iii
iv DEDICATÓRIA
Aos meus pais, por tornarem possíveis as minhas conquistas.
v AGRADECIMENTOS
Desde o início do mestrado, contei com a confiança, apoio e amizade de inúmeras pessoas. Sem elas, esta investigação não teria sido possível.
Agradeço à minha orientadora, Profa Helena Coutinho Franco de Oliveira, pelo exemplo de dedicação a pesquisa a ser seguido. Aos professores Antônio Carlos Boschero, Everardo Magalhães Carneiro, Lúcia Nassi Castilho e Eliana Cotta de Faria que me acompanharam durante o mestrado.
À minha família e amigos pelo apoio e por sempre me lembrarem que a vida é feita de coisas boas. Ao Gustavo pelo amor e companheirismo.
Às minhas super amigas Elisa Jackix, Giovana Costa, Lilia Zago, Adriana Botelho e Mônica Teixeira dos Santos pela amizade e cumplicidade na vida pessoal e profissional.
Ao grupo Qual, sobretudo à Profa. Semíramis M. A. Domene e à Marlene Braz por me iniciarem na pesquisa e me acompanharem com tanto carinho.
À Maria Lucia Bonfleur, Gabriel de Gabriel e Dorighello, Patrícia Riva Patrício, Alessandro Salerno, Letícia Paiva Siqueira, Mariana Costa Simões e Emerielle Cristine Vanzela meus sinceros agradecimentos pelo espírito em equipe que esteve sempre presente em nosso laboratório. Agradeço por toda ajuda, dedicação e disponibilidade para realização dos experimentos, discussão dos resultados e pelo companheirismo fora do laboratório.
Agradeço aos colegas e amigos do Laboratório de Pâncreas Endócrino e Metabolismo, pela convivência e ajuda sempre que necessária. Ao funcionário Léscio Domingos Teixeira, pelo seu exemplo de seriedade e competência profissional e aos demias funcionários do Departamento de Fisiologia e Biofísica, Alexandra e Ivo, pela atenção e auxílio dispensados sempre que necessário.
vi Sumário RESUMO ... 9 ABSTRACT ... 10 LISTA DE ABREVIATURAS ... 11 INTRODUÇÃO ... 13
I. Metabolismo de lipoproteínas e aterosclerose ... 13
II. Transporte reverso de colesterol (TRC) ... 15
III. Efeito da CETP sobre as lipoproteínas plasmáticas ... 17
IV. CETP e aterogênese ... 19
V. Regulação da CETP: fatores hormonais e nutricionais ... 20
VI. Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (peroxisome proliferator-activated receptors) (PPAR)... 22
VII. Fibratos ... 23
VIII. Efeito dos ácidos graxos n-3 e n-6 sobre o metabolismo de lipoproteínas e risco de aterosclerose. ... 26
Justificativa para o estudo da regulação da CETP por ácidos graxos ... 31
Modelos animais geneticamente modificados ... 33
OBJETIVO ... 34
MATERIAIS E MÉTODOS ... 34
I. Animais Transgênicos (Tg)... 34
II. Tratamento dos animais ... 35
III. Fluxograma: Protocolos de tratamento. ... 37
IV. Análises bioquímicas ... 38
V. Extração lipídica do fígado ... 38
VI. Atividade da CETP no plasma ... 38
VII. Expressão RNA mensageiro por RT-PCR ... 39
VIII. Fracionamento de lipoproteínas por FPLC (Fast protein liquid chromatography) 41 IX. Análise Estatística ... 42
RESULTADOS ... 42
DISCUSSÃO ... 50
CONCLUSÃO ... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
Apêndice ... 77
Quadro 1. Estimativa do consumo energético diário, considerando-se o consumo médio de ração em cada grupo e a dose média de suplemento de óleo. ... 77
Quadro 2. Composição de dietas experimentais ... 78
vii
Anexos ... 80 Autorização da Comissão de Ética em Experimentação Animal
Autorização da Comissão Interna de Biossegurança
Índice de figuras e tabelas
Figura 1. Esquema do transporte reverso de colesterol (TRC):... 17 Figura 2. Ação dos agonistas de PPAR em genes que codificam proteínas envolvidas no
transporte reverso de colesterol... 26 Figura 3. Evolução do peso corporal e consumo de ração em camundongos CETP
fêmeas (A) e machos (B) tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2 semanas ... 44 Figura 4. Concentrações plasmáticas (jejum) de leptina (A) e adiponectina (B) em
camundongos CETP machos e fêmeas tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2 semanas... 46
Figura 5. Atividade da CETP no plasma (A) e expressão do RNAm de CETP no fígado (B) de camundongos CETP machos e fêmeas tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2 semanas... 47
Figura 6. Atividade da CETP no plasma (A) e expressão de RNAm de CETP no fígado (B) em camundongos machos e fêmeas CIII/CETP tratados com três diferentes
fibratos (Bezafibrato - BEZA, Fenofibrato – FENO, Gemfibrozil – GEM) e veículo (goma arábica 2% - Cont) durante 2 semanas... 48
Figura 7. Expressão de RNAm hepático de PPARα (A), SREBP1 (B), SREBP2 (C) e LXRα (D) de camundongos CETP machos e fêmeas tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2 semanas... 49
Figura 8. Perfil da distribuição de colesterol nas lipoproteínas plasmáticas em
camundongos CETP fêmeas (A) e machos (B) tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2 semanas... 50
Figura 9. Esquema explicativo para respostas gênero-específicas da expressão de genes do metabolismo lipídico... 57
Tabela 1. Composição de ácidos graxos por 100 g de gordura dos óleos usados para suplementação dietética... 36
viii
Tabela 3. Peso corporal final, consumo de ração, peso relativo dos tecidos (% em relação ao peso corporal) e teor de gordura hepática em camundongos CETP machos (M) e fêmeas (F) tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina durante 2
semanas... 43
Tabela 4. Concentrações plasmáticas (jejum 12 h) de glicose e lipídios em camundongos CETP machos (M) e fêmeas (F) tratados com óleo de peixe, óleo de milho ou salina... 45
9 RESUMO
Os óleos de peixe e de milho são fontes de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) n-3 e n-6, respectivamente. Estes ácidos graxos são ligantes naturais dos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs) e, dessa forma, modificam a expressão de diversos genes envolvidos no metabolismo de lipídios. A proteína de transferência de colesteril-éster (CETP) é uma proteína plasmática sintetizada em vários tecidos, principalmente do fígado. A CETP participa do transporte reverso de colesterol, reduzindo HDL no plasma e aumentando o risco de aterosclerose. Este trabalho teve como objetivo investigar os efeitos dos óleos ricos em PUFA n-3 e n-6 e de fibratos (ligantes sintéticos de PPAR e agentes redutores de triglicérides) sobre a expressão e atividade da CETP. Assim, camundongos transgênicos que expressam a CETP foram tratados por duas semanas com óleo de peixe, óleo de milho ou salina, e camundongos CETP hipertrigliceridêmicos foram tratados com gemfibrozil (GEM), fenofibrato (FENO), bezafibrato (BEZA) ou veículo (control). Após os tratamentos com os PUFA, não foi verificada diferença no peso corporal, na ingestão ou no peso relativo do fígado e tecidos adiposos. Também não houve alteração das concentrações plasmáticas de glicose e triglicerídios. O óleo de peixe reduziu os níveis de ácidos graxos livres (37%) e colesterol (15%), enquanto o óleo de milho aumentou significativamente os níveis de colesterol. Comparado ao grupo salina, os camundongos tratados com óleo de milho apresentaram aumento nos níveis de leptina (30-40%). O tratamento com óleo de peixe elevou os níveis de adiponectina quando comparados com o grupo salina (27%) e com o grupo tratado com óleo de milho (31%). Dois dos três fibratos testados (FENO, GEM) induziram elevação da atividade plasmática (15-30%) e da expressão hepática de RNAm da CETP (53-75%) quando comparados ao grupo controle. FENO também reduziu a concentração plasmática de triglicérides. O óleo de peixe aumentou os níveis plasmáticos de CETP em relação aos grupos salina e óleo de milho (13-14%), efeito verificado apenas nas fêmeas. Entretanto, não foi observada alteração na expressão hepática de RNAm de CETP. Verificou-se que os tratamentos com os óleos PUFA reduziram a expressão hepática de RNAm de PPARα (36%) e o óleo de milho induziu aumento da expressão do fator de transcrição SREBP1 (120%) nos machos, mas não nas fêmeas. Os óleos PUFA também induziram aumento da expressão de SREBP2, porém, apenas em fêmeas. As alterações diferenciais de RNAm de PPARα, SREBP1 e SREBP2 em cada sexo poderiam estar implicadas na resposta gênero-específica da CETP frente aos PUFA. Assim concluímos que o gene da CETP é responsivo aos agonistas sintéticos de PPARα, e que os ácidos graxos n-3 controlam a expressão da CETP de maneira gênero-dependente e por mecanismo pós-transcricional.
