FOTOACÚSTICA: CONSTRUÇÃO E APLICAÇÕES
Luana Carina Benetti
1, Paulo R. Innocente
2RESUMO: Neste trabalho é descrita a técnica de Espectroscopia Fotoacústica com Célula
Aberta (Open Photoacustic Cell - OPC) bem como sua montagem experimental. Mostra-se que
a configuração experimental pode ser realizada com materiais de baixo custo. A técnica
fotoacústica é aplicada para observação do efeito negativo, relacionado a evolução do oxigênio,
em amostras de Camboatã Vermelho e Eucalipto Citriodora. A técnica permite experiências “in
vivo” e as analises com uso desta técnica apresentam-se de acordo com os resultados
esperados. Palavras – chave: fotoacústica, fotossíntese
INTRODUÇÃO: A Fotoacústica é uma técnica experimental, através da qual, é possível analisar
as propriedades e o desenvolvimento de plantas relacionadas à fotossíntese. Esta técnica
consiste em medir o calor e o oxigênio liberados pela incidência de luz sobre a folha de uma
árvore. Tanto o calor, como o oxigênio, quando emitidos formam uma onda sonora, fazendo
oscilar o diafragma do microfone. O processo fotossintético inicia com a absorção de energia,
proveniente da luz. A energia absorvida excita os elétrons das moléculas de clorofila que
“saltam” para fora desta, dando início a fase fotoquímica da fotossíntese. Nesta fase é gerado o
oxigênio e o armazenamento de energia, no entanto, nem toda a energia absorvida é
armazenada, parte dela se dissipa em forma de calor. Apesar de ser uma técnica recente, a
técnica fotoacústica vem sendo muito utilizada por não necessitar de grande preparação da
amostra podendo ser utilizada “in vivo”, havendo várias teses, dissertações e artigos
publicados. A montagem experimental tem um custo elevado, uma vez que não se trata de um
equipamento que encontra-se pronto no mercado e, portanto um dos desafios deste trabalho foi
realizar a montagem experimental da técnica fotoacústica com um custo relativamente baixo,
mas que obtivesse resultados significativos. Pode-se dizer que o trabalho foi dividido em duas
partes. A primeira, a montagem experimental, envolvendo a aquisição e fabricação de
equipamentos e a segunda, os testes com amostras para verificar o funcionamento do
equipamento. Para montagem experimental tivemos como referência as teses e dissertações já
publicadas em que constam esquemas da montagem e até equipamentos utilizados. O
equipamento foi composto pelos seguintes itens: fonte de luz intensa e contínua (duas lâmpada
de tungstêncio de 200 W), fonte de luz pulsada laser, filtro para infravermelho, lentes,
processador, conversor analógico digital, amplificador e a célula fotoacústica com microfone de
eletreto. Os testes foram realizados com amostra de Camboatã Vermelho, fornecido pelo
Viveiro Florestal da Unochapecó e Eucalipto Citriodora e seus resultados encontram-se no
capítulo 4 do presente trabalho.
CONCEITOS BÁSICOS: Albert Einstein em 1905 propôs que a luz era composta por partículas
de energia denominado fóton. A energia que cada fóton possui é dada por E=h.f, sendo h a
constante de Plank e f a freqüência da onda, isto é, quanto maior a freqüência da onda
absorvida, maior será a energia do fóton. Pigmentos são substâncias capazes de absorver luz.
Um pigmento absorve todos os comprimentos de onda, aparece na cor preta, já os pigmentos
absorvem apenas comprimentos de onda determinados e aparecem, na cor dos comprimentos
de onda refletidos. A clorofila é um pigmento que torna as folhas dos vegetais verdes, pois
absorve comprimentos de onda violeta, azul e vermelho, refletindo principalmente luz verde.
Observa-se que os picos de produção fotossintética ocorrem juntamente com os picos de
absorção da clorofila a e ocorrem em 435nm e 680nm, região que corresponde ao azul e ao
1 Acadêmica Curso de Física – Licenciatura Plena, Unochapecó, e-mail: lucbenetti@unochapeco.edu.br 2 Professor Orientador Mestre em Física
vermelho, respectivamente. É justamente pela coincidência nos picos de produção
fotossintética e absorção da radiação que a clorofila a é um dos pigmentos mais importantes na
absorção de radiação. A absorção de energia implica no aumento de energia das moléculas.
