CÍCERA LOPES DOS SANTOS
USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS NA ABSORÇÃO DE Pb (II) NO CRESCIMENTO DE Eichhornia Crassipes (Mart.) Solms
ARAPIRACA - AL 2018
USO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS NA ABSORÇÃO DE Pb (II) NO CRESCIMENTO DE Eichhornia Crassipes (Mart.) Solms
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Alagoas como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Agricultura e Ambiente, para a obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Wander Gustavo Botero Coorientadora: Drª Roberta Samara Nunes de Lima
ARAPIRACA - AL 2018
A Deus e minha filha Maria Clara DEDICO.
trabalho;
Aos meus pais João Lopes Sobrinho (in memorian) e Gedalva Maria dos Santos, incentivadores incansáveis dos meus estudos;
Ao meu orientador, Professor Dr. Wander Gustavo Botero, pelo acolhimento e aprendizado durante a execução e conclusão deste trabalho;
À minha coorientadora e amiga Drª. Roberta Samara Nunes pelos momentos de aprendizado e alegria;
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Agricultura e Ambiente da Universidade Federal de Alagoas – UFAL, CampusdeArapiraca, pelo conhecimento compartilhado e contribuição para minha formação, especialmente Prof. Dr. José Vieira e Profª Drª. Ademária.
Muito obrigada!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) pelo suporte financeiro para conclusão deste trabalho;
Ao Dr. Jessé Marques por me dar suporte e compartilhar de seus conhecimentos, sendo de grande valia para a realização desse trabalho;
Ao Dr. Jakson Leite pelos ensinamentos, momentos de descontração e alegria;
Aos técnicos Adeildo, Wanderson e Sivaldo dos Laboratórios de Ensino em Química, Nutrição Mineral e Química dos solos respectivamente pela colaboração durante a execução deste trabalho;
Ao Secretário executivo do PPPGAA, Renilson Pereira pela atenção e carinho;
Ao meu esposo José Santana por torcer sempre pelo meu sucesso;
À minha filha Maria Clara pelo seu amor incondicional, inspiração para seguir em busca dos meus sonhos;
Aos meus amigos do mestrado, pelos momentos compartilhados juntos, especialmente Ana Jéssica, Elvia Jéssica, Jéssica Moreira, Júlia Rocha e Elizabete que se tornaram verdadeiras amigas e tornaram mais leve meu dia-a-dia. Obrigada por dividir comigo as angústias e alegrias.
Foi muito bom conhecer vocês!
Ao meu amigo Ricardo Rafaell pela amizade, parceria,envolvimento e ajuda durante o a execução desse trabalho. Muito obrigada pela atenção e carinho!
Aos colegas do Laboratório de Ciências Ambientais do Agreste Tamyres, Jardielson, Andresa, Aline, especialmente Célia e Thalyta,as quais auxiliaram nas diversas etapas dessa pesquisa;
À minha amiga e prima Jéssica Lopes pela amizade e carinho. E também pela ajuda no desenvolvimento desse trabalho;
Ao colega Anderson, por toda ajuda!
Enfim, a todos que contribuíram direto e indiretamente para realização deste trabalho, muito obrigada!
em função de atividades, como o uso em larga escala de fertilizantes e o aumento das atividades industriais e de mineração, contribuindo para a contaminação do solo, corpos d’água e do lençol freático. As plantas, de maneira geral, podem absorver e acumular MPT através de mecanismos que as capacitam a tolerar e crescer na presença desses metais. A Eichhornia crassipes(Mart.) solms, mais conhecida como aguapé, é considerada uma planta promissora, com capacidade de fixar em seus tecidos nutrientes em quantidades superiores às suas necessidades, bem como MPT ao seu metabolismo. Objetivou-se com este trabalho avaliar o avaliar o efeito de substâncias húmicas, extraídas de amostras de turfa, na absorção de Pb2+ por plantas E.
crassipes(Mart.) solms. Os experimentos foram desenvolvidos em casa de vegetação e as análises realizadas nos Laboratório de Fisiologia Vegetal (LABFIVE) e de Ciências Ambientais do Agreste (LCAA) situados na Universidade Federal de Alagoas, Campus de Arapiraca. Os indivíduos de E. crassipes(Mart.) solmsforam obtidas do Lago da Perucaba, localizada no município de Arapiraca, Alagoas. Foi realizado umensaio, a saber: i) seleção da dose resposta de plantas submetidas à solução nutritiva de 10% de força iônica, com diferentes concentrações de substâncias húmicas (0; 25 mg L-1; 50 mg L-1; 100 mg L-1; 200 mg L-1 e 400 mg L-1), em delineamento casualizado com cinco repetições; ii)a partir da dose selecionada, foi realizada a interaçãodesta com o Pb2+. Para isto, plantas foram expostas à solução nutritiva com a presença e ausência de SH, em diferentes concentrações de Pb2+ [0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 mg L-
1de Pb(NO3)2]. Foi adotado o delineamento em blocos casualizados em esquema fatorial 2x6 (solução nutritiva; substâncias húmicas e seis concentrações de Pb2+) com cinco blocos. Ao final do experimento foi determinado, o teor de Pb2+ em solução nutritiva de cultivo e nas partes da planta (raiz, caule e folhas) por meio da técnica de voltametria de onda quadrada. Os resultados obtidos mostraram um maior acúmulo de Pb2+com as maiores concentrações na presença de SH nas diferentes partes da planta, sendo a raiz o órgão que apresentou maior acúmulo. O efeito do Pb2+ no crescimento das plantas apresentou uma correlação negativa em relação comprimento da raiz, parte aérea e massa da raiz seca. As concentrações crescentes do metal promoveram diminuição nas variáveis avaliadas.
Palavras-chave: Macrófitas aquáticas. Bioacumulação. Metais potencialmente tóxicos.
Substâncias húmicas.
of activities such as the large-scale use of fertilizers and the increase of industrial and mining activities, contributing to the contamination of soil, bodies of water and litter water table. Plants, in general, can absorb and accumulate MPT through mechanisms that enable them to tolerate and grow in the presence of these metals. Eichhornia crassipes, better known as aguapé, is considered a promising plant with the ability to fix nutrients in its tissues in quantities superior to its needs, as well as MPT to its metabolismo. The objective of this work was to evaluate the effect of different doses of humic substances extracted from peat samples on the absorption of Pb2 + by Eichhornia crassipes (Mart.) Solm plants. The experiments were carried out in a greenhouse and the analyzes carried out at the Laboratory of Plant Physiology (LABFIVE) and Agreste Environmental Sciences (LCAA) located at the Federal University of Alagoas, Campus Arapiraca. The plants of Eichhornia crassipes were bats from Lake Perucaba, located in the municipality of Arapiraca, Alagoas. A bioassay was performed, namely: i) selection of the dose response of plants submitted to the nutrient solution of 10% ionic strength, with different concentrations of humic substances (0, 25 mg L-1, 50 mg L-1, 100 mg L-1, 200 mg L-1 e 400 mg L-1), in a randomized design with five replicates; ii) from the selected dose, the interaction was performed with Pb2 +. For this, plants were exposed to the nutrient solution with the presence and absence of SH, in different concentrations of Pb [0,0; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0; 16.0 mg L-1 of Pb (NO 3) 2]. A randomized block design in a 2x6 factorial scheme (SN and SH, seven concentrations of Pb 2+) with five replications. At the end of the experiment, the content of Pb2+ in nutrient culture solution and in the plant parts (root, stem and leaves) was determined by means of the square wave voltammetry technique. The results showed a higher accumulation of Pb2+ with the highest concentrations in the presence of SH applied in the different parts of the plant, being the root the organ with the highest Pb 2 + contente. The effect of Pb2+ on plant growth showed a negative correlation in relation to root length, aerial part and dry root mass.
The increasing concentrations of the metal promoted decrease in the evaluated variables.
