CAMILA CHAVIER MACEDO

Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada

Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br

! "#$%& '()'* +,%- ",%' Instituto de

Biociências PG-BGA

USO DO SISTEMA DE CULTIVO BIDIMENSIONAL E

TRIDIMENSIONAL PARA DIFERENCIAÇÃO DE

CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGÔNIAIS E INDUÇÃO DA

ESPERMATOGÊNESE IN VITRO EM MURINOS

CAMILA CHAVIER MACEDO

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração: Biologia Celular Estrutural e Funcioanal

Fernanda da Cruz Landim

BOTUCATU – SP 2012

Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada

Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br

! "#$%& '()'* +,%- ",%' Instituto de

Biociências PG-BGA

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“Julio de Mesquita Filho”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

USO DO SISTEMA DE CULTIVO BIDIMENSIONAL E

TRIDIMENSIONAL PARA DIFERENCIAÇÃO DE

CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGÔNIAIS E INDUÇÃO DA

ESPERMATOGÊNESEIN VITRO EM MURINOS

CAMILA CHAVIER MACEDO

FERNANDA DA CRUZ LANDIM

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração: Biologia Celular Estrutural e Funcional.

Fernanda da Cruz Landim

BOTUCATU – SP 2012

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Macedo, Camila Chavier.

Uso do sistema de cultivo bidimensional e tridimensional para diferenciação de células-tronco espermatogônias e indução da

espermatogênese in vitro em murinos / Camila Chavier Macedo. – Botucatu : [s. n.], 2012

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu

Orientador: Fernanda da Cruz Landim Capes: 20600003

1. Espermatogênese. 2. Células-tronco. 3. Reprodução.

Palavras-chave: Células-tronco espermatogonial (SSC); Cultivo celular bidimensional; Cultivo celular tridimensional; Diferenciação;

DEDICATÓRIA

Aos meus grandes guerreiros, meus pais; e ao meu engenheiro poeta, meu irmão. !

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais por me transformarem no que hoje eu sou, pelos constantes ensinamentos, pelo suporte nas minhas mais loucas escolhas e pelos inúmeros esforços, muitas vezes, acima dos seus próprios limites, pela minha felicidade.

Ao meu irmão, que apesar de caçula, muitas vezes eu aprendo muito mais com ele do que ele comigo.

A minha orientadora, Prof.a Dr.a Fernanda da Cruz Landim, pelo carinho, amizade e todo o apoio desde a graduação.

À Prof.a Dr.a Renee Laufer Amorim por disponibilizar o seu laboratório e compartilhar os seus conhecimentos.

À Isadora Arruda não só pela incansável ajuda, mas também pela nova amizade.

Aos meus amigos de laboratório: João, Paulinho, Ian, Midyan, Luís Eduardo, Amanda, Letícia, Rosiara, Cely, Luís, Vinicíus, Camila pela contribuições diretas ou indiretas.

Aos técnicos do Biotério Central, Luiz Carlos Diniz, Leonardo Gagliani, José Rafael Franco pela imensa ajuda prestada durante todo o experimento.

Aos camundongos Swiss, sem os quais este experimento não seria possível.

Ao técnico “Zé”, não só pelo prontidão no processamento dos materiais, mas também por ser sempre tão atencioso.

Aos funcionários do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária (FMVZ) pela convivência sempre cordial.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio auxílios financeiros, bolsa e auxílio pesquisa (Processos: 2009/13320-8 e 2010/14930-1).

MUITÍSSIMO OBRIGADA!!!! !

EPÍGRAFE

“Por não saber que era impossível Ele foi lá e fez”. (Jean Cocteau)

SUMÁRIO

1.Resumo... 7

2.Abstract... 8

3.Introdução... 9

4.Revisão de Literatura 4.1.Definição de Célula-Tronco e Classificação... 10

4.2.Breve Histórico da Espermatogênese in vitro... 11

4.3.Espermatogênese in vivo... 12

4.4.Origem das Células-Tronco Espermatogônias (SSC) e Diferenciação das Células Espermatogênicas... 12

4.5.Cultivo das SSC 4.5.1.Sistema de Cultivo Bidimensional ... 15

4.5.2.Sistema de Cultivo Tridimensional ... 18

4.5.3.Meio de Cultivo 4.5.3.1.Meios de Cultivos Básicos ... 19

4.5.3.2.Adição de Gonadotrofinas (FSH e hCG) ... 19

4.5.3.3.Soro Fetal e Suplementos... 20

5.Objetivos e Hipótese... 21 6.Capítulo Título... 22 Introdução... 27 Materias e Métodos... 27 Resultados... 30 Discussão... 32 Referências... 37 7.Conclusão... 40 8.Referências da Introdução... 41 !

