Subprojeto 19
1. Identificação:Título do subprojeto: O papel da disquerina na diferenciação das células hematopoéticas País: Brasil
Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq Área: Hematologia Código: 4.01.01.05-3 2. Dados do coordenador do subprojeto Nome completo: Eduardo Magalhães Rego Data de nascimento:
02/06/1965
Sexo: X Masculino Feminino Nacionalidade: Brasileiro
Endereço eletrônico: eduardo.rego@pq.cnpq.br
3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto
Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Universidade de São Paulo Sigla: USP
Órgão (instituto, faculdade, etc): Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto Unidade (departamento, laboratório, etc): Laboratório de Hematologia Cargo/função: Diretor Científico
4. Resumo do subprojeto
Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto.
A disqueratose congênita ligada ao X (DC-X) é uma doença recessiva rara causada por mutações pontuais no gene DKC1, o qual codifica para a disquerina (Heiss et al, 1998), e é caracterizada por diversas manifestações clínicas, incluindo susceptibilidade aumentada ao câncer e comprometimento da medula óssea (MO) (Dokal, 2000).
A anemia aplástica grave, por sua vez, é uma síndrome caracterizada por pancitopenia associada a hipocelularidade da MO, sendo assim, a DC-X causada por mutações no gene DKC1 representa uma das principais anemias aplásticas hereditárias. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na disfunção da MO na disqueratose congênita ainda são desconhecidos. O gene DKC1 codifica para uma pseudouridina sintase, proteína que modifica o RNA ribossomal e é essencial para a biogênese do ribossomo. Portanto, considerando a hipótese de que o mecanismo que conduz à anemia aplástica e câncer na DC-X esteja associado à disfunção ribossomal, seria a primeira demonstração do papel desta organela na diferenciação de progenitores imaturos. Ainda não é claro se a alteração na atividade da disquerina afeta o progenitor hematopoético pluripotente (mais imaturo) ou os precursores já associados a uma (ou poucas) linhagem hematopoética específica.
Nosso grupo colaborou com a geração de um modelo animal de DC-X, o qual nos permite entender os mecanismos que controlam a diferenciação e auto-renovação das células tronco hematopoéticas. O projeto resultou na obtenção de um camundongo Dkc1 mutante hipomórfico (Dkc1m), o qual apresenta características patológicas muito semelhantes às da anemia aplástica (Ruggero et al., 2003). Neste projeto, propomos experimentos para determinar como a disquerina regula a geração e diferenciação das células tronco hematopoéticas. Nossos resultados preliminares mostraram que a inativação parcial da disquerina não está associada à diminuição de todas as linhagens hematopoéticas maduras, mas afeta principalmente o desenvolvimento das células eritróides e B. Esses resultados sugerem que mutações no gene DKC1 não prejudicam a célula tronco hematopoética, mas progenitores já comprometidos. Nosso principal objetivo neste projeto é determinar em que estágio da ontogênese linfóide a disquerina é essencial. Para isso, usaremos o modelo de transplante em animais mutantes rag-/- (os quais não possuem células T e B maduras) com diferentes precursores hematopoéticos isolados da MO de animais Dkc1m. Analisaremos também possíveis defeitos nos
precursores multilinhagem, por meio da determinação em animais receptores congênitos letalmente irradiados, da origem destes precursores (se tem origem de um doador Dkcm ou de um selvagem).
5. Objetivos
Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto.
Objetivo geral: Determinar o papel da biogênese ribossomal na auto-renovação e diferenciação da célula tronco hematopoética
Objetivos específicos:
1. Avaliar o papel da disquerina nas células tronco hematopoéticas
Para determinar se as anormalidades nos camundongos Dkc1m são devido a um defeito autônomo da célula, realizaremos ensaios de repopulação competitivos. Nestes experimentos, células tronco hematopoéticas de mutantes Dkc1 serão testadas contra seus correlatos selvagens quanto a sua capacidade de repovoar receptores C57/BL6 letalmente irradiados. Se a função do gene Dkc1 for essencial para a célula tronco, esperamos por um número reduzido de células maduras de todas as linhagens (linfóide, granulocítica/monocítica e megacariocítica) nos camundongos receptores de células Dkcm.