Palavras- chave: fibratos, óleo de peixe, ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, PPARα, CETP.
10 ABSTRACT
Fish and corn oils are n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA) sources, respectively. They are natural ligands of the peroxisome proliferator activated receptors (PPARs), thus capable of modifying the expression of several genes involved in lipid metabolism. CETP is a plasma protein synthesized in several tissues, mainly liver, which reduces plasma HDL and increases the risk of atherosclerosis. The aim of this work was to investigate the potential effects of PUFA oils and fibrates on the CETP levels. Therefore, CETP transgenic mice were treated during 2 weeks with fish oil (FO), corn oil (CO) or saline, whilst hypertrygliceridemic CETP mice were treated with gemfibrozil (GEM), fenofibrate (FENO), bezafibrate (BEZA) or vehicle (control). There were no differences in body weight, food intake and relative weight of liver and adipose tissue after PUFA or saline treatments. Also, no changes were verified in glucose and triglyceride plasma levels after both PUFA treatments. FO reduced plasma free fatty acid (37%) and cholesterol (15%) levels, whilst CO increased cholesterol mildly. Compared to saline, mice treated with CO showed an increase in leptin levels (30-40%). Treatment with FO enhanced adiponectin plasma levels when compared to saline (27%) and CO (31%). Two out of the three fibrates (FENO, GEM) induced elevation in plasma CETP activity (15-30%) and liver mRNA expression (53-75%) when compared to control. FENO also reduced triglyceride levels. FO increased CETP plasma levels (13-14%) when compared to CO and saline, an effect verified only in females. However, no changes were observed in liver CETP mRNA expression. FO treatment decreased PPARα (36%) and CO increased SREBP1 liver mRNA levels (120%) in males, but not in females. PUFA treatment increased SREBP2 mRNA only in females. These distinct mRNA changes could explain gender-specific CETP response to PUFA treatments. In conclusion, CETP gene is responsive to PPARα agonists, and n-3 PUFA (FO) can regulate CETP expression by post-transcriptional mechanisms, in a manner dependent on the female context.
11 LISTA DE ABREVIATURAS
AA Ácido araquidônico
ABCA1 ATP binding cassette transporter A1
AG Ácido graxo
AGL Ácidos graxos livres apo A-1 Apolipoproteína A-1 apo CIII Apolipoproteína CIII apoB Apolipoproteína B apoE Apolipoproteína E BEZA Bezafibrato 14
CCE 14C-colesteril-éster cDNA DNA complementar CE Colesteril éster
CETP Proteína de transferência de colesteril éster CLA Ácido linoléico conjugado
CPT Carnitine palmitoyl transferase CYP7 Colesterol 7a-hidroxilase DAC Doença arterial coronariana DBP D-binding protein
DCV Doenças cardiovasculares DHA Ácido docosahexaenóico
dNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid / ácido etilenodiamino tetra-acético EPA Ácido eicosapentaenóico
FABP Fatty acid binding protein FAT/CD36 Fatty acid transporter/CD36 FATP Fatty acid transport protein FDA Food and Drug Administration FENO Fenofibrato
FPLC FXRα
Fast-protein liquid chromatography Farnesoid X receptor α
GEM Gemfibrozil
HDL High Density Lipoproteins / lipoproteínas de alta densidade HDL-C HDL-colesterol
IDL Intermediate Density Lipoproteins / lipoproteínas de densidade intermediária
IMC Índice de Massa Corpórea
LCAT Lecithin: cholesterol acyltranferase
LDL Low Density Lipoproteins / lipoproteínas de baixa densidade LDL-C LDL-colesterol
LH Lipase hepática
LP Lipoproteínas
LPL Lipoproteína-lipase
LRP LDL receptor related protein LXR Liver X receptor
12
MUFA Monounsaturated fatty acid / ácido graxo monoinsaturado PCR Reação em cadeia da polimerase
PLTP Phospholipid trasfer protein
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptors / Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos
PPRE Elemento responsivo ao PPAR
PUFA Poliunsaturated fatty acid / áciod graxo poliinsaturado
QM Quilomícrons
RAR Retinoic acid receptor RNA Ácido ribonucleico RNAm RNA mensageiro
RXR Retinoid X receptor /receptor do ácido 9-cis retinóico SAFA Saturated fatty acid / ácido graxo saturado
SR-BI Scavenger receptor type BI
SREBP Sterol Regulatory Element Binding Proteins TG Triglicérides
TRC Transporte reverso de colesterol UCP1 Mitochondrial uncoupling protein 1 VET Valor energético total
VLDL Very Low Density Lipoproteins / lipoproteínas de muito baixa densidade WT Wild type
13 INTRODUÇÃO
I. Metabolismo de lipoproteínas e aterosclerose
A aterosclerose, principal responsável pela patogênese do infarto miocárdico e acidente vascular cerebral, bem como de outras doenças vasculares periféricas, permanece como principal causa de morbidade e mortalidade nas populações “ocidentalizadas”. Anormalidades no metabolismo das lipoproteínas plasmáticas, principalmente em lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e de alta densidade (HDL), são fatores de risco primários para aterosclerose, cuja lesão mais precocemente reconhecível caracteriza-se por uma agregação de macrófagos carregados de colesterol (foam cells) e linfócitos T na íntima arterial, a chamada fatty streak. As lesões iniciais progridem em função de uma resposta inflamatória-fibroproliferativa exagerada à injúria ou disfunção das células endoteliais e musculares lisas da parede arterial (para revisão ver Ross, 1993, Fan e Watanabe 2003).
A homeostase do colesterol no compartimento plasmático e nos tecidos é regulada por processos fisiológicos complexos que envolvem a síntese e secreção de lipoproteínas, atividade de receptores celulares específicos para as lipoproteínas, atividade de enzimas lipolíticas e de proteínas de transferência de lipídios.
Há cinco classes principais de lipoproteínas plasmáticas (LP) transportadoras de lipídios, classificadas de acordo com sua densidade: as LP de densidade alta, baixa, intermediária e muito baixa, respectivamente, HDL, LDL, IDL, VLDL, e os quilomícrons (QM). As várias LP diferem entre si em densidade, tamanho e carga elétrica porque têm composição lipídica e protéica distintas. QM e VLDL são as chamadas LP ricas em triglícerídios (TG), de origem intestinal e hepática, respectivamente. Essas LP são metabolizadas no compartimento vascular pela lipoproteína-lipase (LPL) que hidrolisa seus TG gerando partículas remanescentes de quilomícrons e de VLDL. As IDL são os produtos intermediários e as LDL os produtos finais do catabolismo intravascular das VLDL. A LDL é a LP mais abundante do plasma dos seres humanos (cerca de 70% do colesterol plasmático é encontrada nessa fração).