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RESUMO

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1. RESUMO

Introdução: O estudo da espermatogênese e, consequentemente, das células-tronco espermatogoniais (SSC), podem acarretar descobertas de novos conhecimentos sobre a biologia dessas e de outros tipos de células-tronco (SC) adultas, bem como, futuramente, proporcionar tratamentos para infertilidade masculina, entendimento sobre a origem e formação de tumores testiculares, conservação de espécies em extinção e melhoramento genético de animais de produção, entre outros temas importantes em medicina reprodutiva. No entanto, os sistemas de cultivos e composição dos meios utilizados para induzir a espermatogênese in vitro, à partir de SSC, não são totalmente conhecidos. Desta forma, o objetivo geral deste experimento foi estudar a diferenciação celular e a indução da espermatogênese in vitro de SCC oriundas da digestão testicular de camundongos Swiss (entre 6-10 dias pós-parto, dpp) cultivadas em diferentes sistemas: o bidimensional (2D) ou convencional e o tridimensional (3D). Materias e métodos: Para tanto, após a digestão testicular, a suspensão celular foi transferida para placas cobertas por uma fina camada de ágar (sistema 2D). Enquanto, uma camada mais espessa de ágar (SACS - Soft Ágar Culture System) ou metilcelulose (MCS – Methylcellulose Culture System) foram confeccionadas para mimetizar a disposição celular in vivo (sistema 3D). Além disso, também foram avaliados o efeito da adição de gonadotrofinas ao meio de cultivo, em ambos os sistemas. Resultados: A formação e manutenção de clusteres de espermatogônias foram mais visíveis nas placas contendo gonadotrofinas, independente do sistema de cultivo. Porém, o sistema de cultivo 3D-MCS-gonadotrofinas(+) mostrou-se mais vantajaso em relação ao sistema de cultivo 2D, uma vez que beneficiou a neoformação de estruturas císticas semelhante a luz dos túbulos seminíferos, além de resultar em suspensão celular, o que favorece recuperação e caracterização das células pós cultivo. Conclusão: Conclui-se que o sistema 3D-MCS-(+) apresentou-se mais fiel a organização espacial encontrada in vivo. No entanto, o potencial de fertilização dessas espermátides redondas e em alongamento é desconhecido, necessitando de novos experimento.

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ABSTRACT

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2. ABSTRACT

Introduction: _{The study of spermatogenesis and spermatogonial stem cells (SSC) may result in}

the discovery of new knowledge about the biology of these and other types of adults stem cells (SC). In the future, could be provided treatments for male infertility , understanding the origin and formation of testicular tumors, preservation of endangered species and genetic improvement of livestock and others importants issues in reproductive medicine. However, culture systems and composition of culture media used to induce spermatogenesis in vitro from the SSC are not fully understood. Thus, the goal of this experiment was to study the induction of those cells differentiation and spermatogenesis in vitro from the testicular digestion of Swiss mice 6-10dpp cultivated in different systems: the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D). Materials

and methods_{: After testicular digestion, the suspension cell was transferred to plates coated with}

a thin layer of agar (2D). While a thicker layer of agar (SACS - Soft Agar Culture System) or methylcellulose (MCS – Methylcellulose Culture System) were made to mimic the in vivo cell (3D). We also evaluated the effect of the addition of gonadotropins. Results: The cluster formation and maintenance of spermatogonia was more visible on gonadotropins (+), in both systems. . However, the 3D-MCS(+) was more advantageous compared to 2D culture system because benefited the formation of clusters of spermatogonia and also the newly formed cystic structures similar to lumen of the tubules seminiferous tubules. Conclusion: We could concluded that the 3D-MCS(+) culture demonstrated better spatial organization found in vivo. However, the potential fertility of these round spermatids and elongation is unknown, requiring further experiments.

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INTRODUÇÃO E

REVISÃO LITERATURA

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3. INTRODUÇÃO

Os tecidos biológicos estão em constante e espontânea autorrenovação e autorreparação, cujos os mecanismos estão relacionados a utilização das reservas de células-tronco (SC) tecido-específico. Assim, quando um tecido é perdido, ferido ou lesionado essas reservas de SC tentam repor ou reparar essas células. No entanto, quando a reparação tecidual espontânea está incapacitada, a medicina regenerativa busca através da terapia celular reparar o tecido lesionado pelo uso das SC (ALBERTS et al, 2010).

As células-tronco são definidas como células com capacidade de auto-renovação (gerar novas células semelhante a ela) e diferenciação -gerar novas células diferenciadas, progenitoras (MINGRONI-NETTO & DESSEN, 2006).

Os primeiros estudos envolvendo a aplicação de SC tiveram início com as células-tronco hematopoiéticas. No decorrer do século XX, a transfusão de componentes sanguíneos foi desenvolvida, consolidada e, hoje, o transplante de medula óssea, é a terapia celular mais difundida (ZAGO & COVAS, 2006). Inicialmente, conhecia-se poucos tipos SC adulta como medula óssea, pele, intestino e testículos. Nos últimos anos, foram descobertas em outras regiões como: fígado, polpa de dente, pâncreas, sistema nervoso, córnea, retina, gordura e sangue menstrual, entre outras.