Keywords: Aquatic macrophytes. Bioaccumulation. Potentially toxic metals. Humic substances.
no solo e águas subterrâneas podem ser absorvidos pelos tecidos vegetais. B - Rota hipotética do metabolismo durante o acúmulo de contaminantes do solo 23 Figura 2 - Local de coleta dos indivíduos de Eichhornia crassipes (Lago da Perucaba, Arapiraca– AL). 28 Figura 3 - Pontos de coleta das plantas Eichhornia crassipes no Lago da Perucaba - Arapiraca/AL 29 Figura 4 - Padronização das plantas quanto ao tamanho (A) e número de folhas (B) 29 Figura 5 - Solubilização das amostras de substâncias húmicas em mesa agitadora, conforme recomendado pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas (IHSS) 30 Figura 6 -Padronização das plântulas (A) e identificação (B) para seleção da dose resposta de substâncias húmicas 31 Figura 7 -Análise do comprimento da raiz (CR) das plântulas ao 1º DAT (A), 10 º DAT (B) e 15 º DAT (C) 31 Figura 8 -Plantas submetidas a diferentes concentrações de Pb 2+ em casa de vegetação UFAL –Campusde Arapiraca (A e B) 33 Figura 9 -Amostras de água do Lago da Perucaba em chapa aquecedora para digestão 34 Figura 10 - Material vegetal moído em moinho de facas 35 Figura 11 - Efeitos das doses de substâncias húmicas no comprimento da raiz de plantas Hydrocleys nymphoides 38 Figura 12 - Comprimento das raízes de Eichhornia crassipes (Mart.) Solm em função de diferentes concentrações de Pb2+ (mg L-1). Barras representam o intervalo de confiança associado ao teste tukey, a 1% de probabilidade 43 Figura 13 - Comprimento da parte aérea de Eichhornia crassipes em função de diferentes concentrações de Pb2+ (mg L-1). Barras representam o intervalo de confiança associado ao teste tukey, a 1% de probabilidade 45 Figura 14 - Massa da parte aérea seca de Eichhornia crassipes em função de diferentes concentrações de Pb2+. Barras representam o intervalo de confiança associado ao teste tukey, a 5% de probabilidade 46 Figura 15 - Aspectos visuais das plantas submetidas a concentrações crescentes de Pb2+ ao 1º DAT (A), 15º DAT (B), 20 º DAT (C) e (D) plantas aos 28º DAT 47 Figura 16 - Teor total de Pb2+ (ug Kg-1) na folha de E.crassipes na presença e ausência de substâncias húmicas 50
Figura 18 - Teor total de Pb2+ (ug Kg-1) nas raízes de E.crassipes na presença e ausência de substâncias húmicas 52 Figura 19 - Distribuíção em (%) do acúmulo de Pb2+ absorvido pelas plantas E. crassipes 56 Figura 20 - Teor de Pb2+ total em solução nutritiva para o cultivo de E. crassipes 57
pelas razões atômicas H/C e C/O, teor de grupos funcionais e razão E4/E6 34 Tabela 2 - Resumo da análise variância e médias do comprimento da raiz (CR), massa seca da
raiz (MSR) e massa seca da parte aérea (MSPA) em plântulas Hydrocleys nymphoides aos 10 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes doses de substâncias húmicas 39 Tabela 3 - Determinação dos parâmetros físicos e químicos em amostras de água do Lago da Perucaba, Arapiraca- AL 39 Tabela 4 - Resumo da análise variância do comprimento da raiz (CR), massa seca da raiz (MSR), massa seca do caule(MSC) e massa seca da folha (MSF) de Eichhornia crassipes aos 28 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes concentrações de Pb2+
na presença de substâncias húmicas 40 Tabela 5 - Resumo da análise variância do comprimento da raiz (CR), massa seca da raiz), massa seca do caule (MSC) e massa seca da folha (MSF) de Eichhornia crassipes aos 28 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ na ausência de substâncias húmicas 42 Tabela 6 - Concentração total de Pb2+ em amostras da água (A1, A2 e A3) e em plantas Eichhornia crassipes cultivadas no Lago da Perucaba Arapiraca – AL 49
2.1 Metais e ecossistemas aquáticos ... 16
2.2 Chumbo ... 18
2.3 Macrófitas aquáticas e os Metais Potencialmente Tóxicos ... 18
2.3.1 Eichhornia crassipes ... 20
2.4 Remediação ... 21
2.5 Substâncias húmicas e a interação com metais potencialmente tóxicos ... 23
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 26
3.1 Caracterização da área de coleta do material vegetal ... 26
3.2 Condução dos ensaios experimentais ... 27
3.3 Substâncias Húmicas de Turfa ... 28
3.4 Caracterização das Substâncias Húmicas ... 29
3.5 Ensaio I: seleção da dose resposta de susbstâncias húmicas em plantas Salvínias sp.29 3.6 Ensaio II: exposição das plantas Eichhornia crassipes a diferentes concentrações de Pb2+ na presença e ausência de substâncias húmicas ... 30
3.7 Análise físico-química das amostras de água ... 31
3.8 Determinação dos teores Pb2+ em água de cultivo e em plantas Eichhornia crassipes31 3.8.1 Digestão de amostras de água do Lago da Perucaba ... 31
3.8.2 Digestão do material vegetal ... 32
3.8.3 Quantificação do teor de Pb2+ nas amostras de água e material vegetal ... 33
3.8.3.1 Eletrodo de trabalho... 33
3.8.3.2 Calibração e determinação de Pb2+ nas amostras ... 34
3.9 Análises de crescimento e massa seca ... 34
3.10Aspectos visuais de plantas Eichhornia crassipes expostas ao Pb2+ ... 34
4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
5.1 Avaliação do efeito das substâncias húmicas no comprimento da raiz (CR) e massa seca em plantas Savínias sppara seleção da dose-resposta... 36
5.2 Parâmetros físicos e químicos em amostras da água do Lago da Perucaba ... 39
5.3 Avaliação do pH e condutividade elétrica da solução de cultivo durante a condução do experimento ... 39
... 40
5.6 Aspectos visuais das plantas Eichhornia crassipes durante a condução do experimento ... 46
5.7 Determinação dos teores totais de Pb2+ em plantas E. crassipes ... 48
5.7.1 Teor total de Pb2+ das plantas cultivadas no Lago da Perucaba e em amostra de água ... 48
5.7.2 Determinação do teor de Pb2+ em diferentes partes das plantas Eichhornia crassipes na presença e ausência de substâncias húmicas. ... 49
5.8 Distribuição do acúmulo de Pb2+ absorvido pelas plantas Eichhornia crassipes ... 54
5.9 Teor total de Pb2+ em solução para cultivo de plantas E. crassipes ... 56
6CONCLUSÕES ... 58
REFERÊNCIAS ... 59
1 INTRODUÇÃO
A contaminação ambiental é um dos graves problemas enfrentados pela população mundial e, dentre as várias formas de contaminação, resultante de atividades industriais e agrícolas, a com metais potencialmente tóxicos (MPT) tem merecido atenção por parte de pesquisadores e órgãos governamentais envolvidos no controle da poluição (VIEIRA et al., 2015). Concentrações naturais desses elementos nos ecossistemas aquáticos são provenientes da solubilização das rochas e de sua lixiviação no solo (MALDONADO; WENDLING, 2009).
Alguns desses metais, incluindo Mg, Fe, Zn e Cu são necessários à sobrevivência de animais e vegetais, com importante papel na dinâmica de ambientes aquáticos. No entanto, outros como Cd, Pb2+ e Hg, aparentemente não possuem qualquer função biológica, sendo, portanto, considerados tóxicos (TAVARES, 2013).