14
As IDL e LDL são removidas da circulação sanguínea via receptores de LDL amplamente expressos em tecidos em proliferação, tecidos esteroidogênicos (gônadas e adrenal) e, principalmente, no fígado (Brown e Goldstein, 1986). Os remanescentes de QM e as IDL são também rapidamente captados por receptores hepáticos chamados LRP (LDL receptor related protein) (Herz et al., 1988). Uma vez dentro da célula, o colesterol derivado das LP exerce várias ações regulatórias, incluindo a repressão da expressão da enzima que catalisa a etapa limitante da biossíntese do colesterol, a HMG-CoA redutase, e a repressão da transcrição do gene do receptor da LDL. Desta forma, as células se protegem de um aumento excessivo da concentração de colesterol. Por outro lado, na deprivação de colesterol, as células aumentam a expressão da HMG-CoA redutase, estimulando a síntese de novo de colesterol, e aumentam também a expressão dos receptores de LDL, promovendo captação do colesterol exógeno (Brown e Goldstein, 1986). Como consequência, a concentração de LDL no plasma varia em função do número de receptores de LDL nos tecidos, principalmente no fígado. Estes podem estar diminuídos por defeito genético ou por excesso de colesterol na dieta que aumenta o aporte de lipoproteínas de origem intestinal (QM e remanescente) para o fígado.
Concentração elevada de LDL plasmática resulta em aumento da quantidade de LDL que se infiltra no espaço subendotelial. A LDL interage com elementos da matriz extracelular (ex.: glicosaminoglicanos e colágenos) e fica retida por mais tempo neste microambiente, onde sofre alterações químicas tais como oxidação e proteólise. Esta LDL quimicamente modificada estimula as células endoteliais a expressarem moléculas de adesão, facilitando a adesão e transmigração de células linfomonocitárias circulantes para o espaço subendotelial. Os monócitos proliferam-se e diferenciam-se em macrófagos que captam as LDL modificadas via receptores scavanger. Diferentemente dos receptores de LDL, os receptores scavanger não são regulados, e os macrófagos captam as LDL modificadas de maneira contínua, transformando-se em foam cells. Com o tempo, as foam cells morrem e vão constituir o núcleo necrótico da lesão aterosclerótica avançada. Células musculares lisas também migram da camada adventícia para a íntima, proliferam-se e finalmente transformam-se em foam cells. O processo ocorre em progressão geométrica
15
com a participação de um grande número de fatores de crescimento, citocinas e moléculas vasoregulatórias (Ross, 1993; Lusis, 2000 e Libby, 2000).
II. Transporte reverso de colesterol (TRC)
A expressão “transporte reverso de colesterol” foi criada a partir do trabalho de Glomset (1968) sobre estudos da atividade de uma enzima plasmática que esterifica o colesterol livre na superfície da HDL, a LCAT (lecithin: cholesterol acyltranferase). A LCAT é uma enzima sintetizada e secretada pelo fígado, cuja atividade é dependente de co-ativação pela apolipoproteína-A1 (Glomset, 1968). O TRC é definido como o transporte do colesterol proveniente de células de tecidos extra-hepáticos, que através da HDL é levado para excreção pelo fígado. Por reduzir o acúmulo de colesterol na parede das artérias, o TRC é um dos mecanismos que dificultam o desenvolvimento da aterosclerose (Tall, 1998; Sviridov et al., 2002).
Ao longo das três ultimas décadas, o TRC revelou-se uma complexa série de eventos envolvendo inúmeras proteínas (Figura 1).
O processo inicia-se com o efluxo do colesterol das membranas celulares para as HDL nascentes, essencialmente constituídas de apolipoproteína A-1 (apo A-1) pobre em lipídios, levando à formação de partículas chamadas preβ1 - HDL. Essa etapa é mediada pelo transportador ABCA1 (ATP binding cassette transporter A1), uma proteína de membrana que facilita a transferência de colesterol e fosfolipídios das membranas celulares para as HDL (Hayden et al., 2000).
O acúmulo de colesterol nas preβ1 - HDL caracteriza a formação das partículas preβ2 – HDL, e a contínua esterificação deste colesterol pela LCAT promove a formação de partículas esféricas denominadas α3 - HDL. A aquisição e esterificação de mais colesterol transformam essas partículas em HDL maiores denominadas α2 - HDL e α1 - HDL (para revisão ver Sviridov et al., 2002).
As partículas α – HDL sofrem a ação da proteína de transferência de colesteril éster (CETP), que promove a troca de colesteril éster presente na
16
HDL por TG das lipoproteínas que contêm apolipoproteína B (apoB-LP) (Tall, 1993). Nesta etapa podem ocorrer, também, a transferência de fosfolipídios mediada pela PLTP (phospholipid transfer protein) e ainda a hidrólise de TG e fosfolipídios por ação da lipase hepática (LH), enzima que se encontra ancorada nos sinusóides hepáticos. Destes processos decorre a reconversão das HDL em α3 – HDL e Apo-A1 pobre em lipídios (Sviridov et al., 2002).
O último passo do TRC envolve o SR-BI (scavenger receptor type BI), receptor hepático para HDL, que promove a captação seletiva do conteúdo de colesterol esterificado da HDL, para subsequente reutilização hepática ou excreção biliar (Acton et al., 1996). No fígado, o colesterol pode ser reutilizado para produção e secreção de VLDL para a circulação sanguínea ou ser direcionado para excreção na bile como colesterol, ou após conversão em ácido biliar. A enzima colesterol 7α-hidroxilase (CYP7) é a etapa regulatória neste processo de conversão de colesterol em ácido biliar (Shefer et al., 1970).
17
Figura 1. Esquema do transporte reverso de colesterol (TRC): 1- O TRC inicia-se com
o efluxo do colesterol das membranas celulares para moléculas de Apo- A1 pobres em lipídios, pré-beta-HDL ou α-HDL3. Esta etapa é mediada pelos transportadores de
membrana ABCA1 e ABCG1. 2- Segue-se a esterificação do colesterol da superfície da prébeta-HDL e α-HDL3 pela enzima LCAT, formando HDL maiores (α-HDL2). 3-
Ocorre troca de colesteril éster (CE) presente na HDL por triglicérides (TG) das apoB-LP, mediada pela CETP. 4- As apoB-LP são captadas pelo fígado através de seus receptores específicos. 5- Ocorre captação seletiva do conteúdo de colesteril éster das α-HDL2 pelo fígado através do receptor SR-BI, com conseqüente formação
(regeneração) de Apo-A1 pobre em lipídios e α-HDL3. 6- No fígado, o colesterol pode
ser convertido a ácidos biliares e excretado pela bile.
III. Efeito da CETP sobre as lipoproteínas plasmáticas
A CETP é uma glicoproteína de 74 KDa que facilita a transferência de colesterol esterificado (CE) das HDL para as LP que contêm apo B (quilomicrons, VLDL e LDL) (Tall, 1993). A CETP também promove a troca de TG no sentido inverso de maneira não equimolar (Oliveira e Quintão, 1996).
apoB apoA1 LDLr LRP SR-B1 VLDL IDL LDL α -HDL2
Tecidos extra hepáticos/ macrófagos
ABCA1/G1 α -HDL3 LCAT CYP7 Ácido biliar COL LCAT CETP CE TG COL/PL Pré β-HDL
18
Desta forma, a CETP desempenha importante papel no catabolismo da HDL, alterando também a composição química e a distribuição de colesterol nas lipoproteínas plasmáticas (Bruce et al., 1998; Tall, 1995).
Nos seres humanos, os órgãos que mais expressam o RNAm da CETP são o fígado, baço e tecido adiposo, enquanto níveis mais baixos de expressão são encontrados no intestino delgado, adrenal, rim e coração (Drayna et al., 1987). A síntese hepática parece ser a maior fonte da CETP no plasma dos primatas (Son et al., 1986). A CETP é expressa em várias espécies, incluindo primatas, coelhos, hamsters, répteis e peixes; enquanto camundongos e ratos não a expressam (Ha & Barter, 1982).
