Os experimentos foram desenvolvidos na UFAL, Campus Arapiraca, localizada na região Agreste de Alagoas, com latitude 09° 48’ 40,3’’ Sul e Longitude 36° 37’ 19,7’’ Oeste, altitude de 245 m. Esta região é de transição entre a Zona da Mata e o Sertão Alagoano, cujo clima é classificado como tropical com estação seca de Verão, pelo critério de classificação de Köeppen. Após selecionadas, as plantas foram lavadas em água corrente e descontaminadas em solução a 2% de hipoclorito de sódio por cinco minutos. Em seguida, foram lavadas novamente para retirada de qualquer resíduo.
Os experimentos foram desenvolvidos em dois ensaios experimentais, conduzidos em casa de vegetação (80,03 W m-2) com estrutura de tela antiofídica, aluminete e filme agrícola.As análises foram realizadas nos Laboratórios de Ciências Ambientais do Agreste (LCAA) e Fisiologia Vegetal (LABFIVE).
3.3 Coleta das substâncias húmicas de Turfa
As amostras de turfas foram coletadas no município de Ribeirão Preto – SP (na região do Rio Mogi, com profundidade de 50 cm, secas ao ar e peneiradas em malha de 2mm. As SH foram coletadas e extraídas por Botero et al., (2014) de acordo com o procedimento recomendado pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas – IHSS utilizando NaOH 0,1 mol L-1 numa razão 1:10 como turfa:extrator em atmosfera inerte. Em seguida a massa correspondente a cada dose de SH foi solubilizada utilizando solução básica durante 4h sob agitação (Fig. 5 A) de 20 rpm (BOTERO et al., 2014). A solução para o cultivo das plantas teve seu pH ajustado para 6,0 (Fig.5 B).
Figura 5 – Solubilização das amostras de substâncias húmicas em mesa agitadora, conforme recomendado pela Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas - IHSS (A) e ajuste do pH da solução para cultivo das plantas Eichhornia crassipes, conforme recomendado pela literatura (B).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.4 Caracterização das Substâncias Húmicas
As amostras das substâncias húmicas foram caracterizadas por Botero et al., (2014) quanto à análise elementar (C, H, N, O, S) em equipamento Thermo Finingan Flash EA1112 nas melhores condições sugeridas pelo fabricante. A razão H/C está relacionada com o grau de aromaticidade das SH, isto é, quanto menor a razão H/C, maior o grau de aromaticidade das SH. Elevados valores dessa razão indicam menor grau de humificação, devido à diminuição nos teores de carboidratos.
3.5 Ensaio I: seleção da dose resposta de substâncias húmicas em plantas Salvínia sp.
Cinco plantas padronizadas e identificadas (Fig.6) foram conduzidas por 48 h a solução nutritiva de Norris (VINCENT, 1970) a 10% da força iônica antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos controle (solução nutritiva); 25 mg L-1; 50 mg L-1; 100 mg L-1; 200 mg L-1 e 400 mg L-1de SH. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com cinco repetições por tratamento. As doses foram determinadas a partir da massa de SH e selecionada a dose-resposta para avaliar o efeito das SH na absorção de Pb2+em ensaio posterior.
As avaliações de comprimento de raiz ocorreram ao 1º dia após aplicação do tratamento (DAT), ao 10º DAT e ao 15º DAT (Fig. 7).
Figura 6 - Padronização das plantas (A) e identificação (B) para seleção da dose resposta de substâncias húmicas
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
B
A
Figura 7 - Análise do comprimento da raiz (CR) das plântulas ao 1º DAT (A), ao 10 º DAT (B) e ao 15 º DAT (C).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.6Ensaio II: exposição das plantas Eichhornia crassipes a diferentes concentrações de Pb2+na presença e ausência de substâncias húmicas.