Tendo em vista nossos resultados preliminares, o melhor candidato a progenitor hematopoético alvo das mutações Dkc é o Progenitor Linfóide Comum (CLP). Assim, isolaremos os CLPs de camundongos Dkc1m e controles selvagens, e realizaremos os ensaios de repopulação competitivos como descritos acima, mas desta vez, os receptores serão camundongos rag-/-, os quais não apresentam células T e B maduras no sangue periférico.
3. Quantificar a expressão do gene Dkc1 nos precursores isolados
Planejamos isolar HSCs, CLPs, Frações A and B da linfopoese, Progenitores Mielóides Comuns (CMPs), Progenitores Granulocíticos/Monocíticos (GMPs), and e Progenitores Mielóides/Eritróides (MEPs) da MO de camundongos Dkc1m e selvagens por Fluorescence-activated cell sorter (FACS), e analisaremos a expressão do gene Dkc por PCR em Tempo Real.
4. Analisar apoptose e crescimento celular dos progenitors linfóides Dkcm
Uma vez identificado o progenitor hematopoético específico no qual o gene Dkc está qualitativa e quantitativamente comprometido, testaremos estas células quanto à susceptibilidade a apoptose e/ou a presença de defeitos na regulação do crescimento celular comparadas as células correlatas dos animais selvagens.
6. Plano de trabalho
Descrever as etapas de execução do subprojeto.
1. Ensaios de repopulação competitiva usando HSCs: A camada de células mononucleares da MO de 12 camundongos selvagens (expressando Ly5.2 nas células hematopoéticas) e de 12 camundongos Dkc1m (expressando Ly5.1) serão obtidas por flushing da cavidade da MO com meio RPMI. Em seguida, as células serão marcadas com o painel de anticorpos monoclonais (MAbs) contendo: Sca-1, CD117 e um coquetel de marcadores de linhagens B220/CD11b/Gr-1/TER119/CD3. As amostras serão analisadas por citometria de fluxo (FACS Aria-CTC) e as HSCs serão isoladas de acordo com a expressão do fenótipo: Sca1+ CD117+ e linhagens negativas. Na noite do sorting, camundongos C57 que expressam o marcador Ly5.2 serão irradiados com 900 cGy para induzir mieloablação. Serão injetadas, pelo plexo retro-orbital, proporções fixas de HSCs de animais selvagens (Ly5.2) e Dkc1m (Ly5.1). Após 6 a 8 semanas, os receptores serão sacrificados e o sangue periférico e MO serão marcados com um painel de anticorpos o qual permitirá a identificação das células T (CD3+/CD4+ or CD3+/CD8+), B (B220+/CD43-/sIgG+), granulócitos e monócitos maduros (Mac-1+/Gr-1+) Ly5.1 ou Ly5.2. Esta estratégia nos
permitirá enumerar as células originárias das HSC de camundongos Dkc1m ou selvagens.
2. Ensaios de repopulação competitiva usando CLPs: Células mononucleares de 12 camundongos selvagens e de 12 mutantes Dkc1m serão obtidas como descrito acima e marcadas com o seguinte painel de MAbs: CD45/B220, CD19, CD24, AA4, CD43 e um coquetel contendo: CD11b/Gr-1/TER119/CD3. As CLPs serão isoladas de acordo com a expressão do seguinte fenótipo: CD45/B220-, CD19-, CD24+low, CD43+, AA4+ e CD11b/TER119/CD3-. Na noite do sorting, camundongos Rag1-/- serão irradiados com 600cGy para induzir mieloablação. Serão injetadas, pelo plexo retro-orbital, diferentes proporções de células oriundas de camundongos selvagens e mutantes Dkc1m. Após 6 a 8 semanas, os receptores serão sacrificados e o sangue periférico e MO serão marcados com um painel de MAbs que permitirá a análise das células T e B maduras (conforme citado acima), as frações A (B220+CD19 -AA4+c-Kit+CD24+low, CD43+) e B (B220+CD19+AA4+c-Kit+CD24+med, CD43+) de células B imaturas, assim como os CLPs (mesmo fenótipo do sorting). Ao compararmos os receptores que receberam CLPs de camundongos Dkc1m com aqueles que receberam CLPs dos controles selvagens, poderemos determinar o estágio da diferenciação linfóide que é afetado pela desregulação da função do gene Dkc.