Estudos em humanos com mutações no gene da CETP mostraram que a falta desta proteína está relacionada com o aumento dos níveis plasmáticos de HDL, portanto elevados níveis de CETP reduzem a HDL, o que representa uma condição pró-aterogênica da CETP, já que a HDL promove o transporte reverso de colesterol, processo eficiente de remoção do excesso de colesterol das células (incluindo o da parede arterial) pelas HDL. Além disso, a HDL possui propriedades antioxidante, antitrombótica e antiinflamatória (Koizumi et al., 1985; Moriyama et al., 1998). Entretanto, a CETP pode ser também reconhecida como fator antiaterogênico por facilitar o TRC de diversas maneiras. Existem evidências de que a CETP facilita o efluxo do colesterol celular (Stein et al., 1985; Morton, 1988), a reação mediada pela LCAT (Oliveira et al., 1997) e a interação da HDL com os receptores SR-B1(Collet et al., 1999). Além disso, por transferir colesterol para as apoB-LP, a CETP promove um transporte reverso de colesterol indireto, uma vez que as apoB-LP serão captadas por receptores espcíficos hepáticos. Em espécies que não expressam a CETP, como ratos e camundongos, não existe o transporte reverso indireto de CE via apoB-LP para o fígado. Camundongos transgênicos que expressam CETP humana exibem redução dos níveis de HDL-colesterol e elevação de LDL-colesterol e VLDL-colesterol (Agellon et al., 1991). Assim, a atividade desta proteína pode alterar o risco de desenvolvimento de aterosclerose. Este risco está diretamente correlacionado à concentração plasmática de LDL-colesterol e inversamente à concentração plasmática de HDL-LDL-colesterol (Huuskonen, 2000; Pedersen, 2000; Assmann, 2001).
19 IV. CETP e aterogênese
A atividade da CETP induz o enriquecimento das apoB-LP com colesteril éster. Estas podem aumentar a quantidade de colesterol transportado para os tecidos extra-hepáticos, inclusive parede arterial (ação aterogênica). Se não houver limitação da via de captação de lipoproteínas pelo fígado, de onde o colesterol pode ser excretado na bile, a ação da CETP pode ser considerada anti-aterogênica (Tall, 1995).
A deficiência genética da CETP foi documentada pela primeira vez em 1985 por Kurasawa e Koizumi e seus colaboradores. Desde então, mutações e polimorfismos nas regiões codificadoras e regulatórias do gene da CETP têm sido descritos e sua relação com aterosclerose investigada em populações asiáticas, caucasianas, afro-americanas e outras (Nagano et al., 2004; Thompson et al., 2004). Em seres humanos, a deficiência genética de CETP acompanhada de altas concentrações de HDL-colesterol (>60 mg/dL) está estatisticamente correlacionada a menor risco de doença arterial coronariana (DAC). No entanto, indivíduos com deficiência de CETP com níveis moderadamente altos de HDL (40-60 mg/dL) apresentam maior risco de DAC (Zhong et al., 1994). Estudos com inibidores da CETP têm sido considerados como terapia anti-aterogênica (Okamoto, et al., 2000; Huang et al., 2002; Barter et al., 2003, Clark et al., 2004; Brousseau et al., 2004). O inibidor de CETP Torcetrapib aumenta os níveis de HDL e reduz VLDL e LDL (Clark, 2006), primariamente devido a aumento do clearance das LP que contêm apoB100 (Millar et al., 2006). Mas o aumento da mortalidade em indivíduos tratados com Torcetrapib causou a suspensão de um amplo estudo com mais de 15000 pacientes nos EUA, o “Investigation of Lipid Level Management to Understand its Impact in Atherosclerotic Events” (ILLUMINATE). Resta esclarecer se este efeito adverso do Torcetrapib decorre da inibição da CETP ou de uma ação colateral da droga (Clark, 2006; Pearson, 2006; Tall, 2007, Kontush et al., 2008).
Durante os últimos anos, estudos com camundongos geneticamente modificados mostraram que o papel da CETP sobre a aterogênese é dependente do contexto metabólico. O papel protetor da CETP foi demonstrado
20
em camundongos transgênicos expressando CETP em condições de hipertrigliceridemia (Hayek et al., 1995), na superexpressão da LCAT (Foger et al., 1999; Berti et al., 2005), na superexpressão da apoB combinada com deficiência da lipoproteína lipase e diabetes (Kako et al., 2002) e em camundongos castrados (Cazita et al., 2003; Casquero et al., 2006). Outros autores, porém, observaram ações pró-aterogênicas em camundongos que expressam a CETP em concentrações supra-fisiológicas (Marotti et al.,1993), em hipercolesterolemia severa por ausência completa de receptores de LDL ou da apoE (Plump et al.,1999) e em ratos hipertensos (Herrera et al.,1999). Há ainda situações onde a expressão da CETP é neutra para o desenvolvimento de aterosclerose (Foger et al., 1999; Berti et al., 2005).
V. Regulação da CETP: fatores hormonais e nutricionais
A expressão gênica da CETP pode ser regulada por estímulos nutricionais, hormonais e inflamatórios (Tall, 1993;1995).
Hormônios da tireóide podem alterar a expressão da CETP. Tan et al. (1998) verificaram diminuição da atividade da CETP em pacientes hipotireoideos e aumento nos pacientes hipertireoideos, quadros que foram revertidos com os tratamentos para restabelecer a função tireoideana. Em estudos com camundongos transgênicos para CETP, observou-se que o excesso de hormônio tireoideano aumentou a atividade plasmática da CETP, enquanto no hipotireoidismo não houve alteração da CETP (Berti et al., 2001).
A expressão do gene da CETP é influenciada também pelos corticoesteróides. Tratamento com corticoesteróides em seres humanos e em camundongos transgênicos para CETP induziu diminuição das concentrações plasmáticas da CETP (Tall, 1995). Nos camundongos transgênicos para CETP esse efeito foi resultado de uma diminuição do RNAm da CETP no fígado (Masucci-Magoulas et al., 1995).
Mulheres normolipidêmicas apresentam maiores concentrações plasmáticas de CETP que homens (Stevenson, 1998; Kinoshita et al., 1996; Marcel et al., 1990) bem como as pré-menopausadas quando comparadas às pós-menopausadas (Zhang et al., 2001). No entanto, Kinoshita et al. (1996)
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não observaram variação de CETP em mulheres ao longo da idade de 31 a 70 anos. A atividade plasmática da CETP diminui durante a gestação em coelhos, mas aumenta no segundo e terceiro trimestres de gestação em seres humanos (Tall, 1993). Diversos tratamentos com estrógeno ou testosterona parecem não alterar a atividade da CETP no plasma de seres humanos (Buckler et al., 1997; Tilly-Kiesi et al., 1997; Tan et al., 1998) e de animais (Vadlamudi et al., 1998; Zuckerman et al., 1999). Em camundongos, tanto a ooforectomia (Vladamudi et al., 1998) quanto a administração de 17b-etinil estradiol (Zuckerman et al., 1999) não alteraram a atividade da CETP. A castração de camundongos transgênicos para CETP mostrou que a expressão desta proteína não estava alterada pela deficiência de estrógeno (Cazita et al., 2003) ou de testosterona (Casquero et al, 2006). Mesmo assim, a expressão da CETP reduziu o desenvolvimento de aterosclerose nos animais castrados (Cazita et al., 2003; Casquero et al., 2006).
Em hamsters, os estados de jejum e pós-alimentar aparentemente modificam a expressão do gene da CETP. O RNAm da CETP no tecido adiposo e músculo cardíaco está aumentado após 12 horas de jejum quando comparado à alimentação com dieta rica em carboidratos (Jiang et al., 1991). Outros estudos demonstraram diminuição da velocidade de transferência de CE no plasma e tecido adiposo nos animais alimentados (alta insulina) comparados aos em jejum de 24 horas (baixa insulina) (Shen et al., 1995). MacLean e colaboradores (2000) encontraram aumento da CETP plasmática e mRNA hepático em camundongos transgênicos para CETP alimentados quando comparados aos em jejum. A hiperinsulinemia produzida durante o procedimento de “clamp” euglicêmico-hiperinsulinêmico diminui a atividade da CETP em diabéticos do tipo 2 (Sutherland et al., 1994). De acordo com este achado, Berti et al (2003) mostraram que a insulina regula negativamente a expressão da CETP em camundongos transgênicos.