Dentre os potencialmente tóxicos, o Pb2+é considerado um dos mais tóxicos para o homem e para as plantas, causando preocupações ambientais. Trata-se de um elemento que tende aacumular-se no solo e ambientes aquáticos provocando danos ao crescimento e desenvolvimento das plantas, principalmente nos tecidos radiculares. Entretanto, uma vez absorvido pelo vegetal, pode distribuir - se para os diferentes tecidos por meio de uma complexa rede de homeostase, causando distúrbios bioquímicos e moleculares (SILVA; SANTOS;
GUILHERME, 2015). Embora o Pb2+apresente elevada toxidade, diferentes espécies de macrófitas aquáticas vêm sendo estudadas em relação ao seu potencial remediador de ambientes contaminados por este metal (GOMES, 2016; KOMY ABDELRAHEE; ISMAIL, 2013;
REZANIA et al., 2016; ALMEIDA, 2009), uma vez que podem remover, imobilizar ou tornar menos tóxicos os elementos que estejam presentes no ambiente por meio de diferentes técnicas de remediação (ACCIOLY; SIQUEIRA, 2000).
Uma das técnicas que vem ganhando destaque pela sua alta eficiência e baixo custo é a fitorremediação, a qual consiste no uso de plantas para reduzir concentrações ou efeitos tóxicos de contaminantes no ambiente (SOUZA et al., 2017). Esse processo depende de algumas características apresentadas pelas macrófitas aquáticas que propiciam sua utilização como remediadoras, dentre elas: rápido crescimento, elevada produção de biomassa, propagação fácil e rápida, ampla distribuição e um sistema radicular fasciculado, possibilitando maior área de contato com o contaminante (GUIMARÃES, 2006). Tais características estão associadas as características dos metais como solubilidade e disponibilidade no meio (WUANA &
OKIEIMEN, 2011).
Eichhornia crassipes (Mart.) Solm, popularmente conhecida como aguapé, é uma espécie aquática nativa do Brasil (POTT e POTT, 2000). Morfologicamente é constituída de um rizoma do qual partem as raízes e as folhas. O rizoma flutua logo abaixo da superfície da água, protegido por certo número de folhas (VIEIRA et al., 2015). A espécie apresenta grande capacidade de sobrevivência e absorção de MPT de ambientes poluídos, sendo utilizada no tratamento de efluentes domésticos e/ou industriais. Suas raízes são capazes de reter partículas sólidas, bem como absorver, além de nutrientes essenciais, MPT e outras substâncias tóxicas (PETRUCIO e ESTEVES, 2000).
Nesse contexto, a substâncias húmicas distribuídas nos sistemas aquáticos e terrestres, influenciam na toxicidade de alguns metais, formando complexos com diferentes labilidades relativas (ROCHA et al., 1997). As SH são os principais componentes da matéria orgânica do solo (85 a 90 %) e originam-se a partir de transformações bioquímicas de compostos como lignina, celulose, hemicelulose, açúcares, aminoácidos. De acordo com a solubilidade, essas substâncias são fracionadas usualmente em ácidos fúlvicos, ácidos húmicos e humina (SILVA e MENDONÇA, 2007). As SH apresentam características muito diferentes, dependendo da origem do material, do método de extração e até mesmo do clima que a originou.
Considerando que as SH podem reduzir a toxidade de MPT no ambiente por meio de suas características redox, complexante e de biodisponibilidade, torna-se relevante estudar o efeito dessas substâncias em plantas Eichhornia crasipes (Mart.) Solm na presença de contaminantes (PANTANO, 2012). Entretanto, o efeito das SH não é fácil de ser explicado, devido à sua natureza complexa ainda pouco conhecida. Tais efeitos também podem diferir entre espécies vegetais, que podem responder diferentemente em cada estádio de desenvolvimento (ROSA et al., 2009).
Sendo assim, esta pesquisa teve como objetivo principal avaliar o efeito de substâncias húmicas, extraídas de amostras de turfa, na absorção de Pb2+ por plantas de E. crassipes (Mart.) Solm. Como objetivos específicos, avaliou-se a influência das SH frente à diferentes concentrações de Pb2+ no comprimento radicular e massa seca e avaliação dos teores de Pb2+totaisna raiz, no caule,nas folhas e na solução nutritiva de cultivo. Para isto, foram realizados dois ensaios experimentais conduzidos separadamente. No primeiro, analisou-se o efeito de diferentes doses de SH no comprimento radicular de plantas Salvínias com o objetivo de selecionar a melhor dose-resposta para uso em ensaio posterior. No segundo ensaio avaliou- se a absorção de Pb2+ por plantas E. crassipes (Mart.) Solm na presença e ausência de substâncias húmicas.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Metais e ecossistemas aquáticos
Alguns elementos químicos são tóxicos, entretanto, em condições naturais não atingem o ambiente aquático ou mesmo o solo em concentrações capazes de causar efeitos danosos. A demanda crescente de materiais para o consumo humano aumenta a sua exploração e industrialização, fazendo com que cada vez mais estas substâncias sejam dispersas no ambiente em elevadas concentrações, por meio de rejeitos de minerações, pelos processos de beneficiamento que geram resíduos sólidos e líquidos e pelo descarte inadequado (ZULIANI et al., 2017). Estes elementos podem ser chamados de “metais traço” ou “elementos. Termo usado para se referir aos elementos detectados no ambiente em baixas concentrações, teores em torno de partes por milhão (mg kg-1 ou mmol kg-1), ou ainda menores (μg kg-1 ou μmol kg-1), em substratos como solo, planta, água subterrânea e outros (ZULIANI et al., 2017).
Ao tratar de metais, deve ser considerado que a maioria ocorre naturalmente e exerce funções fisiológicas importantes na biota na condição de micronutrientes essenciais e somente em elevadas concentrações tornam-se tóxicos, levando alguns autores a sugerir por causa desse comportamento, o termo metal potencialmente tóxico (AHMAD e GONI, 2010; TIWARI et al., 2011; LENZI et al., 2009). Dessa forma, os metais potencialmente tóxicos (MPT) são contaminantes químicos não biodegradáveis e tendem a se acumular nos organismos vivos, provocando distúrbios e doenças variadas, e têm sido sistematicamente lançados no ambiente, afetando a qualidade de solos e águas (OLIVEIRA & SILVA, 2013).
Alguns metais, incluindo ferro (Fe), molibdênio (Mo), manganês (Mn), zinco (Zn), cobre (Cu) e níquel (Ni) são micronutriente es essenciais para as plantas. Metais como vanádio (V), cobalto (Co) e crômio (Cr) III não desempenham funções vitais nas plantas, mas podem ter importância para certas espécies vegetais. No entanto, cádmio (Cd), mercúrio (Hg), chumbo (Pb) e urânio (U), além de não serem essenciais e, ou benéficos às plantas, podem ser extremamente tóxicos em baixas concentrações (VIEIRA et al., 2015).
A contaminação por MPT em sistemas aquáticos é motivo de preocupação devido à sua toxicidade, abundância, persistência e não biodegradabilidade. Dessa forma, a industrialização rápida, intensiva e descontrolada urbanização resulta em liberação excessiva desses elementos no sistema fluvial, onde são possivelmente bioacumulados e até mesmo biomagnificados pela cadeia alimentar provocando efeitos nocivos para saúde humana e todo o ecossistema (GARCIA et al., 2017). Ao persistir no sistema aquático, a concentração do MPT é
gradualmente aumentada e consequentemente absorvida pelos organismos e/ou no sedimento (RODRIGUES e FORMOSO, 2006).
Nesse contexto, a poluição dos ambientes aquáticos é um dos graves problemas ambientais do mundo. Diferentes classes de contaminantes, como substâncias inorgânicas (metais tóxicos, ácidos e sais), compostos orgânicos (solventes orgânicos, combustíveis fósseis, pesticidas, etc.), ânions e cátions (fosfato, nitratos, sulfatos, Mg2+, Ca2+ e F-), solúveis em água, substâncias radioativas e microorganismos patogênicos (bactérias, vírus e protozoários) são considerados poluentes comuns de ambientes aquáticos (AHMAD et al., 2014).
Conforme Varol (2011), os metais são introduzidos nos sistemas fluviais pelos seguintes principais caminhos: fontes naturais (vulcanismo, erosão, atividades de bactérias, processos de intemperismo) e entradas exógenos (industrial processamento, mineração e outros efluentes de descarga). A fim de diferenciar a influência de fontes naturais e de metais, vários índices como fator de enriquecimento (EF), índice de geoacumulação (IGEO), grau de contaminação (CD), e o índice de carga da poluição (PLI) são amplamente aplicados na área de estudo.
