Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA 1 placa - 96 testes placas testes 72558

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(1)Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA 1 placa - 96 testes 5 placas - 480 testes. 72556 72558. DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR HCV NO SORO/PLASMA HUMANO POR TÉCNICA IMUNOENZIMÁTICA. IVD Controlo da qualidade de fabrico Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad são submetidos a um sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização do produto final. Cada lote de produto final é submetido a um controlo da qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação. A documentação relativa à produção e controlo de cada lote é arquivada pela nossa empresa..

(2) ÍNDICE 1 - OBJECTIVO DA QUANTIFICAÇÃO 2 - PRINCÍPIO DO TESTE 3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO 4 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO 5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E DE SEGURANÇA 6 - PRECAUÇÕES 7 - AMOSTRA 8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES - VALIDADE - CONSERVAÇÃO 9 - MODO DE FUNCIONAMENTO 10 - ADAPTAÇÃO DO SISTEMA 11 - CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO 13 - DESEMPENHOS DO TESTE 14 - LIMITES DO TESTE 15 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 46.

(3) 1 - OBJECTIVO DA QUANTIFICAÇÃO Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA é um teste imunoenzimático qualitativo para demonstração da infecção por HCV com base na detecção de anticorpos e do antigénio de cápside associados a uma infecção pelo vírus da hepatite C no soro ou plasma humano.. 2 - PRINCÍPIO DO TESTE A microplaca é sensibilizada com : • Um anticorpo monoclonal dirigido contra a cápside da hepatite C. • 2 proteínas recombinantes correspondentes à região NS3 : genotipo 1 e 3a. • Uma proteína recombinante correspondente à região NS4. • Um peptido de mutação correspondente à região cápside da hepatite C. Os conjugados utilizados são : • Conjugado 1 (R6) : Um anticorpo monoclonal murino biotinilado, dirigido contra a cápside da hepatite C. Este anticorpo monoclonal não reage contra o peptido de mutação de cápside utilizado na fase sólida. • Conjugado 2 (R7) : O conjugado 2 é uma mistura de anticorpos murinos anti-IgG humanas, marcados com peroxidase, e estreptavidina, marcada com peroxidase. A realização do teste compreende as etapas reaccionais seguintes : 1) O conjugado 1, seguido das amostras a estudar e dos soros de controlo, são distribuídos pelos poços da microplaca. Se estiverem presentes anticorpos anti-HCV, estes ligam-se aos antigénios fixados na fase sólida. Se estiverem presentes antigénios de cápside da hepatite C, estes antigénios são ligados pelos anticorpos monoclonais da fase sólida e os anticorpos monoclonais biotinilados do conjugado 1. 2) Após uma incubação de 90 minutos a 37°C e uma etapa de lavagem, o conjugado 2 contendo anticorpos anti-IgG humanas, marcados com peroxidase, e estreptavidina marcada com peroxidase, são adicionados a cada poço da microplaca. Em caso de presença de IgG humanas que tenham reagido com a fase sólida, o conjugado anti-IgG humanas liga-se aos anticorpos humanos. O conjugado peroxidase/estreptavidina fixa-se na biotina do conjugado 1, em caso de presença do antigénio de cápside do vírus da hepatite C na amostra. 3) Após 30 minutos de incubação a 37°C e eliminação dos conjugados enzimáticos não ligados por lavagem, a presença dos complexos antigénio/anticorpo/peroxidase são revelados por adição do substrato. 4) Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente e paragem da reacção, a leitura efectuase por espectrofotometria a 450/620-700 nm. A absorvência medida para uma amostra permite concluir quanto à presença ou à ausência de anticorpos anti-HCV e/ou de antigénio de cápside da hepatite C na amostra testada. A intensidade da coloração é proporcional à quantidade de anticorpos anti-HCV e/ou de antigénio cápside de hepatite C ligados na fase sólida.. 47.