Em uma variedade de espécies, coelhos (Quinet et al., 1990), macacos (Quinet et al.,1991), hamsters (Jiang et al., 1991), camundongos transgênicos (Jiang et al., 1992) e seres humanos (Martin et al., 1993), observou-se aumento do RNAm da CETP em resposta à dieta rica em colesterol. A hiperlipidemia endógena (genética) também induz aumento da expressão do gene da CETP por um mecanismo similar ao observado com dieta rica em colesterol (Tall,
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1995). Oliveira et al. (1996) localizaram a região responsiva ao colesterol no promotor do gene da CETP, e Lou & Tall (2000) mostraram que o transativador LXR (Liver X receptor) era o responsável pela ativação do gene da CETP na vigência de dieta rica em colesterol.
VI. Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (peroxisome proliferator-activated receptors) (PPAR)
Os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs) são membros da superfamília de receptores de hormônios esteróides, que atuam como fatores de transcrição ativados por ligantes; esta superfamília também inclui o receptor de ácido retinóico (RAR) e o receptor do ácido 9 cis retinóico (RXR) (Sampath et al., 2005). Os PPARs foram identificados em 1990 por Issemann e Green e assim designados por serem receptores ativados por drogas que induzem a proliferação de peroxissomos (Issemann e Green, 1990). Tais receptores ocorrem em três diferentes isoformas (α, β/δ e γ), que exibem padrões de expressão tecido-específicos e modulam a transcrição de diferentes genes envolvidos na homeostase e metabolismo lipídicos (Staels et al., 1997; Schoonjans et al., 1997).
O PPARα é expresso em tecidos como fígado, coração e intestino delgado e regula primariamente vias catabólicas do metabolismo lipídico, por modular genes envolvidos na captação e oxidação de ácidos graxos, na lipólise, na lipogênese e no metabolismo do glicerol (Mandard et al., 2004). O PPARγ, bastante expresso em tecido adiposo branco e marrom (Knouff e Auwerx, 2004), é importante na regulação da expressão de genes participantes do anabolismo e armazenamento de lipídios e diferenciação de adipócitos (Michalik e Wahli, 1999). Há menos conhecimento disponível sobre a isoforma β/δ. Evidências recentes apontam seu envolvimento na oxidação de ácidos graxos, metabolismo de lipoproteínas (semelhante ao efeito dos PPARα) e cicatrização (para revisão veja Kersten, 2008).
Os macrófagos, tipo celular relevante para aterogênese, inflamação e obesidade, presentes em vários tecidos, incluindo o espaço subendotelial dos vasos sanguíneos, expressam as 3 isoformas de PPAR (Rigamonti et al., 2008)
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Os PPARs são fatores de transcrição dependentes de ligantes e, quando ativados, formam heterodímeros com o receptor do ácido 9-cis retinóico (RXR). Esses ligam-se a elementos responsivos (PPREs) na região promotora dos genes alvo, alterando sua velocidade de transcrição (Schoonjans et al., 1997; Fruchart et al., 1999). Já foram identificados mais de 300 genes alvo de PPAR (Michalik e Wahli, 1999), e seus ligantes naturais conhecidos são os ácidos graxos, preferencialmente os de cadeia longa como os ácidos graxos poliinsaturados DHA (ácido docosahexaenóico), linoléico e araquidônico e seus derivados: leucotrienos e prostaglandinas e também os saturados C6-C18. Drogas como fibratos e glitazonas (agentes hipolipemiantes e anti-diabéticos, respectivamente) são ligantes sintéticos dos PPARs (Lefebvre et al., 1997). Os fibratos atuam principalmente sobre a isoforma alfa dos PPARs encontrada em tecidos com alta taxa metabólica de ácidos graxos (fígado, coração) (Devchand et al., 1996), enquanto as glitazonas atuam principalmente nos PPARγ, envolvidos na diferenciação do tecido adiposo (Miles et al., 2000).
Tanto os ácidos graxos ômega 3 (n-3) quanto os fibratos são efetivos na redução dos níveis plasmáticos de TG, uma vez que a ativação do PPARα aumenta a lipólise intravascular e o clearance das partículas ricas em TG, devido à regulação positiva do gene da lipoproteína lipase (LPL) e negativa do gene da apo CIII. O PPARα também participa do controle do transporte e captação de ácidos graxos, por estimular os genes das proteínas FATP (fatty acid transport protein) e FABP (fatty acid binding protein). A ação dos PPARα resulta ainda no aumento da CPT (carnitine palmitoyl transferase) e de enzimas da β-oxidação tanto em mitocôndrias como em peroxissomos, além da redução da síntese e esterificação de ácidos graxos e da secreção de VLDL (Schoonjans et al., 1996; Michalik e Wahli, 1999; McKenney e Sica, 2007).
VII. Fibratos
Os fibratos são compostos derivados do ácido fíbrico que vêm sendo utilizados na prática clínica por mais de quatro décadas como uma classe de agentes efetivos na redução dos níveis plasmáticos de triglícerídios (Hiuge et
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al., 2007). A primeira publicação que identifica a ação dos derivados do ácido fíbrico no metabolismo de lipoproteínas data de 1962 (Thorp e Waring, 1962).
Tais drogas reduzem a concentração plasmática de triglícerídios em cerca de 30% a 50%, além de elevarem os níveis de HDL-colesterol de 2% a 20%. Seu efeito sobre a concentração de LDL-colesterol é variável, desde nenhuma alteração a pequenas reduções da ordem de 10%, ou mesmo causando aumento (Barter e Rye, 2006). Embora os fibratos não tenham grande atuação nos níveis de LDL-colesterol, notam-se efeitos benéficos no tamanho e número da partícula de LDL. Com tratamento com fenofibrato observa-se menor concentração de LDL pequenas e densas em relação às partículas maiores, que têm mais afinidade com os receptores de LDL (Caslake et al., 1993, Remick et al., 2008).
Considera-se que o aumento da transcrição do gene da apoA1 humano é importante para a elevação nos níveis de HDL promovidos pelos ligantes de PPAR. Entretanto, em camundongos, o tratamento com agonistas sintéticos de PPARα reduz os níveis de HDL-colesterol (Staels et al., 1992). Tal diferença é decorrente de um polimorfismo no elemento responsivo a PPAR (PPER) na região promotora do gene da apoA1 de camundongos, que o torna não funcional (Berthou et al., 1996).
Fibratos podem ainda modular outros genes relacionados ao transporte reverso de colesterol (TRC). Chinetti et al. (2001) observaram que agonistas de PPARα e PPARγ promovem aumento de ABCA1 em macrófagos humanos. Knight et al. (2003) verificaram que o tratamento de camundongos com WY 14,643, agonista preferencial de PPARα, aumentou os níveis de RNAm de ABCA1 em células intestinais e reduziu a absorção de colesterol dietético. O aumento da transcrição do gene do ABCA1 por agonistas de PPARα parece decorrer da regulação positiva do gene do fator de transcrição LXR (Arakawa et al., 2005). Entretanto, Cheema et al. (2005) sugerem uma regulação negativa do LXR pelo PPARα. Os autores propõem dois possíveis mecanismos: o de competição pelo RXR para formação do heterodímero e o da existência de um elemento responsivo ao PPAR na região promotora do gene do LXR. Recentemente, Hossain et al. (2008) demonstraram que fenofibrato, bezafibrato, gemfibrozil e LY518674 aumentam a expressão de LXRα em
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células HepG2. Em seu trabalho sugerem que, por este mecanismo, os fibratos aumentaram a expressão de ABCA1 e a biogênese de HDL pelos hepatócitos.