Barros et al. (2009) afirmam que os altos índices de toxicidade de alguns metais para os organismos, mesmo em baixas concentrações, associados à sua relativa facilidade de entrar e permanecer nas cadeias tróficas por longos períodos, reforça a importância de estudos que determinem suas concentrações em ambientes aquáticos. De acordo coma Resolução CONAMA 430 de 13 de maio de 2011 os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser lançados diretamente no corpo receptor desde que obedeçam às concentrações de metais potencialmente tóxicos, no caso do Pb2+ total é 0,5 mg L-1.
É importante compreender o comportamento desses compostos nos corpos hídricos, os quais recebem grande parte da descarga de metais, seja de origem antrópica ou por fontes naturais, sendo necessário entender as interações que elas apresentam com o meio, principalmente a especiação química. Além disso, a variação das condições ambientais pode remobilizar os metais que se concentram nos sedimentos de um rio ou de um reservatório permitindo, assim, a reentrada para a coluna d’água (SANTOS e SANTOS 2008).
Para Santos e Santos (2008), a maior parte dos contaminantes adsorvidos nos sedimentos não está prontamente disponível para os organismos aquáticos, embora a variação de algumas características físicas e químicas, como pH, salinidade, potencial redox e teores de quelatos orgânicos na água, podem provocar a remobilização para a fase aquosa. Segundo os autores, a maioria dos estudos enfoca apenas a adsorção de metais pesados nos sedimentos.
Porém, o lançamento para a coluna d’água do metal mobilizado através da desorção a partir de um sedimento poderia produzir efeitos ambientais sérios.
2.2 Chumbo
O chumbo (Pb 2+) é um metal cinza-azulado, de peso atômico 207,19u, baixo ponto de fusão (327,507ºC) e de ebulição (1717ºC). O coeficiente de expansão térmica é de 29x10- 6/ºC. Apresenta a propriedade de absorver radiações de ondas curtas, tais como, as emanações de rádio ou produzidas pelos raios-X (SILVA, 2001). As principais propriedades do Pb2+ são maciez, maleabilidade, ductilidade, pouca condutividade elétrica, alta densidade, resistência à corrosão e estabilidade química do ar, solo e água (OLIVEIRA, 2012).
Um dos metais mais tóxicos é o Pb2+ e não se tem conhecimento de nenhuma necessidade biológica deste metal, sendo que em níveis elevados, é letal para a maioria dos organismos vivos. Apesar de não ser um elemento essencial, é facilmente absorvido e acumulado em diferentes partes das plantas (OLIVEIRA, 2012). A absorção deste elemento é regulada pelo pH, tamanho de partículas e capacidade de troca de cátions dos solos (CTC), assim como pela exsudação e outras características físico-químicas. A absorção do solo para as raízes se dá através da membrana plasmática, provavelmente, por canais catiônicos, como os canais de cálcio (ROMEIRO et al., 2007).
O Pb2+ presente no solo pode causar efeitos diretos no desenvolvimento dos vegetais, comprometendo a germinação de sementes e o crescimento da planta, reduzindo a transpiração e a pressão osmótica da seiva celular, o potencial de água no xilema, o conteúdo de água, a absorção e o transporte de nutrientes minerais, e, além disso, tem sido reportado evidencias de que prejudica o desenvolvimento radicular (ALMEIDA et al., 2007).
Apesar dos efeitos do Pb2+no organismo vegetal, algumas espécies de plantas classificadas como hiperacumuladoras possuem a capacidade de acumular em seus tecidos altos teores deste metal, chegando a representar o Pb2+ 1% da biomassa seca. Estas espécies de plantas podem absorver de 50 a 100 vezes mais as quantidades de metais em comparação com outras plantas, e geralmente translocam, sequestram e degradam estes poluentes (LEE, 2013).
2.3 Macrófitas aquáticas e os Metais Potencialmente Tóxicos (MPT)
As macrófitas são plantas que habitam desde brejos até ambientes verdadeiramente aquáticos. Distribuem-se nos seguintes grupos: macrófitas aquáticas emersas; flutuantes;
submersas enraizadas; submersas livres. São consideradas plantas promissoras na descontaminação de ambientes aquáticos, pois elas apresentam características como habilidade
de acumular altas concentrações de metal, rápido crescimento e considerável estabilidade fisiológica, quando submetidas a altas concentrações. (ESTEVES, 1998).
Uma planta acumuladora deve ser capaz de retirar os íons do metal do seu metabolismo, depositando-os no vacúolo, removendo-os por bombeamento da célula ou ainda transformando-os em formas inócuas (BRITO, 1983). Algumas espécies vegetais aquáticas apresentam grande capacidade de concentrar metais tóxicos, podendo tolerar altas concentrações sem apresentar efeitos negativos no seu crescimento. Particularmente, as macrófitas aquáticas flutuantes livres desempenham papel importante na absorção de metais, pois são capazes de captar materiais suspensos na água por meio de seu sistema radicular, antes que esses se depositem no sedimento (MENDES et al., 2009).
Nesse contexto, as plantas que apresentam capacidade de acumular grandes quantidades de metais são conhecidas como plantas hiperacumuladoras. Assim, para uma planta ser classificada como tal, deve absorver e reter na parte aérea, ou seja, no caule e folhas, no mínimo, as seguintes concentrações de metais: 10 mg Kg-1 de Hg, 100 mg Kg-1 de Cd, 1000 mg Kg-1 de Pb, Cu, Co, Cr ou Ni, e 10000 mg Kg-1 de Zn e Mn (REEVES e BAKER, 1999).
Segundo Rodrigues et al. (2006), a tolerância a MPT é detectada quando uma planta é capaz de sobreviver em um ambiente com elevadas concentrações desses elementos, onde outras plantas não conseguiriam devido aos seus efeitos tóxicos. Essa capacidade pode ser adquirida ao longo do tempo, com o desenvolvimento de mecanismos de adaptação às condições estressantes do meio.
Os autores acrescentam que uma mesma planta pode apresentar diferentes formas de suportar a contaminação, sendo que as respostas podem variar de acordo com as características de cada espécie, com os elementos causadores do estresse e as condições específicas da área.
Nessa direção Espinoza-Quiñones et al., (2009) destacam que a captação de metais potencialmente tóxicos pelos sistemas radiculares das plantas aquáticas depende tanto do tipo de metal quanto da espécie de planta que o absorve. Embora os metais se acumulem preferencialmente nas raízes, foram relatadas alterações na concentração de pigmentos fotossintéticos, rendimento quântico e trocas gasosas em macrófitas expostas a metais. Assim, o conhecimento das espécies de macrófitas presentes naturalmente em uma determinada região, bem como a análise da concentração dos metais potencialmente tóxicos presentes nessas plantas são essenciais para direcionar futuros estudos no que se refere a aplicação de técnicas de fitorremediação(PAIVA et al., 2009; HARGUINTEGUY et al., 2013).
2.3.1 Eichhornia crassipes (Mart.) Solm
Eichhornia crassipes (Mart.) Solm são plantas aquáticas flutuantes da família Pontederiacea bastantes comuns em regiões de clima tropical. É usualmente conhecida como aguapé, camalote, murerê de Amazônia, jacinto de água, variando de acordo com a região em que é encontrada. São consideradas macrófitas aquáticas de forma biológica flutuante livre, com sistema de raízes fibrosas e com folhas de coloração verde escuras (OLIVEIRA, 2012).
Mede aproximadamente30 a 40 cm de comprimento, suas folhas possuem pecíolo esponjoso inflado que possibilita flutuação e as flores possuem pétalas em tons de lilás claro à azul escuro, utilizada como flor ornamental, encontrada em lagos e aquários (GANGULY; CHATTERJEE;
DEY, 2012).