(4) 3 - COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO ETIQUET -AGEM R1. R2. R3. R4. R5a. R5b. R6. R7. R8. R9 R10. NATUREZA DOS REAGENTES MICROPLACA 12 tiras sensibilizadas com um anticorpo monoclonal anti-cápside do VHC e antigénios recombinantes purificados (NS3, NS4) e um peptido de mutação da região cápside do VHC. SOLUÇÃO DE LAVAGEM concentrada 20X Tampão Tris NaCl pH 7,4 Conservante : Proclin™ 300 (0,04 %) CONTROLO NEGATIVO Tampão Tris HCl, contendo SAB ; Conservante : Proclin™ 300 (0,1 %) CONTROLO POSITIVO Soro humano contendo anticorpos anti-HCV e negativo para o antigénio HBs e para os anticorpos anti-HIV1 e anti-HIV2 diluído num tampão Tris HCl contendo S.A.B., inactivado por método fotoquímico. Conservante : Proclin™ 300 ( 0,1 %) ANTIGÉNIO POSITIVO DE CONTROLO Antigénio positivo sintético de controlo contendo um peptido de cápside liofilizado. DILUENTE DO ANTIGÉNIO DE CONTROLO Diluente do R5a. Água contendo um conservante : Proclin™ 300 (0,5 %) CONJUGADO 1 Anticorpo monoclonal murino dirigido contra a cápside do VHC marcado com biotina. Corado de violeta. Conservante : Azida de sódio (<0.1%), Cosmocil 0.025%. CONJUGADO 2 Anticorpos murinos anti-IgG humanas, marcados com peroxidase, e estreptavidina marcada com peroxidase Corado de verde. Conservante : Proclin™ 300 (0,5%) TAMPÃO SUBSTRATO DA PEROXIDASE Solução de ácido cítrico e de acetato de sódio, pH 4,0 contendo 0,015% de H2O2 e 4% de dimetilsulfoxida (DMSO) CROMOGÉNIO Solução contendo tetrametilbenzidina (TMB) SOLUÇÃO DE PARAGEM Solução de ácido sulfúrico 1 N. APRESENTAÇÃO 1 placa 5 placas 1 5. 1 frasco 70 ml. 1 frasco 235 ml. 1 frasco 1 ml. 1 frasco 1 ml. 1 frasco 1,5 ml. 1 frasco 3 ml. 1 frasco qsp 1 ml. 1 frasco qsp 1 ml. 1 frasco 1 ml. 1 frasco 1 ml. 1 frasco 15 ml. 2 frascos 2 x 30 ml. 1 frasco 15 ml. 2 frascos 2 x 30 ml. 1 frasco 60 ml. 2 frascos 2 x 60 ml. 1 frasco 5 ml 1 frasco 28 ml. 2 frascos 2 x 5 ml 3 frascos 3 x 28 ml. 4 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO • • • • • • • 48. Água destilada ou completamente desmineralizada. Lixívia e bicarbonato de sódio. Papel absorvente. Luvas descartáveis. Óculos de protecção. Tubos descartáveis. Pipetas automáticas ou semi-automáticas reguláveis ou fixas com capacidade de distribuição de 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl e 1 ml..

(5) • Provetas graduadas de 10 ml, 200 ml e 1000 ml. • Agitador tipo vortex. • Sistema de lavagem automático*, semi-automático* ou manual para microplaca. • Recipiente para banho-maria ou incubadora a seco* com termóstato a 37°C ± 1°C. • Contentor de resíduos contaminados. • Aparelho de leitura* para microplacas (equipado com filtros 490, 620, 450/620-700 nm). (*) Para informações mais precisas acerca dos aparelhos validados é favor contactar os nossos serviços técnicos.. 5 - INSTRUÇÕES DE HIGIENE E SEGURANÇA Todos os reagentes do dispositivo são destinados a utilização no diagnóstico ‘’in vitro’’ e para uso profissional. • Este kit deve ser manuseado apenas por pessoal qualificado e familiarizado com os procedimentos laboratoriais com os seus perigos potenciais. Usar vestuário de protecção adequados, incluindo bata e protecção para olhos e face e luvas descartáveis (sintéticas, luvas de látex não são recomendados) e manipular os reagentes e as amostras do paciente com o requisito Boas Práticas de Laboratório. Lave bem as mãos após a realização do teste. • Usar luvas descartáveis durante a manipulação dos reagentes e das amostras e lavar cuidadosamente as mãos após a sua manipulação. • Não ’’pipetar com a boca’’. • O controlo positivo R4 foi inactivado por método fotoquímico. • O material de origem humana utilizado na preparação do controlo positivo (R4) foi testado e comprovado como não reactivo em antigénio de superfície do vírus da hepatite B (Ag HBs), e em anticorpos dirigidos contra os vírus de imunodeficiência humana (anti-HIV-1 e anti-HIV-2). Uma vez que nenhum método de teste conhecido pode oferecer garantia absoluta da ausência de agentes infecciosos, os reagentes, bem como todas as amostras de doentes, deverão ser considerados como potencialmente infecciosos e manipulados com as precauções habituais. • Considerar o material directamente em contacto com as amostras e os reagentes de origem humana, bem como as soluções de lavagem, como produtos contaminados. • Evitar o derramamento de amostras ou de soluções que as contenham. • As superfícies contaminadas devem ser lavadas com lixívia diluída a 10%. Se o líquido contaminante for um ácido, as superfícies afectadas deverão ser previamente neutralizadas com bicarbonato de sódio e, em seguida, lavadas com lixívia e secas com papel absorvente. O material utilizado para a limpeza deverá ser eliminado num contentor especialmente reservado a resíduos contaminados. • As amostras, os reagentes de origem humana, bem como o material e os produtos contaminados, deverão ser eliminados após descontaminação : - por imersão em lixívia à concentração final de 5% de hipocloreto de sódio, durante 30 minutos, - ou por esterilização em autoclave a 121°C durante um mínimo de 2 horas. ATENÇÃO : Não introduzir na autoclave quaisquer soluções que contenham hipocloreto de sódio. • Evitar qualquer contacto do tampão substrato, do cromogénio e da solução de paragem com a pele e as mucosas. As fichas de dados de segurança estão disponíveis a pedido. • Nunca deixar de neutralizar e/ou esterilizar as soluções ou efluentes de lavagem ou qualquer líquido contendo amostras biológicas, antes de os eliminar na canalização. • Alguns reagentes contêm azida de sódio. Este composto pode formar, com as canalizações de chumbo ou de cobre, azotetos metálicos altamente explosivos. • A fim de evitar a acumulação de tais azotetos nas canalizações, antes de proceder à sua eliminação na canalização, neutralizá-los e lavar os canos de despejo com água abundante. • Alguns reactivos contêm ProClin™ 300 (0,04%, 0,1 % e/ou 0,5%) Xi Irritante R43 : Pode causar sensibilização em contacto com a pele S28-37 : Após contacto com a pele, lavar imediatamente com bastante água e sabão. Usar luvas adequadas. 49.