Quando uma molécula está em seu estado fundamental de energia e absorve um fóton, ela
passa para um estado de maior energia. Como a energia do fóton é igual a E=h.f, isso significa
que a luz azul, por possuir maior freqüência, excita mais a clorofila a do que a luz vermelha, no
gráfico representado pelo maior pico. De acordo com Mesquita (2005, p. 11), “...no estado de
mais alta energia a molécula é muito instável [..] perdendo parte da energia absorvida na forma
de calor e decaindo para um estado excitado de mais baixa energia”. A clorofila pode retornar
para seu estado fundamental por várias maneiras: 1. A energia é total ou parcialmente
convertida em calor, liberando um fóton de luz de energia menor que a absorvida, denominado
fluorescência. 2. A energia é transferida da clorofila excitada para a clorofila vizinha, deixando a
vizinha excitada e a primeira retornando ao estado fundamental. 3. Processo denominado
Ressonância, o elétron de alta energia da clorofila, é transferido para a molécula vizinha,
oxidando a clorofila e reduzindo a molécula vizinha. Para as células o segundo e terceiro
processos são mais interessantes, pois permitem o armazenamento de energia. Enquanto no
primeiro todo o trabalho realizado para a transformação de energia, torna-se inútil para a célula.
Fotossíntese: De forma geral a fotossíntese é o processo pelo qual alguns organismos
convertem energia luminosa em energia química, produzindo substâncias orgânicas. A
fotossíntese ocorre no interior dos cloroplastos, ali estão presentes pigmentos, como a clorofila,
capazes de captar a energia luminosa e transformá-la em energia potencial química. É nos
cloroplastos que ocorre uma das principais etapas da fotossíntese e a mais importante para
este estudo, é a etapa fotoquímica ou reações de claro. É nesta fase, que ocorre a absorção da
luz, o transporte de elétrons e a produção do ATP. Após essa fase ocorre a fixação do carbono,
que é a conversão do CO
2em glicídios, é denominada fase química ou reações de escuro e
não necessita da luz para ocorrer. As moléculas dos pigmentos fotossintetizantes (clorofilas e
carotenóides) absorvem a energia luminosa. A energia absorvida excita os elétrons da clorofila,
que adquirem um alto nível de energia e “saltam” para fora da molécula. Os elétrons perdidos
pela clorofila são recuperados retirando-os das moléculas de água, forçando a fotólise da água.
Ao ter elétrons removidos, as moléculas de água se decompõem em íons de H
+(prótons), e
átomos de oxigênio, estes se unem formando o gás oxigênio O
2que é liberado para o meio. Os
elétrons excitados, que “saltaram” da clorofila, são transferidos de uma substância aceptora
(citocromo) para outra, nessa transferência liberam parte da energia captada na forma de luz. A
última substância aceptora é o NADP (fosfato de dinucleotídio de nicotinamida-adenina) que se
une com os íons para formar o NADPH. Unindo a equação química da fotólise da água e o
transporte de elétrons, temos: 2H
2O+2NAPH
+O
2+2H
++2NAPH
+. A energia que os elétrons
liberam ao serem transportados pelas substâncias aceptoras, é usada para forçar a passagens
dos íons H
+pela membrana tilacóide, os prótons se acumulam no lúmen tilacóide, devido a alta
concentração os íons tendem a ir para o estroma. A passagem dos prótons leva a produção do
ATP (trifosfato de adenosina), a partir de uma molécula de ADP (difosfato de adenosina) mais
um fosfato. O ATP funciona como um agente armazenador de energia, através das ligações
entre os fosfatos que envolvem grande quantidade de energia. Esse processo é denominado
fotofosforilação. A fase química ou de escuro, ocorre no estroma dos cloroplastos. Nessa
etapa, o NADPH e o ATP gerados na fase anterior, fornecem, respectivamente, átomos
hidrogênio e energia para a produção dos glicídios a partir do gás carbônico. Basicamente, na
fase fotoquímica da fotossíntese é gerado, a partir da água, o gás oxigênio e o armazenamento
de energia, para na etapa química ocorrer a produção dos glicídios a partir do gás carbônico. A
fotossíntese pode ser resumida pela equação: 6CO
2+ 6H
2O
2 C
3H
6O
3+ 6O
2.