Uma característica morfológica desta espécie está relacionada a epiderme composta por uma camada de células retangulares (circular para hexagonal), que conseguem absorver nutrientes e gases diretamente da água. A estrutura anatômica mais relevante deste vegetal é a presença de câmaras de ar e as passagens de gás nos rizomas, folhas e raízes (BRONZATO, 2016). Essas câmaras são grandes, normalmente regulares, com uma forma de circular para hexagonal, e proporcionam uma espécie de atmosfera interna para as plantas, além conferir a capacidade de flutuarem (MAHMOOD et al., 2005).
Malik (2007), relata que as plantas E. Crassipes (Mart.) Solms crescem sobre uma grande variedade de tipos de zonas úmidas e apresentam elevada taxa de crescimento em águas ricas em nutrientes (nitrogênio e fósforo). Além disso, são capazes de tolerar variações consideráveis de concentração de nutrientes, pH e temperatura. Em relação ao pH adequado da água de cultivo para o crescimento dessas plantas situa-se entre 6 e 8. Quanto à temperatura, a melhor faixa para o cultivo está entre 25 e 28ºC, embora esta macrófita tenha a capacidade sobreviver em uma ampla faixa de temperatura (SIMPSON e SANDERSON, 2002).
No que se refere à toxicidade em plantas como a E.crassipes, o Pb2+pode provocar vários sintomas, dentre os principais a inibição do crescimento radicular e da parte aérea, clorose e redução da área foliar (MALIK, 2007). Além disso, inibição da atividade de enzimas, mudança no padrão hormonal e alteração na permeabilidade das membranas, inibição da fotossíntese, devido a distúrbios em reações de transferência de elétrons, redução na taxa de respiração, perturbação na nutrição mineral e balanço hídrico (SHARMA & DUBEY, 2005).
Alguns mecanismos podem estar associados a tolerância da planta a metais potencialmente tóxicos. Dentre eles destacam-se: redução da disponibilidade do metal no solo ou na água, retenção do elemento tóxico nas raízes impedindo sua translocação para parte aérea,
imobilização do metal para a parte aérea, compartimentalização e biotransformação (ALMEIDA et al., 2007).
2.4 Remediação
A contaminação ambiental por metais potencialmente tóxicos (MPT) tem se tornou objeto de grande interesse, devido à incapacidade dos corpos hídricos de suportar a alta poluição provocada pela atividade antrópica intensa (ALVAREZ et al., 2002). Os MPT, diferentes dos poluentes orgânicos, persistem por muitos anos nos compartimentos aquáticos: sedimentos de fundo e em suspensão, em plantas ou peixes. Diversas estratégias têm sido adotadas objetivando a remediação de solos e ambientes aquáticos contaminados por MPT e, assim, possibilitar o retorno da funcionalidade e estabilidade do ecossistema (MISHRA e TRIPATHI, 2008).
Uma técnica in situ que faz uso de organismos vivos é a fitorremediação em que as plantas são utilizadas para estabilizar ou para remover metais do solo ou da água contaminada por meio de diferentes mecanismos: A fitoextração, processo iniciado quando ocorre a remoção dos contaminantes do solo e posterior retenção no tecido vegetal. É a forma de fitorremediação mais estudada, onde as plantas extraem os MPT (ou outros poluentes) e os acumulam nos tecidos. A remoção desses contaminantes do meio se dá com a colheita das plantas, podendo as mesmas serem utilizadas posteriormente para fins não alimentares, como produção de energia, sendo chamadas de hiperacumuladoras de MPT as plantas que se destacam nesse processo (RODRIGUES et al., 2016); a fitotransformação, é uma técnica pode ser aplicada tanto no tratamento da água quanto no solo, na qual o metabolismo da planta atua na degradação dos contaminantes; já a fitoestimulação é um mecanismo, onde a estimulação da atividade dos microrganismos degradadores dos contaminantes ocorre na rizosfera da planta; e fitoestabilização, é a técnica onde as plantas são utilizadas para reduzir a migração dos contaminantes no solo. (JACQUES et al., 2007).
A fitorremediação tem por base a fisiologia vegetal, a bioquímica do solo e a química dos contaminantes, promovendo a reabilitação da estrutura e da ecologia do solo (MERKL et al., 2006), aumentando a quantidade de carbono orgânico, a porosidade e a infiltração da água no solo e reduzindo a erosão.
As plantas que apresentam tais características supracitadas atuam direta ou indiretamente na remediação ambiental por meio de diferentes mecanismos básicos (AKEN, CORREA & SCHNOOR, 2010), como mostrados na Figura 1, os quais conferem capacidade de: a)‘sequestro’ e acúmulo de contaminantes inorgânicos tóxicos (ex.: metais) nos tecidos
vegetais, particularmente em vacúolos (fitoextração) (1 A e B); b) absorção e, às vezes, precipitação de contaminantes encontrados em águas poluídas (rizofiltração) (1 A); c) degradação de contaminantes orgânicos, com transformação dependente das enzimas nos tecidos vegetais ou na superfície das raízes (fitotransformação) (1 A); d) volatilização de contaminantes extraídos do solo e do lençol freático (fitovolatilização) (1 A); e) estabelecimento de condições favoráveis à atividade microbiana da rizosfera no solo, promovendo a biodegradação dos contaminantes pelos microrganismos (rizodegradação) (1 A).
O metabolismo de plantas que removem ou são tolerantes aos compostos xenobióticos (metais potencialmente tóxicos, petróleo, fenóis, etc) de acordo com o proposto por AKEN, CORREA & SCHNOOR (2010) e demonstrado na figura 1 B, é representado como sendo um sistema trifásico, onde a fase I consiste na oxidação de compostos xenobióticos via oxidação e formação de produtos hidroxilados caracterizado pela maior solubilidade e reatividade; fase II envolve compostos de conjugação da fase I com moléculas de origem vegetal (por exemplo, a glutationa ou aminoácidos) formando moléculas menos tóxicas e mais solúveis do que os compostos xenobióticos e por fim a fase III a qual envolve o sequestro dos conjugados em organelas vegetais (por exemplo, vacúolo) ou incorporação em estruturas da planta (por exemplo, parede celular).
Figura 1 - A - Fitorremediação de poluentes orgânicos envolvendo vários processos: poluentes no solo e águas subterrâneas podem ser absorvidos pelos tecidos vegetais (fitoextração) ou adsorvidos pelas raízes (rizofiltração); poluentes no interior dos tecidos de plantas podem ser transformados pelas enzimas (fitotransformação) ou podem volatilizar para a atmosfera (fitovolatilização); poluentes no solo podem ser degradados por microrganismos na zona de raiz (rizodegradação). B – Rota hipotética do metabolismo durante o acúmulo de contaminantes do solo: fase 1; ativação do metabolismo via hidroxilação; a fase II: conjugação com uma molécula de planta (açúcar) e fase III: seqüestro e conjugação dentro do vacúolo ou parede celular.
Fonte: AKEN, CORREA & SCHNOOR (2010).
Dessa forma, são vários os mecanismos de descontaminação englobados pelas técnicas da biorremediação e fitorremediação na recuperação de áreas contaminadas. Ambas têm sido estudadas nas condições brasileiras e tem mostrado grande potencial, devido à grande biodiversidade e ao clima do Brasil, que favorecem os processos biológicos no tratamento da poluição, o que amplia as possibilidades de utilização das mesmas (COUTINHO et al., 2015).
2.5Substâncias húmicas e a interação com metais potencialmente tóxicos
A matéria orgânica (MO) presente nos solos, turfas e sedimentos consiste em uma mistura de produtos, em vários estágios de decomposição, resultantes da degradação química e biológica de resíduos vegetais e animais, e da atividade da síntese de microorganismos. Os componentes da (MO) são húmus, substâncias húmicas (SH) e substâncias não húmicas (ROCHA e ROSA, 2003). A base da diferenciação é que as substâncias não húmicas são de natureza definida, como aminoácidos, carboidratos, proteínas e ácidos orgânicos, já as substâncias húmicas originam-se da degradação química e biológica de resíduos orgânicos e da atividade sintética da biota do solo.
