Artigo Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: Um Guia Prático Forezi, L

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2650

Artigo

Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: Um Guia Prático

Forezi, L. S. M.;^a,* Castelo-Branco, F. S.^b

Rev. Virtual Quim., 2017, 9 (6), 2650-2672. Data de publicação na Web: 13 de novembro de 2017

http://rvq.sbq.org.br

Editing NMR Spectra with MestReNova Software: A Practical Guide

Abstract: The Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a technique that has many applications in chemistry, biochemistry and medical sciences. Within the chemistry, the NMR spectra allow elucidation and characterization from small molecules of synthetic or natural origin, to macromolecules and their interactions with ligands. However, in many cases, the edition of the spectra is restricted to proprietary software of workstations that are part of the NMR system, being performed by the operator of the equipment, which undoubtedly can delay the performance of new analyzes, as well as generate spectra that lacks some of the information that the user needs. Thus, independent editing by the users through spectral editing software, which can be installed on their personal computers, is highly useful, which can streamline the process, as well as allowing the user to extract all the relevant information of the spectrum. Thus, this manuscript describes a practical guide to editing ¹H NMR, COSY, ¹³C / APT, HSQC and HMBC NMR spectra from FID files through MestReNova 6.0 software, which is one of the most used in the world for this purpose. In addition to being intuitive and easy to operate, it offers a large variety of tools that can help students, professors and researchers in their NMR analysis.

Keywords: Spectroscopic techniques; ¹H-RMN, ¹³C-APT-RMN; HSQC; HMBC; FID.

Resumo

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica que apresenta inúmeras aplicações, seja na química, bioquímica e ciências médicas. Dentro da química, os espectros de RMN possibilitam a elucidação e caracterização desde pequenas moléculas de origem sintética ou natural, até macromoléculas e suas interações com ligantes. No entanto, muitas vezes a edição dos espectros fica restrita à softwares proprietários exclusivos das estações de trabalho integrantes do sistema de RMN, sendo realizadas pelo próprio operador do equipamento, o que, sem dúvidas, pode atrasar a realização de novas análises, bem como não gerar espectros com todas as informações que o usuário necessita.

Assim, a edição independente por parte do próprio usuário através de software de edição de espectros, que podem ser instalados em seu próprio computador, se mostra altamente útil, podendo agilizar o processo, além de permitir que o usuário extraia todas as informações que julgar pertinentes do espectro. Desta forma, este manuscrito descreve um guia prático de edições de espectros de RMN de

1H, COSY, ¹³C/APT, HSQC e HMBC, a partir de arquivos FID, através do software MestReNova 6.0, que é um dos mais usados no mundo para este propósito e que, além de ser intuitivo e de fácil operação, apresenta inúmeras ferramentas que podem ajudar a alunos, professores e pesquisadores em suas análises por RMN.

Palavras-chave: Técnicas espectroscópcas; ¹H-RMN, ¹³C-APT-RMN; HSQC; HMBC; FID.

* Universidade Federal Fluminense, Departamento de Química Orgânica, Campus do Valonguinho, CEP 24020-150, Niterói-RJ, Brasil.

luanaforezi@hotmail.com DOI: 10.21577/1984-6835.20170155

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Volume 9, Número 6

Revista Virtual de Química ISSN 1984-6835

Novembro-Dezembro 2017

2651 Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672|

Editando Espectros de RMN com o Software MestReNova: um Guia Prático

Luana S. M. Forezi,^a,* Frederico S. Castelo-Branco^b,*

a Universidade Federal Fluminense, Departamento de Química Orgânica, Campus do Valonguinho, CEP 24020-150, Niterói-RJ, Brasil.

b Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz, Instituto de Tecnologia em Fármacos – Farmanguinhos, Departamento de Síntese de Fármacos, Laboratório de Síntese 1, Manguinhos, 21041-250, Rio

de Janeiro-RJ, Brasil.