Espectroscopia Fotoacústica: A espectroscopia fotoacústica é uma técnica experimental, que
consiste na incidência de luz modulada sobre uma amostra, como uma folha de árvore, a
absorção da luz provoca uma variação de temperatura, também de forma modulada, gerando
um efeito mecânico de contração e expansão, dando origem a ondas de pressão, captadas
através de microfones. Da análise dos sinais captados é possível entender e monitorar, por
exemplo, processos metabólicos e reações fotossintéticas. O efeito fotoacústico pertence aos
chamados efeitos fototérmicos e foi descoberto por Alexander Graham Bell em 1880. Bell
percebeu que ao incidir luz modulada sobre um sólido numa câmara, produzia um som que
podia ser ouvido através de um tubo ligado à câmara. Posteriormente, Bell se dedica à
investigar os efeitos fotoacústicos em líquidos e gases. Com o advento do microfone em 1938,
desperta o interesse por experimentos qualitativos e quantitativos em gases e, surgem diversas
teorias a respeito. Somente na década de 70 é que a fotoacústica volta a ser aplicada ao
estudo das propriedades dos sólidos. Em 1976, surge a primeira interpretação teórica do efeito
fotoacústico em sólidos, proposta por Rosencwaig e Gersho. Outros pesquisadores
continuaram desenvolvendo modelos matemáticos para melhor entender a técnica e suas
diversas formas de aplicação. Hoje a espectroscopia fotoacústica tem aplicações não apenas
na física, mas na química, biologia, engenharia e medicina. A técnica fotoacústica começa a ser
aplicada ao estudo da fotossíntese em 1976, por Adams M. J. ao obter o espectro fotoacústico
de uma solução preparada a partir da clorofila extraída de folhas de espinafre. Dois anos depois
Rosencwaig, mostrou ser possível obter o espectro fotoacústico de uma folha, colocando-a em
uma célula fechada. Em 1986, Perondi e Miranda apresentam a Célula Fotoacústica Aberta
(OPC). E poucos anos depois, a OPC foi completamente introduzida no campo de estudo da
fotossíntese. Célula Fotoacústica Aberta: Segundo Mesquita (2005, p.28), o espectrômetro
fotoacústico é composto por duas fontes de luz, uma lâmpada de Xenônio e uma de filamento
de tungstênio. À frente a lâmpada de xenônio é colocada uma pá mecânica que serve como
modulador. Para que a luz seja modulada em um comprimento de onda específico utiliza-se um
monocromador, que permite controlar a resolução do comprimento de onda. Também são
utilizados filtros ópticos para limitar a luz emitida pela lâmpada. Uma lente de quartzo focaliza o
feixe resultante numa das entradas do cabo óptico bifurcado, que guia a luz até a célula
fotoacústica. O filamento de tungstênio é usado para produzir a saturação fotossintética. Em
frente a ele é colocada uma coluna de água (para cortar o espectro infravermelho), e uma lente
para focalizar o feixe na outra estrada do cabo óptico. A Open Photoacustic Cell (OPC) no
estudo de plantas é adequada, pois permite a utilização de uma mesma amostra várias vezes
podendo inclusive acompanhar o desenvolvimento da mesma. A OPC é constituída por um
microfone de eletreto comercial, cuja câmara é usada como célula fotoacústica. O microfone é
composto por um diafragma de eletreto metalizado e uma placa de metal, separados por uma
fina camada de ar e conectados por um resistor. As oscilações de pressão na câmara de ar
provocam deflexões na membrana, gerando uma voltagem através do resistor. Esta voltagem
passa por um pré-amplificador interno ao microfone. A célula é acomodada em um suporte de
alumínio para facilitar a fixação na folha. As amostras vegetais são plantadas em recipientes até
atingirem idade e tamanho suficiente para o estudo fotoacústico. Segundo Barja (1996, p. 25), o
tamanho ideal para o estudo é de 30cm, para caber adequadamente sobre a célula fotoacústica
aberta. Efeitos de Absorção: Ao iniciar o uso da técnica fotoacústica em plantas, esperava-se
observar apenas o efeito térmico, resultante da transformação da energia luminosa em calor.