As SH apresentam coloração escura, elevada massa molecular, estrutura complexa e indefinida. Além disso, constituem o produto final de decomposição de resíduos orgânicos e
representam o principal componente da matéria orgânica em água, solos e sedimentos (CANELLAS et al., 2006). Quando os materiais orgânicos frescos chegam ao solo, os microorganismos formam biofilmes e sintetizam seu complexo enzimático, para iniciarem a decomposição do novo substrato. A matéria orgânica fresca, em um ecossistema, pode ser representada pela serrapilheira ou liteira, comumente designada horizonte O. Abaixo do O está o horizonte A (BALDOTTO e BALDOTTO, 2014).
Muitas são as teorias sobre a formação das SH, as primeiras descreviam as SH como produtos poliméricos derivados da degradação de carboidratos, ligninas, proteínas e gorduras em diferentes estágios de decomposição (STEVENSON 1982). Já Malcolm (1990) afirma que a lignina não é o principal precursor de substâncias húmicas de solos. Outra teoria defende que em vez de serem polímeros macromoleculares, as SH são associações supramoleculares de moléculas heterogêneas, unidas por ligações fracas adjacentes a sítios hidrofóbicos e hidrofílicos de grandes moléculas (PICOLLO et al., 2000).
Nesse sentido, a formação das SH se dá por inúmeros mecanismos e rotas bioquímicas, que são mais ou menos atuantes de acordo com a quantidade do substrato orgânico e das condições químicas e/ou bioquímicas do meio onde se processam essas reações (STEVENSON, 1982). Logo, o processo de formação das SH a partir das substâncias orgânicas que entram ou se formam dentro do solo acontece de forma contínua e pode ser qualificado como reversível quando enfocado a distância. Uma vez que as substâncias húmicas formadas se degradam ao longo do tempo, o processo é recomeçado da biossíntese de novas substâncias orgânicas, aos quais ao seguir um ciclo de permanência nos sistemas biológicos são excretadas e depositadas no solo formando SH novamente (PÉREZ e SAVICH, 2005).
A matéria orgânica humificada no solo apresenta-se como um continuum indissociável de compostos de carbono que vão desde os encontrados em células vivas até biomacromoléculas pouco ou muito transformada. No entanto, é possível separar distintas frações com base em aspectos químicos, entre eles, solubilidade, densidade e massa molar (CUNHA et al., 2005). De modo geral, é aceito a distribuição operacional das frações humificadas em três categorias: as huminas (Hu) que representam a matéria orgânica intimamente ligada à fração mineral do solo, e por isso insolúvel; os ácidos fúlvicos (AF), que apresentam grande quantidade de grupamentos funcionais oxigenados e são solúveis tanto em meio ácido como básico, e os ácidos húmicos (AH), insolúveis em meio fortemente ácido, pois, com a protonação dos grupamentos funcionais ocorre o colapso da estrutura e precipitação das macromoléculas (CANELLAS et al., 2001).
A maior parte do carbono orgânico da superfície do planeta encontra-se na matéria orgânica humificada, ou seja, nas SH. Além de fornecer nutrientes para as plantas por meio da mineralização (transformação das formas orgânicas dos elementos em formas iônicas através da ação das enzimas dos microrganismos), as SH também podem estimular diretamente o desenvolvimento e o metabolismo das plantas através de mecanismos ainda não totalmente elucidados (OLIVEIRA, 2011).
Silva et al. (2006), enfatizam que a matéria orgânica participa ativamente na imobilização dos metais potencialmente tóxicos, mesmo quando em pequena quantidade no solo, pela presença das cargas negativas e pela alta área superficial específica que pode chegar a 800-900 m2 g-1. Dessa forma, a matéria orgânica cria cargas negativas em pH relativamente baixo, fazendo com que a matéria orgânica seja a principal fonte de cargas elétricas negativas nos solos tropicais, onde predominam minerais do tipo 1:1 (MEURER et al, 2006).
Dessa forma, a afinidade da matéria orgânica pelos metais potencialmente tóxicos manifesta-se pela exposição de sítios de adsorção (COSTA et al., 2006). As cargas negativas podem formar ligações não especificas com alguns cátions do solo, principalmente com Ca+2, Mg+2 e K+ ou adsorver especificamente metais de transição como Zn+2, Cu+2, Mn+2 e Co+2, sendo que quando essa ligação ocorre em dois ou mais pontos da molécula orgânica, forma-se um complexo metálico, geralmente conhecido como quelato (CAMARGO et al., 2001).
Assim, a complexação de íons metálicos pelas SH pode reduzir a atividade dos metais potencialmente tóxicos na solução do solo, atenuando sua capacidade de produzir efeitos tóxicos ou de contaminar águas superficiais e subterrâneas (CAMARGO et al., 2001). De maneira geral, os ácidos fúlvicos (baixo peso molar) formam complexos estáveis com esses, que são em geral solúveis, tornando mais disponíveis às plantas, enquanto os formados com ácidos húmicos são insolúveis, tornando os metais mais imobilizados (JÚNIOR, 2014).
A interação dos MPT com as SH é influenciada por algumas variáveis dentre elas: carga e heterogeneidade química do material húmico. Além disso, depende da força iônica, podendo ser descrito empiricamente pela seletividade da função ligante (SÁNCHEZ-MARÍN, 2007).
Tais interações podem acontecer através de adsorção, reações de troca catiônica e por complexação. Esta, por sua vez, é a mais importante, pois afetam profundamente a geoquímica dos íons metálicos, modificando a sua solubilidade, carga e potencial redox. Além disso, influenciam a biodisponibilidade, transporte e migração dos metais nos ecossistemas aquáticos.
(STUMM e MORGAN, 1996).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Caracterização da área de coleta do material vegetal
Os indivíduos de Eichhornia crassipes (Mart) Solm foram coletadas no Lago da Perucaba (Fig. 2), situado no município de Arapiraca com Latitude: 9º 45’ 6” Sul e Longitude: 36º 39’
37” Oeste (PREFEITURA MUNICIPAL DE ARAPIRACA, 2015). Situado em área urbana e com extensão aproximada de 1,5 km, o lago recebe aporte de contaminantes, entre esses se destacam os metais, podendo ser de origem antrópica, principalmente por meio de atividades domésticas (PORTAL ARAPIRACA, 2018).
Figura 2 – Local de coleta dos indivíduos de Eichhornia crassipes (Lago da Perucaba, Arapiraca– AL).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
As plantas foram coletadas em diferentes tamanhos para a execução dos experimentos, de acordo com cada ensaio experimental. A coleta foi realizada em três pontos da lagoa:
margem e uma distância média de 5m e 10 m da margem (Fig 3) e acondicionadas em bacias de polietileno para o transporte até a Universidade Federal de Alagoas (UFAL), Campus Arapiraca. As plantas foram selecionadas quanto a uniformidade de tamanho e número de folhas para a montagem do experimento (Fig 4).
No momento da coleta das plantas, a água da lagoa também foi coletada para as análises físico-químicas e para a determinação do teor total de metais, conforme metodologias que serão descritas no decorrer do trabalho.
Figura 3 – Pontos de coleta das plantas Eichhornia crassipes no Lago da Perucaba – Arapiraca/AL. (vermelho:
bordadura; amarelo: 5m da bordadura; azul: 10 m da bordadura.
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
Figura 4 - Padronização das plantas quanto ao tamanho (A) e número de folhas (B).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
A B
3.2 Condução dos ensaios experimentais
Os experimentos foram desenvolvidos na UFAL, Campus Arapiraca, localizada na região Agreste de Alagoas, com latitude 09° 48’ 40,3’’ Sul e Longitude 36° 37’ 19,7’’ Oeste, altitude de 245 m. Esta região é de transição entre a Zona da Mata e o Sertão Alagoano, cujo clima é classificado como tropical com estação seca de Verão, pelo critério de classificação de Köeppen. Após selecionadas, as plantas foram lavadas em água corrente e descontaminadas em solução a 2% de hipoclorito de sódio por cinco minutos. Em seguida, foram lavadas novamente para retirada de qualquer resíduo.
