Absorção e Metabolismo de Nitrogênio em Plantas. Sonia Regina de Souza Prof a.associada IV-Bioquímica

Absorção e Metabolismo

de Nitrogênio em Plantas

Sonia Regina de Souza

Profa_{.Associada IV-Bioquímica}

Disponibilidade no solo

↓

Aplicação de N

↑

Até 70% do N aplicado = perdido

“Eficiência de Absorção e Uso de N pelas Plantas”

Nitrogênio

N absorvido: orgânica ou inorgânica

Nacry et al., 2013

Principais formas absorvidas:

NH

₄+

_e

_NO

3

-Peptídeos

Aminoácidos

COO_ + H+ COO- + H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ NO3 _ NO₃_ NO3_ Citossol R-COO_ + H+ COO_ COO- R-COO_ + H+ COO_ + H+ COO- + H+ pH 7,2

P-H

+

_-ATPases

de

Membrana plasmática

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ NO3 _ NO₃_ NO3_ Citossol pH 5,5 pH 7,2 -120mV

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ Citossol pH 5,5 pH 7,2

Transportadores

de NO

₃-

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH₄+ pH 5,5 pH 7,2 Citossol

Transportadores

de NH

₄+

Absorção de NO

₃-

_{x Atividade de P-H}

+

_-ATPase

Santi et al. (2003)

Absorção de NO

₃-

Maior expressão em baixa dose de NO

₃

-*P<0,05

Expressão gênica de isoformas de P-H

+

_{-ATPases (OsA2 e OsA7)}

x

NRT2.1 e NRT2.2 em arroz

Sperandio et al. (2014)

Sem N A ti vid ad e re la ti va ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 IRS (vv) osa7.1 osa7.2 osa7.3

0,2 mM Cte 0,2 mM Ress 2,0 mM Cte

Atividade da PM H+-ATPase (µmol Pi mg-1 proteina h-1)

* *

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Atividade das P-H

+

_{-ATPases e influxo de NO}

3-

em mutantes de arroz

osa7

Sem N A tiv id a d e r ela tiv a (% ) 0 20 40 60 80 100 120 IRS (vv) osa2.2 osa2.3 osa2.4

0,2 mM Cte 0,2 mM Ress 2,0 mM Cte

Atividade da PM H+-ATPase (µmol Pi mg-1 proteina h-1)

*

*

*

*

* *

_{* * *}

_*

* *

Atividade 0,2 mM Ress In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 10 20 30 40 50 0,2 mM Ress In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 10 20 30 40 50 0,2 mM Cte In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 10 20 30 40 50 IRS (vv) osa2.2 osa2.3 osa2.4 2,0 mM Cte In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 20 40 60 80 100 120 0,2 mM Cte In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 10 20 30 40 50 IRS (vv) osa7.1 osa7.2 osa7.3 2,0 mM Cte In flu xo d e N -N O 3 -µm oles g M F -1 ra iz h -1 0 20 40 60 80 100 120 * * * * * * Experimento mutantes osa7

Experimento mutantes osa2

ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns

Influxo

de NO

₃-

Silenciamento de P-H

+

_{-ATPase osa 7}

_{por amiRNA}

Transportadores

de NO

₃

-

NRT

NRT2 HATS [NO₃-_{]<1 mM} NRT2 iHATS NRT2.1 NRT2.2 NRT2 cHATS NRT2.3 NRT2.4 NRT2.5 NRT2.6 NRT2.7 NPF6.3 (NRT1.1/CHL1) NPF4.6 (NRT1.2) NPF6.4 (NRT1.3) NPF6.2 (NRT1.4) NPF7.3 (NRT1.5) NPF2.12 (NRT1.6) NPF2.13 (NRT1.7) NPF7.2 (NRT1.8) NPF2.9 (NRT1.9) NRT1/NPF cLATS [NO3-]>1 mM

NPF (NRT1/PTR FAMILY)

Transportadores de NO

₃-

_{de alta afinidade:}

OsNRT2.1 e OsNRT2.2

(SPERANDIO et al., 2011)

OsNRT1

.1

OsNRT2

.1

OsNRT2

.2

Exp

re

ssã

o Relativ

a (2

-

C

T

)