(6) 6 - PRECAUÇÕES A qualidade dos resultados depende do cumprimento das seguintes boas práticas de laboratório : • O nome do teste, bem como um número de identificação específico do teste, estão referidos no quadro de cada microplaca. Este número de identificação específico figura igualmente em cada tira. Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA : Número específico de identificação = 55 Esta identificação deve ser verificada antes de cada utilização. Qualquer tira cujo número de teste não esteja presente ou seja diferente do acima referido não deverá ser utilizada. • Não utilizar reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. • Não misturar reagentes de lotes diferentes num mesmo ensaio. NOTA : Pode-se utilizar outros lotes de solução de lavagem(R2, identificação do rótulo: cor verde 20X), de tampão substrato (R8, identificado como TMB buf. a azul), de cromogénio (R9, identificado como TMB 11X. a violeta) e de solução de paragem (R10, identificado como 1N a vermelho), em vez dos fornecidos com o dispositivo, desde que se utilize apenas um mesmo e único lote de qualquer deles no decorrer de um mesmo ensaio. Estes reagentes podem ser utilizados com outros produtos da nossa empresa. Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo: cor verde 20X) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10X ou cor laranja 10X) quando adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado ensaio. É favor contactar os nossos serviços técnicos para obter informações mais detalhadas. • Antes de utilizar, aguardar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente. • Reconstituir cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação. • Não efectuar o teste em presença de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldeídos) ou de poeiras que possam alterar a actividade enzimática do conjugado. • Utilizar recipientes em vidro perfeitamente lavados e enxaguados com água destilada ou, de preferência, material descartável. • Não deixar que a microplaca seque entre o final da lavagem e a distribuição dos reagentes. • A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais e iões metálicos. Em consequência, nenhum elemento metálico deverá entrar em contacto com as diferentes soluções que contenham o conjugado ou a solução substrato. • A solução de revelação (tampão substrato + cromogénio) deve apresentar a coloração rosa. O aparecimento de qualquer outra coloração nos minutos que se seguem à reconstituição indica que o reagente está inutilizado e deve ser substituído. Para esta preparação, utilizar de preferência recipientes e material de distribuição descartável, em plástico, ou recipientes de vidro previamente lavados com ácido clorídrico 1N, enxaguados com água destilada e secos. Conservar esta solução ao abrigo da luz. • Utilizar uma ponta de distribuição nova para cada soro. • A lavagem dos poços representa uma etapa essencial da manipulação: respeitar o número de ciclos de lavagem prescritos e assegurar que todos os poços são completamente cheios e, depois, completamente esvaziados. Uma lavagem deficiente pode dar origem a resultados incorrectos. • Nunca utilizar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de revelação.. 7 - AMOSTRAS Recolher uma amostra de sangue segundo a prática habitualmente utilizada. Os testes são realizados em amostras não diluídas de soro ou de plasma (recolhidas com anticoagulantes : EDTA, citrato e ACD). As amostras que apresentem agregados devem ser clarificadas por centrifugação antes do teste. As partículas ou agregados de fibrina em suspensão podem dar origem a resultados falsamente positivos. As amostras devem ser conservadas a + 2-8°C se a detecção for efectuada nos 7 dias seguintes, ou podem ser conservadas congeladas a -20°C. Evitar os processos repetidos de congelação/ descongelação. Se for necessário transportar as amostras, estas deverão ser acondicionadas em conformidade com a regulamentação em vigor para transporte de agentes etiológicos e transportadas preferencialmente congeladas. NÃO UTILIZAR SOROS CONTAMINADOS, HIPERLIPÉMICOS OU HIPER-HEMOLIZADOS. 50.