Os experimentos foram desenvolvidos em dois ensaios experimentais, conduzidos em casa de vegetação (80,03 W m-2) com estrutura de tela antiofídica, aluminete e filme agrícola.As análises foram realizadas nos Laboratórios de Ciências Ambientais do Agreste (LCAA) e Fisiologia Vegetal (LABFIVE).
3.3 Coleta das substâncias húmicas de Turfa
As amostras de turfas foram coletadas no município de Ribeirão Preto – SP (na região do Rio Mogi, com profundidade de 50 cm, secas ao ar e peneiradas em malha de 2mm. As SH foram coletadas e extraídas por Botero et al., (2014) de acordo com o procedimento recomendado pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas – IHSS utilizando NaOH 0,1 mol L-1 numa razão 1:10 como turfa:extrator em atmosfera inerte. Em seguida a massa correspondente a cada dose de SH foi solubilizada utilizando solução básica durante 4h sob agitação (Fig. 5 A) de 20 rpm (BOTERO et al., 2014). A solução para o cultivo das plantas teve seu pH ajustado para 6,0 (Fig.5 B).
Figura 5 – Solubilização das amostras de substâncias húmicas em mesa agitadora, conforme recomendado pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas - IHSS (A) e ajuste do pH da solução para cultivo das plantas Eichhornia crassipes, conforme recomendado pela literatura (B).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.4 Caracterização das Substâncias Húmicas
As amostras das substâncias húmicas foram caracterizadas por Botero et al., (2014) quanto à análise elementar (C, H, N, O, S) em equipamento Thermo Finingan Flash EA1112 nas melhores condições sugeridas pelo fabricante. A razão H/C está relacionada com o grau de aromaticidade das SH, isto é, quanto menor a razão H/C, maior o grau de aromaticidade das SH. Elevados valores dessa razão indicam menor grau de humificação, devido à diminuição nos teores de carboidratos.
3.5 Ensaio I: seleção da dose resposta de substâncias húmicas em plantas Salvínia sp.
Cinco plantas padronizadas e identificadas (Fig.6) foram conduzidas por 48 h a solução nutritiva de Norris (VINCENT, 1970) a 10% da força iônica antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos controle (solução nutritiva); 25 mg L-1; 50 mg L-1; 100 mg L-1; 200 mg L-1 e 400 mg L-1de SH. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com cinco repetições por tratamento. As doses foram determinadas a partir da massa de SH e selecionada a dose-resposta para avaliar o efeito das SH na absorção de Pb2+em ensaio posterior.
As avaliações de comprimento de raiz ocorreram ao 1º dia após aplicação do tratamento (DAT), ao 10º DAT e ao 15º DAT (Fig. 7).
Figura 6 - Padronização das plantas (A) e identificação (B) para seleção da dose resposta de substâncias húmicas
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
B
A
Figura 7 - Análise do comprimento da raiz (CR) das plântulas ao 1º DAT (A), ao 10 º DAT (B) e ao 15 º DAT (C).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.6Ensaio II: exposição das plantas Eichhornia crassipes a diferentes concentrações de Pb2+na presença e ausência de substâncias húmicas.
O segundo ensaio foi conduzido com indíviduos de Eichhornia crassipes (Mart.) Solms em vasos de polietileno contendo 3L de solução nutritiva comercial Hidrogood Fert da empresa (Horticultura Moderna), em um sistema de aeração artificial em casa de vegetação três dias antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos, constituído de concentrações crescentes de Pb2+ [0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 mg L -1 de Pb(NO3)2] e o controle (apenas solução nutritiva) na presença e ausência da dose de SH selecionada no ensaio I. As concentrações de Pb2+
utilizadas nos diferentes tratamentos foram determinadas com base no valor máximo permitido (VPM) de Pb2+ total para lançamento de efluentes em corpos de água doce estabelecidas com base na Resolução nº 430 de 13 de maio de 2011 que dispõe sobre as condições e padrões de lançamento de efluentes.
A solução nutritiva possui em sua composição todos os macronutrientes necessários para o cultivo da espécie Nitrogênio (N), Fósforo (P), Potássio (K), Magnésio (Mg), Enxofre (S) e micronutrientes Boro (B), Cobre (Cu), Molibdênio (Mo), Manganês (Mn) e Zinco (Zn). Os macronutrientes são requeridos em maiores quantidades pelas plantas principalmente devido ao fato deles constituírem parte de moléculas essenciais para o vegetal, isto é, possuem uma função estrutural. No que se refere aos micronutrientes estão mais relacionados à ativação de certas enzimas, desempenhando uma função regulatória (OLIVEIRA, 2012). O pH da solução foi ajustado para 6,0 seguindo recomendações de um estudo desenvolvido por Gomes (2016).
O delineamento experimental adotado foi em blocos casualizados em esquema fatorial 2 (substância húmica e controle) x6 (concentrações de Pb2+) em cinco blocos. A parcela experimental foi constituída de um vaso com uma planta (Fig.8). O pH e a condutividade da solução para cultivo das plantas foram medidos durante todo o período experimental (28 dias
B C A
de exposição ao Pb2+). O volume da solução foi completado, diariamente, com água deionizada a fim de compensar a perda de volume por absorção, transpiração e evaporação.
Figura 8 - Plantas submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ em casa de vegetação UFAL –Campus Arapiraca (A e B).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.7 Análise físico-química das amostras de água
A amostra da água coletada no momento da coleta das plantas foi diluída (2:1) e em seguida determinado, o pH, a condutividade, a temperatura utilizando um pHmetro (HI 8314 HANNA instruments), um condutivímetro (modelo HI 8730 HANNA instruments) e um termômetro com coluna de mercúrio, respectivamente.
3.8 Determinação dos teores Pb2+ em água de cultivo e em plantas Eichhornia crassipes 3.8.1 Digestão de amostras de água do Lago da Perucaba
Transferiu-se 100 mL da amostra da água para ernlenmeyer e adicionado 4 mL de HNO3
65 % (m/v) sob o aquecimento de 130ºC em mesa aquecedora modelo Fisatom. A análise foi realizada em duplicata para cada amostra (Fig.9). Durante o procedimento 10 mL de H2O2 30%
(m/v) foram adicionados gota a gota, até completa digestão. Para o branco da análise foi repetido esse mesmo procedimento sem adição da amostra. Após o resfriamento das amostras, estas foram transferidas para balões volumétricos de 50 mL, completando-se o volume com
A B
água deionizada. Em seguida, o filtrado límpido foi transferido para frascos graduados (tubos tipo falcon), suficiente para determinação de metais (adaptado de BOTERO, 2009).
Figura 9 - Amostras de água do Lago da Perucaba em chapa aquecedora para digestão.
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.8.2 Digestão do material vegetal
Ao final do período experimental, as plantas foram separadas em diferentes partes (raiz, caule e folha) e em seguida foram submetidas a secagem em estufa de circulação forçada a 65ºC até atingirem a massa seca constante. Em seguida, o material seco foi triturado em moinho de facas tipo Willye (Fig. 10). A digestão do material foi realizada em duplicata para cada amostra utilizando 1g de material seco adicionando 8 mL de HNO3 a 65 % (m/v) em ernlenmeyer, deixando em repouso por aproximadamente 5h para uma prévia digestão.
Em seguida, as amostras foram colocadas em chapa aquecedora a 130ºC permanecendo nessa temperatura até cessar total de NO2 (vapor castanho). Durante o processo foram adicionados 20 mLdeH2O2 a 30% (m/v) gota a gota, até completa digestão. Para o branco da análise foi repetido esse mesmo procedimento sem adição da amostra. Após o resfriamento das amostras, estas foram transferidas para balões volumétricos de 50 mL, completando-se o volume com água deionizada. Em seguida, o filtrado límpido foi transferido para frascos graduados (tubos tipo falcon), suficiente para determinação de metais (Adaptado de CARMEN et al., 2000).