No entanto, percebeu-se que o sinal fotoacústico é gerado pela ocorrência de dois efeitos, o
térmico (como era esperado) e outro proveniente da liberação de gás oxigênio, durante a
fotossíntese, que também produz uma variação de pressão na câmara fotoacústica. Este efeito
é denominado efeito bárico. Parte da luz modulada incidente é absorvida pelas folhas,
convertida em energia química e o restante liberado na forma de calor (ou luz -fluorescência),
também de forma modulada. A resposta fotossintética (componente bárica) à luz é modulada, e
para eliminá-la usa-se uma fonte de luz branca, contínua e de alta intensidade, capaz de atingir
a saturação fotossintética, ou seja, o aumento de luz não provocará mais um aumento do sinal
devido a liberação do oxigênio. A incidência de luz contínua (ou luz de saturação) pode gerar
diferentes efeitos dependendo da freqüência de modulação da outra luz incidente. a) Efeito
Negativo: Se a freqüência de modulação for baixa, a adição de luz contínua, provocará a
saturação fotossintética, eliminando a componente bárica – de evolução modulada do oxigênio.
A conversão de luz modulada em energia química se anula e o oxigênio produzido é liberado de
forma contínua. O sinal fotoacústico decresce quando a luz é adicionada. b) Efeito positivo: O
oxigênio é produzido nos cloroplastos e necessita de tempo para chegar a região onde ocorre a
geração da onda acústica. Assim, quando a freqüência de modulação é alta, o sinal
fotoacústico devido a componente bárica não estará em fase com a freqüência de modulação, o
oxigênio evoluído difunde-se lentamente no inteior da folha não contribuindo para o sinal
fotoacústico. Neste caso, ocorrerá um aumento na amplitude do sinal fotoacústico quando a
lâmpada de saturação é, já que a energia absorvida é quase totalmente convertida em calor.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: optou-se por realizar as medidas teste com uma muda
de Camboatã Vermelho, que estava sendo cultivada pelo Viveiro Florestal da UNOCHAPECÓ e
uma muda de Eucalipto Citriodora. O Camboatã vermelho é uma espécie nativa da região oeste
catarinense, encontra-se em extinção e esta entre as várias espécies cultivadas pelo Programa
Viveiro Florestal da UNOCHAPECÓ. O Eucalipto Citriodora, também conhecido como Eucalipto
Cheiroso é muito utilizado para exploração comercial de folhas para a extração de óleo, devido
ao seu cheiro. Ambos foram usados “in vivo”, isto é, sem destacar a folha da planta. Altura das
plantas usadas estava entre 30 e 40 cm. Montagem Experimental: o equipamento
compreende fonte de luz intensa e contínua (duas lâmpada de tungstêncio de 200 W), fonte de
luz pulsada laser de comprimento 650 nm, filtro para infravermelho (recipiente de vidro com
água), três lentes convergente, processador, conversor analógico digital, amplificador e a célula
fotoacústica construída em latão e microfone de eletreto. A parte eletrônica e a célula foram
construídas com auxílio de terceiros. O valor total gasto com o equipamento, não chegou a 10%
do convencional. O processador permite a escolha da freqüência do laser numa freqüência que
pode variar de 1 a 999Hz, evitando o uso de modulador mecânico. A fonte de luz de tungstênio
foi usada para saturar a fotossíntese. A célula fotoacústica consiste em um cilindro de latão com
um orifício de cerca de 1,0 cm de diâmetro onde é encaixado o microfone de eletreto, acima do
microfone é colocado a amostra que é vedada com um outro cilindro, este de espessura menor.
O microfone de eletreto foi conectado a um amplificador, em seguida vem o conversor
analógico digital e o computador onde os dados são recebidos e analisados. As medidas foram
realizadas num tempo de cerca de 60 s, sendo nos primeiros 20 s a amostra recebe luz laser
numa baixa freqüência (10 Hz), depois recebe também luz intensa de cerca de 300 W/m
2e nos
últimos 20 s volta a receber apenas a luz laser de baixa freqüência.