(7) NOTA : Não foi observada qualquer interferência em amostras contendo até 90 g/l de albumina, 50 µg/l de biotina e 100 mg/l de bilirrubina, bem como em amostras lipémicas contendo até 36 g/l de trigliceridos e em amostras hemolizadas contendo até 87 g/l de hemoglobina. Foram testadas amostras negativas e positivas quanto à presença de anticorpos anti HCV ou do antigénio do HCV, antes e após tratamento a 56°C durante 30 minutos, bem como após 3 ciclos de congelação/descongelação. Nenhum destes tratamentos teve qualquer impacto sobre a detecção de anticorpos. No entanto, o tratamento por calor diminui, de forma significativa, a resposta quanto à detecção do antigénio do HCV para o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA.. 8 - RECONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES - VALIDADE - CONSERVAÇÃO Antes da utilização dos reagentes do dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, aguardar que todos estabilizem à temperatura ambiente durante 30 minutos. 1) Reagentes prontos a utilizar Microplaca (R1) Cada suporte quadro que contém 12 tiras está acondicionado numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa com a ajuda de tesouras ou escalpelo de 0,5 a 1 cm acima da soldadura. Abra a bolsa e retire o quadro. Coloque as tiras não-utilizadas de volta na bolsa. Feche cuidadosamente a bolsa e guarde-a de novo a +2-8 °C. Conjugado 1 pronto a utilizar (R6) Homogeneizar por inversão, antes de utilizar. Conjugado 2 pronto a utilizar (R7) Homogeneizar por inversão, antes de utilizar. 2) Reagentes a reconstituir Solução de lavagem concentrada 20X : Reagente 2 (R2) Diluir 20 vezes a solução em água destilada. Obtém-se assim a solução de lavagem pronta a utilizar. Prever 800 ml para uma placa de 12 tiras. Solução de revelação enzimática (R8 + R9) Diluir o reagente R9 no reagente R8 a 1/11 (exemplo : 1 ml de reagente R9 em 10 ml de reagente R8), sabendo que 10 ml são necessários e suficientes para tratamento de 12 tiras. Homogeneizar. Antigénio de controlo positivo (R5a + R5b) : Solução de trabalho. Encher o frasco de R5a com a totalidade da solução do frasco R5b. Voltar a colocar a tampa e aguardar 10 minutos à temperatura ambiente, agitando de vez em quando o frasco por inversão. 3) Validade O dispositivo deve ser conservado a +2-8°C. Cada elemento do dispositivo conservado a +2-8°C pode ser utilizado até ao termo do prazo de validade indicado naembalagem (salvo indicação específica) R1 : Uma vez aberta a bolsa selada sob vácuo, as tiras de micro-poços conservadas a +2-8 °C na bolsa cuidadosamente selada de novo podem ser utilizadas durante 1 mês. R2 : A solução de lavagem diluída pode ser armazenada à temperatura ambiente (2-30°C) durante 2 semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada à temperatura de +2-30°C. R5a + R5b : A solução de trabalho do antigénio de controlo positive pode ser armazenada 1 mês a +2-8°C e 2 meses a –20°C (5 ciclos de congelação /descongelação, após congelação a –20°C). R8 + R9 : Após a reconstituição, o reagente armazenado em local escuro pode ser utilizado durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30°C).. 9 - MODO DE FUNCIONAMENTO • Seguir estritamente o protocolo proposto. • Utilizar os soros de controlo negativo e positivo em cada realização do teste, a fim de validar a sua qualidade. • Aplicar as boas práticas de laboratório.. 51.

(8) Protocolo 1) Estabelecer cuidadosamente o plano de distribuição e identificação das amostras. 2) Preparar a solução de lavagem diluída R2 e a solução de trabalho do antigénio de controlo positivo (R5a + R5b ). 3) Retirar o suporte e as tiras (R1) da embalagem de protecção. 4) Depositar directamente, sem pré-lavagem da placa, em sucessão: 4.1 100 µl de conjugado 1 (R6) em cada poço 4.2 50 µl de controlo negativo (R3) em A1, 50 µl de controlo positivo (R4) em B1, C1, D1, 50 µl da solução de trabalho do antigénio de controlo positivo (R5a + R5b) em E 1, 50 µl da primeira amostra em F1, 50 µl da segunda amostra em G1, etc. Homogeneizar a mistura com 3 aspirações no mínimo ou com um agitador de microplacas, durante 5 segundos. Se a distribuição das amostras exceder os 10 minutos, recomenda-se então distribuir os controlos negativos e positivos depois das amostras a testar. Em função do sistema utilizado é possível modificar a posição ou a ordem de distribuição dos controlos. NOTA : Após adição da amostra, o poço contendo a amostra (ou os controlos) + o conjugado 1 passa de violeta a azul. É possível verificar, por leitura espectrofotométrica a 620 nm, a presença de amostras nos poços (ver capítulo 12 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO) 5) Se possível, cobrir com película autocolante, pressionando bem sobre toda a superfície para assegurar a estanqueidade. 6) Incubar a microplaca em banho-maria com termóstato ou numa incubadora a seco de microplacas durante : 90 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. 7) Retirar a película adesiva. Aspirar o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados (contendo hipocloreto de sódio) e adicionar, em cada um deles, um mínimo de 0,370 ml de solução de lavagem. Aspirar de novo. Repetir a lavagem 4 vezes (um mínimo de 5 lavagens). O volume residual deve ser inferior a 10 µl (se necessário, secar a placa por inversão sobre uma folha de papel absorvente). Se se dispuser de um aparelho de lavagem automático, respeitar o mesmo ciclo operatório. 8) Distribuir rapidamente 100 µl da solução de conjugado 2 (R7) por todos os poços. Agitar o conjugado antes de utilizar. Cobrir, se possível, com uma película nova e incubar durante 30 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. NOTA : O conjugado é de coloração verde. É possível verificar, por leitura espectrofotométrica a 620 nm, a presença do conjugado nos poços (ver capítulo 12 : VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO). 9) Retirar a película adesiva, esvaziar todos os poços por aspiração e lavar 5 vezes, como anteriormente descrito. 10) Preparar a solução de revelação (ver capítulo 8, reagente R8 + R9). 11) Distribuir rapidamente por todos os poços 80 µl da solução de revelação da actividade enzimática (R8 + R9) anteriormente preparada. Deixar que a reacção se desenvolva ao abrigo da luz durante 30 ± 5 minutos à temperatura ambiente (18 a 30°C). Nesta incubação não utilizar película adesiva. NOTA : A distribuição da solução de revelação, de cor rosa, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação : observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a solução de revelação de cor rosa. (ver o parágrafo 12 para a verificação automática, VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DOS REAGENTES). 12) Adicionar 100 µl da solução de paragem (R10), adoptando a mesma sequência e o mesmo ritmo de distribuição que para a solução de revelação. NOTA : A distribuição da solução de paragem, que é incolor, pode ser controlada visualmente nesta fase da manipulação. A coloração do substrato, rosa (para as amostras negativas) ou azul 52.