3. Análise da expressão do gene Dkc1 nas HSCs, CMPs, GMPs e MEPs: Células mononucleares de animais Dkc1m e controles selvagens serão incubadas com dois painéis de MAbs: um para quantificar as HSCs, os CMP, os GMPs e os MEPs e, o segundo painel irá quantificar os CLPs e frações A e B da linfopoese. O primeiro painel (HSC/mielóide) será constituído pelos MAbs contra: CD3, B220/CD45, Ter119, Gr-1 e Mac-1, IL-7Rα, Sca-1, c-Kit, CD34 e FcγR. O segundo painel para isolamento dos CLPs será o mesmo já citando anteriormente. As HSC serão definidas pelo imunofenótipo: Sca-1 positivo, linhagem e IL-7Rα negativos; os CMPs: Sca-1, linhagem e IL-7Rα negativos, CD34 positivo e FcγR positive com baixa intensidade de expressão (FcγRlow); os GMPs: Sca-1, linhagem
e IL-7Rα negativos, CD34 positivo e FcγR positivo, com alta intensidade de expressão (FcγRhigh) e os MEPs: Sca-1, linhagem e IL-7Rα negativos, CD34 negativo e FcγRlow. Os diferentes progenitores serão isolados por citometria de fluxo (FACS Aria). As células serão coletadas diretamente em TrizolR (Invitrogen). O RNA total será extraído e a transcrição reversa realizada com a enzima MMLV (Gibco BRL) e random primers (Promega) na presença de inibidores de RNase (Amersham-Pharmacia). Para as reações de PCR em tempo real utilizaremos sondas TaqMan (Applied Systems) para os genes Dkc e constitutivo Hypoxanthine-guanine phosphoribosil transferase (HPRT). 4. Análise de apoptose e crescimento celular: 10 camundongos machos Dkc1m entre 8-12 semanas de idade, e 10 controles selvagens com idade e sexo pareados serão injetados com uma solução de BrdU 10mg/ml. Duas horas depois os animais serão sacrificados por intoxicação com CO2. Células. da MO serão coletadas por flusing da
cavidade óssea com RPMI. De acordo com os resultados dos experimentos anteriores, escolheremos o progenitor hematopoético a ser isolado. A suspensão celular será incubada com o painel de MAbs para progenitores linfóides descrito acima, as células serão fixadas e permeabilizadas com solução contendo paraformaldeído 1% e Nonidet P40 0.05%. Em seguida, as células serão tratadas com DNase I (30µg) para exposição dos epítopos BrdU e incubadas com anti-BrdU conjugado com APC. Após remover o excesso de anticorpos, as células serão coradas
com 20µl de uma solução 1mg/ml de 7-AAD. As análises serão realizadas no FACS Aria (CTC). A porcentagem de células precursoras em proliferação nas diferentes fases do ciclo celular (G0/G1, S and G2/M) serão determinadas de acordo com a análise simultânea da marcação para BrdU e conteúdo de DNA. A porcentagem de células nas fases G0/G1, S, G2/M do ciclo celular bem como o número de células apoptóticas serão apresentadas como média±SEM, e a comparação entre o número de progenitores em apoptose de camundongos Dkc1m e selvagens será feita pelo teste T ou Mann-Whitney (dependendo da distribuição dos dados), utilizando o software GraphPad.
P-values igual ou menor que 0.05 serão considerados significativos.
7. Metodologia
Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida. - Ensaios de repopulação competitiva
- Fluorescence-activated cell sorter (FACS) - PCR em Tempo Real
- Combinação de injeção intraperitoneal de bromodeoxiuridina (BrdU) e coloração com 7-amino-actinomicina (7-AAD). Com esta combinação, as análises da citometria de fluxo permitirão enumerar e caracterizar as células que estejam sintetizando ativamente DNA (incorporação de BrdU) de acordo com sua posição no ciclo celular (incorporação de 7-AAD). Além disso, por meio da quantificação das células hiplodiplóides distribuídas na posição sub-GO do ciclo celular, será possível avaliar o número de células em apoptose.
8. Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores.
Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento.
Nome CPF Objetivo/Justificativa da atividade Função no projeto (pesquisador ou responsável pelo Laboratório Experiências anteriores Titulação Eduardo Magalhães Rego
070317728-18 Pesquisador Principal Desenho experimental, interpretação de dados, redação de artigos científicos Pesquisador principal do centro de terapia celular (CEPID/FAPESP); Geração e análise dos modelos de animais geneticamente modificados de disceratose congênita e leucemia promielocítica aguda. Pos-doutorado no laboratório do Dr Píer Paolo Pandolfi, Memorial Sloan Ketering de Nova York. Professor Associado (livre docente) Roberto Passetto Falcão 221676768-91 Pesquisador colaborador Análise da differenciação linfóide Pesquisador principal do centro de terapia celular (CEPID/FAPESP); Coordenador do laboratório de citometria de fluxo do HCRP Professor Titular Flávio Vieira Meirelles
156140658-90 Pesquisador colaborador Isolamento de subpopulações celulares por citometria de fluxo
Zago 49 Barbara Amélia Santana-Lemos
000690966-35 Pós-doutor Estudo do modelo animal de leucemia promielocítica aguda, técnicas de biologia molecular, citometria de fluxo,caracterização e análise de precursores hematopoéticos murinos Mestre em Genética e Bioquímica Doutorado em Clínica Médica (Investigação Biomédica Hematologia) Rodrigo A. Panepucci 254862308-42 Pós-doutor Patrícia V. B. Palma 159952578-03 Apoio Técnico Ana Silvia G. Lima 098881208-83 Apoio Técnico 9. Fontes de financiamento
Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados)
Fonte de
Financiamento Título Vigência Valor Relação com a presente solicitação FAPESP (2001/08693-8) Determinação do efeito da Inativação do Gene da Proteína Ligante do Enhancer CCAAT Alfa (CEBPA) na hematopoese de animais transgênicos PML RARA 01.11.01 a 31.10.03 182.890,33 CNPq (48.1911/2004-9) Análise in vitro e in vivo da atividade antileucêmica dos tocoferóis na leucemia promielocítica aguda 01.03.05 a 01.03.07 47.800,00 CNPq (484873/2007-5) Análise do papel da via do TGFbeta e do potencial terapêutico de seu inibidor, a Halofuginona, na Leucemia Promielocítica Aguda 01.02.08 a 31.01.10 80.000,00
10. Contrapartida das instituições participantes
Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos (horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens.
11. Orçamento justificado e adequado com a proposta Formulário anexo
12. Bolsas
Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV)
Modalidade Duração Quantidade
AT 24m 2
13. Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação:
Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras – indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES
NOME DA DISCIPLINA: Utilização de modelo animal para o estudo de leucemias (60 horas) DOCENTE RESPONSÁVEL: Prof. Dr. Eduardo Magalhães Rego
AUXILIARES: Bárbara A. A. Santana-Lemos, Alexandre Krause, Fábio Morato de Oliveira PROGRAMA: Genética de leucemias
O modelo animal para o estudo de doenças humanas Bioética
Introdução à biologia molecular Citogenética (clássica, molecular) Citometria de fluxo
Modelos de transgênicos: clássico (microinjeção), infecção (retrovirus, lentivirus), recombinação homóloga (K.O., K.I.)
Modelo de transplante de medula Referências:
Heiss NS, Knight SW, Vulliamy TJ, Klauck SM, Wiemann S, Mason PJ, Poustka A, Dokal I.X-linked dyskeratosis congenita is caused by mutations in a highly conserved gene with putative nucleolar functions, Nat Genet. 1998 May;19(1):32-8.
Dokal I. Dyskeratosis congenita in all its forms. Br J Haematol. 2000 Sep;110(4):768-79. Ruggero D, Grisendi S, Piazza F, Rego E, Mari F, Rao PH, Cordon-Cardo C, Pandolfi PP.
Dyskeratosis congenita and cancer in mice deficient in ribosomal RNA modification. Science. 2003 Jan 10;299(5604):259-62.