ANALISE DOS RESULTADOS: As medidas foram realizadas “in vivo”, utilizando a técnica
OPC. Utilizamos folhas de Camboatã Vermelho e Eucalipto Citriodora. O tempo de cada medida
foi de aproximadamente 60 s segundos e em ambas as amostras foi possível perceber o efeito
negativo. O tratamento dos dados e plotagem dos gráficos foram realizados como o uso do
software Matlab. A Figura 1 mostra a amplitude do sinal (em mV) versus tempo de incidência
para o Camboatá Vermelho e a Figura 2 da amostra de Eucalipto Citriodora.
As setas para cima e para baixo representam respectivamente o inicio e término da incidência
de luz contínua de fundo sobre a amostra. Em ambos os gráficos, podemos perceber 3 etapas
ou fases. Na primeira a amplitude é elevada, na segunda há um decréscimo do sinal e na
terceira a amplitude do sinal volta a ser elevada. Na primeira fase, correspondente 20 e 30
primeiros segundos da Figura 1 e 2, respectivamente, há uma elevação da amplitude do sinal
fotoacústico, neste momento há apenas a incidência da luz laser modulada a uma freqüência
de 17Hz. As moléculas de clorofila absorvem a energia proveniente da luz de forma modulada,
dando início a fase fotoquímica da fotossíntese, que tem como resultado o armazenamento de
energia, liberação de oxigênio e, como vimos, de calor. A liberação de oxigênio e calor gera
ondas de pressão moduladas, que são captadas pelo microfone de eletreto, ou seja, o sinal
fotoacústico observado neste primeiro momento é devido a liberação modulada de calor e
oxigênio de forma modulada, isto fica bastante visível na Figura 2, onde o tempo de medida foi
maior. Observe que os picos parecem se repedir a cada instante nesta primeira fase, dando
indícios da modulação do sinal fotoacústico. Na segunda fase, início indicado pela seta para
cima, além do lazer, é ligada a luz contínua de fundo ou luz de saturação, e verifica-se um
decréscimo na amplitude do sinal. Como a freqüência de modulação é baixa (17Hz), a luz
contínua de fundo atua de forma a saturar a evolução do oxigênio (componente bárica). As
moléculas de clorofila passam a absorver a energia continuamente, assim a liberação do
oxigênio passa a ocorrer também de forma contínua, como não há variação de pressão, o sinal
devido a liberação do oxigênio deixa de ser captado pelo microfone de eletreto e não contribui
para o sinal fotoacústico, assim o sinal deve-se apenas a liberação de calor (componente
térmica), mas o oxigênio continua sendo liberado. Ao apagar a luz contínua, indicada pela seta
para baixo, deixando novamente apenas o lazer, a absorção de energia pelas moléculas de
clorofila volta a ocorrer de forma modulada, a liberação de oxigênio e calor também e, volta a
ser captado pelo microfone. Identifica-se este aumento do sinal fotoacústico na terceira fase. Se
na primeira fase, o sinal deve-se apenas a liberação de calor, podemos perceber que esta é
relativamente baixa se comparada à evolução do oxigênio, ou seja, a contribuição do oxigênio
para o sinal fotoacústico é maior do que a de calor. Isso significa que durante o processo
fotossintético, uma pequena parcela de energia é dissipada na forma de calor, enquanto a outra
parte é armazenada durante o processo fotoquímico, processo este que identificamos através
da liberação de oxigênio, para ser utilizada durante a fase química da fotossíntese que tem
como resultado a produção da glicose.
CONSIDERAÇÕES FINAIS: O trabalho realizado mostrou que é possível desenvolver técnicas
de pesquisa com custos relativamente baixos, e que a confecção de equipamentos de
aquisição de dados além de eficaz torna-se indispensável para se fazer pesquisa com
Intensidade da luz de 650nm: 11,3W/m2; frequência de
modulação: 17Hz. Intensidade luz de saturação (125W/m2).
Figura 1: Gráfico efeito negativo em folhas de Camboatã
Vermelho
Intensidade da luz de 650nm: 11,3W/m2; frequência de
modulação: 17Hz. Intensidade luz de saturação (250W/m2).
Figura 2: Gráfico efeito negativo em folhas de Eucalipto