As células-tronco adultas encontradas no testículo, também denominadas espermatogônias-tronco, células-tronco espermatogoniais (SSC) ou células-tronco germinativas (GSC), são únicas porque são oriundas de tecido jovem e/ou adulto, e não embrionária; possuem capacidade de auto-renovação, diferenciação, como outras SC; são responsáveis pela transmissão genética e, em estudos recentes, demonstraram sua notável plasticidade, cuja capacidade é gerar tipos celulares diferentes do folheto germinativo de origem, característica evidente até então somente em SC embrionária (KUBOTA & BRINSTER, 2008).

Há quase um século, estudos sobre a espermatogêneses in vitro buscam a compreensão da auto-renovação e diferenciação das células germinativas testiculares. Os primeiros estudos revelaram a necessidade da manutenção da estrutura do epitélio testicular e a preservação da interação entre células somáticas e germinativas. Além disso, estes autores conseguiram promover in vitro, ainda que apresentasse meios de cultivo mais simples em relação aos padrões atuais, a progressão das espermatogônias até a meiose, mas não chegaram concluir a

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espermatogênese (GOLDSCHMIDT, 1915; MICHAILOW, 1937; STEINBERGER et al, 1964; STEINBERGER & STEINBERGER, 1966, 1970).

Nos últimos anos, os pesquisadores tem buscado definir quais os fatores de crescimento e hormonais necessários para promover in vitro a auto-renovação e diferenciação das espermatogônias. A presença de fatores de crescimento nos meios de cultivo, como o fator neurotrófico derivada das células da glia (GNDF), fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), fator inibitória de leucemia (LIF) em placas cobertas com uma fina camada de gelatina permitiram o isolamento e amplificação, por meses, das SSC, fornecendo uma ferramenta importante para exploração das células germinativas masculina (MIGUEL et al, 1996; MENG et al, 2000; KANATSU-SHINOHARA et al, 2003; KUBOTA et al, 2004a, b).

Entretanto, até agora, o sistema de cultivo utilizado, a composição do meio e sua suplementação para o desenvolvimento completo in vitro da espermatogênese é muito discutido, pois os resultados são promissores, mas ainda estão longe de um número suficiente de espermatozóides viáveis e com potencial fertilização.

4.REVISÃO DE LITERATURA

4.1.DEFINIÇÃO DE CÉLULA-TRONCO E CLASSIFICAÇÃO

As SC podem ser classificadas de acordo com o local de origem e o grau de potencialidade em: embrionárias (eSC) ou adultas; e totipotentes, pluripotentes, multipotentes ou unipotentes, respectivamente (MINGRONI-NETTO & DESSEN, 2006).

As SC totipotentes, como os blastômeros até estágio de mórula pré-compactação, são capazes de gerar por si só um indivíduo completo, incluindo os anexos placentários. Enquanto, as eSC, derivadas da massa celular interna (IMC) de blastocistos é pluripotente – cuja potencialidade é originar mais de 200 tipos celulares, derivados dos três folhetos germinativos, exceto os anexos extraembrionários. Por outro lado, as células-tronco adultas, mantidas em reserva nos tecidos, são denominadas multipotentes, nas quais a capacidade é originar múltiplos tipos celulares mas com uma origem comum, como as SC da medula óssea. Finalmente, as SC unipotentes são capazes de originar só um tipo celular, tais como as células da camada

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germinativa da epiderme e como era definidas as espermatogônias no testículos ((MINGRONI-NETTO & DESSEN, 2006; BARROCA ET AL, 2008).

4.2.BREVE HISTÓRICO DA ESPERMATOGÊNESE IN VITRO

Os primeiros estudos sobre a espermatogênese in vitro tentaram cultivar fragmentos de tecido testicular de várias espécies obtendo sucesso na progressão da meiose, embora utilizassem meios de cultivo mais simples em relação aos padrões atuais, sem, no entanto, chegarem a concluir a espermatogênese. Esses experimentos revelaram a necessidade da manutenção estrutural do tecido testicular e a preservação da interação entre células somáticas e germinativas (GOLDSCHMIDT, 1915; CHAMPY, 1920; MICHAILOW, 1937). Esses trabalhos foram abandonados e somente retomados durante a década de 1970. O resultado foi que o cultivo de fragmentos testicular melhorava quando co-cultivados com células de Sertoli isoladas (STEINBERGER et al. 1964; STEINBERGER & STEINBERGER, 1966, 1970). Assim, pode-se concluir que a presença de uma monocamada de células somáticas, constituída, principalmente de células Sertoli, parece ser fundamental para o estabelecimento da diferenciação (STEINBERGER et al. 1964; STEINBERGER & STEINBERGER, 1966, 1970; STUKENBORG et al, 2008, 2009; DONG et al, 2009). Nas últimas duas décadas, inúmeros trabalhos tentaram induzir a diferenciação in vitro de células germinativas (GC, ASLAM & FISHEL, 1998; TESARIK et al, 1998a, b; TANAKA et al, 2003) ou de espermátides redondas ou alongadas (CREMADES et al, 1999, 2001), mas a espermatogênese completa desde as SSC até os espermatozóides só foi evidenciado por DONG et al (2010); STUKENBORG et al (2008, 209); ELHIJA et al (2011); SATO et al, 2011a; 2011b).