O segundo ensaio foi conduzido com indíviduos de Eichhornia crassipes (Mart.) Solms em vasos de polietileno contendo 3L de solução nutritiva comercial Hidrogood Fert da empresa (Horticultura Moderna), em um sistema de aeração artificial em casa de vegetação três dias antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos, constituído de concentrações crescentes de Pb2+ [0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 mg L -1 de Pb(NO3)2] e o controle (apenas solução nutritiva) na presença e ausência da dose de SH selecionada no ensaio I. As concentrações de Pb2+
utilizadas nos diferentes tratamentos foram determinadas com base no valor máximo permitido (VPM) de Pb2+ total para lançamento de efluentes em corpos de água doce estabelecidas com base na Resolução nº 430 de 13 de maio de 2011 que dispõe sobre as condições e padrões de lançamento de efluentes.
A solução nutritiva possui em sua composição todos os macronutrientes necessários para o cultivo da espécie Nitrogênio (N), Fósforo (P), Potássio (K), Magnésio (Mg), Enxofre (S) e micronutrientes Boro (B), Cobre (Cu), Molibdênio (Mo), Manganês (Mn) e Zinco (Zn). Os macronutrientes são requeridos em maiores quantidades pelas plantas principalmente devido ao fato deles constituírem parte de moléculas essenciais para o vegetal, isto é, possuem uma função estrutural. No que se refere aos micronutrientes estão mais relacionados à ativação de certas enzimas, desempenhando uma função regulatória (OLIVEIRA, 2012). O pH da solução foi ajustado para 6,0 seguindo recomendações de um estudo desenvolvido por Gomes (2016).
O delineamento experimental adotado foi em blocos casualizados em esquema fatorial 2 (substância húmica e controle) x6 (concentrações de Pb2+) em cinco blocos. A parcela experimental foi constituída de um vaso com uma planta (Fig.8). O pH e a condutividade da solução para cultivo das plantas foram medidos durante todo o período experimental (28 dias
B C A
de exposição ao Pb2+). O volume da solução foi completado, diariamente, com água deionizada a fim de compensar a perda de volume por absorção, transpiração e evaporação.
Figura 8 - Plantas submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ em casa de vegetação UFAL –Campus Arapiraca (A e B).
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.7 Análise físico-química das amostras de água
A amostra da água coletada no momento da coleta das plantas foi diluída (2:1) e em seguida determinado, o pH, a condutividade, a temperatura utilizando um pHmetro (HI 8314 HANNA instruments), um condutivímetro (modelo HI 8730 HANNA instruments) e um termômetro com coluna de mercúrio, respectivamente.
3.8 Determinação dos teores Pb2+ em água de cultivo e em plantas Eichhornia crassipes 3.8.1 Digestão de amostras de água do Lago da Perucaba
Transferiu-se 100 mL da amostra da água para ernlenmeyer e adicionado 4 mL de HNO3
65 % (m/v) sob o aquecimento de 130ºC em mesa aquecedora modelo Fisatom. A análise foi realizada em duplicata para cada amostra (Fig.9). Durante o procedimento 10 mL de H2O2 30%
(m/v) foram adicionados gota a gota, até completa digestão. Para o branco da análise foi repetido esse mesmo procedimento sem adição da amostra. Após o resfriamento das amostras, estas foram transferidas para balões volumétricos de 50 mL, completando-se o volume com
A B
água deionizada. Em seguida, o filtrado límpido foi transferido para frascos graduados (tubos tipo falcon), suficiente para determinação de metais (adaptado de BOTERO, 2009).
Figura 9 - Amostras de água do Lago da Perucaba em chapa aquecedora para digestão.
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.8.2 Digestão do material vegetal
Ao final do período experimental, as plantas foram separadas em diferentes partes (raiz, caule e folha) e em seguida foram submetidas a secagem em estufa de circulação forçada a 65ºC até atingirem a massa seca constante. Em seguida, o material seco foi triturado em moinho de facas tipo Willye (Fig. 10). A digestão do material foi realizada em duplicata para cada amostra utilizando 1g de material seco adicionando 8 mL de HNO3 a 65 % (m/v) em ernlenmeyer, deixando em repouso por aproximadamente 5h para uma prévia digestão.