Em ratos, fibratos reduziram a atividade plasmática da LCAT e a expressão hepática de seu RNAm (Staels et al., 1992). Estudo com camundongos demonstrou que fenofibrato aumenta a expressão hepática e a atividade de PLTP de maneira dependente de PPARα, pois não ocorre em animais com deficiência completa de PPARα (mutante null) (Bouly et al., 2001). A última etapa do TRC também parece ser regulada pelos agonistas de PPARα, porém os resultados ainda são contraditórios. Mardones et al. (2003) demonstraram regulação negativa da expressão protéica do SR-BI no fígado de camundongos tratados com fibratos, sendo esta resposta mediada por mecanismo pós-transcricional dependente de PPARα. Entretanto, Le Morvan et al. (2002) verificaram aumento dos níveis de RNAm hepático de SR-BI após tratar camundongos fêmeas com dieta rica em ácidos graxos n-3 durante três semanas. A figura 2 resume os efeitos de agonistas de PPAR sobre genes envolvidos no transporte reverso de colesterol.
Os fibratos também atuam no metabolismo de lipoproteínas por meio da modulação de diversas apolipoproteínas. Estudos em humanos mostram que os fibratos reduzem as concentrações de apoE, apoCIII e apoB e aumentam as de apoA1 e apoA2 (Remick et al., 2008).
Além disso, os fibratos têm sido associados à redução de marcadores inflamatórios e pro-trombóticos (proteína C reativa, fosfolipase A2 associada às lipoproteínas e PAI-1) relacionados a doenças cardiovasculares (Muhlestein et al., 2006, Remick et al., 2008).
Embora os fibratos sejam considerados primariamente agonistas de PPARα, a maioria deles não é estritamente seletiva. Bezafibrato é conhecido como um agonista de PPAR tipo “pan”, que ativa não somente o PPARα como também o PPARγ. O fenofibrato (Fruchart et al., 2001) e o Gemfibrozil (Hossain et al., 2008) também têm tal característica. O Wy14643, uma droga não usada clinicamente, ativa as 3 isoformas em ensaios de transativação celular em concentrações maiores que 30 µmol/L (Fruchart et al., 2001).
Figura 2. Ação dos agonistas de PPAR em genes que codificam proteínas envolvidas
no transporte reverso de colesterol. acordo com os seguintes autores
Arakawa et al., 2005; 4 Bérard et al., 2004; 5 Neschen et al., 2006; 6 Le Morvan et al., 2002; 7 Mardones et al., 2003; 8 Lou e Tall, 2000; 9 Dallongeville et al., 2001; 10 B et al., 2001; 11 Staels et al., 1992; 12 Hiuge et al., 2007;
(Baixa dose 10 mg/kg/dia: reduz SREBP 2, de forma dependente de PPARα).
VIII. Efeito dos ácidos graxos n
lipoproteínas e risco de aterosclerose.
Os ácidos graxos (AG) são ácidos monocarboxílicos classificados pelo tamanho da cadeia carbônica, podendo ser de cadeia curta (de 2 a 4 carbonos), média (6 a 12 carbonos) ou longa (acima de 12 carbono Normalmente apresentam número par de carbonos devido
biológica ocorrer pela adição sucessiva de moléculas de acetil CoA (Rodriguez-Cruz et al., 2005). Eles podem apresentar apenas ligações simples, sendo denominados saturados
LCAT SR-BI Apo A1 ABCA1 Ref. 6 Ref. 7 Ref. 9 + -+Ref. 2 Ref. 11 Ref. 3 SREBP-2 -Ref. 13 + Ref. 13 26
Ação dos agonistas de PPAR em genes que codificam proteínas envolvidas no transporte reverso de colesterol. regulação positiva, regulação negativa de acordo com os seguintes autores: 1 Cheema et al., 2005; 2 Berthou et al., 1996; 3 Arakawa et al., 2005; 4 Bérard et al., 2004; 5 Neschen et al., 2006; 6 Le Morvan et al., 2002; 7 Mardones et al., 2003; 8 Lou e Tall, 2000; 9 Dallongeville et al., 2001; 10 B et al., 2001; 11 Staels et al., 1992; 12 Hiuge et al., 2007; 13 Nakajima et al., 2008
Baixa dose 10 mg/kg/dia: reduz SREBP-2; alta dose 100 mg/kg/dia: aumenta SREBP 2, de forma dependente de PPARα).
Efeito dos ácidos graxos n-3 e n-6 sobre o metabolismo de lipoproteínas e risco de aterosclerose.
Os ácidos graxos (AG) são ácidos monocarboxílicos classificados pelo tamanho da cadeia carbônica, podendo ser de cadeia curta (de 2 a 4 carbonos), média (6 a 12 carbonos) ou longa (acima de 12 carbono Normalmente apresentam número par de carbonos devido a sua síntese biológica ocorrer pela adição sucessiva de moléculas de acetil CoA
Cruz et al., 2005). Eles podem apresentar apenas ligações simples, saturados (SAFA, saturated fatty acid), apenas uma dupla
Agonistas de PPAR
PPARαααα PPARγγγγ adiponectina Ref. 12 PLTPCETP
LXRαααα SREBP-1 CYP7 ABCA1 Ref. 7 + + + + Ref. 1 Ref. 3 + + Ref. 10 +Ref. 8 + Ref. 3 Ref. 4 + + Ref. 3-Ação dos agonistas de PPAR em genes que codificam proteínas envolvidas regulação negativa de : 1 Cheema et al., 2005; 2 Berthou et al., 1996; 3 Arakawa et al., 2005; 4 Bérard et al., 2004; 5 Neschen et al., 2006; 6 Le Morvan et al., 2002; 7 Mardones et al., 2003; 8 Lou e Tall, 2000; 9 Dallongeville et al., 2001; 10 Bouly 13 Nakajima et al., 2008 2; alta dose 100 mg/kg/dia: aumenta
SREBP-metabolismo de
Os ácidos graxos (AG) são ácidos monocarboxílicos classificados pelo tamanho da cadeia carbônica, podendo ser de cadeia curta (de 2 a 4 carbonos), média (6 a 12 carbonos) ou longa (acima de 12 carbonos). sua síntese biológica ocorrer pela adição sucessiva de moléculas de acetil CoA
Cruz et al., 2005). Eles podem apresentar apenas ligações simples, ), apenas uma dupla
adiponectina Ref. 5
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ligação, os monoinsaturados (MUFA, monounsaturated fatty acid) e duas ou mais insaturações, os poliinsaturados (PUFA, poliunsaturated fatty acid).
Uma notação comum para o tipo de AG é dada pelo número de carbonos da cadeia, seguido pelo número de insaturações. Assim, os AG palmítico, oléico e linoléico são representados como 16:0, 18:1 e 18:2, respectivamente.
Os PUFAs são classificados ainda quanto à localização da primeira insaturação a partir do terminal metil, o que define a nomenclatura ômega (ω ou n). Desta forma, os PUFA compõem famílias de AG n-9, n-6 e n-3, representadas pelos ácidos oleico, linoleico e linolênico, respectivamente. Os ácidos linoleico (18:2 n-6) e α-linolênico (18:3 n-3) são essenciais, portanto devem ser obtidos pela dieta, possibilitando que o organismo sintetize os demais AG de suas famílias como o ácido araquidônico - AA (20:4 n-6) e os ácidos eicosapentaenóico - EPA (20:5 3) e docosahexaenóico - DHA (22:6 n-3) (IOM, 2005).
Os PUFA n-6 encontram-se nas castanhas, sementes e nos óleos vegetais como de milho e soja (IOM, 2005). Já os PUFA n-3 são encontrados nos peixes, principalmente savelha, salmão, atum e anchova (Whelan e Rust, 2006). O ácido α-linolênico (18:3 n-3) tem como principal fonte a semente de linhaça, cujo óleo contém 53% de ácido α-linolênico (USDA, 2006). Entretanto, a conversão deste AG em EPA e DHA, principais responsáveis pelos efeitos terapêuticos dos AG 3, é modesta (cerca de 6%) (Burdge, 2006). Os PUFA n-6 são precursores de prostanóides série-2 e leucotrienos série-4, que estão associados a atividades pró-inflamatória e pró-trombótica. Os PUFA n-3 são precursores de prostanóides série-3 e leucotrienos série-5, associados às propriedades antiinflamatórias e antitrombóticas (McKenney e Sica, 2007).