0

2

4

10

20

30

40

OsNRT1

.1

OsNRT2

.1

OsNRT2

.2

0

2

4

10

20

30

40

Constante Ressuprimento Deficiência

Experimento com N-NO

₃

-Raiz

Parte aérea

*

*

*

*

*

*

*

*

(a)

(0,2 mM NO

₃-

₎

(b)

Nacry et al., 2013

Proteína NAR 2.1

Proteína Regulatória

NAR2.1

e

NRT2.1

alta afinidade

Proteína Regulatória

NAR2.1

Barbier-Brygoo et al., 2011

Alta afinidade

NO3- NO₃- NO₃- NO₃- NO₃-

Baixo N

NRT2.1

e

5,0 mM N-NO3- (ressuprimento) Tempo (h) 0 3 6 9 24 IAC-47 Piauí 0,2 mM N-NO3- (ressuprimento) Tempo (h) 0 3 6 9 24 µmol N-NO 3 - g -1 M F 0 200 400 600 800 Absorção de NO₃ -0 20 40 60 a* b* c* d* a b c d a* a b* b b* b c* c (Sperandio et al., 2014) OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNAR2.1 Time (h) 3 6 9 24 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 0.2 mM NO3--N (resupply) 5.0 mM NO3--N (resupply) OsNRT2.1 Time (h) 3 6 9 24 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 IAC-47 Piauí OsNRT2.2 Time (h) 3 6 9 24 OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 NO3- Starvation OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNRT2.2 OsNRT2.2 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 2.0 mM NO3--N (constant) OsNRT2.2 0 20 40 60 0 20 40 60 * * * * * * * _* * * * * * *

(a)

(b)

(c)

(d)

OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 * OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 * * * * * * * * OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNAR2.1 Time (h) 3 6 9 24 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 0.2 mM NO3--N (resupply) 5.0 mM NO3--N (resupply) OsNRT2.1 Time (h) 3 6 9 24 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 IAC-47 Piauí OsNRT2.2 Time (h) 3 6 9 24 OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 NO3- Starvation OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNRT2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 50 100 150 200 OsNRT2.2 OsNRT2.2 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 2.0 mM NO3--N (constant) OsNRT2.2 0 20 40 60 0 20 40 60 * * * * * * * * * * * * * *

(a)

(b)

(c)

(d)

OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 * OsNAR2.1 Relati ve Expre ss ion (2 - CT ) 0 5 10 15 20 * * * * * * * * OsA2 R elativ e Ex press io n (2 - CT ) 0 5 10 15 20 NO3- Starvation 2.0 mM NO3--N (constant) 0.2 mM NO3--N (resupply) 5.0 mM NO3--N (resupply) OsA2 R elativ e Ex press io n (2 - CT ) 0 5 10 15 20 IAC-47 Piauí OsA2 R elativ e Ex press io n (2 - CT ) 0 5 10 15 20 OsA2 Time (h) 3 6 9 24 R elativ e Ex press io n (2 - CT ) 0 5 10 15 20 OsA7 OsA7 OsA7 OsA7 Time (h) 3 6 9 24 * * _* * * * * * * * * * *

(a)

(b)

(c)

(d)

** P< 0,01

Expressão de OsNRT2.1, OsNRT2.2 e OsNAR2.1 em variedades de arroz X Absorção de NO

₃

-OsNRT2.1 e OsNRT2.2 X OsNAR2.1

Baixo Suprimento de N-NO

₃-

Alto Suprimento de N-NO

₃-

Plantas

WT

Plantas

mutantes

nrt3.1

NRT3.1 ~ ao NAR2.1

Silenciadas nrt3.1

(MILLER et al., 2007)

Transportador de nitrato de dupla afinidade

CHL1

(NRT1.1)

Arabidopsis: NPF6.3

Arroz: NPF8.9

Transportador de nitrato de dupla afinidade

CHL1

(NRT1.1)

(Tsay et al., 2011)

Baixa afinidade

Alt

a afinidade

T101 T101

CIPK23 (calcineurin-like protein CBL-Interacting Protein Kinase 23)

GOJON et al., 2011

e o desenvolvimento de raízes

laterais em resposta ao NO

₃ -Transporte de Auxina

Acúmulo de Auxina

(desenvolvimento raízes laterais) Não Transporte de Auxina

O transceptor CHL1 (NRT1.1)