* luanaforezi@hotmail.com

Recebido em 6 de novembro de 2017. Aceito para publicação em 12 de novembro de 2017

1. Introdução

2. Guia do Software MestreNova®

2.1. RMN de Hidrogênio (¹H)

2.2. Espectroscopia de Correlação (COSY) 2.3. RMN de Carbono 13 (¹³C)/APT

2.4. Espectroscopia Heteronuclear de Coerência de Quantum Simples (HSQC) 2.5. Espectroscopia hereronuclear de correlação entre múltiplas ligações (HMBC)

1. Introdução

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica poderosa e versátil, largamente empregada na solução de problemas químicos, físicos e biológicos. Suas aplicações incluem: a caracterização de substâncias orgânicas de origem sintética ou natural, bem como a determinação de sua estrutura tridimensional, a localização dos sítios ativos de biomoléculas ou de moléculas adsorvidas na superfície de catalisadores e a interpretação de seus respectivos mecanismos de ação, entre muitas outras.^1,2 A RMN passou por uma verdadeira revolução nos últimos anos.

Com o advento da informática, a partir dos anos 2000, a edição dos espectros de RMN foi popularizada e tornou-se uma ferramenta fundamental e indispensável para a elucidação e apresentação dos espectros de RMN nas teses, dissertações e publicações científicas a partir de softwares executáveis em computadores domésticos, não sendo mais restritos as estações de trabalhos anexas aos equipamentos de RMN.

Os aparelhos atuais de RMN utilizam a técnica pulsada, na qual um campo magnético é aplicado aos núcleos analisados, através de pulsos de radiação de radiofrequência, o que os excita. Ao voltar ao estado fundamental, estes núcleos irradiam energia, a qual é detectada. A soma da energia irradiada por todos o núcleos é então

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livre (FID, do inglês Free Induction Decay).³ Desta forma, os softwares de edição de espectros de RMN fazem o processamento dos arquivos contendo o FID e, após a transformada de Fourier (FT, do inglês Fourier Transform) é gerado o espectro tal qual conhecemos, e a edição poderá ser realizada.

Assim, este artigo consiste em um guia prático para utilização do software MestReNova® versão 6.0 (2009) de edição de espectros de RMN, visando a correta utilização de suas ferramentas por estudantes, professores e pesquisadores.

Este Software é amplamente usado em todo mundo, sendo o mais conhecido e um dos mais completos para este propósito, além de ser intuitivo e de fácil operação.⁴ Assim, o usuário poderá fazer a edição de seus espectros de forma autônoma e independente, visualizando com mais detalhes as regiões de interesse do espectro, bem como apresentar as informações da forma mais pertinente, além de contar com todas as facilidades que o programa oferece.

2. Guia do Software MestReNova®

2.1. RMN de Hidrogênio (¹H)

2.1.1. Abrir um FID

Para abrir um determinado FID, com o MestreNova já aberto, segue-se os seguintes passos:

- Clique em File  Open  Busque a pasta que contém o FID da amostra a ser analisar, dê um duplo clique no arquivo FID.

Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele.

(*) Mesmo que o FID esteja compactado em arquivo zip, este também pode ser arrastado até a janela já aberta e soltado.

Assim, aparecerá imediatamente o espectro.

- Aparecerá o espectro:

arrastar até essa janela

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Forezi, L. S. M.; Castelo-Branco, F. S.

Quando as páginas que estão do lado esquerdo da janela não estiverem visíveis, basta clicar em View  Pages .

2.1.2. Corrigir a linha base

Em alguns casos, ao abrir o espectro, a linha base encontra-se desalinhada. Este

problema pede ser facilmente solucionado através da opção baseline correction, através do modo automático, bastando clicar neste botão.

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2654 2.1.3. Referenciar o espectro

- Antes de iniciar a edição do espectro deve-se fazer a referência dos sinais. Esta poderá ser feita pelo tetrametilsilano (TMS), comumente usado em RMN como a referência do zero ppm, ou, na falta deste,

poderá ser referenciado o solvente utilizado.

- Clique no botão TMS e direcione o cursor para o pico a ser referenciado e clique sobre ele (o cursor estará com uma linha vermelha vertical).

- Ao clicar aparecerá a seguinte imagem:

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Caso o sinal escolhido seja o do próprio TMS, após clicar em OK, este já ficará referenciado como zero. Caso a análise não tenha sido feita com a adição de TMS, poderá ser referenciado o solvente usado, conforme explicado abaixo:

- Clique em TMS, escolha o pico do solvente usado e clique sobre ele;

- Clique em solventes e selecione o solvente usado na análise  OK.