Os benefícios dos AG n-3 são sugeridos pela baixa prevalência de doenças cardiovasculares (DCV) em populações que consomem abundantemente peixes e frutos do mar (Din et al., 2004). Tais benefícios têm sido confirmados em estudos experimentais com animais, humanos e culturas de células (Connor, 2000). Os AG n-3 têm se mostrado efetivos no tratamento de dislipidemias, DCV, diabetes melitos tipo 2, resistência à insulina e hipertensão (Storlien et al., 1998). Em uma meta-análise, Mozaffarian e Rimm (2006) verificaram que o consumo de peixe ou óleo de peixe reduziu o risco de
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morte por doenças cardiovasculares e morte súbita. A ingestão modesta de cerca de 250-500 mg/dia de EPA e DHA reduz em 25% ou mais o risco relativo de mortalidade, enquanto que ingestões maiores não promovem reduções adicionais no risco de mortalidade.
Muitos dos efeitos dos ácidos graxos poliinsaturados sobre o metabolismo, diferenciação e crescimento celular ocorrem através de alterações no padrão de expressão dos genes responsivos aos PPARs (Sampath e Ntambi, 2004).
Em geral, todos os AG n-3 e n-6 ativam as três isoformas dos receptores nucleares PPARα, β, γ, mas com diferentes afinidades pelos subtipos. O ácido eicosapentaenóico (EPA) apresenta maior afinidade pelo PPARα, enquanto outros PUFAs, como ácido linoléico conjugado (CLA), mostraram-se capazes de ativar o PPARγ (Sampath e Ntambi, 2005). Além disso, os ácidos graxos EPA e DHA têm ação independente dos PPAR, por exemplo, boa afinidade pelas enzimas responsáveis pela síntese, esterificação e secreção de TG, mas são substratos pobres para elas, acarretando inibição da enzima acil CoA 1,2-diacilglicerol-O-aciltransferase e contribuindo para a redução na produção hepática de TG (McKenney e Sica, 2007).
Em novembro de 2004, o FDA (Food and Drug Administration) aprovou a prescrição do Omacor (Reliant Pharmaceuticals, Inc., Liberty Corner, NJ), suplemento à base de óleo de peixe, que contém 900 mg de EPA e DHA por cápsula, para adultos com hipertrigliceridemia maior que 500 mg/dL a uma dose de 2 a 4 g por dia. No Brasil, o uso do ácido graxo ômega-3 isoladamente, ou em associação com os fármacos, é aprovado pelo Departamento de Aterosclerose da Sociedade Brasileira de Cardiologia na terapia para hipertrigliceridemia (Departamento de Aterosclerose, 2007).
Em sua revisão, McKenney e Sica (2007) constataram que a magnitude da redução de TG é dependente do nível basal deste lipídeo no plasma. Assim, tratamento com EPA e DHA promoveu redução de 27% em pacientes que apresentavam TG inicial por volta de 250 mg/dL e redução de 45% naqueles com níveis basais de 900 mg/dL. Chan et al. (2003) puderam verificar que a suplementação com AG n-3 reduz a secreção hepática de VLDL e aumenta sua conversão em LDL, o que explica o aumento de LDL encontrado naqueles
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pacientes tratados com óleo de peixe. Além disso, notaram um aumento modesto nos níveis de HDL desses indivíduos.
A suplementação com AG n-3 e n-6 parece retardar o desenvolvimento de aterosclerose em camundongos knockout para o receptor de LDL, uma vez que reduzem os níveis plasmáticos de TG, colesterol total, LDL-colesterol e o tamanho da área de lesão na aorta, sendo maior o efeito do AG n-3. Nenhuma proteção contra aterosclerose foi observada em camundongos knockout para Apo E, seja do AG n-3 ou n-6 (Zampolli et al., 2006).
Além dos efeitos sobre o metabolismo de lipoproteínas, a suplementação da dieta com óleo de peixe (rico em AG n-3) tem sido empregada para tratamento da obesidade e síndrome metabólica. Em estudo com camundongos 129Sv wild type (WT) e knockout do PPARα, Neschen et al. (2006) verificaram que o óleo de peixe estimula a secreção de adiponectina em tecido adiposo epididimal de maneira dependente de PPARγ e independente de PPARα. A adiponectina é um fator exclusivamente secretado pelo tecido adiposo e possui efeito antiinflamatório e antiaterogênico. Os autores sugerem que parte dos efeitos antiinflamatórios, antiaterogênicos e antidiabéticos do óleo de peixe pode ser mediada por tal mecanismo. Seu efeito antiaterogênico parece estar vinculado à supressão da proliferação e migração de células musculares lisas para as áreas de lesões ateroscleróticas (Arita et al., 2002). A adiponectina também tem sido relacionada com melhora da sensibilidade à insulina em roedores (Yamauchi et al., 2001), e sua concentração plasmática é inversamente relacionada ao índice de massa corpórea (IMC) em humanos (Hotta et al., 2000).
A suplementação da dieta com óleo de linhaça (rico em ácido linolênico n-3) não teve efeito na concentração plasmática de adiponectina em homens dislipidêmicos (Paschos et al., 2007). Em contrapartida, o óleo de peixe parece regular de maneira dose dependente a concentração plasmática de adiponectina em camundongos, apresentando diferença estatística já no segundo dia de tratamento com 27% de óleo de peixe na dieta, mesmo quando comparado a dieta com a mesma concentração de óleo de açafrão, rico em ácido oléico (n-9) (Neschen et al., 2006). Em estudo também com camundongos, os AG n-3 EPA e DHA estimularam a expressão do gene da
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adiponectina e seus níveis circulantes, de maneira relativamente independente de ingestão e massa corpórea (Flachs et al., 2006). No entanto, em outro estudo em camundongos tratados durante 8 semanas, a dieta com óleo de peixe (rica em EPA e DHA) também provocou redução na concentração plasmática de adiponectina, embora seu efeito tenha sido menor do que o causado pelas dietas com óleo de soja (rico em n-6), banha (rico em AG saturados), ou coco (fonte de triglícerídio de cadeia média) (Bueno et al., 2008). Em cultura de adipócitos (3T3-L1) tratados com diferentes ácidos graxos os ácidos palmítico (16:0), linoléico (18:2 n-6), EPA (20:5 n-3) e DHA (22:6 n-3) reduziram a expressão gênica da adiponectina (Bueno et al., 2008).
Assim como o EPA e o DHA (n-3), o ácido araquidônico (n-6) previne a redução da expressão protéica do receptor de LDL causada pelo colesterol em cultura de fibroblastos e células HepG2 (Yu-Poth et al., 2005).
O óleo de peixe também se mostrou útil na prevenção do acúmulo de lipídios no fígado causado pela suplementação com ácido linoléico conjugado (CLA), uma vez que corrige o aumento da expressão gênica de enzimas relacionadas à síntese e acúmulo de lipídios hepáticos induzidas por CLA (Ide, 2005; Yanagita et al., 2005).
Contudo, é importante ressaltar que diferentes genótipos (polimorfismos) respondem de maneira distinta à ingestão de AG n-3 e n-6 (Ordovas, 2006). Por exemplo, o polimorfismo no códon 162 do gene do PPARα (PPARA Leu162Val) acarreta maior redução de TG em indivíduos cujo polimorfismo codifica o aminoácido valina do que naqueles com leucina, quando suplementados com AG n-6. No caso de suplementação com AG n-3, a redução de TG é similar nos dois genótipos (Dwyer et al., 2004). O efeito sobre as concentrações de HDL também depende do polimorfismo na região promotora do gene da ApoA1 (APOA1-75GA). Indivíduos G/G apresentam redução, enquanto os A/A apresentam elevação nos níveis plasmáticos de HDL em resposta à ingestão de PUFA.