Baixo NO

₃-

_{Alto NO}

3-

(Krouk et al., 2010) Acúmulo de Auxina Acúmulo de Auxina Acúmulo de Auxina Transporte de Auxina

Silenciamento de chl1

Transporte de Auxina Transporte de Auxina Transporte de Auxina

(AMT, Ammonium transporter)

Alta Afinidade (HATS)

Transportadores

de NH

₄

+

Baixa Afinidade (LATS)

OsAMT1;3 2h 4h E xp re ssã o R ela ti va (OsA M T1; 3: A cti na ) 0 200 400 600 OsAMT1;2 2h 4h Ex pres são Relativ a (O sAM T 1;2 :Actin a ) 0 20 40 60 80 100 OsAMT1;1 2h 4h E xp re ssã o R ela ti va (OsA M T1; 1: A cti na ) 0 1 2 3 4 5 6 7 Manteiga Revenda IAC-47 Bico Ganga (Souza, VM. 2010)

C

_min

C_mín para N-NH₄+ _{em variedades de arroz. Valores obtidos 24 horas}

após a adição de solução com 0,2 mM de N-NH₄+_.

Variedade de arroz com maior eficiência de absorção sob baixo suprimento de NH

₄-

_.

OsAMT1.1

OsAMT1.2

Manteiga:

proteína do grão > 12%

Influxo de NH₄+ _{e teor do íon nas raízes de linhagens mutantes L1, L2 e L6 silenciando o gene}

OsAMT1.3 (UBIL:amiRNA-osamt1.3) e plantas controle IRS154 (vetor vazio) ressupridas com 0,15

mM de N-NH₄+ _{e supridas com 2,0 mM de N-NH} 4+. Jacques, ML. 2014 0,15 mM 2,0 mM  m o le s N -NH 4 + a b so rv id o g -1 MF h -1 0 10 20 30 40 50 IRS L1 L2 L6 * * * * Raiz Sem N 0,15 mM 2,0 mM µ m ole s N -N H 4 + g M F -1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 IRS #L1 #L2 #L6 * * * * *

Teor de NH

₄+

_raiz

Influxo de NH

₄+ OsAMT1.1 Dose de N-NH₄+ Sem N 0,15 mM 2,0 mM Expr essã o R elat iva 0 10 20 30 40 IRS #L1 #L2 #L6 * * * * IRS #L1 #L2 #L6 OsAMT1.2 Dose de N-NH₄+ Sem N 0,15 mM 2,0 mM E xpr essão Re lat iva 0 20 40 60 80 IRS #L1 #L2 #L6 * * * _{* *} * *

Linhagens mutantes L1, L2 e L6: amiRNA-osamt1.3

AMT1.1 - 2h (a) Ex pressão relativ a (2 - CT ) 0 1 2 3 4 WT L#2 L#8 AMT1.1 - 6h (b) AMT1.2 - 2h (c) Ex pressão relativ a (2 - CT ) 0 10 20 30 40 AMT1.2 - 6h (d) Const 0,2 mM 2,0 mM 0 1 2 3 4 5 AMT1.3 - 2h (e) Const 0,2 mM 2,0 mM Ex pressão relativ a (2 - CT ) 0 5 10 20 25 30 AMT1.3 - 6h (f) Const 0,2 mM 2,0 mM OsAMT1.1

OsAMT1.2

OsAMT1.3

(Ferreira, L. 2012)

Linhagem 8 apresentou

maior depleção de NH

₄

+

na solução nutritiva

E

maior expressão

em baixa dose

0,2 mM N-NH4+ Tempo (h) 0 1 2 3 4 5 6 Conc ent raç ão de N-NH 4 + (mM) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 WT L#2 L#8

Superexpressão do OsAMT1.3 em arroz

Corte transversal evidenciando a alta atividade do pOsAMT1.3 na região de

emissão de raízes laterais de plantas

de arroz.

(Ferreira, L. 2012)

Corte longitudinal com detalhe para a ponta da raiz lateral com alta atividade do pOsAMT1.3. Corte transversal evidenciando alta atividade do pOsAMT1.3 região do córtex

Locais de atuação do

OsAMT1.3 em plantas

privadas de N.