(9) (para as amostras positivas), desaparece dos poços, que passam a incolores (para as amostras negativas) ou amarelos (para as amostras positivas), após adição da solução de paragem. 13) Limpar cuidadosamente a superfície inferior das placas. Aguardar pelo menos 4 minutos após a distribuição da solução de paragem e, nos 30 minutos que se seguem à paragem da reacção, proceder à leitura da densidade óptica a 450/620-700 nm por meio de um leitor de placas. 14) Antes da transcrição dos resultados, assegurar a concordância entre a leitura e o plano de distribuição e identificação das placas e das amostras.. 10 - ADAPTAÇÃO DO SISTEMA Lavagem : É indispensável respeitar os procedimentos de lavagem a fim de obter o máximo desempenho do teste. Para certos instrumentos poderá ser necessário aumentar o número de ciclos de lavagem para obter um ruído de fundo aceitável.. 11 - CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A presença ou ausência de anticorpos anti-HCV e/ou do antigénio de cápside do HCV é determinada comparando, para cada amostra, a absorvência registada com a do valor limiar calculado. Calcular a média das absorvências medidas para o controlo positivo R4 Exemplo : Controlo positivo R4 Amostra Densidade óptica B1 1,636 C1 1,704 D1 1,650 Total 4,990 Densidade Óptica Total 4,990 DO R4 = ----------------------------- = -------- = 1,663 3 3 Cálculo do valor limiar (Vs) Média DO R4 Vs = ----------------4 Exemplo : Média DO R4 = 1,663 1,663 Vs = -------- = 0,415 4 Os critérios de validação são os seguintes a Para o controlo negativo R3 : a absorvência medida deve ser inferior a 0.6 vezes a D.O do valor limiar. b) Para o controlo positivo R4. A média das absorvências medidas deve ser superior ou igual a 0,800 e inferior ou igual a 2,400. Se um dos valores individuais do controlo positivo se afastar em mais de 30% da média, repetir os cálculos com os dois valores de controlo positivo restantes. c) Para a solução de trabalho do antigénio de controlo positivo (R5a + R5b). A densidade óptica medida deve ser superior a 0,500. O teste não é válido se o controlo negativo R3, a solução de trabalho do antigénio de controlo positivo (R5a +R5b) e/ou mais de um valor de controlo positivo R4 se situarem fora do intervalo dos valores acima indicados. Interpretação dos resultados As amostras cuja densidade óptica é inferior ao valor limiar são consideradas negativas, segundo o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA. No entanto, os resultados situados imediatamente abaixo do valor de cut-off (CO - 10% < DO<CO) devem serinterpretados com prudência, sendo aconselhável testar de novo as amostras em duplicado, quando os sistemasutilizados e os procedimentos de laboratório o permitirem). As amostras cuja densidade óptica é superior ou igual ao limiar são consideradas como inicialmente positivas e devem ser testadas de novo em duplicado, antes da interpretação final. Após a repetição do ensaio, a amostra é considerada positiva segundo o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA se a segunda e/ou a terceira medições foram positivas, quer dizer, superiores ou iguais ao valor limiar. A amostra é considerada negativa se estes dois valores forem inferiores ao valor limiar. 53.