Em seguida, as amostras foram colocadas em chapa aquecedora a 130ºC permanecendo nessa temperatura até cessar total de NO2 (vapor castanho). Durante o processo foram adicionados 20 mLdeH2O2 a 30% (m/v) gota a gota, até completa digestão. Para o branco da análise foi repetido esse mesmo procedimento sem adição da amostra. Após o resfriamento das amostras, estas foram transferidas para balões volumétricos de 50 mL, completando-se o volume com água deionizada. Em seguida, o filtrado límpido foi transferido para frascos graduados (tubos tipo falcon), suficiente para determinação de metais (Adaptado de CARMEN et al., 2000).
Figura 10 - Material vegetal moído em moinho de facas.
Fonte: Dados da pesquisa, 2017.
3.8.3 Determinação do teor de Pb2+ nas amostras de água e material vegetal
A determinação dos teores de Pb2+foi realizada com o auxílio de um potenciostato PGSTAT10 (Autolab Ecochemie) controlado pelo software GPES 4.9 em conjunção com um stand 663VA Metrohm. A célula eletroquímica consiste de um sistema de três eletrodos, sendo o eletrodo de trabalho um filme fino de Hg depositado na superfície de um eletrodo de carbono vítreo de disco rotatório (Hg-C), um eletrodo de carbono vítreo como contra-eletrodo e um eletrodo de Ag/AgCl como referência. Todas as médias serão realizadas em solução de NaNO3
0,01 mol L-1. A determinação do teor de Pb2+ após digestão nas amostras de água e material vegetal foi realizada por voltametria de onda quadrada (VOQ).
3.8.3.1 Eletrodo de trabalho
Foi realizada uma verificação da superfície do eletrodo impresso com uma solução NH4CH3COO (1 mol L-1)/HCl (0,5 mol L-1) e voltametria cíclica (50 ciclos) entre os potenciais -0,8 e + 0,8 V e velocidade de varredura de 0,1 V s-1. Para a deposição do filme fino de mercúrio foi utilizado Hg (II) 1,25x10-4 mol L-1 (pH 1,9) por eletrodeposição a - 1,3 V para diferentes
deposições (180, 240 ou 360 s) e uma taxa de rotação de 1000 rpm.A carga associada ao mercúrio depositado (QHg) foi calculada pela integração eletrônica do pico de remoção linear de mercúrio, para v = 0,005 V s1. A solução eletrolítica foi o tiocianato de amônio 5 mM (pH 3,4 (ROCHA, 2007). Após a deposição, segue automaticamente com varredura entre - 1,3 e + 0,3 V para verificar o perfil da formação do filme. Ao final de cada experimento, o filme era removido por varredura linear de redissolução utilizando taxa de varredura 0,005 V s-1 entre -0,15 e +0,4 V em 5 mmol L-1 de NH4SCN (pH 3,4) e determinada a carga associada com o Hg depositado (QHg) por integração do pico.
3.8.3.2 Calibração e determinação de Pb2+ nas amostras
A determinação do Pb2+ nas amostras foram realizadas por voltametria de onda quadrada com os seguintes parâmetros:1mL das amostras para análise diluído em 9 mLde água deionizada em atmosfera inerte (N2), para evitar oxidação do metal pelo O2. A curva de calibração foi feita com NaNO3 0,1 mol L-1 com as concentrações de Pb 2+ (1 10-4; 2 10 -4 e 4 10-4) em triplicata em cada ponto da curva. A determinação do Pb2+ nas amostras de água e material vegetal foram realizadas nas mesmas condições da curva de calibração, após purga de N2 no sistema e diluição para quantificação do Pb2+.
3.9Análises de crescimento e massa seca
A altura da planta foi determinada em cm, adotando-se, como critério, a distância entre o colo da planta e a extremidade do meristema apical do ramo principal com uso de uma régua milimétrica. Aos 28 dias as plantas foram coletadas e as partes separadas para determinação da massa da raiz e massa da parte aérea seca. Ambos os materiais foram acondicionados em sacos de papel, devidamente identificados, e levados à estufa de circulação forçada de ar a 65 °C, até peso constante.