-

Absorção

- Emissão raízes

GUS– Azul GFP – Verde

P

_OsAMT1.3

:GFP:GUS

Localização Tecido – específica do transportador de amônio

OsAMT1.3

Redução do Nitrato

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH4+ Citossol pH 5,5 pH 7,2

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH4+ Citossol pH 5,5 pH 7,2 NADH NAD+ NR NO2_

Nitrato

Redutase

(NR)

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH4+ Citossol pH 5,5 pH 7,2 NADH NAD+ NR NO2_ Cloroplasto NO₂_

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH4+ Citossol pH 5,5 pH 7,2 NADH NAD+ NR NO2_ Fdred Fd_oxi NH₄+ Cloroplasto NO₂_

Nitrito

Redutase

(NiR)

Os elétrons doados pelo NAD(P)H são transferidos pelo FAD, citocromo b557 e cofator molibdênio-pterina até chegarem ao NO₃- _{que então é reduzido a NO}

2-.

Transferência de elétrons na Nitrato Redutase.

elétrons elétrons

Variedades de arroz, IAC-47 (melhorada) e Piauí (tradicional) submetidas a 4 concentrações de N-NO3- em solução nutritiva (0; 0,1; 1 e 10 mM). (31 dias+48 hs sem N a seguir receberam os tratamentos com N)

(Santos, A.M. et al., 2007).

Parte Aérea A N R ( nmoles gpf -1 h -1 ) 0 400 800 1200 1600 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea N-NO 3 - (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea mM N-NO3 -0 0,1 1 10 N -amino ( moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes 0 0,1 1 10 IAC-47 Piaui

Atividade da NR

Parte Aérea A N R ( nmoles gpf -1 h -1 ) 0 400 800 1200 1600 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea N-NO 3 - (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea mM N-NO3 -0 0,1 1 10 N -amino (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes 0 0,1 1 10 IAC-47 Piaui

Variedades de arroz, IAC-47 (melhorada) e Piauí (tradicional) submetidas a 4 concentrações de N-NO3- em solução

nutritiva (0; 0,1; 1 e 10 mM). (31 dias+48 hs sem N a seguir receberam os tratamentos com N) (Santos, A.M. et al., 2007).

Parte Aérea A N R ( nmoles gpf -1 h -1 ) 0 400 800 1200 1600 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea N-NO 3 - (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea mM N-NO3 -0 0,1 1 10 N -amino (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes 0 0,1 1 10 IAC-47 Piaui Parte Aérea A N R ( nmoles gpf -1 h -1 ) 0 400 800 1200 1600 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea N-NO 3 - (  moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes IAC-47 Piaui Parte Aérea mM N-NO3 -0 0,1 1 10 N -amino ( moles gpf -1 ) 0 5 10 15 Raízes 0 0,1 1 10 IAC-47 Piaui

Atividade da NR

Teores de NO₃- _{na planta}

Mutantes - Deleção

do gene da NR (

nia

)

Wang et al. (2004)

Silenciamento da Nitrato Redutase em Arabidopsis

Mutantes - Deleção

do gene da NR (

nia

)

WT

-H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NH4+ Citossol pH 5,5 pH 7,2 NADH NAD+ NR NO2_ Fdred Fd_oxi NH₄+ Cloroplasto Exportado

NO

₃_ NO₂_

Exportado

H+ H+ ADP + Pi ATP ATP ADP + Pi PPi 2Pi H+ H+ H+ NO₃_ H+ 2NO₃_ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ C lC NO₃_ NR NADH NAD+ NO2_ NO₂_ NH₄+ Fdred Fd_oxi NH4+ NO3 _ Exportado Vacúolo Cloroplasto Citossol pH 5,5 pH 7,2 H+ H+ H+ H+ pH 5,5

Armazenado

no

Vacúolo

H+ H+ ADP + Pi ATP ATP ADP + Pi PPi 2Pi H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NR NADH NAD+ NO2_ NO₂_ NH₄+ Fdred Fd_oxi NH4+ NO3 _ Exportado Vacúolo Cloroplasto Citossol pH 5,5 pH 7,2 H+ H+ H+ H+ pH 5,5 NO₃_ H+ NO3_ NO₃_ NO3_

