ESTUDO CINÉTICO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae IMOBILIZADO EM ALGINATO DE SÓDIO.

PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA

ESTUDO CINÉTICO DA PRODUÇÃO DE ETANOL POR Saccharomyces

cerevisiae

IMOBILIZADO EM ALGINATO DE SÓDIO.

Larissa Nayhara Soares Santana1

Faculdade de Engenharia Química - Universidade Federal de Uberlândia – Av. João Naves de Ávila, 2121 – Campus Sta. Mônica – Bloco K – CEP: 38400-902 – Uberlândia – MG – Fone: (34) 3239-4189.

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Patrícia Tavares Cordeiro2

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Luís Cláudio Oliveira Lopes3

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Eloízio Júlio Ribeiro3

Faculdade de Engenharia Química - Universidade Federal de Uberlândia – Av. João Naves de Ávila, 2121 – Campus Sta. Mônica – Bloco K – CEP: 38400-902 – Uberlândia – MG – Fone: (34) 3239-4189.

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Resumo:Este trabalho apresentou como objetivo imobilizar células de Saccharomyces cerevisiae

em alginato de sódio e estudar a cinética da produção de álcool pela levedura imobilizada. Foram testados concentrações de alginato de sódio de 3% e 2%, a fim de verificar a estabilidade dos pellets. Os pellets submeteram-se a um tratamento com Al(NO3)3 o que levou a um aumento da estabilidade dos mesmos em relação à ruptura. Durante os ensaios fermentativos foi proposta uma nova configuração de reator que consistiu de um reator de mistura operado em batelada, dotado de uma placa perfurada localizada no centro do reator, cuja finalidade foi impedir a flutuação dos pellets. Para o estudo cinético foram testados diversos modelos visando descrever os perfis das concentrações de substrato e produto no reator e de células no interior dos pellets e no meio. Os modelos cinéticos de Monod, Hinshelwood e Levenspiel foram os mais apropriados para descrever o processo de produção de etanol utilizando células imobilizadas em alginato.

Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae; alginato de sódio; fermentação alcoólica;

imobilização.

1. INTRODUÇÃO

O álcool é um dos biocombustíveis que tem ganhado destaque na economia brasileira tem sido e ganhado posição estratégica no mercado tanto nacional quanto internacional, trata-se de um produto renovável, limpo e extremamente importante, pois contribui para a redução do efeito estufa. A matéria prima para a produção do etanol brasileiro é a cana-de-açúcar, enquanto países como os EUA usam milho para a produção de álcool, o Brasil consegue obter o biocombustível através da fermentação da cana-de-açúcar. O processo de fermentação da cana é uma técnica dominada pelo Brasil, se comparada a desenvolvida pelos países desenvolvidos para a produção de etanol a partir de outras fontes renováveis, o álcool brasileiro custa até três vezes menos que o estrangeiro. Recentemente, a fermentação tem emergido como uma tecnologia fundamental e vital, como uma força integrante da biotecnologia moderna (PANTOJA, 2006).

A literatura apresenta inúmeros modelos de biorreatores usados para a produção biotecnológica de etanol, entretanto, a configuração com células livres em batelada alimentada merece destaque especial quando se refere a utilização industrial desses sistemas de biorreatores. Não obstante, a utilização de esquemas com células imobilizadas na fermentação alcoólica, possui vários aspectos desejados para a operação de fermentação: (i) o uso de altas concentrações celulares por unidade de volume do reator; (ii) facilita a reutilização dos biocatalisadores; (iii) minimiza tempos “mortos” e custos de separação; e (iv) confere maior estabilidade às células além de permitir uma operação contínua do reator. Diversos suportes são utilizados para imobilização: polímeros sintéticos, gel de poliacrilamida, polipropileno, resinas epóxi, polissacarídeos naturais (alginato de cálcio, kcarragena, pectina cítrica, agar), minerais (crisotila, alumina, terra diatomácea, rocha vulcânica, sílica porosa), vegetais (madeira, fibras de algodão, bagaço de cana) e metais (aço inoxidável).

Na fermentação alcoólica, o uso de leveduras imobilizadas permite o uso de altas concentrações celulares por unidade de volume do reator, dispensa o uso de centrífugas no final do processo de fermentação e permite operação contínua do reator.