(10) 12 - VERIFICAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DO DEPÓSITO DAS AMOSTRAS E DO CONJUGADO (OPCIONAL) VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DO CONJUGADO 1 (R6) E DAS AMOSTRAS NA PRIMEIRA ETAPA A presença simultânea do conjugado 1 (R6) e da amostra (ou do controlo) pode ser verificada por leitura espectrofotométrica a 620 nm. Cada poço contendo simultaneamente o conjugado 1 (R6) e uma amostra (ou um controlo) deve apresentar uma densidade óptica superior a 0.800. NOTA : após adição da amostra, o conjugado 1 (R6) passa de violeta a azul VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DO CONJUGADO 2 (R7) NA SEGUNDA ETAPA NOTA : o conjugado 2 (R7) é de coloração verde A presença de conjugado 2 (R7) nos poços pode ser verificada por leitura espectrofotométrica a 620 nm : o valor de DO medido para cada poço deverá ser superior a 0,300 (um valor situado abaixo desta norma indica má distribuição do conjugado). VERIFICAÇÃO DO DEPÓSITO DA SOLUÇÃO DE REVELAÇÃO É possível verificar a presença da solução de revelação rosa por leitura automática a 490 nm : um poço contendo a solução de revelação deve apresentar uma densidade óptica superior a 0.100 (uma DO mais baixa indica má distribuição da solução de revelação) Observa-se uma diferença de coloração significativa entre um poço vazio e um poço contendo a solução de revelação rosa.. 13 - DESEMPENHOS DO TESTE A - ESTUDO DA ESPECIFICIDADE Amostras provenientes de dadores de sangue e de doentes foram testadas com o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA em comparação com o teste habitualmente utilizado em diferentes locais para determinar a especificidade deste ensaio. Especificidade numa população de dadores de sangue O estudo foi efectuado em 3 locais diferentes, a partir de dadores habituais ou de novos dadores. Locais. Nº de amostras testadas Nº de amostras positivas repetíveis. EFS Rungis France 2410 5. EFS Bordeaux France 2503 3. Dadores de Montpellier France 2248 4. Total. 7161 12. Em 7161 amostras de dadores de sangue testados, 12 amostras deram um resultado positivo repetível com o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, mas não foram confirmadas positivas pelo diagnóstico genómico (PCR) ou por Immunoblot HCV PLUS Deciscan™. A especificidade nesta população de dadores é de 99,83% (99,71% a 99,91% com intervalo de confiança de 95%). Especificidade numa população de doentes hospitalizados Um estudo prospectivo foi realizado em 469 amostras provenientes de 2 locais hospitalares diferentes. 440 amostras em 469 testadas deram um resultado negativo com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA e com o teste habitualmente utilizado 22 amostras foram encontradas positivas com estes dois testes, 21 das quais foram confirmadas positivas em Immunoblot HCV PLUS Deciscan™ e uma positiva provável. 7 amostras apresentaram resultados discordantes entre o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, o Immunoblot HCV PLUS Deciscan™ e a PCR. Para estas 7 amostras os resultados são os seguintes : • 2 amostras são positivas com o teste de rotina e negativas com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, bem como em PCR e em Immunoblot HCV PLUS Deciscan™. Estas amostras podem ser consideradas como falsos positivos prováveis com o teste de rotina. • Para 2 amostras não foi possível chegar a qualquer conclusão, uma vez que os resultados do teste de PCR eram não interpretáveis. Estas amostras foram excluídas do cálculo de especificidade. • Foi obtida uma amostra positiva no teste de rotina, negativa com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab 54.

(11) ULTRA, indeterminada em Immunoblot HCV PLUS Deciscan™ e negativa com o teste de PCR. • Apenas 2 amostras fracamente positivas com o teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA (ratio inferior a 1,7) e com o teste de rotina utilizado pelo laboratório deram um resultado negativo com o teste de PCR e indeterminadas com o teste de Immunoblot HCV PLUS Deciscan™ (fraca banda em NS4). A especificidade calculada a partir deste estudo é de 99,5 % (443/445) se se considerarem as 2 últimas amostras como falso-positivos e 100 % se forem consideradas como verdadeiro-positivos devido à presença de anticorpos residuais sequentes a uma infecção antiga (indeterminados em immunoblot). Especificidade em amostras potencialmente interferentes 429 amostras susceptíveis de provocar reacções cruzadas para um teste de detecção de anticorpos anti VHC foram testadas com o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA. As amostras testadas eram provenientes de : • doentes com infecções por hepatite B, hepatite A, rubéola, toxoplasmose, papeira, sarampo CMV, VHS, VEB, VZV, HTLV I, VIH, Chagas, Flavivirus, doentes vacinados contra a gripe. • doentes positivos quanto ao factor reumatóide. • doentes sofrendo de doenças auto-imunes (tipo SLE) com presença de mieloma, HAMA e ANA. • mulheres grávidas, doentes cirróticos, sob diálise, doentes com insuficiência renal. Entre estas 429 amostras, uma única foi encontrada positiva com o Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, bem como com um teste de rotina de detecção de anticorpos anti-VHC, com registo CE. A especificidade obtida é assim de 100% (428/428) nesta população. B – ESTUDO DE SENSIBILIDADE A sensibilidade foi avaliada numa vasta série de amostras positivas provenientes de doentes infectados pelo HCV, entre os quais painéis comerciais de seroconversões, amostras provenientes de locais especializados e amostras provenientes da Bio-Rad. As amostras testadas são apresentadas a seguir. Sensibilidade nas amostras confirmadas positivas quanto a infecção por HCV Um total de 646 amostras maioritariamente provenientes de infecções crónicas por HCV (presença de anticorpos anti HCV) foram testadas. 405 amostras eram determinações de genotipos. A totalidade destas 646 amostras são reactivas com o dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA. A sensibilidade calculada é assim de 100% nesta população. Mais 25 novas amostras (1 dia após a recolha de sangue) foram testadas e todas revelaram ser positivas. Sensibilidade nas amostras de genotipo positivo HCV Um total de 405 amostras de genotipo foram testadas, das quais 133 amostras de origem diversa e 272 amostras provenientes de laboratórios hospitalares. A distribuição dos genotipos testados é a seguinte : Genotipo. 1a. 1b. 1c. 1d 1a/b. 2. 2a. 2b. 2c. 2i. 2a/c. 3. 3a. 3b. Número. 53. 83. 2. 3. 3. 31. 7. 18. 4. 1. 17. 25. 77. 1. Genotipo. 3a/b. 4. 4a. 4c. 4d. 4h. 4k. 4f. 4c/d 5a. 6a. 6d. Número. 2. 10. 21. 6. 5. 2. 2. 3. 1. 1. 1. 24. 1b, 1a/b, Total 2a/2 2a/c 1. 1. 405. Todas as amostras foram positivas: sensibilidade 100%. Sensibilidade em amostras provenientes de infecções agudas A sensibilidade foi avaliada em amostras provenientes da fase aguda da infecção pelo HCV (fase inicial da infecção). Foi testado um total de 53 painéis de seroconversão correspondendo a 421 amostras com o kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA e comparados com um kit de detecção de anticorpos anti-HCV registado CE. O kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA detecta a infecção mais precocemente em praticamente todos os painéis : foram detectadas 119 amostras suplementares comparativamente a um kit de detecção de anticorpos anti-HCV (kit anti-HCV). 53 painéis de seroconversão (421 amostras) Número de amostras positivas. Kit anti-HCV. Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA. 152. 271 55.