Remobilizado

At ividade das V-ATP ases um oles de Pi.u g-1 ptn .h -1 0 50 100 150 200 250 300 _Raiz Bainha 0 10 20 30 72 48 24 0 Tempo (h) At ivi da de d as H + -PP as es um ol es d e Pi .u g-1 pt n.h -1 0 50 100 150 200 250 300 Raiz Bainha 0 24 48 72

Tempo após retirada do NO

₃-

_{da solução nutritiva}

V-H

+

_-ATPases

H

+

_-PPases

Tempo (h) um ole s de N-NO 3 - g -1 M F 0 10 20 30 40 50 60 70 Folha Bainha Raiz 24 48 72 0 81,6% 73,4% 48,5%*

Os teores de NO

₃-

_{nas folhas, bainhas e}

_raízes

_:

Após retirada do NO

₃-

_{da solução nutritiva (arroz):}

Santos et al., 2011

Assimilação do NH

₄

+

GS, GOGAT

GDH

H+ H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NR NADH NAD+ NO2_ NO₂_ NH₄+ Fdred Fd_oxi NH₄+ Cloroplasto Citossol pH 5,5 pH 7,2

H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NR NADH NAD+ NO2_ NO₂_ NH₄+ Fdred Fd_oxi Glutamato + Glutamina ATP ADP + Pi GS2 NH₄+ Glutamato + ATP ADP + Pi Glutamina Cloroplasto Citossol pH 5,5 pH 7,2

Glutamina

sintetase

GS1

GS2

H+ H+ H+ ADP + Pi ATP H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ NH₄+ NH4+ AMT1 AMT2 NO3 _ 2H+ NO₃_ 2H+ NO3_ 2H+ NO₃_ NR NADH NAD+ NO2_ NO₂_ NH₄+ Fdred Fd_oxi Glutamato + Glutamina ATP ADP + Pi GS2 + α-cetoglutarato Fdred Fdoxi ₂Glutamato NH₄+ Glutamato + ATP ADP + Pi Glutamina Cloroplasto Citossol pH 5,5 pH 7,2

Glutamato

sintase

(GOGAT)

Esquema representativo da Via Glutamina Sintetase-Glutamato sintase (GS-GOGAT) para a assimilação de amônio. (Fdox = ferredoxina oxidada e Fdred = Ferredoxina reduzida).

(Souza e Fernandes, 2006).

ATP

ATP + Pi

Fd ox ou NAD+ Fd red ou NADH

GS

Via

GOGAT

Knockout das isoformas de GS1:

gln1-3 e gln1-4

Superexpressão de Gln1-3

 kernel number increased by 30%

(Martin et al., 2006)

(Cels. do Mesófilo foliar)

- Número grãos

(Cels. da bainha vascular das folhas)

Knockout da GS1

(gln1-3 e gln1-4)

Superexpressão da GS1 (Gln1-3)

Aumento do número de grãos em 30%

(Martin et al., 2006)

Glutamato desidrogenase de plantas

(GDH)

K

_M

pelo NH

₄+

_:

GDH = 10 – 80 mM

GS = 50 µM

-cetoglutarato Glutamato NH₄+ NH₄+ NH₄+ NH₄+ NH₄+

Catabolismo

do

Glutamato

Aminação

Ciclo Krebs

GS

Desaminação

Glutam

Leaf Senescence

Proteins

Hydrolyses

AMINO ACIDS

i.e. Glutamate

α-Ketoglutarate

(Carbon Skeletons)

+

NH

₄+ Glutamate Dehydrogenase

Glutamine

Glutamine Synthetase cytosolic

Catabolism

Phloem

Transport

Via

Phloem

Grain

(GS1)

(GDH)

5C:2N

5C:1N

GDH desaminação

(Souza et al, 2007).