Figura 10 - Material vegetal moído em moinho de facas.
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.8.3 Determinação do teor de Pb2+ nas amostras de água e material vegetal
A determinação dos teores de Pb2+foi realizada com o auxílio de um potenciostato PGSTAT10 (Autolab Ecochemie) controlado pelo software GPES 4.9 em conjunção com um stand 663VA Metrohm. A célula eletroquímica consiste de um sistema de três eletrodos, sendo o eletrodo de trabalho um filme fino de Hg depositado na superfície de um eletrodo de carbono vítreo de disco rotatório (Hg-C), um eletrodo de carbono vítreo como contra-eletrodo e um eletrodo de Ag/AgCl como referência. Todas as médias serão realizadas em solução de NaNO3
0,01 mol L-1. A determinação do teor de Pb2+ após digestão nas amostras de água e material vegetal foi realizada por voltametria de onda quadrada (VOQ).
3.8.3.1 Eletrodo de trabalho
Foi realizada uma verificação da superfície do eletrodo impresso com uma solução NH4CH3COO (1 mol L-1)/HCl (0,5 mol L-1) e voltametria cíclica (50 ciclos) entre os potenciais -0,8 e + 0,8 V e velocidade de varredura de 0,1 V s-1. Para a deposição do filme fino de mercúrio foi utilizado Hg (II) 1,25x10-4 mol L-1 (pH 1,9) por eletrodeposição a - 1,3 V para diferentes
deposições (180, 240 ou 360 s) e uma taxa de rotação de 1000 rpm.A carga associada ao mercúrio depositado (QHg) foi calculada pela integração eletrônica do pico de remoção linear de mercúrio, para v = 0,005 V s1. A solução eletrolítica foi o tiocianato de amônio 5 mM (pH 3,4 (ROCHA, 2007). Após a deposição, segue automaticamente com varredura entre - 1,3 e + 0,3 V para verificar o perfil da formação do filme. Ao final de cada experimento, o filme era removido por varredura linear de redissolução utilizando taxa de varredura 0,005 V s-1 entre - 0,15 e +0,4 V em 5 mmol L-1 de NH4SCN (pH 3,4) e determinada a carga associada com o Hg depositado (QHg) por integração do pico.
3.8.3.2 Calibração e determinação de Pb2+ nas amostras
A determinação do Pb2+ nas amostras foram realizadas por voltametria de onda quadrada com os seguintes parâmetros:1mL das amostras para análise diluído em 9 mLde água deionizada em atmosfera inerte (N2), para evitar oxidação do metal pelo O2. A curva de calibração foi feita com NaNO3 0,1 mol L-1 com as concentrações de Pb 2+ (1 10-4; 2 10 -4 e 4 10-4) em triplicata em cada ponto da curva. A determinação do Pb2+ nas amostras de água e material vegetal foram realizadas nas mesmas condições da curva de calibração, após purga de N2 no sistema e diluição para quantificação do Pb2+.
3.9Análises de crescimento e massa seca
A altura da planta foi determinada em cm, adotando-se, como critério, a distância entre o colo da planta e a extremidade do meristema apical do ramo principal com uso de uma régua milimétrica. Aos 28 dias as plantas foram coletadas e as partes separadas para determinação da massa da raiz e massa da parte aérea seca. Ambos os materiais foram acondicionados em sacos de papel, devidamente identificados, e levados à estufa de circulação forçada de ar a 65 °C, até peso constante.
3.10 Aspectos visuais das plantas Eichhornia crassipes expostas ao Pb2+
Foram realizados registros fotográficos das plantas expostas às diferentes concentrações de Pb2+ ao 1º DAT, ao 15º DAT, ao 20º e ao 28º DAT do experimento, utilizando-se câmera de celular iphone modelo 7 red com resolução de 13 x 750 pixels.
4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico SISVAR®, versão 5.6 (FERREIRA, 2014). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo Teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05) e ajustadas por meio de regressão linear ou polinomial (p≤5%). Para construção dos gráficos foi utilizado o software ORIGIN9.0.0.87e as tabelas foram organizadas utilizando o software Excel® 16.0.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterizações das amostras de substâncias húmicas de turfa
As razões atômicas obtidas pelo resultado da análise elementar forneceram informações sobre as características estruturais das substâncias húmicas (SH) das amostras de turfa. A razão H/C está relacionada com o grau de aromaticidade das SH, isto é, quanto menor a razão H/C, maior o grau de aromaticidade das SH (BOTERO, W.G, 2010). Também, um aumento no conteúdo de hidrogênio indica um maior número de carbonos alifáticos (CH2) do que carbonos insaturados (CH2=CH2).
O valor obtido para a razão atômica H/C está similar ao relatado na literatura (Tabela 1) (ZACCONE et al. 2007). A razão atômica O/C está relacionada com os teores de carboidratos das SH. Sendo assim, elevados valores dessa razão indicam menor grau de humificação, devido à diminuição nos teores de carboidratos. A amostra em estudo apresenta um menor número de grupos oxigenados.
Tabela 1 - Resultados das caracterizações para amostras de substâncias húmicas (SH) de turfa pelas razões atômicas H/C e C/O, teor de grupos funcionais e razão E4/E6.
Parâmetro Amostras
Substâncias húmicas de turfa H/C 1,16
C/O 0,81 Alifático (%) 23,7 Éter (%) 4,2 Aromático (%) 61,6 Carbolíxicos, éteres 10,5 e amida (%)
E4/E6 3,47
Fonte: BOTERO W.G, 2010.
Dessa forma, a razão E4/E6 é um importante indicativo do grau de condensação da macromolécula húmica que geralmente está associada à sua aromaticidade. O aumento da razão indica estrutura com menor aromaticidade e a diminuição da razão maior aromaticidade. De acordo com a literatura, razões menores que 4 indicam maior presença de estruturas aromáticas condensadas, e valores maiores que 4, presença de poucas estruturas aromáticas condensadas (ROSA et al. 2000).
5.2 Avaliação do efeito das substâncias húmicas no comprimento da raiz (CR) e massa seca de plantas Salvínias sp para seleção da dose-resposta.
Por meio da análise de variância observou-se efeito significativo das doses de SH para o comprimento da raiz (CR) apenas aos 10º DAT, isto é, não houve diferença estatística aos 15º DAT para esta variável. Em relação as variáveis, massa seca da raiz (MSR) massa seca da parte aérea (MSPA) não houve diferença estatística entre as doses de SH para nenhuma das datas avaliadas (Tabela 2).
Tabela 2 - Resumo da análise variância e médias do comprimento de raiz (CR), massa seca da raiz (MSR) e massa seca da parte aérea (MSPA) de plantas Salvínias sp aos 10 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes doses de substâncias húmicas.
Fonte de Variação GL Soma dos Quadrados Médios
CR MSR MSPA
Dose 5 1,56* 0,0009 NS 0,0011NS
Rep 4 0,37 0,0 002 NS 0,0001NS
Regressão Linear 1 2,57* 0,0010 NS 0,0000NS Regressão Quadrática 1 1,30NS 0,0000 NS 0,0000NS
Regressão Cúbica 1 3,76* 0,0028** 0,0037 NS
Desvio Regressão 2 0,01NS 0,0048
Resíduo 19 0,44 0,0003NS 0,0009NS
CV (%) 17,82 19,38 17,88
Médias (cm)
Dose 1 (Controle) 2,43 0,04 0,03
Dose 2 (25 mg L-1) 3,07 0,04 0,07
Dose 3 (50 mg L-1) 3,44 0,04 0,06
Dose 4 (100 mg L-1) 3,52 0,05 0,06
Dose 5 (200 mg L-1) 2,56 0,02 0,04
Dose 6 (400 mg L-1) 2,15 0,02 0,05
* e ** significativo a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente, NS não significativo.
Em relação ao comprimento da raiz observou-se efeito crescente até a dose 100 mg L-1, a partir desta ocorreu um decréscimo indicando que as doses 200 e 400 mg L-1 não influenciaram significativamente a variável analisada (Fig.11).