(12) Entre estes painéis de seroconversão, 11 começam por uma amostra não virémica, o que permite uma estimativa mais precisa da janela serológica (fase negativa em anticorpos anti-HCV).. Painel. Genótipo. ARN HCV** BCP-6211. Diferença entre os kits anti-HCV e Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA kit Monolisa™ HCV (em dias) Ag-Ab ULTRA. Prazo de aparecimento da positividade desde a primeira colheita (em dias). 1a. 140. Kit anti-HCV 186. 140. 46. BCP-6213. 1a. 11. 43. 30. 13. BCP-6222. 1a. 17. 40. 17. 23. BCP-6225. 1a. 45. 78. 45. 33. BCP-6227. 1a. 42. 74. 46. 28. BCP-9041. 1a. 24. 62. 24. 38. BBI-PHV919. 1a. 25. 28. 28. 0. BCP-9054. 3a. 52. 60. 52. 8. BCP-9055. NG*. 31. 68. 33. 35. BCP-6216. NG*. 23. 23. 23. 0. NABI-SC90. NG*. 10. 52. 10. 42. 38.2. 64.9. 40.7. 24.2. Média em dias. * Não genotipado ** Os resultados dos testes de RNA são os indicados pelos fornecedores de painéis Nestes 11 painéis, o kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA detecta, em média, 24 dias mais cedo a infecção pelo HCV, comparativamente a um kit anti-HCV. Esta vantagem deve-se essencialmente à detecção do antigénio da cápside do HCV utilizada no kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA. Sensibilidade antigénica A contribuição da sensibilidade antigénica pode ser demonstrada nos painéis de seroconversões comerciais; por exemplo, no painel BBI 917. Nesta curva é possível comparar a sensibilidade do dispositivo Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA com um teste de detecção de anticorpos anti HCV. Painel de Seroconversão HCV BBI PHV – 917. HCV RNA. 9. -. +. ++. -. +--. - -. Razão : DO Amostra / DO Limiar. 8 7. HCV Ag-Ab ULTRA. 6 5. HCV Ab EIA 4 3 2 Cut-off. 1 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. Data de Hemorragia (dias). 56. 120. 140. 160.

(13) Precisão A precisão do teste Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA foi determinada pela análise de 7 amostras: 1 amostra negativa em anticorpos do HCV, 3 amostras positivas em anticorpos anti HCV e 3 amostras positivas em Ag de HCV. A repetibilidade (intra-ensaio) foi avaliada por análise destas 7 amostras, que foram testadas 30 vezes durante uma mesma manipulação. A reprodutibilidade (inter-ensaio) foi avaliada por análise destas mesmas 7 amostras, que foram testadas em duplicado durante 20 dias, à razão de 2 ensaios independentes por dia (procedimento NCCLS EP5). Os resultados estão agrupados nos quadros seguintes : Quadro 1 : Repetibilidade intra-ensaio Amostra Negativo Ag-Ac HCV Fraco positivo Ac HCV Positivo Médio Ac HCV Positivo Forte Ac HCV Fraco positivo Ag HCV Positivo Médio Ag HCV Positivo Forte Ag HCV. Razão Média 0,14 1,12 2,39 4,88 1,14 1,97 5,86. DP 0,01 0,04 0,08 0,18 0,03 0,06 0,14. CV% 6,1 3,65 3,39 3,7 3,04 3,02 2,38. Os CV obtidos para as 6 amostras positivas são inferiores a 10%. Quadro 2 : Reprodutibilidade inter-ensaio Amostra Negativo Ag-Ac HCV Fraco positivo Ac HCV Positivo Médio Ac HCV Positivo Forte Ac HCV Fraco Positivo Ag HCV Positivo Médio Ag HCV Positivo Forte Ag HCV. Razão Média 0,16 1,2 2,39 4,77 1,13 2,0 5,99. DP 0,02 0,08 0,13 0,17 0,09 0,15 0,37. CV% 1,24 6,65 5,38 3,58 7,97 7,73 6,2. Os CV obtidos para as 6 amostras positivas são inferiores a 15%.. 14 - LIMITES DO TESTE Dada a diversidade das respostas imunológicas de doentes infectados pelo vírus da hepatite C (nomeadamente em seroconversões), podem observar-se diferenças de detecção entre testes, em função da natureza das proteínas antigénicas utilizadas. Um resultado analítico negativo num teste de detecção não exclui, por isso, a possibilidade de uma exposição ou de uma infecção pelo vírus da hepatite C. Qualquer técnica ELISA pode produzir reacções falsamente positivas. É aconselhável verificar-se a especificidade da reacção para todas as amostras observadas positivas com repetibilidade, consoante os critérios de interpretação do kit Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA, através de um método apropriado: utilização de um teste ELISA de rastreio de anticorpos anti-HCV por si só ou por meio de um teste immunoblot de detecção de anticorpos anti-HCV para provar a presença de anticorpos anti-HCV e, se necessário, por um teste de procura do genoma viral do HCV ou por um teste específico de rastreio dos antigénios do HCV, seguido de neutralização. O método colorimétrico de verificação do depósito das amostras e/ou dos conjugados e/ou da solução de revelação não permite verificar a exactidão dos volumes distribuídos, mas apenas mostrar a presença de amostra e/ou de conjugados e/ou da solução de revelação. A taxa de respostas erróneas obtidas com este método está ligada à precisão do sistema utilizado (CV acumulados de pipetagem e de leitura superiores a 10% podem degradar significativamente a qualidade desta verificação).. 57.