Superexpressão de

GDH de fungo

(Cylindrocarpon ehrenbergii)

CeGDH em arroz

Atividade GDH in vitro

Atividade GDH in vivo

Zhou et al., 2014

> Atividade GDH aminação



-cetoglutarato + NH

₄+



_Glutamato

Estrutura espacial GDH arroz GDH Fungo

Arroz superexpressando GDH de fungo (Cylindrocarpon ehrenbergii) CeGDH

Zhou et al., 2014

Plântulas

CeGDH

Sob

Baixo N

Maior crescimento

Arroz superexpressando GDH de fungo (Cylindrocarpon ehrenbergii) CeGDH

Zhou et al., 2014

Aumento da produção de grãos e n

o

_{. panículas}

sob baixo N

Cultivo em condições de campo

Superexpressão de

fator de transcrição

Superexpressão do Dof25 de arroz em Arabidopsis

(35S:OsDof25)

terra:fibra de coco na proporção 2:1

WT – planta não transformadas (Santos et al., 2012)

Maior

crescimento

OsDof25

Expressão de AMT1 e AMT2

W T O s1 O s3 O s1 4 E x p re ss ã o R el a ti v a (A ta m t1 .1 :u b i1 4 ) 0 ,0 0 ,5 1 ,0 1 ,5 2 ,0 2 ,5 3 ,0 3 ,5 W T O s1 O s3 O s1 4 E x p re ss ã o R el a ti v a (A ta m t2 .1 :u b i1 4 ) 0 ,0 0 ,5 1 ,0 1 ,5 2 ,0 2 ,5 3 ,0 3 ,5 A tA M T 2 .1 A tA M T 1 .1

Expressão gênica de transportadores de NH₄+ _{de alta (AtAMT1.1) e baixa afinidade}

(AtAMT2.1) em linhagens de Arabidopsis superexpressando Osdof25 e WT.

(Santos et al., 2012)

>Atividade GDH

WT Os1 Os3 Os14 WT Os1 Os3 Os14

--- Parte aérea ---

Raiz

---WT Os1 Os3 Os14 ---WT Os1 Os3 Os14

--- Parte aérea ---

Raiz

---GDH2 GDH1

Atividade de Glutamato Desidrogenase (GDH) em gel nativo

de poliacrilamida, mostrando suas sete isoenzimas.

Arabidopsis Superexpressando Dof25 de arroz

↑Expressão de genes do

metabolismo de carbono.

AtICDH1 WTOs1Os3_Os14 Re lat ive E x p re ss ion (UB I1 4 :A tI C DH _ ) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AtICDH2 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 AtICDH3 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 WTOs1Os3_Os14 R elative E xp re ss ion (U B I14 :A tP K _ ) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

AtPK1 AtPK2 AtPEPC1

WTOs1Os3_Os14 Ex p res sã o Rel at iv a (UBI 1 4 :AtPEP C_ ) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 AtPEPC2 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

(A)

(B)

(C)

AtIDH1 WTOs1Os3_Os14 R elative E xp re ss ion (U B I14 :A tID H _ ) 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 AtIDH2 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 AtIDH5 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 AtIDH6 WTOs1Os3_Os14 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

(D)

Isocitrato desidrogenase citossólica

Piruvato carboxilase PEP carboxilase

Isocitrato desidrogenase mitocondrial

Arabidopsis Superexpressando

Dof25 de arroz

(Santos et al., 2012) Teores de açúcares solúveis e

N-amino livre em linhagens transgênicas de Arabidopsis superexpressando o gene

Osdof25 e WT

Superexpressão proteína regulatória:

•Absorção e metabolismo de N

•Metabolismo de ácidos orgânicos (C)

•Maior crescimento sob baixo N

N -N O₃ -W T O s1 O s2 O s1 4  m o l d e N -N O 3 - g -1 M F 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 N -a m in o W T O s1 O s2 O s1 4  m o l d e N -a m in o g -1 M F 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 A çúc. solúveis W T O s1 O s2 O s1 4  m o l d e a çú c. s o l. g -1 M F 0 2 4 6 8 1 0 1 2 Maior crescimento OsDof25

Eficiência de Absorção e Uso de N

Superexpressão e silenciamento de genes:

Absorção e metabolismo do N

Proteínas regulatórias

Fatores de transcrição

Proteínas relacionadas ao metabolismo de C

 Identificação de variedades mais eficientes, em

agricultura de baixos insumos

•Genômica

•Transcriptômica

•Metabolômica

•Proteômica

•Epigenômica #

Sonia Regina de Souza

Laboratório de Bioquímica e Nutrição de Plantas, Depto. de Química, ICE, UFRRJ. BR 465 km 47, CEP: 23895-000 – Seropédica - RJ,

sonia_ufrrj@yahoo.com.br