3.10 Aspectos visuais das plantas Eichhornia crassipes expostas ao Pb2+
Foram realizados registros fotográficos das plantas expostas às diferentes concentrações de Pb2+ ao 1º DAT, ao 15º DAT, ao 20º e ao 28º DAT do experimento, utilizando-se câmera de celular iphone modelo 7 red com resolução de 13 x 750 pixels.
4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico SISVAR®, versão 5.6 (FERREIRA, 2014). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo Teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade (p<0,05) e ajustadas por meio de regressão linear ou polinomial (p≤5%). Para construção dos gráficos foi utilizado o software ORIGIN9.0.0.87e as tabelas foram organizadas utilizando o software Excel® 16.0.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterizações das amostras de substâncias húmicas de turfa
As razões atômicas obtidas pelo resultado da análise elementar forneceram informações sobre as características estruturais das substâncias húmicas (SH) das amostras de turfa. A razão H/C está relacionada com o grau de aromaticidade das SH, isto é, quanto menor a razão H/C, maior o grau de aromaticidade das SH (BOTERO, W.G, 2010). Também, um aumento no conteúdo de hidrogênio indica um maior número de carbonos alifáticos (CH2) do que carbonos insaturados (CH2=CH2).
O valor obtido para a razão atômica H/C está similar ao relatado na literatura (Tabela 1) (ZACCONE et al. 2007). A razão atômica O/C está relacionada com os teores de carboidratos das SH. Sendo assim, elevados valores dessa razão indicam menor grau de humificação, devido à diminuição nos teores de carboidratos. A amostra em estudo apresenta um menor número de grupos oxigenados.
Tabela 1 - Resultados das caracterizações para amostras de substâncias húmicas (SH) de turfa pelas razões atômicas H/C e C/O, teor de grupos funcionais e razão E4/E6. macromolécula húmica que geralmente está associada à sua aromaticidade. O aumento da razão indica estrutura com menor aromaticidade e a diminuição da razão maior aromaticidade. De acordo com a literatura, razões menores que 4 indicam maior presença de estruturas aromáticas condensadas, e valores maiores que 4, presença de poucas estruturas aromáticas condensadas (ROSA et al. 2000).
5.2 Avaliação do efeito das substâncias húmicas no comprimento da raiz (CR) e massa seca de plantas Salvínias sp para seleção da dose-resposta.
Por meio da análise de variância observou-se efeito significativo das doses de SH para o comprimento da raiz (CR) apenas aos 10º DAT, isto é, não houve diferença estatística aos 15º DAT para esta variável. Em relação as variáveis, massa seca da raiz (MSR) massa seca da parte aérea (MSPA) não houve diferença estatística entre as doses de SH para nenhuma das datas avaliadas (Tabela 2).
Tabela 2 - Resumo da análise variância e médias do comprimento de raiz (CR), massa seca da raiz (MSR) e massa seca da parte aérea (MSPA) de plantas Salvínias sp aos 10 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes doses de substâncias húmicas.
Fonte de Variação GL Soma dos Quadrados Médios
CR MSR MSPA
* e ** significativo a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente, NS não significativo.
Em relação ao comprimento da raiz observou-se efeito crescente até a dose 100 mg L-1, a partir desta ocorreu um decréscimo indicando que as doses 200 e 400 mg L-1 não influenciaram significativamente a variável analisada (Fig.11).
Figura 11 – Efeitos das doses de substâncias húmicas no comprimento da raiz de plantas Savínias sp.