Muitos estudos têm relacionado os benefícios do tratamento com AG n-3 na prevenção de doenças cardiovasculares com sua ação no transporte reverso de colesterol (Figura 2). O tratamento com óleo de peixe por uma semana reduziu os níveis plasmáticos e de RNAm hepático da apoA-1 em camundongos wild type, mas não nos deficientes em PPARα, indicando a
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contribuição essencial deste fator de transcrição no efeito do óleo de peixe sobre a expressão do gene da apoA-1 (Dallongeville et al., 2001). Em humanos, entretanto, a regulação da apoA-1 por ligantes de PPARα parece oposta à encontrada em camundongos devido a um polimorfismo no elemento responsivo aos PPAR do gene da apoA-1 (Berthou et al., 1996).
Substituição de gordura saturada por PUFA n-6 resultou em regulação positiva da expressão de SR-BI hepático em hamsters (Spady et al., 1999). Em camundongos, dieta rica em AG n-3 aumentou a captação hepática de HDL-colesterol em paralelo com aumento de 2 a 3 vezes da expressão de RNAm para SR-BI no fígado (Le Morvan et al., 2002).
A suplementação com AG n-3 parece ainda alterar a excreção biliar de colesterol. Bérard et al. (2004) verificaram que o nível de RNAm da 7-alfa-hidroxilase (CYP7) estava de 2 a 3 vezes maior nos fígados de camundongos tratados com EPA e DHA, assim como a excreção de ácido biliar e de colesterol também estavam cerca de 2 vezes maior nos animais tratados. Tal estudo encontrou ainda aumento da expressão de RNAm de DBP (D-binding protein) e de LXRα, reguladores positivos da expressão do gene que codifica a CYP7.
Justificativa para o estudo da regulação da CETP por ácidos graxos
A CETP é uma proteína chave no metabolismo das lipoproteínas plasmáticas, podendo assim interferir no risco de desenvolvimento de doenças ateroscleróticas. A expressão do gene da CETP é regulada positivamente pela quantidade de colesterol da dieta (Tall, 1995). Essa regulação envolve a ativação do fator de transcrição LXRα (Lou & Tall 2000). Enquanto a indução da expressão da CETP pelo colesterol da dieta está bem estudada, o efeito da quantidade e qualidade das gorduras da dieta sobre esta proteína não estão bem estabelecidos. Camundongos transgênicos que expressam a CETP sob o controle de seu promoter natural são bons modelos para o estudo da regulação do gene da CETP.
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Jiang et al. (1992) mostraram que, em hamsters, dieta rica em gordura saturada produz aumento na expressão do RNAm da CETP em tecido adiposo, mas resulta em redução deste no coração. Ao contrário, Dorfman et al. (2005) não encontraram alteração na atividade desta proteína em hamsters submetidos à dieta rica em gordura saturada.
Estudos com diferentes desenhos experimentais obtiveram resultados conflitantes dos efeitos dos AG monoinsaturados (MUFA) sobre a expressão da CETP: foi verificado redução na concentração da CETP plasmática de humanos (Jansen et al., 2000), nenhuma alteração em camundongos transgênicos (Chang e Snook, 2001) e aumento de sua atividade em macacos (Gupta et al., 2003). Recentemente, Cheema et al. (2005) mostraram que a adição de MUFA em uma dieta rica em colesterol reduz a expressão de CETP em camundongos transgênicos, ao contrário do efeito esperado do colesterol. Em cultura de células SW872 (linhagem de lipossarcoma humano) foi demonstrado que o ácido oléico, ou o colesterol individualmente, estimula a expressão de CETP, em conjunto, porém, não há efeito. Os autores mostraram que os MUFA inibem a expressão dos LXRα, inibindo o mecanismo pelo qual o colesterol estimula a CETP.
Em hamsters, tanto a massa quanto a atividade da CETP no plasma estavam reduzidas de maneira dose dependente com a suplementação de óleo de peixe (Silva et al., 2005). No entanto, o gene da CETP de hamsters e de humanos provavelmente tem regiões reguladoras diferentes, uma vez que o padrão de expressão tecido específico é totalmente diferente nestas espécies (Jiang et al., 1992). Em humanos, a suplementação com 4 g/dia de AG n-3 (EPA e DHA) durante 4 semanas não alterou a atividade da CETP, embora tenha modificado o perfil de lipoproteínas (Thomas et al., 2004). Em indivíduos hipercolesterolêmicos, que têm CETP elevada, o tratamento com óleo de peixe durante 6 semanas, reduziu a atividade da CETP no plasma (Abbey et a., 1990), provavelmente por ter reduzido a quantidade de colesterol intracelular.
Na literatura científica, o efeito dos ligantes sintéticos de PPARα sobre a CETP ainda é controverso. Estudos apontam que fibratos reduzem (Van der Hoogt et al., 2007; Watts et al., 2006; Jonkers et al., 2003; Guérin et al., 1996; Homma et al., 1994; Guérin et al., 2003), não alteram (Ponsin et al., 1994; Franceschini et al., 1995; Durrington et al., 1998; McPherson et al., 1996;
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Chapman et al., 1998) ou aumentam a CETP (Kahri et al., 1993; Beyer et al., 2008) no plasma.
Como os PUFA n-3, principalmente o EPA e o DHA, encontrados no óleo de peixe, têm se mostrado importantes na redução do risco de doenças cardiovasculares, faz-se necessária a compreensão de seu efeito na modulação da expressão da CETP e sua conseqüência sobre o perfil lipídico.
Assim, este trabalho tem como hipótese que a expressão da CETP e sua atividade podem ser moduladas pela suplementação da dieta com óleo de peixe, provavelmente pela ativação dos PPARα, uma vez que os ácidos graxos n-3 de cadeia longa presentes neste óleo são conhecidos ligantes naturais deste fator de transcrição.
Modelos animais geneticamente modificados
Camundongos normalmente não expressam CETP e por isso os transgênicos são modelos muito úteis para o estudo dos esfeitos da expressão dessa proteína. A expressão da CETP nestes animais resulta em diminuição do colesterol na fração HDL (Agellon et al., 1991; Jiang et al., 1992).
Camundongos que super-expressam a apoCIII exibem o fenótipo de hipertrigliceridemia primária, pois esta apolipproteína prejudica o reconhecimento das LP ricas em TG pelos seus recptores hepáticos. Desta forma, o estas LP permanecem mais tempo na circulação sanguínea. Este modelo animal é útil para estudos de drogas redutoras de TG, especialmente as que atuam via PPAR, uma vez que o gene da apoCIII é alvo de PPAR.
34 OBJETIVO
Este trabalho teve como objetivo principal avaliar os efeitos da suplementação da dieta com óleos ricos em ácidos graxos n-3 e n-6 (peixe e milho, respectivamente) sobre a expressão e atividade da CETP e sua conseqüência sobre o perfil de lípides e lipoproteínas plasmáticas em camundongos transgênicos para CETP.
Considerando que a hipótese do trabalho se baseia na ação dos ácidos graxos n-3 como ligantes naturais de PPARα, foi também objetivo do trabalho (i) confirmar os efeitos de ligantes sintéticos (fenofibrato, gemfibrozil e bezafibrato) sobre a expressão (RNAm hepático) e atividade da CETP (plasma), e (ii) analisar a expressão do RNAm de outros genes reguladores do metabolismo lipídico, a saber, o receptor LXRα (liver X receptor) e as proteínas SREBP-1 e 2 (sterol responsive element binding protein).
MATERIAIS E MÉTODOS
I. Animais Transgênicos (Tg)
Todos os animais gerados para estes estudos foram derivados de animais gentilmente fornecidos pelo Dr. Alan Tall da Divisão de Medicina Molecular da Columbia University, NY, E.U.A. em 1996. As linhagens são mantidas no biotério da Dra. Helena C. F. de Oliveira no departamento de fisiologia e biofísica do Instituto de Biologia da Unicamp, