dia 6, 500 ng/mL até o dia 12 e 1000 ng/mL até o dia 18 de cultivo) associados ao LH e EGF (ambos na concentração de 100 ng/mL; Saraiva et al., 2010), ao GH (50 ng/mL; Magalhães et al., 2011) ou ao VEGF (100 ng/mL; Silva et al., 2014). Todos esses experimentos tiveram a duração de 18 dias e as taxas de maturação oocitária e produção de embriões foram baixas.
No estudo de Saraiva et al. (2010) as concentrações de FSH utilizadas foram superiores às encontradas no plasma caprino, que podem variar entre 85 a 248 ng/mL durante o estro natural (Chemineau et al., 1981). Além disso, as concentrações de EGF variam em porcas e camundongas entre 1 (Hsu et al., 1987) e 10 ng/mL (Demeestere et al., 2005), respectivamente. Já a concentração de LH estava dentro dos níveis plasmáticos determinados por Chemineau et al. (1982) que publicou que os níveis de LH no plasma caprino variam entre 2,6 a 114,0 ng/mL. Quanto às vias de sinalização envolvidas com os fatores utilizados, a insulina compartilha as mesmas vias de sinalização do FSH, EGF e do IGF (a PKC, a MAPK e a PI3K) exceto
para a via PKA estimulada apenas pelo FSH.
Já Magalhães et al. (2011) utilizou a combinação apenas de fatores extraovarianos, insulina, FSH e GH. A concentração de GH utilizada nesse experimento também foi superior à encontrada para o plasma de caprinos que varia entre 2 a 3 ng/mL (Simms et al., 1978; Kornalijnslijper et al., 1997). Aqui, pressupõe-se que os folículos foram capazes de produzir os fatores intra-ovarianos reguladores da foliculogênese, uma vez que houve o completo desenvolvimento folicular, maturação e produção embrionária. As altas concentrações dos fatores utilizados podem ter superestimulado as vias de sinalização celular. Além disso, a insulina compartilha as mesmas vias de sinalização do FSH e GH (a PKC, a MAPK e a PI3K), exceto para a via PKA estimulada apenas pelo FSH e GH.
Já Silva et al., 2014 adicionou ao meio de cultivo os fatores extraovarianos insulina e FSH e o fator intraovariano VEGF. Esses fatores estimulam vias em comum (a PKC, a MAPK e a PI3K), enquanto a via PKA é estimulada apenas pelo FSH.
Aliado à todas as considerações anteriores ressalta-se que, em caprinos, a foliculogênese dura aproximadamente 6 meses. Um estudo recente nessa espécie desenvolvido também por nossa equipe (Pessoa et al., 2014), sugeriu a extensão do período do cultivo in vitro para 36 dias. Nesse experimento verificou-se que o período de 36 dias de cultivo pode aumentar as taxas de retomada da meiose, levando a um aumento no número de oócitos maduros e, consequentemente, de embriões.
4. Ovinos
Arunakumari et al. (2010) demonstraram que a suplementação do meio de cultivo com T4 (1 µg/mL), FSH (2
µg/mL), IGF-I (10 ng/mL) e GH (1 mIU/mL) melhorou o desenvolvimento in
vitro de folículos pré-antrais (250 a 400
µm), a maturação oocitária e o desenvolvimento de embriões até o estágio de mórula. Nesse experimento foram utilizados três hormônios extraovarianos (T4, FSH e GH) e um intraovariano, o IGF-I, durante um cultivo in vitro por 6 dias.
As concentrações utilizadas para o T4 foram superiores às encontradas no soro de ovelhas (45,41 ng/mL a 51,32 ng/mL; Colodel et al., 2010), assim como a de FSH encontrado em média na concentração de 13,5 ± 5,2 ng/mL (Miller et al., 1981). Já o IGF-I é encontrado no plasma de ovelhas em média de 300 a 400 ng/mL durante a fase estral (Mirzaei & Rezaei, 2014), tendo sido utilizado uma concentração inferior à fisiológica. Foram estimuladas com essa combinação de fatores, as vias de sinalização celular: PKC, MAPK e a PI3K (vias em comum entre o FSH, GH e IGF-I), a via PKA, que é estimulada apenas pelo FSH, além da via dos receptores nucleares estimulada apenas pelo T4.
Estima-se que, na ovelha, ao deixar o pool de reserva, o folículo levaria aproximadamente 180 dias para atingir o estágio pré-ovulatório, 135 dias até o aparecimento do antro e mais de 45 dias até a ovulação (Cahille Mauléon, 1980). O estudo de Aranakumari et al (2010) demonstrou que a aceleração desse processo
in vitro pode ter sido justificada devido à
adição das substâncias anteriormente citadas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A presente revisão mostra a complexidade da foliculogênese em função da sua regulação por inúmeros hormônios e fatores de crescimento, os quais atuam através de receptores identificados em diferentes estágios de desenvolvimento e células foliculares. Somado a isso, a
ativação de diferentes vias de sinalização celular e a interação entre estas dificulta a elucidação da foliculogênese. Essas vias podem ser influenciadas pela combinação, momento de adição e concentração dos hormônios e fatores de crescimento utilizados. Entretanto, a compreensão de como isso ocorre ainda não foi completamente elucidada, sendo foco de
várias pesquisas. Estudos que avaliem o bloqueio e/ou estímulo de determinadas vias de sinalização podem ajudar a desvendar o processo de foliculogênese, além de poder aprimorar o cultivo in vitro, resultando na produção de elevado número de embriões a partir de oócitos oriundos de folículos pré-antrais crescidos in vitro nas espécies domésticas.
Tabela 1. Local de produção do FSH, LH e melatonina e localização por categoria folicular de seus receptores em murinos, bovinos, caprinos e ovinos.
FATOR LOCAL DE
PRODUÇÃO
LOCALIZAÇÃO POR CATEGORIA
FOLICULAR REFERÊNCIAS Ligante Receptor Primordial Pré antral em crescimento Antral FSH Adenohipófise m m, b, c, o m, b, c, o
Camp et al., 1991; Xu et al., 1995; Roy, 1993; Tisdall et al., 1995; Saraiva et al.,
2010
LH m, b, c m, b, c, o
Xu et al., 1995; Gelety & Magoffin, 1997; Abdennebi et al., 1999; Saraiva et
al., 2012
MELATONINA Pineal m, c m, c Soares et al., 2003; Barros et al., 2013;
Murinos (m), bovinos (b), caprinos (c) e ovinos (o).
Tabela 2. Localização por categoria folicular da insulina, EGF, FGF-2, IGF-I, IGF-II, KL, VEGF (ligante e receptor) em murinos, bovinos, caprinos e ovinos.
FATOR LOCAL DE PRODUÇÃO LOCALIZAÇÃO POR
CATEGORIA FOLICULAR REFERÊNCIAS
Ligante Receptor Primordial Pré antral em crescimento Antral Primordial Pré antral em crescimento Antral
INSULINA Pâncreas b, c b, c Shimizu et al., 2008; Chaves et al., 2012;
EGF c c c m, c m, c m, c Garnett et al., 2002; Silva et al., 2006
FGF-2 m, b, c m, b b, c m m m, b
Shikone et al., 1992; Wordinger et al., 1993; Wezel et al., 1995;
Nilsson et al., 2001; Van Almeida et al., 2012; IGF-I m, b m, b m, b m, b m, b Spicer et al., 1994; Wandji et al., 1998; Armstrong et al., 2000
IGF-II m, b, o m, b, o m, b m, b m, b Monniaux & Pisselet, 1992; Armstrong et al., 2000
KL m, c m, c m, c m, c, o m, c, o m, c, o
Motro & Bernstein, 1993; Clark et al., 1996; Doneda et al., 2002; Silva et al., 2006; Lima et al.,
2011;
VEGF c m, b, c b, c, o c m, b, c, o b, c, o
Berisha et al., 2000; Koos, 1995; Yang & Fortune, 2007; Bruno et al., 2009; Sharma & Sudan, 2010;
Chowdhury et al., 2010; Murinos (m), bovinos (b), caprinos (c), ovinos (o).
Tabela 3. Componentes da superfamília TGF-β e seus receptores (Tabela adaptada de Silva et al., 2009).
FATOR RECEPTOR REFERÊNCIAS
Tipo 2 Tipo 1 BMP-2 BMP-4 BMPR-II BMPR-IA (ALK3) BMPR-IB (ALK6) Shimasaki et al., 1999; Erickson & Shimasaki, 2003
BMP-6 BMP-7 BMPR-II ActR-IIA ActR-IIB ActR-IA (ALK2) BMPR-IB (ALK6) Sidis et al., 1998; Drummond et al., 2002;
Knight & Glister, 2003
BMP-15 BMPR-II BMPR-IB (ALK6) Erickson & Shimasaki, 2003; Shimasaki et al., 2004
GDF-9 BMPR-II TβR-I (ALK5)
Vitt et al., 2002; Erickson & Shimasaki, 2003; Mazerbourg et al., 2004 AMH AMHR-II ActR-IA (ALK2) BMPR-IA (ALK3) BMPR-IB (ALK6)
Erickson & Shimasaki, 2003; Shimasaki et al., 2004
ATIVINA ActR-IIA
ActR-IIB ActR-IB (ALK4)
Drummond et al., 2002; Pangas et al., 2002
TGF-β TβR-II TβR-I (ALK5) Ten Dijke et al., 1994; Shimasaki et al., 2004
Tabela 4. Localização por categoria folicular dos fatores da superfamília TGF-β (ligante e receptor) em murinos, bovinos, caprinos e ovinos.
FATOR LOCALIZAÇÃO POR CATEGORIA FOLICULAR REFERÊNCIAS
Ligante Receptor
Primordial Pré antral
em crescimento Antral Primordial
Pré antral em crescimento Antral BMP-2 m m, b m, o m, o Drummond et al., 2002; Silva et al., 2009; BMP-4 m m, b m, o m, o BMP-6 m m m, o m, o BMP-7 m, b m, b m, o m, o BMP-15 c m, c m, c m m, o m, o
TGF-β b b m, b Nilsson et al., 2003 Christopher, 2000;
GDF-9 b, c, o m, b, c, o m, b, c, o m, c m, c m, c McGrath et al., 1995; Bodensteiner et al., 1999; Silva et al., 2004; ATIVINA m, b, c m, b, c m, c m, c m, c m, b, c Hulshof et al., 1997; Izadyar et al., 1998; Zhao et al., 2001; Silva
et al., 2006; INIBINA m, c, o m, c, o m, b, c, o m, c m, c m, b, c
Smitz & Cortvrindt, 1998; Silva et al., 2006; Leitão et al., 2013 AMH m, b, o m, b, o Bezard et al., 1987; Baarends et al., 1995; Durlinger et al., 2002 Murinos (m), bovinos (b), caprinos (c), ovinos (o).
Tabela 5. Localização por categoria folicular do GHR e LIF (ligante e receptor) em murinos, bovinos, ovinos e caprinos.
FATOR LOCALIZAÇÃO POR CATEGORIA FOLICULAR REFERÊNCIAS
Ligante Receptor
Primordial Pré antral
em crescimento Antral Primordial
Pré antral em crescimento Antral GH Adenohipófise m, b, o m, b, c, o m, b ,o Carlsson et al., 1993; Eckery et al., 1997; Kölle et al., 1998; Frota et al., 2010
LIF m m m Nilsson et al., 2002
m= murinos, b= bovinos, c= caprinos, o= ovinos.
Tabela 6. Localização por categoria folicular da triiodotironina (T3), tiroxina (T4), estradiol e progesterona (ligante e receptor) em murinos, bovinos, ovinos, caprinos e humanos.
FATOR LOCALIZAÇÃO POR CATEGORIA FOLICULAR REFERÊNCIAS
Ligante Receptor
Primordial Pré antral
em crescimento Antral Primordial
Pré antral em crescimento Antral T3 Tireóide h Zhang et al., 1997 T4 h Estradiol m, b, c, o m, o m, o m, b, c, o Byers et al., 1997; Jansen et al., 2001 Progesterona m, b, c, o o m, b, c, o Juengel et al., 2006 m= murinos, b= bovinos, c= caprinos, o= ovinos, h= humanos.
Figura 1. Ativação dos receptores acoplados à proteína G. O complexo ligante-receptor ativa as proteínas G associadas, promovendo a conversão de guanosina difosfato (GDP) em guanosina trifosfato (GTP), que se liga à subunidade α da proteína G, estimulando a adenil ciclase a gerar AMP cíclico (cAMP). Este, por sua vez, aciona uma cascata de fosforilação nas proteínas quinases dependentes de cAMP que irão desencadear a resposta celular através da transcrição gênica.
Figura 2. Localização dos fatores reguladores da foliculogênese (ligante e receptor) em folículos ovarianos pré-antrais e antrais nas espécies caprina, ovina e bovina.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDENNEBI, L.; MONGET, P.; PISSELET, C.; REMY, J. J.; SALESSE, R.; MONNIAUX, D. Comparative expression of luteinizing hormone and follicle-stimulating hormone receptors in ovarian follicles from high and low prolific sheep breeds. Biology of Reproduction, v. 60, p. 845–854, 1999.
ABIR, R.; FISCH, B.; JIN, S.; BARNNET, M.; FREIMANN, S.; VAN DEN HURK, R.; FELDBERG, D.; NITKE, S.; KRISSI, H.; AO, A. Immunocytochemical detection and RT-PCR expression of leukaemia inhibitory factor and its receptor in human fetal and adult ovaries. Molecular Human Reproduction, v.10, n.5, p. 313-319, 2004. ADASHI, E. Y. Endocrinology of the ovary. Human Reproduction, v.9, p.815-827, 1994.
AKBAR, A. M.; REICHERT JR., L. E.; DUNN, T. G.; KALTENBACH, C. C.; NISWENDER, G. D. Serum levels of follicle-stimulating hormone during the bovine strous cycle. Journal of Animal Science, v. 39, p. 360 – 366, 1974.
ALMEIDA, A.P.; SARAIVA, M.V.A.; FILHO, J.G.A.; SILVA, G.M.; GONÇALVES, R.F.B.; BRITO, I.R.; SILVA, A.W.B.; LIMA, A.K. F.; CUNHA, R.M.S.; SILVA, J.R.V.; FIGUEIREDO, JR. Gene Expression and Immunolocalization of Fibroblast Growth Factor 2 in the Ovary and Its Effect on the In vitro Culture of Caprine Preantral Ovarian Follicles. Reproduction in Domestic Animals, v. 47, p. 20-25, 2012.
ALMEIDA, H. B. Concentrações plasmática de estradiol, testosterona, triiodotironina e tiroxina e a longevidade de sêmen equino resfriado. 2004, 25-26 p. Tese ( Doutorado em Reprodução Animal): Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia.
AMROZI, K. S.; ANDO, T.; HAMANA, K. Distribution of estrogen receptor a in the
dominant follicles and corpus luteum at the three stages of estrous cycle in Japanese black cows. The Journal of Veterinary Medical Science, v. 66, p. 1183–1188, 2004.
ARAÚJO, V. R.; SILVA, G. M.; DUARTE, A. B. G.; MAGALHÃES, D. M.; ALMEIDA, A. P.; GONÇALVES, R. F. B.; BRUNO, J. B.; SILVA, T. F. P.; CAMPELLO, C. C.; RODRIGUES, A. P. R.; FIGUEIREDO, J. R. Vascular endothelial growth factor-A165 (VEGF-A165) stimulates the in vitro development and oocyte competence of goat preantral follicles. Cell and Tissue Research, v. 346, p. 273–281, 2011.
ARMSTRONG, D. G.; GUTIERREZ, C. G.; BAXTER, G.; GLAZYRIN, A. L.; MANN, G. E.; WOAD, K. J.; HOGG, C. O.; WEBB, R. Expression of mRNA encoding IGF-I, IGF-II and type I IGF receptor in bovine ovarian follicles. Journal of Endocrinology, v. 165, p. 101–113, 2000.
ARUNAKUMARI, G.;
SHANMUGASUNDARAM, N.; RAO, V. H.; Development of morulae from the oocytes of cultured sheep preantral follicles. Theriogenology, v. 74, p. 884–894, 2010. AUERNHAMMER, C. J.; MELMED, S.
Leukemia-Inhibitory Factor—
Neuroimmune Modulator of Endocrine Function. Endocrine Reviews, v.21, p. 313-345, 2000.