Segundo Freeman e Lily (1998), citados por Carvalho (2000), a imobilização de células viáveis possui grande potencial para aplicações em conversões ou sínteses que envolvam sistemas multienzimáticos complexos, nos quais a presença de passos que requerem provisão de energia ou uso de cofatores seja comum, uma vez que a regeneração desses compostos ocorre de forma natural. O aprisionamento de células em gel de alginato de sódio é a técnica mais amplamente utilizada para a imobilização de células viáveis, visto que a gelificação do alginato ocorre rapidamente na presença de íons de cálcio sem alterações drásticas na temperatura, pH e pressão osmótica, o que permite preservar a atividade e a viabilidade dos microrganismos imobilizados. Além disso, o alginato é um material barato e facilmente encontrado (BATISTA et al. 1999).

O objetivo desse trabalho consiste na investigação do processo de formação de partículas estáveis com células de levedura imobilizadas em alginato de cálcio, a investigação de um esquema modificado de reator sob recirculação de fluxo e o estudos cinético da fermentação alcoólica nesses biorreatores.

2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material

A levedura utilizada nas fermentações foi uma cepa industrial, Linhagem Y904, produzida por Mauri Brasil, utilizada por unidades industriais produtoras de etanol. O meio de cultura utilizado foi composto de glicose em concentrações variáveis de acordo com o experimento, extrato de levedura 6 g/L, KH2PO4 5 g/L, MgSO4.7H2O 1 g/L, NH4Cl 5 g/L e KCl 1 g/L, e o pH inicial do

meio foi corrigido para 4,5. 2.2 Quanto á imobilização

Para a imobilização, uma massa de levedura hidratada, definida para cada experimento segundo um planejamento com concentração inicial de células na imobilização (X0), nos níveis de

17g/L, 29,0g/L, 36 g/L, 43,0g/L e 68g/L e concentração inicial de substrato (S0) nos níveis de

30,5g/L, 52,0g/L, 78,5g/L, 105 g/L e 148,5g/L. Após a hidratação, a suspensão de levedura era misturada a um gel de alginato de sódio a 3% m/v previamente preparado. Os estudos com alginato de sódio a 2% m/v levaram a partículas com característica de menor estabilidade (rompimento obsevável em condições de cisalhamento no experimento). Os pellets de gel foram obtidos pelo gotejamento da mistura alginato/células em uma solução de cloreto de cálcio na concentração de 30g/L, sob agitação magnética, com um volume de 250 mL, em um béquer de 600 mL. O procedimento de imobilização seguiu metodologia descrita por Lim e Moss (1981). Os pelletes após imobilização da levedura foram tratados com solução 0,3 molar de Al(NO3)3 por 5 minutos,

conforme ROCCA et al (1995). As células imobilizadas foram armazenadas a 4°C em uma solução de cloreto de cálcio, para posterior utilização nas fermentações. Uma foto do sistema utilizado para a imobilização é mostrado na Figura 1.

Figura 1 - Foto do sistema utilizado para a imobilização de Saccharomyces cerevisae em alginato de sódio.

2.3. Quanto à fermentação

Vários esquemas de operação foram testados para se avaliar a estabilidade e eficiência do biorreator: (i) biorreator com partículas suspensas por agitação; (ii) reator tubular contínuo de leito fluidizado com retirada de CO2; e (iii) Reator de mistura modificado com fluxo direcionado,

conforme indicado na Figura 2. Devido a dificuldades operacionais decorrentes das configurações (i) e (ii), das quais destacam-se: (a) flutuação de partículas para o nível máximo do biorreator, com diminuição de eficiência; (b) dificuldade com a geração de CO2; (c) diminuição de estabilidade da

partícula para regimes de agitação para suspensão e fluidização. A opção (iii) foi então avaliada e mostrou ser uma alternativa de resposta a esses problemas. Os experimentos efetuados foram conduzidos para a operação em batelada, com temperatura controlada a 32ºC. As fermentações foram acompanhadas determinando periodicamente a concentração de glicose pelo método do DNS, a concentração celular no meio e no interior dos pellets por espectrofotometria e a concentração de etanol por oxidação com dicromato de potássio e espectrofotometria. A concentração de células imobilizadas, ou seja, a concentração no interior do pellet foi quantificada em intervalos de 1 hora. Recolheu-se uma amostra de 4 pellets de alginato do fermentador e estes foram colocados em 10 mL de uma solução de citrato de potássio 4% (p/v), por um período de 2 horas, para que os mesmos fossem dissolvidos. Em seguida a solução foi centrifugada a 12000 rpm por 6 minutos. O sobrenadante foi descartado e o material sólido contido no frasco foi suspenso em água destilada e determinada a concentração celular por espectrofotometria a 650 nm.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Avaliação do biorreator modificado