(14) 15 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS • Busch MP, Kleinman SH. Committee report : nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40 : 143-159. • Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289 : 959-962. • Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification : a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36 : 211-218. • Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole–blood donations. Transfusion. 2003, 43 : 721-729. • Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay : Monolisa™ HCV AgAb ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3) : 61-62. • Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes : an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43 : 958-962. • Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42 : 1037-1045.∑ Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55 : 1-6. • Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36 : 565-573. • Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and 2000. Transfusion. 2002, 42 : 980-988. • Simmonds P. HCV heterogeneity : the science and the practice. In Hepatitis C. 1998. Yanamouchi Europe BV Ed. p 3-10. • Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171. • Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52 : RR-3. • EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30 : 956-961. • NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C : 2002. NIH Consensus and State-ofthe-Science Statements. 2002, 19 N°3. 46p.. 58.

(15) (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) CE-mærkning (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

(16) CE ( 98/79/CE in vitro

(17)

(18)

(19) ). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagnóstico in vitro Per uso diagnostico in vitro In-vitro-Diagnostikum Para uso em diagnóstico in vitro In vitro-diagnostik Til in vitro-diagnostik in vitro . (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Manufacturer Fabricant Fabricante Produttore Hersteller Fabricante Tillverkad av Fremstillet af

(20). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Batch code Code du lot Código de lote Codice del lotto Chargen-Bezeichnung Código do lote Batchnr Batchnummer

(21)

(22). CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия). Do stosowania in vitro in vitro diagnostikai Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra In vitro diagnostiliseks kasutamiseks Na diagnostiku in vitro Pro diagnostiku in vitro (NO) - Til in vitro-diagnostikk (RO) - Pentru diagnostic in vitro (BG) - За ин витро диагностика. Producent Gamintojas Gyártó Tootja Výrobca Výrobce (NO) - Produsent (RO) - Producător (BG) - Производител. Numer serii Serijos numeris Gyártási szám Partii kood Číslo šarže Číslo šarže (NO) - Partikode (RO) - Număr de lot (BG) - Партиден номер. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Numero di catalogo - Bestellnummer - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer -

(23) - Numer katalogu - Katalogo numeris - Cikkszám - Katalooginumber - Katalógové číslo - Katalogové číslo. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Authorised Representative Représentant agréé Representante autorizado Distributore autorizzato Bevollmächtigter Representante Autorizado Auktoriserad representant Autoriseret repræsentant

(24)

(25). (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). -. Expiry date YYYY/MM/DD Date de peremption AAAA/MM/JJ Estable hasta AAAA/MM/DD Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG Verwendbar bis JJJJ/MM/TT Data de expiração AAAA/MM/DD Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

(26) YYYY/MM/DD. (NO) - Katalognummer (RO) - Număr de catalog (BG) - Каталожен номер. Upoważniony Przedstawiciel Įgaliotasis atstovas Meghatalmazott Képviselő Volitatud esindaja Autorizovaný zástupca Zplnomocněný zástupce (NO) - Autorisert representant (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Упълномощен представител. Data ważności YYYY/MM/DD Galioja iki YYYY/MM/DD Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP Použiteľné do RRRR/MM/DD Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Срок на годност година/месец/ден.

(27) (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura límite - Limiti di temperatura di conservazione - Lagertemperatur - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning -

(28)

(29)

(30) - Temperatura przechowywania - Saugojimo temperatūriniai apribojimai - Tárolási hőmérsékleti határok - Piirangud säilitustemperatuurile - Skladovacia teplota od do - Teplotní rozmezí od do. (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение. (GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ). - Consult Instruction for use - Consulter le mode d'emploi - Consulte las instrucciones de uso - Consultare le istruzioni per uso - Siehe Gebrauchsanweisung - Consulte o folheto informativo - Se bruksanvisningen - Se brugsanvisningen -

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(33) - Sprawdź instrukcję - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje - Olvassa el a használati utasítást - Kasutamisel vaata instruktsiooni - Katalógové číslo - Viz návod k použití. (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба.

(34) Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tél.: +33 1 47 95 60 00 Fax.: +33 1 47 41 91 33. 11/2010 Code: 883607.

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