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2656 2.1.4. Expandir o espectro

- Para expandir uma determinada região do espectro, basta clicar no botão de lupa e com o mouse, segurando o botão esquerdo, selecionar a área desejada e soltar o botão.

- Para retornar ao modo de visualização total do espectro, clique no botão Full Spectrum .

(*) Para criar uma expansão adicional na mesma folha do espectro, clique em Expansion e selecione a região que deseja expandir (vide imagem abaixo). Para apagá-la basta selecionar a expansão e deletar.

(**) Esses ícones estão localizados na parte superior da janela conforme mostrado na Figura abaixo:

2.1.5. Ajustar as fases

Após a expansão do espectro, podemos ver com detalhes a forma dos sinais apresentados. Em alguns casos, as fases destes encontram-se desajustadas, tornando- os distorcidos. Desta forma, será necessário realizar o ajuste de fases. Este processo poderá ser feito de forma automática, clicando no botão Automatic Phase

Correction , porém, muitas vezes o resultado ainda não é satisfatório. Por isso, a correção manual poderá ser realizada. Para selecionar o ajuste manual, clique em Manual Correction na seta para baixo ao lado do ícone do Automatic Phase Correction . Uma caixa irá abrir e clicando com o botão esquerdo e arrastando para cima e para baixo, no local indicado, é corrigida a fase 0 e com o botão esquerdo corrige-se a fase 1.

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2.1.6. Proceder a integração

(*) Recomendável que se expanda a região para facilitar a integração dos sinais.

 Integração manual

- Clique no botão Integration e selecione manual. Direcione o mouse até a extremidade esquerda da base do sinal e pressione o botão esquerdo do mouse e arraste-o até a extremidade direita do mesmo sinal e solte.

- A referência do programa para a primeira integral é 1,0 e todas as outras serão feitas com base nela. Para modificá-la dê um clique com o botão direito em cima do

marcador da integral (cor verde), click em Edit integral e digite o valor novo na caixa normalized . Veja nas figuras abaixo o enunciado.

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- Para apagar uma determinada integral clique em Integration e Delete Manually . Direcione o cursor para o sinal contendo a integral a ser apagada e selecione a região pressionando o botão esquerdo e arrastando-o até a extremidade direita e solte.

- Para apagar todas as integrais clique em Integration e Delete All .

- Para que a curva de integral não apareça

no espectro clique com o botão direito  Properties  Integrals e desmarque Curve  OK. Na mesma janela se pode mudar a cor da integral e o tamanho/cor/fonte do valor da integral (aparece na parte inferior do espectro abaixo de cada sinal).

2.1.7. Atribuir os deslocamentos químicos

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2660 - Se desejar atribuir os valores em um pico

de cada vez clique em Peak Picking  Peak by peak . Clicar sobre cada pico e o deslocamento aparecerá na parte superior.

Se desejar atribuir os deslocamentos de uma única vez clique em Peak Picking  Manual Threshold . Com o botão esquerdo pressionado, arraste o cursor até passar com a linha horizontal vermelha por todos os sinais desejados e solte. Esta é a opção mais prática e que apresenta os melhores resultados.

- Para aumentar ou diminuir as casas decimais dos valores dos deslocamentos químicos  clique no espectro com o botão direito  Properties  Peaks 

Decimals .

2.1.8. Editar a intensidade dos picos

-Para aumentar ou diminuir a altura dos picos, clique no ícone ou . Também se pode utilizar a roda (scroll) do mouse para frente (para aumentar a intensidade) e para trás (para diminuir a intensidade).

2.1.9. Mudar a aparência do espectro

- Clique no espectro com o botão direito

 Properties . Lá se pode modificar as

cores do espectro, tamanho e fonte das scales , integrals e peaks .

- Para retirar o quadriculado do espectro clique em Properties  Scales  Grid

 desmarque as caixas show horizontal e show vertical  OK.

(*) Show frame pode deixar marcado, pois é a borda do espectro.