Borvioni et al. (2016) obtiveram resultados semelhantes quando avaliaram o efeito da aplicação de frações de substâncias húmicas no comprimento radicular e produtividade da alface americana. Para os autores, esse efeito pode estar associado à presença de compostos semelhantes às auxinas nas substâncias húmicas, contribuindo para o crescimento das plantas, especialmente do sistema radicular. Canellas e Santos (2005), associam também esses efeitos a bioatividade das substâncias húmicas, tendo um efeito auxínico sobre as plantas e com a ativação da H+-ATPase de membrana plasmática, promovendo o aumento do gradiente eletroquímico de H+ e provocando a acidificação do apoplasma que leva ao rompimento de ligações da parede celular, promovendo sua elasticidade, o que favorece o crescimento celular.
O aumento no comprimento das raízes é um dos principais efeitos fisiológicos das SH e pode variar conforme sua origem, a dose utilizada, a espécie e idade das plantas (SILVA et al., 2011; VAUGHAN e MALCOLM, 1985). Bernades et al. (2012) avaliaram o efeito das substâncias húmicas do produto comercial CODAHUMUS 20® (fonte de ácidos húmicos e ácidos fúlvicos) no comprimento da raiz de mudas de tomateiro e constataram que a dose de 0,96 mL foi a que proporcionou o maior crescimento.
No presente estudo, foi observado um melhor desempenho no comprimento da raiz na dose 100 mg L-1 de SH em plantas Salvínias sp, sendo esta a selecionada para avaliar o efeito da matéria orgânica na absorção de contaminantes por plantas E. Crassipes no segundo ensaio.
Embora tenha sido observado diferenças no comprimento da raiz em função das diferentes doses de SH, não foram encontradas diferenças significativas para as variáveis massa seca da raiz e massa seca da parte aérea em nenhumas das datas de avaliação.
5.3 Parâmetros físicos e químicos em amostras da água do Lago da Perucaba
A Tabela 4mostra os parâmetros físicos e químicos de amostras da água do Lago da Perucaba avaliados neste estudo.
Tabela 4 - Determinação dos parâmetros físicos e químicos em amostras da água do Lago da Perucaba, Arapiraca- AL. condutividade elétrica, os valores estão acima do valor máximo estabelecidos pela Portaria 518 do Ministério da Saúde. A temperatura variou entre 28,6 e 32,0ºC. De acordo com Carvalho et al. (2011), esses valores podem estar relacionados ao horário de coleta das amostras de água.
5.4Avaliação do pH e condutividade elétrica da solução de cultivo durante a condução do experimento
O monitoramento do pH da solução de cultivo possibilitou verificar a faixa em que este se manteve durante o período de cultivo das plantas de E. crassipes. No início do cultivo, isto é, antes do contato com a planta o pH médio foi de 5,6 e, após o período de bioacumulação, observou-se que houve redução nos valores de pH aproximando-se de 3,9 em alguns tratamentos. Agunbiade et al. (2009) destacam que a melhor faixa de pH para a remoção do metal Pb2+ da solução de cultivo de E. crassipes está entre 5,5 e 6,5.
Assim sendo, o pH inferior a este intervalo pode ocasionar redução no crescimento das plantas. Entretanto, Malik (2007) enfatiza que a faixa mais adequada para o desenvolvimento da E. crassipes situa-se entre 6 e 8, sendo também um fator que pode contribuir para redução do crescimento da planta. Nesse caso, fez-se necessária a manutenção do pH da solução com
caráter ácido entre a faixa de 5,2 a 6,2 durante os 28 dias de cultivo avaliado a fim de evitar a precipitação do metal, indisponibilizando para a absorção na planta.
Da mesma forma que o pH, os resultados obtidos para a condutividade elétrica, por meio do monitoramento durante o período de cultivo, apresentaram-se em aproximadamente 150 a 870 mS cm-1 ao longo do período avaliado. Na metade do período experimental ocorreram aumento dos valores da condutividade elétrica para os tratamentos submetidos a diferentes concentrações de Pb2+ na presença e ausência de substâncias húmicas. Segundo Martins e Pitelli (2005), esse aumento está relacionado a liberação de nutrientes durante o processo de decomposição das plantas e a degradação de material orgânico alterando gradativamente o equilíbrio iônico da solução de cultivo.
5.5 Interação das substâncias húmicas em diferentes concentrações de Pb2+ no crescimento e na massa seca de plantas Eichhornia crassipes na presença e ausência de substâncias e húmicas
A tabela 5 apresenta o resumo da análise de variância para as variáveis comprimento da raiz, massa seca da raiz, massa seca do caule de plantas Echhornia crassipes submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ na presença de substâncias húmicas. Observou-se que não houve diferença significativa para nenhuma das variáveis analisadas.
Tabela 5 - Resumo da análise variância do comprimento de raiz (CR), massa seca da raiz (MSR), massa seca do caule (MSC) e massa seca da folha (MSF) de Eichhornia crassipes aos 28 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ na presença de substâncias húmicas.
Fonte de
Variação GL Soma dos Quadrados Médios
CR CPA MSR MSC MSF
NS não significativo ao nível de 5% de probabilidade.
Jezler (2012) obteve resultados semelhantes quando observou que nenhuma das variáveis de crescimento analisadas apresentou efeito significativo (p≤0,05) das concentrações crescentes de Pb2+ e Cd2+ aplicados, demonstrando valores semelhantes aqueles obtidos para as plantas sem aplicação dos metais. Almeida et al. (2008), avaliando o efeito do Pb2+no crescimento e acúmulo nas raízes e na parte aérea do feijão-de-porco observaram que o CR e MSR 14, 22 e 27 dias após a aplicação do metal não apresentaram diferenças significativas.
Batista (2015), verificou que o crescimento das plantas de feijão-de-porco não apresentou diferença significativa entre os tratamentos avaliados aos 30 e 60 dias de experimento, comprovando que o Pb2+ nas concentrações testadas, não afetou o CR, CPA, MSR e MSPA das plantas.
Neste estudo, o período de exposição a diferentes concentrações de Pb2+ na presença de SH, não foram suficientes para afetar a biomassa vegetal, demonstrando que o metal comprometeu pouco a produção de matéria seca da parte aérea, não havendo assim, grande impacto desse metal no desenvolvimento das plantas (ZHELJAZKOV et al., 2006). Apesar de não ocorrer diferenças estatísticas em relação as variáveis analisadas, as plantas apresentaram sintomas característicos de toxicidade (clorose, desidratação e necrose foliar), principalmente quando expostas as concentrações maiores de Pb2+.
As variáveis CR, CPA, MSR, MSC e MSF avaliadas na ausência de substâncias húmicas são apresentadas na tabela 4 por meio do resumo da análise de variância. O comprimento da raiz apresentou efeito significativo ao nível de 1% de probabilidade, enquanto o comprimento da parte aérea e fitomassa seca da raiz diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade em função das diferentes concentrações de Pb2+. Contudo, não houve efeito significativo para as demais variáveis analisadas.
Tabela 6 -Resumo da análise variância do comprimento da raiz (CR), massa seca da raiz (MSR), massa seca do caule (MSC) e massa seca da folha (MSF) de Eichhornia crassipes aos 28 dias após aplicação dos tratamentos (DAT) submetidas a diferentes concentrações de Pb2+ na ausência de substâncias húmicas.
Fonte de
Variação GL Soma dos Quadrados Médios
CR CPA MSR MSC MSF
* e ** significativo a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente, NS não significativo.
Estudos realizados sobre a absorção de Pb2+ nas plantas tem demonstrado que este metal apresenta alta toxidade e capacidade de se acumular nesses vegetais (CHAVES, 2013; ORAES, 2011). A sua fitotoxicidade depende da concentração, do período de exposição ao metal, da espécie e órgão ou tecido da planta, provocando problemas no crescimento e desenvolvimento
Estudos realizados sobre a absorção de Pb2+ nas plantas tem demonstrado que este metal apresenta alta toxidade e capacidade de se acumular nesses vegetais (CHAVES, 2013; ORAES, 2011). A sua fitotoxicidade depende da concentração, do período de exposição ao metal, da espécie e órgão ou tecido da planta, provocando problemas no crescimento e desenvolvimento