Utilizando um sistema de cultivo convencional (2D), Dong et al (2010) conseguiram induzir a espermatogênese in vitro, onde as SSC isoladas, enriquecidas foram cultivadas sobre uma monocamada de células de Sertoli. Enquanto, Stukenborg et al (2009, 2010) e Elhija et al (2011) produziram espermatozóides à partir de SSC empregando sistema de cultivo 3D. Já, Sato et al (2011a, 2011b) produziram espermatozóides ao retomar os estudos iniciais com fragmentos testiculares.

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4.3.ESPERMATOGÊNESE IN VIVO

Os espermatozóides são produzidos pelas espermatogônias, presentes nos testículos, após a puberdade, durante toda a vida, em um processo denominado espermatogênese. Esse processo é altamente coordenado, complexo, contínuo e constituído de três fases distintas (SHARPE, 1994): na primeira fase, fase mitótica ou proliferativa, as espermatogônias sofrem auto-renovação ou diferenciação, ambos envolvendo sucessivas divisões mitóticas até a formação do espermatócito primário préleptóteno (CLERMONT, 1962); esse entra na segunda fase ou fase meiótica, caracterizada pela divisão meiótica e a recombinação genética, resultando na formação de células haplóides (STERN, 1993); e na terceira fase, fase pós-meiótica ou espermiogênese, o citoesqueleto é rearranjado, transformando as espermátides, haplóides, em células altamente especializadas, os espermatozóides (CLERMONT et al, 1993).

A espermatogênese é iniciada por uma população pequena, entre 0,02-0,03%, de SSC presente nos testículos de camundongos adultos (DE ROOIJ & RUSSEL, 2000), residentes em microambientes especializados na membrana basal dos túbulos seminíferos (DE ROOIJ & GROOTEGOED, 1998), que se submetem a divisões, tanto para manter o número de SSC, quanto para originar as células progenitoras que depois se desenvolverão até espermatozóides.

A função da maioria, se não toda, a população de células-tronco adulta é fundamentada dentro desses microambientes especializados, chamados de nichos, que fornecem estímulos extrínsecos para regular a auto-renovação e diferenciação, através de um estrutura arquitetônica de suporte e estimulação de fatores de crescimento (SPRANDLING et al, 2001; SCADDEN, 2006). Desta maneira, o nicho pode ser definido como uma área no tecido, na qual as SC residem e são mantidas ao longo da vida (DE ROOIJ, 2009). Nos testículos de mamíferos, as principais contribuintes do nicho são as células de Sertoli, além de outras células somáticas testiculares, como as células mióides e células de Leydig.

4.4.ORIGEM DAS CÉLULAS-TRONCO ESPERMATOGÔNIAS (SSC) E DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS ESPERMATOGÊNICAS

O começo da formação do nicho, ocorre durante o desenvolvimento pós-natal, coincidindo com a maturação das células de Sertoli. O número de nichos de SSC é variável e muda de acordo com a idade, aumentando durante o período pós-natal até a maturidade sexual,

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quando, em camundongos, o número se torna estável (SHINOHARA et al, 2001), mas pode aumentar em espécies, como ratos, cujos testículos aumentam durante a vida (RUY et al, 2003).

As SSC surgem dos precursores de gonócitos mais indiferenciados, derivadas das células germinativas primordiais (PGC), que migram do ectoderma extra-embrionário para a protuberância urogenital e formam, juntamente com as células precursoras somáticas gonadal, a gônada embrionária (CLERMONT & PEREY, 1957; SAPSFORD, 1962; MCLAREN, 2003). Após migrarem, multiplicarem e colonizarem as gônadas, as PGC se diferenciam em gonócitos, que permanecem quiescentes até o período pós-natal em camundongos ou até 3 dias pós-parto (dpp) em ratos, aproximadamente. Em seguida, os gonócitos femininas são induzidos ao início da meiose, devido a ação do ácido retinóico (AR) que leva a expressão do Stra8 – gene expresso pelas células germinativas, o qual codifica uma proteína citoplasmática, cuja expressão é induzida pelo AR (MCLAREN, 2003; MACLEAN et al, 2007). Ao contrario, os gonócitos masculinos estacionam o seu ciclo celular em G1/G0. Na gônada masculina fetal a meiose é retardada devido à inibição da sinalização do AR pela ação da enzima CYP26B1, cuja expressão é regulada pelas células de Sertoli. Quando ocorre a remoção desta enzima ou adição de AR, reinicia-se a meiose.

Segundo Huckins (1971) e Oakberg (1971), as espermatogônias podem ser classificadas em noves tipos diferentes em roedores, sendo subdivididas em três tipos: tipo A, tipo intermediária (In) e tipo B. As espermatogônias tipo A ainda podem ser dividas em subtipos indiferenciados: As (singular), Apr (pareadas) e Aal (alinhadas); e diferenciados, A1, A2, A3 e A4. Considera-se SSC as As, pois este é o tipo mais primitivo, não possuindo pontes intracelulares. As espermatogônias do subtipo indiferenciadas não são indistinguíveis morfologicamente, por microscopia de luz ou por colorações, em relação as espermatogônias diferenciadas. Existem inúmeros hipóteses para explicar a renovação e diferenciação das SSC. A hipótese mais aceita é de que as espermatogônias As se dividem por mitose em duas células-filha, mantendo o pool de células-tronco, ou se diferenciando em um par de células Apr que não completam a citocinese, mantendo-se conectadas por uma ponte intracelular (DE ROOIJ & RUSSEL, 2000; DE ROOIJ, 2001). Em seguida, as espermatogônias Apr se dividem por mitose formando cadeias de 4, 8 e 16 células, passando a ser denominadas espermatogônias Aal, que se diferenciam em espermatogônias A1, sem sofrer divisão. As espermatogônias A1 sofrem sucessivas divisões mitóticas, formando as espermatogônias A2, A3 e A4. As espermatogônias A4 amadurecem em

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espermatogônias In e B, que sofrem divisões meióticas resultando em espermátides. As espermátides, após o processo de espermiogênese, culmina com formação dos espermatozóides.

Está definida há décadas, o período da aparição de cada célula espermática nos testículos de camundongos. Em camundongos neonatos (dia zero), as únicas células presentes, localizados no centro dos túbulos seminíferos (VERGOUWEN et al, 1993; NAGANO & BRINSTER, 1998), são os gonócitos. Entre o período 0 e 6 ddp, ocorre a transição dos gonócitos, que migram para a membrana basal e se transformam em SSC ou espermatogônias tipo A (HUCKINS & CLERMONT, 1968; BELLVE et al, 1977; DE ROOIJ, 1998; DE ROOIJ & RUSSELL 2000; NAGANO et, 2000; MCLAREN, 2003). As primeiras divisões das SSC ocorrem por volta do 3-4 dpp (MCLEAN, 2003). Em outras espécies, a transição de gonócitos para SSC pode demorar meses ou anos, como touro e humanos, respectivamente. Em seguida, as espermatogônias do tipo A se diferenciam em In e B. Já, os espermatócitos em paquíteno e as espermátides redondas e alongadas se desenvolvem no período entre 10-12, 15-17, 19-21e 23-25 dpp, respectivamente em camundongos (BELLVÉ et al, 1977).

4.5.CULTIVO DAS SSC

Os sistemas de cultivo convencionais ou bidimensionais (2D) utilizam placas ou garrafas (DIRAMI et al, 1999; FENG et al, 2002; HASTHORPE, 2003; NAGANO et al, 2003; KUBOTA et al, 2004a, b; KANATSU-SHINOHARA et al 2004, 2005a,b) cobertas por uma fina camada de colágeno, matrigel, gelatina, ágar ou outros componentes da matriz extracelular (MEC), nas quais células germinativas são cultivadas em presença destes elementos. Enquanto, o sistema de cultivo tridimensional (3D) apresenta uma camada mais espessa de ágar, metilcelulose ou colágeno (LEE et al, 2006, 2007; STUKENBORG et al, 2008, 2009; ELHIJA et al, 2011; SATO et al, 2011a, b).

A arquitetura do epitélio dos túbulos seminíferos está organizada em membrana basal, intraepitelial e compartimento adluminal (STAUB, 2001). Esse fato pode influenciar, negativamente, o desenvolvimento in vitro das SSC no sistema de cultivo 2D, especialmente porque as células em meiose são envolvidas pelas células de Sertoli, assim como os clones interconectados, e não possuem contato direto com a membrana basal ou o compartimento adluminal, devido a barreira hematotesticular. Sendo assim, o sistema de cultivo 3D parece apresentar uma estrutura mais vantajosa para diferenciação in vitro das SSC (LEE et al 2006; LEE et al, 2007; STUKENBORG et al, 2008, 2009; ELHIJA et al, 2011; SATO et al, 2011a, b).

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Durante a década de 1960-70, conclui-se que a incubação a uma temperatura inferior a temperatura corpórea é benéfica para o sucesso da espermatogênese in vivo e in vitro (STEINBERGER et al. 1975; NAKAMURA et al, 1978; MIEUSSET & BUJAN, 1995). Além da escolha do sistema de cultivo, presença das células de Sertoli, temperatura, outros fatores foram sendo descobertos durante e decisivos para a cultura testicular, como idade do doador, a monocamada de sustentação, o soro fetal e a composição do meio de cultivo, descritos a seguir.

A idade do doador de SSC esta relacionado com a qualidade e quantidade das SSC recuperada para o cultivo celular. Demostrou-se que as CG de animais prépúberes são duas vezes mais viáveis em comparação com os estágios mais avançados (CREEMERS et al., 2002) e a proporção de espermatogônias indiferenciadas é 100 vezes maior em testículos de camundongos imaturos quando comparados com os testículos de adultos (DE ROOIJ & RUSSELL, 2000; MCLEAN et al., 2003; APONTE et al., 2005). Portanto, o tecido testicular de camundongos imaturos apresenta melhores condições de cultivo em relação a testículos adultos, devido ao fornecimento de um maior número de SSC iniciais levando a melhores taxas de sobrevivência. Desta forma, recomenda-se o isolamento das células germinativas do tecido testicular de camundongos imaturos entre o período 6-10 dpp, uma vez que é neste período que ocorre a diferenciação dos gonócitos em SSC e espermatogônias, sem, no entanto, haver o desenvolvimento dos espermatócito primários (BELLVÉ et al, 1977.

4.5.1.SISTEMA DE CULTIVO BIDIMENSIONAL

Apesar de existirem diferentes métodos para manutenção das população de SSC, ainda continua laborioso obter um grande número destas células tronco, devido, especialmente, a lenta proliferação deste tipo celular. Os primeiros experimentos evidenciaram que as primeiras duas semanas de cultura de SSC são fundamentais, pois a sobrevivência das SSC é sensível as condições de cultivo (NAGANO et al, 2003; KUBOTA et al, 20004a).

É imprescindível para o estabelecimento de uma cultura de SSC, por longo período, que a população celular inicial seja pura, pois se a concentração inicial de células somáticas for extremamente elevada, elas podem crescer sobre as SSC. Além disso, algumas células somáticas possuem efeitos deletérios sobre os mecanismos de autorrenovação e expansão das SSC. Assim, é necessário que a população inicial de SSC seja enriquecida. Para tanto, há vários métodos, tais como: plaqueamento diferencial (SHINOBARA et al, 2000); seleção por laminina (NAYERNIA

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et al, 2004; HAMRA et al, 2008); sedimentação gravitacional por Percoll (VAN PELT, 1996; KOH et al, 2004); separação por fluorescência (FACS, SHINOHARA et al, 1999; FUJITA et al, 2005; GUAN et al, 2006) e separação por campo magnético (MACS; VON SCHÖNFELDT et al, 1999; KUBOTA et al, 2004a, b; STUKENBORG et al, 2008, 2009). Esse último método, é considerado o mais rápido e o que causa o menor estresse para as espermatogônias.

Inicialmente, diversos trabalhos procuraram definir o meio de cultivo das SSC, porque, apesar do soro ter sido utilizado para promover a proliferação de alguns tipos celulares, a sua presença, dependendo das condições ou do sexo do doador, pode ser tóxica para outras células, devido a expressão fatores inibitórios. Ou ainda, causar a morte das células germinativas, especialmente em razão do crescimento exagerado de tipos celulares contaminantes, como os fibroblastos. Deste modo, ao meio de enriquecimento de SSC foram adicionados diversos fatores de crescimento para compensar a retirada do soro, dentre eles, destacam-se: o fator inibitório de leucemia, (LIF; DE MIGUEL et al 1996; KANATSU-SHINOHARA et al, 2003), o fator neurotrófico derivado das células glia (GDNF; MENG et al, 2000; KANATSU-SHINOHARA et al, 2003; KUBOTA et al, 2004a, b), receptor α1 da família do GNDF (GFRα1, KUBOTA et al, 2004a); fator básico de crescimento de fibroblasto, (bFGF; KANATSU-SHINOHARA et al, 2003; KUBOTA et al, 2004a,b ) e fator de célula-tronco (SCF; ALLARD et al, 1996; BLANCHARD et al, 1998; DE ROOIJ et al, 1998; KUBOTA et al, 2004a). Kubota et al (2004b) utilizando um meio quimicamente definido livre de soro, composto por GNDF, GFRα1 e bFGF, promoveram, expressivamente, a expansão das SSC cocultivadas em uma monocamada de células STO-SIM (mouse embryo-derived Thioguanine and Ouabain resistant- linhagem de fibroblasto derivado de embrião de camundongo mitoticamente inativados) por até 6 meses. Esses trabalhos também evidenciaram, que o GNDF é um fator de crescimento essencial para auto-renovação das SSC de camundongo in vitro (KUBOTA et al, 2004a, b; KANATSU-SHINOHARA et al, 2005a).