Após o estudo da eficiência de diversas configurações de reator no processo de fermentação com leveduras imobilizadas, a opção selecionada e proposto neste trabalho é a do biorreator modificado apresentado na Figura 2, denominado reator modificado com fluxo direcionado, que foi desenvolvido utilizando uma placa perfurada fixada no centro do reator, a fim de criar uma barreira física, fazendo com que os pellets, ao acumularem CO2, continuassem em contato com o meio de

fermentação, não se acumulando na parte superior do reator. Em cada uma das duas partes do reator, acima e abaixo da placa perfurada, foi projetada uma turbina de agitação mecânica que garantia uma recirculação eficiente do meio líquido pelo meio composto por partículas em suspensão na parte inferior do biorreator. Esta configuração de reator foi eficiente, tanto no que diz respeito à mistura do meio em fermentação, quanto na manutenção de estabilidade da levedura imobilizada. Para se avaliar a concentração de células nas partículas do sistema proposto foi desenvolvido um sistema para coleta dos pellets durante o processo de fermentação. Esse dispositivo permitiu o acompanhamento do crescimento celular no interior dos pellets, além de verificar o aumento do diâmetro dos mesmos. O acompanhamento da concentração de etanol, glicose e células livres foi também efetuado durante os experimentos.

Figura 2 - Reator utilizado em processo operando em batelada com direcionador de fluxo 3.2. Estudo da eficiência de imobilização

A eficiência de imobilização foi definida como sendo a razão entre a concentração de células livres no meio e a concentração de células imobilizadas durante o processo de fermentação. A eficiência de imobilização avaliada para fermentações com concentrações variáveis de glicose no meio fermentativo de 52 a 148 g/L é apresentada na Figura 3, para uma concentração inicial de levedura no meio de imobilização igual a 36g/L. Após 10 horas de fermentação, o máximo valor obtido para a razão entre células livres e células imobilizadas foi de 0,35%. Isto mostra que o processo de imobilização foi bastante satisfatório no que diz respeito à retenção das células dentro dos pellets. O crescimento celular no meio externo aos pellets de levedura foi desprezível.

Figura 3 - Análise da eficiência de imobilização dada pela razão existente entre células livres no meio e células imobilizadas

3.3. Cinética da fermentação com levedura imobilizada

A cinética de consumo de glicose, formação de etanol e crescimento celular no interior dos pellets foi analisada segundo 11 modelos cinéticos, conforme proposto por Birol (1998). Utilizando o software Scilab, estes modelos foram avaliados com o objetivo de verificar a adequabilidade dos mesmos para representar os ensaios realizados neste trabalho. Constatou-se que os modelos que melhor descreveram o sistema com células imobilizadas em alginato de sódio foram o modelo cinético de Monod e de Hinshelwood. O modelo descrevendo a variação da concentração do substrato é dado pela Equação 1 em que as variações de concentração de células e produto são dadas na Tabela 1 para os modelos cinéticos selecionados dentre todas todas as avaliações efetuadas. As determinações paramétricas foram feitas utilizando o algoritmo de evolução diferencial (STORN e PRINCE, 1995) de forma a ajustar todos os experimentos realizados simultanemante.       ⋅ −       ⋅ − = dt dP Y dt dX Y dt dS S P S X/ / 1 1 (1)

O problema de sintonia de modelos foi representado por uma função objetivo quadrática representando o somatório do quadrado dos resíduos de todos os dados experimentais e os modelos cinéticos investigados. Os parâmetros da Tabela 2 são as soluções encontradas para um problema de minimização com precisão de 10-6, 15 membros da população e uma probabilidade de cruzamento de 80% no algoritmo de evolução diferencial.

Tabela 1 - Modelos cinéticos selecionados. Modelo dt dX dt dP A

X

S

K

S













+

µ

X

S

K

S

q













+

(

K

P

)

X

S

K

S

−













+

1

µ

(

K

P

)

X

S

K

S

q

−













+

1

Tabela 2 – Valores dos parâmetros ajustados para Modelo proposto por Monod e Hinshelwood

Parâmetros Monod Hinshelwood

max

µ

q

K

K

K

K

Y

Y

As Figuras (4)-(5) apresentam a comparação dos valores experimentais com aqueles previstos pelos modelos de Monod e Hinshelwood.

Figura 4: Comparação de perfis experimentais e obtidos com o modelo de Monod para S0=148,5g/L

Figura 5: Comparação de perfis experimentais e obtidos com o modelo de Hinshelwood para S0=148,5g/L

4. CONCLUSÃO

• Os pellets de levedura imobilizada obtidos utilizando o alginato de sódio na concentração de 3% foram mais estáveis do que os obtidos com 2%. O tratamento dos pellets com Al(NO3)3

aumentou a estabilidade dos mesmos em relação à ruptura.