BAARENDS, W. M.; VAN HELMOND, M. J.; POST, M.; VAN DER SCHOOT, P. J.; HOOGERBRUGGE, J. W.; DE WINTER, J. P.; UILENBROEK, J. T.; KARELS, B.; WILMING, L. G.; MEIJERS, J. H. A novel member of the transmembrane serine/threonine kinase receptor family is specifically expressed in the gonads and in mesenchymal cells adjacent to the mullerian duct. Development, v. 120, p. 189–197, 1994. BARROS, V. R.; CAVALCANTE, A. Y.; MACEDO, T. J.; BARBERINO, R. S.;
LINS, T. L.; GOUVEIA, B. B.; MENEZES, V. G.; QUEIROZ, M. A.; ARAÚJO, V. R.; PALHETA, R. C.; LEITE, M. C.; MATOS, M. H. Immunolocalization of melatonin and follicle-stimulating hormone receptors in caprine ovaries and their effects during in vitro development of isolated pre-antral follicles. Reproduction in Domestic Animals, v. 48, p. 1025-33, 2013.
BAXTER, J. D.; WEBB, P.; GROVER, G.; SCANLAN, T. S. Selective activation of thyroid hormone signaling pathways by GC-1: a new approach to controlling cholesterol and body weight. Trends in Endocrinology and Metabolism, v. 15, p. 154-157, 2004.
BERISHA, B.; PFAFFL, M.; SCHAMS, D. Expression of estrogen and progesterone receptors in the bovine ovary during estrous cycle and pregnancy. Endocrine, v. 17, p. 207–214, 2002.
BERISHA, B.; SCHAMS, D.; KOSMANN, M.; AMSELGRUBER, W.; EINSPANIER, R. Expression and tissue concentration of vascular endothelial growth factor, its receptors, and localization in the bovine corpus luteum during estrous cycle and pregnancy. Biology of Reproduction, v. 63, p. 1106–14, 2000.
BEZARD, J.; VIGIER, B.; TRAN, D.;
MAULEON, P.; JOSSO, N.
Immunocytochemical study of anti-mullerian hormone in sheep ovarian follicles during fetal and post-natal development. Journal of reproduction and fertility, v. 80, p. 509-516, 1987.
BODENSTEINER, K. J.; CLAY, C. M.; MOELLER, C. L.; SAWYER, H. R. Molecular cloning of the ovine growth/differentiation factor-9 gene and expression of growth/differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries. Biology of Reproduction, v.60, p. 381-386, 1999. BRAMLEY T. Non-genomic progesterone receptors in the mammalian ovary: some
unresolved issues. Reproduction, v. 125, p. 3–15, 2003.
BRISTOL, S. K.; WOODRUFF, T. K. Follicle-restricted compartmentalization of transforming growth factor beta superfamily ligands in the feline ovary. Biology of Reproduction, v.70, p.846-859, 2004. BROMBERG, J. Stat proteins and oncogenesis. The Journal of Clinical Investigation, v. 109, p. 1139-1142, 2002. BROWN, R. J.; ADAMS, J. J.; PELEKANOS, R. A.; WAN, Y.; MCKINSTRY, W. J.; PALETHORPE, K.; SEEBER, R. M.; MONKS, T. A.; EIDNE, K. A.; PARKER, M. W.; WATERS, M. J. Model for growth hormone receptor activation based on subunit rotation within a receptor dimer. Nature Structural & Molecular Biology, v.12, p.814-821, 2005. BRUNO, J.B.; CELESTINO, J. J. H.; LIMA-VERDE, I. B.; LIMA, L. F.; MATOS, M. H. T.; ARAÚJO, V. R.; SARAIVA, M. V. A.; MARTINS, F. S.; NAME, K. P. O.; CAMPELLO, C. C.; BÁO, S. N.; SILVA, J. R. V.; FIGUEIREDO, J. R. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor in goat ovaries and improvement of in vitro caprine preantral follicle survival and growth with VEGF. Reproduction, Fertility and Development, v. 21, p. 679–87, 2009. BYERS, M.; KUIPER, G. G. J. M.; GUSTAFSSON, J. A.; PARK-SARGE, O. K. Estrogen receptor mRNA expression in rat ovary: downregulation by gonadotropins. Molecular Endocrinology, v. 11, p. 172–182, 1997. CAHILL, L. P.; MAULÉON, P. Influences of season, cycle and breed on follicular growth rates in sheep. Journal of reproduction and fertility, v. 58, p. 321-8, 1980.
CAMP, T. A.; RAHAL, J. O.; MAYO, K. E. Cellular localization and hormonal regulation of folliclestimulating hormone and luteinizing hormone receptor messenger