A presença de uma feeder (monocamada de sustentação celular) pode estimular as células cocultivadas, não só pela presença de fatores de crescimentos, mas também pelo contato direto célula-célula ou via matriz celular. Entretanto, uma desvantagem da utilização das feederes é a produção fatores de crescimento desconhecidos. Desta forma, os sistemas de cultivos que utilizam feederes, procuram utilizar linhagem celulares bem conhecidas, minimizando as variáveis das condições de cultivo. NAGANO et al (1998) demonstraram que as SSC em meios

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de cultivo não definidos, cocultivadas sobre feeder de células STO podem ser mantidas por meses. Posteriormente, Kanatsu-Shinohara et al (2003) utilizaram como feeder o cultivo primário de fibroblasto embrionário de camundongos (MEF). Entretanto, Kubota & Brinster (2008), ao comparar a utilização de MEF com a feeder de STO, observaram que a feeder de MEF suporta um crescimento medíocre dos clusteres (colônias) de CG, o qual não se compara ao crescimento mais veloz na feeder de células STO. Além disso, estudos recentes, comprovaram que fibroblastos de origens anatômicas diferentes são significantemente diferentes e que existe uma heterogeneidade substancial entre os fibroblastos embrionários (CHANG et al, 2002). Hamra et al (2004, 2005), demonstraram que a feeder de linhagem de células de Sertoli de camundongo (MSC-1) é superior a feeder STO na manutenção das CG, porém as CG foram cocultivadas por um período curto. Kubota & Brinster (2008), demonstraram que a feeder de MSC-1 suporta as CG, mas o crescimento é lento e, após nove dias de cocultivo com as CG em monocamada de MSC-1, a maioria das CG morreram. Desses experimentos, pode-se concluir que a feeder de células STO parece ser superior.

Por outro lado, Kanatsu-Shinohara et al (2005), tentaram cultivar as SSC livre de soro e feeder e, embora as células tenham se mantido em proliferação em meio livre de soro ou em ausência de feeder, na ausência de ambos, as SSC não proliferaram.

O último passo do sistema de cultivo 2D é a espermatogênese in vitro, propriamente dita, na qual as SSC são induzidas a meiose promovendo a produção de células haplóides. Como já vimos anteriormente, é necessário a presença das células de Sertoli para indução da espermatogênese in vitro, devido ao importante papel dessas células durante esse processo (STEINBERGER et al. 1964; STEINBERGER & STEINBERGER, 1966, 1970; DIRAMI et al, 1999; IZADYAR et al, 2003; DONG et al, 2010; STUKENBORG et al, 2008, 2009).

Desta forma, uma população altamente isolada de SSC, expandida por um cultivo em meio quimicamente definido, livre de soro, sobre uma monocamada de células STO, pode ser induzida a diferenciação, quando cultivadas sobre uma feeder de células de Sertoli, mitoticamente inativada. Assim, empregando um sistema de cultivo 2D, Dong et al (2009) conseguiram induzir a espermatogênese in vitro, onde as SSC foram isoladas, enriquecidas e, depois, cultivadas sobre uma monocamada de células de Sertoli isoladas.

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4.5.2.SISTEMA DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL

O sistema de cultivo tridimensional (3D) foi estabelecido, primeiramente, para explorar os mecanismos de proliferação e diferenciação das células hematopoiéticas (PARENT-MASSIN, 2001). Desde então, este novo modelo de cultivo celular é considerado um representante autêntico do ambiente celular in vivo e tem recebido muita atenção no campo da biologia celular (PARKS et al, 2003; ZHANG, 2004). Da mesma forma que os primeiros estudos in vitro, os estudos in situ da espermatogênese também relataram que a disposição estrutural das células testiculares é importante para a regulação e completa maturação das células germinativas (GOLDSCHMIDT, 1915; CHAMPY, 1920; MICHAILOW, 1937; STEINBERGER et al. 1964; STEINBERGER & STEINBERGER, 1966, 1970; LEE et al, 1997; NAGANO et al, 2003; WISTUBA et al, 2007). Devido ao microambiente in vivo criado pelas células testiculares somáticas, o epitélio é compartimentado em: i) compartimento basal, que oferece contato físico com a membrana basal, onde estão as células de Sertoli e as CG prémeióticas, inclusive as SSC; ii) o compartimento intraepitelial, cujo contato é somente com células de Sertoli e CG em transição meióticas e iii) o compartimento adluminal, cujo contato é com as células Sertoli e CG pós-meióticas em processo de diferenciação, assim como, com o fluido luminal (SPRADLING et al, 2001). Portanto, um sistema de cultivo ideal deve mimetizar a organização estrutural do epitélio seminífero in situ promovendo as interações entre células somáticas-germinativas ou entre células germinativas-matriz extracelular durante a espermatogêneses in vitro. Assim, os sistemas de cultivos convencionais parecem não refletir essa complexa estrutura do epitélio seminífero, por não fornecerem a organização espacial presente in vivo, que pode dificultar a viabilização da diferenciação das espermatogônias e sustentação da espermatogênese (STAUB, 2001).

O sistema de cultivo 3D é composto por uma camada mais espessa de colágeno, ágar ou metilcelulose. Essa camada possui vários milímetros até centímetros, proporcionada por um sistema de cultivo em ágar (SACS- Soft Agar Culture System), sistema de cultivo de metilcelulose (MCS) ou uma matiz de colágeno mais encorpada, onde as células cultivadas são envolvidas pelos substratos. Desta maneira, tenta-se recriar a arquitetura do tecido testicular in vivo, ao possibilitar que as CG sejam acondicionadas em condições semelhantes às condições espaciais testiculares. Além disso, o sistema de cultivo 3D parece evitar a isquemia que dificulta cultivos de longa duração e promove a agregação das CG, proporcionando a manutenção das

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interações entre células somáticas-germinativas ou entre células germinativas-matriz extracelular necessários durante a diferenciação e espermatogêneses in vitro (STUKENBORG et al, 2008).

Mais recentemente, foram descritos na literatura, trabalhos que induziram a diferenciação in vitro de células germinativas (CG) proveniente dos estágios iniciais do desenvolvimento (ASLAM & FISHEL, 1998; TESARIK et al, 1998a, b; TANAKA et al, 2003) ou a partir de espermátides redondas ou alongadas (CREMADES et al, 1999, 2001), mas a espermatogênese completa em sistema 3D desde as SSC até os espermatozóides somente foi evidenciado por Stukenborg et al (2009) e Elhija et al (2011). Nas quais, suspensões celulares derivadas da digestão testicular de camundongos prépúberes foram cultivados em camada espessa de ágar (SACS), juntamente com presença de gonadotrofinas, hCG e rhFSH, no meio de cultivo, pode-se observar a completa maturação das CG até espermatozóides, após 40 dias de cultivo.

4.5.3.MEIO DE CULTIVO

4.5.3.1.MEIOS DE CULTIVOS BÁSICOS

Existem diversos meios comerciais básicos que podem ser suplementados para o cultivo celular. O meio de cultivo mais utilizado é Dulbecco modified Eagle Medium suplementado com Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco®). Sato et al (2011) ao comparar os meios DMEM, DMEM/F12, Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco®) e Alpha Minimum Essencial Medium (α-MEM, Gibco®) observaram que tanto o α-MEM e RPMI suplementados com 10% Soro Fetal Bovino (SFB) induziram melhor a expressão do GFP do que DMEM/F12 e DMEM em duas linhagens de camundongos transgênicos: Gsg2-GFP (gene conhecido também como Haspin; gene codificador de proteína quinase nuclear específica de CG haplóides; Green Fluorescent Proteins, GFPs, proteína utilizada para o acompanhamento da progressão da espermatogênese através de sua fluorescência) e Acr-GFP (Acrosin; gene codificador de Acrosin, maior proteinase presente no acrossomo de espermatozóides).

4.5.3.2.ADIÇÃO DE GONADOTROFINAS (FSH e hCG)

Durante a espermatogênese in vitro, além da interação entre células somáticas e germinativas, presença de fatores de crescimento, idade do doador das células testiculares e o tipo de sistema de cultivo, é importante a regulação endócrina. Steinberger et al (1975) relataram que

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a adição de hCG estimula a produção de testosterona e o efeito anti-apoptótico nas das CG. Já, Stukenberg et al (2009) relatam que a presença de células de Leydig ativas fornecem testosterona para o sistema de cultivo 3D e o suporte de gonadotrofinas não é necessário para conclusão da meiose, mas é fundamental para a manutenção das colônias de CG masculinas. Ruwasnpura et al (2010) afirma que FSH regula o desenvolvimento das espermatogônias, enquanto a testosterona regula a fase final da espermiogênese e ambos parecem ser igualmente importante para o desenvolvimento dos espermatócitos.

4.5.3.3.SORO FETAL E SUPLEMENTOS

Como citado anteriormente, o uso soro fetal é polêmico, pois acredita-se que o soro pode induzir a diferenciação de algumas células e em outras ele pode conter fatores inibitórios da espermatogênese. Deste modo, Sato et al (2011), na tentativa de superar esta limitação do soro fetal bovino (FBS), substituíram o FBS por soro KnockOut (KSR, Life Technologies) ou por albumina sérica bovina rica em lipídeos (AlbuMAX®, Life Technologies) - componente mais expressivo presente no KSR – utilizado, geralmente, em meio de cultura de eSC, por promover proliferação e manutenção dessas células em estado indiferenciados. Eles demonstraram que o FBS não possui efeitos inibitórios sobre a espermatogênese e, que a adição de AlbuMAX® ao FBS, foi mais efetiva do que somente o AlbuMAX®.

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OBJETIVOS E

HIPÓTESE

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5.OBJETIVOS E HIPÓTESE

A intenção deste trabalho é comparar a formação de espermatozóides, a partir de espermatogônias, em diferentes sistemas de cultivo. A seguir são descritas as etapas deste trabalho:

1. Cultivar in vitro as células germinativas masculinas até a formação de espermatozóides em cultivo 3D e sistema de cultivo convencional (2D);

2. Caracterizar, através de imunomarcadores, as células desenvolvidas durante a espermatogênese, assim como as células somáticas cocultivadas.

O sistema de cultivo tridimensional parece favorecer estruturalmente a indução da espermatogênese in vitro, uma vez parece fornecer um suporte estrutural semelhante encontrado in vivo_.

CAPÍTULO

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