2.1.10. Melhorar a resolução e a qualidade do espectro

Muitas vezes, dada a resolução do espectrômetro de RMN, os sinais têm multiplicidade difícil de se determinar. Em alguns casos, as técnicas de processamento do MestreNova podem melhorar a resolução dos sinais, auxiliando a sua atribuição.

Uma das técnicas é a apodização, que pode ser aplicada por diferentes métodos.

Para selecioná-la, basta clicar em Apodization e, em seguida, selecionar um dos diferentes métodos. De forma geral, o método sine bell costuma apresentar bons resultados e, após aplicação, necessita de reajuste na intensidade do sinal.

No exemplo a seguir, após a apodização, pode-se notar a multiplicidade de forma mais fácil do que antes da técnica, quando o sinal, que é um tripleto de dupletos, poderia ser confundido com um quarteto.

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Uma outra forma de melhorar a qualidade do espectro é a suavização dos sinais. Para tal, basta selecionar a opção smoothing .

Diversas são as opções e intensidades de suavização, porém, o método Satizsky-Golay costuma apresentar os melhores resultados.

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2662 2.1.11. Determinar a constante de

acoplamento (J) e análise de multipletos

- Para se medir a constante de acoplamento clique em Multiplets Analysis

 Manual . Direcione o cursor para o sinal desejado e selecione a região pressionando o

botão esquerdo e arrastando-o até a extremidade direita e solte. Faça o mesmo processo para todos os sinais que deseja determinar a constante de acoplamento J . Na parte superior de cada sinal aparecerá uma pequena caixa com o valor do deslocamento químico do sinal e sua multiplicidade.

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- Após esse passo clique em Multiplets Analysis  report . Os valores dos J aparecerão para cada sinal, em texto colado no próprio espectro. Os valores de J já são apresentados em Hz. No report da análise de multipletos também é reportada a frequência

do aparelho utilizado na análise, o número de hidrogênios, os valores dos deslocamentos químicos, bem como a multiplicidade de cada sinal, além de discriminar o solvente empregado na análise.

Uma opção ainda mais útil é a de poder copiar o texto da análise de multipletos e colá-lo diretamente em um documento, tal

como um relatório, artigo ou tese. Para tal, basta fazer a análise de multipletos para todos os sinais e em seguida clicar em

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2664 Multiplets Analysis  copy . O texto com

todas as informações do espectro poderá ser colado onde o usuário desejar.

2.1.12. Retirar o texto do espectro

- Para retirar a caixa de texto com as informações da análise, clique com o botão direito  Properties  Spectrum  clique em Common e desmarque a caixa title  OK. A caixa fica localizada no canto superior esquerdo.

2.1.13. Simular um espectro teórico

- Desenhe a estrutura desejada no ChemDraw  copie e cole-a em uma nova página do MestreNova  selecione a estrutura e clique em Molecule  Predict

1H Spectrum .

Em Prediction Options pode-se mudar diversos parêmetros de predição, tal como a frequência do aparelho simulado (300 MHz, 500 Mhz etc.) e o solvente.

Vale ressaltar que o espectro simulado poderá ser editado da mesma forma que um espectro experimental (real).

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(*) Para criar uma nova página em branco clique em Edit  Create new page . Também pode-se usar o atalho ctrl+M .

2.1.14. Colar o espectro

Para colar um espectro no Word, PowerPoint etc, clique uma vez no espectro com o botão direito, copie e em seguida cole no lugar de destino.

2.1.15. Adicionar figuras e estruturas ao espectro

- Para adicionar figuras ou estruturas ao espectro basta copiar e colar no espectro.

(*) Recomenda-se copiar o espectro do MestreNova e colar o mesmo no arquivo Word desejado e em seguida anexar a estrutura sobre a imagem em uma caixa de

texto.

2.2. Espectroscopia de Correlação (COSY)

2.2.1. Abrir um FID de COSY

- Clique em File  Open  Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo FID. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele.

(*) Repare que a pasta é a cosy.fid e não

1H.fid.

(**) Se o FID estiver zipada também pode- se arrastar até a janela já aberta e soltar.

Assim aparecerá imediatamente o espectro COSY.