• A adição de CaCl2 ao meio de cultura, contribuiu consideravelmente para melhoria da

estabilidade dos pellets durante as fermentações.

• Foi desenvolvida uma nova configuração de reator, dotado de uma placa perfurada no interior do mesmo, visando minimizar os efeitos do acúmulo do CO2, das forças de cisalhamento e

outros efeitos externos e melhorar a eficiência de fermentação. Neste reator as fermentações foram conduzidas sem a observação de rompimento observável dos pellets.

• O estudo cinético mostrou um ajuste bastante robusto dos pontos experimentais, e os modelos que melhor se ajustaram (simultaneamente a todas condições investigadas) no processo conduzido foi o modelo de Monod e o modelo de Hinshelwood.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPEMIG e CNPq pelo apoio financeiro. 6. REFERÊNCIAS

BATISTA, M.A., CARVALHO, W., SILVA, S.S., “ Imobilização de células de Cândida

guilliermondii em gel de alginato de cálcio: Efeito do tempo de cura na viabilidade celular.”, In:

Simpósio de Iniciação Científica, 3, 1999, Marília, Brasil. anais... Marília: UNIMAR – Universidade de Marília, p.150, 1999.

BIROL, G., DORUKER, P., KIDAR, B., ONSAN, Z.L., ULGEN, K., “ Mathematical description of ethanol fermentation by immobililzed Saccharomyces cerevisae” Process Biochemistry, v.33, n.7, p.763-771, 1998.

CARVALHO, C. Estudo da imobilização de Cândida guilhermondii FTI 20037 para obtenção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar. Lorena, 2000. 108p. Disseração (Mestrado em Biotecnologia Industrial) Departamento de Biotecnologia industrial, faculdade de Engenharia Química de Lorena. 2000.

LIM, F.; MOSS, R. D. , “Microencapsulation of living cells and tissues.”, Journal of Pharmaceutical Science, v.70 n. 4, p. 351-354, 1981.

PANTOJA, L. Seleção e aproveitameno Biotecnológico de Frutos encontrados na Amazônia para elaboração de bebida alcoólica fermentada utilizando levedura imobilizada. Tese (Doutorado em Biotecnologia), Universidade Federal do Amazonas, Amazonas, 2006.

ROCCA, E., CAMESELLE. C., NUNEZ, M.J., LEMAS, J.M., “Continuous ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae immobilised in Ca-Alginate beads hardened with Al3+.”, Biotechnology techniques, v.9, p+815-820, 1995.

STORN, R., PRICE, K. Differential Evolution – A Simple and Efficient Heuristicfor Global optimization over Continuous Spaces, Journal of Global Optimization vol.11, pp. 341–359, 1995.

KINETIC STUDY OF THE ALCOHOLIC FERMENTATION IN CELLS

IMMOBILIZED IN SODIUM ALGINATE

Larissa Nayhara Soares Santana1

Faculdade de Engenharia Química - Universidade Federal de Uberlândia – Av. João Naves de Ávila, 2121 – Campus Sta. Mônica – Bloco K – CEP: 38400-902 – Uberlândia – MG – Fone: (34) 3239-4189.

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Patrícia Tavares Cordeiro2

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Luís Cláudio Oliveira Lopes3

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Abstract: The present article has as objective develops pellets of resistant alginate to the

fermentation and to study the kinetics of the production of alcohol starting from cells of Saccharomyces cerevisiae immobilized in sodium alginate. Concentrations of sodium alginate of 3% and 2% were tested, in order to verify the stability of the pellets. The pellets were submitted the a treatment with Al(NO3)3 that took the an increase of the stability of the same ones in relation to the rupture. During the rehearsals fermentative it was proposed a new reactor configuration that consisted of a mixture reactor operated in boat-load, endowed with a plate perforated located in the center of the reactor, whose purpose was to impede the flotation of the pellets of cells immobilized during the fermentation. For the kinetic study several models were tested seeking to describe the profiles of the substratum concentrations and product in the reactor and of cells inside the pellet and in the liquid middle. The kinetic models of Monod, Hinshelwood and Levenspiel were the most appropriate for the description of the process of ethanol production using cells of Saccharomyces cerevisiae immobilized in alginate, and the certain kinetic parameters for the three models were shown appropriate to simulate the results of all of the accomplished experiments.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation, immobilization of microorganisms,