- O espectro COSY aparecerá da seguinte forma:

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2666 - Clique em Processing  Symmetrize

 COSY . O espectro aparecerá de forma simétrica, entretanto sem os espectros de 1H na horizontal e vertical.

- Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do COSY, clique em

Show traces  Setup .

- Ao clicar em setup aparecerá a seguinte tela:

A 1H.Fid precisa estar aberta

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- Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e Vertical Trace

 OK.

(*) A 1H.Fid precisa estar aberta.

- A forma do espectro está representado a seguir:

2.3. RMN de Carbono 13 (¹³C)/APT

As técnicas de processamento e edição aplicadas ao RMN de ¹H, poderão ser também utilizadas no RMN de ¹³C, respeitando-se as particularidades da análise deste núcleo. Abaixo são listados alguns procedimentos básicos.

2.3.1. Abrir um FID

- Clique em File  Open  Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo FID. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele.

(*) Repare que a pasta é a APT.fid ou 13C.Fid.

Assim aparecerá imediatamente o espectro 13C ou 13C/APT.

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2668 2.3.2. Referenciar o espectro

- Antes de iniciar a edição do espectro deve-se referenciar o solvente utilizado clicando no botão TMS , assim como na edição do espectro de RMN de ¹H. Direcione o cursor para o pico a ser referenciado e clique sobre ele (o cursor estará com uma linha vermelha vertical).

-Click em solventes e selecione o solvente usado na análise  OK.

2.3.3. Atribuir os deslocamentos químicos

- Se desejar atribuir os valores em um pico de cada vez clique em Peak Picking  Peak by peak . Clicar sobre cada pico e o deslocamento aparecerá na parte superior.

Se desejar atribuir os deslocamentos de uma única vez clique em Peak Picking  Manual Threshold . Com o botão esquerdo pressionado, arraste o cursor até passar com a linha horizontal vermelha por todos os sinais desejados e solte.

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2.3.4. Simular um espectro teórico

- Desenhe no ChemDraw  copie a estrutura e cole em uma nova pagina do MestreNova  selecione a estrutura e clique em Molecule  Predict ¹³C Spectrum .

2.4. Espectroscopia Heteronuclear de Coerência de Quantum Simples (HSQC)

Esta técnica correlaciona dois espectros com núcleos distintos, tal como ¹H e ¹³C, conforme mostrado no exemplo a seguir.

2.4.1. Abrir um FID de HSQC

- Clique em File  Open  Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo fid. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo

click sobre ele.

(*)Repare que a pasta é a HSQC.fid.

Assim aparecerá imediatamente o espectro do HSQC.

- Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do HSQC, clique em

Show traces  Setup  Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e selecione o FID do carbono na caixa Available 1D Spectra e de OK Vertical Trace  OK.

(*) As 1H.Fid e 13C.Fid (ou APT.Fid) precisam estar abertas.

- A forma do espectro de HSQC está representada a seguir:

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Rev. Virtual Quim. |Vol 9| |No. 6| |2650-2672| 2670 2.5. Espectroscopia hereronuclear de

correlação entre múltiplas ligações (HMBC)

Nesta técnica de correlação heteronuclear bidimensional, os núcleos de ¹H e ¹³C podem ser correlacionados em distâncias de até 4 ligações.

2.5.1. Abrir um FID de HMBC

- Clique em File  Open  Busque a pasta que contém o FID que deseja analisar, dê um duplo clique no arquivo fid. Se o arquivo estiver zipado, basta dar um duplo click sobre ele.

(*) Repare que a pasta é a HMBC.fid.

(**) Se o FID estiver zipado também pode- se arrastar até a janela já aberta e soltar.

Assim aparecerá imediatamente o espectro do HMBC.

- Para adicionar os espectros na horizontal e na vertical do HMBC, clique em Show traces  Setup  Selecione o FID do hidrogênio na caixa Available 1D Spectra e de OK para Horizontal Trace e selecione o FID do carbono na caixa Available 1D Spectra e de OK Vertical Trace  OK.

(*) As 1H.Fid e 13C.Fid (ou APT.Fid) precisam estar abertas.

- A forma do espectro está representada a seguir:

Expansão

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Referências Bibliográficas

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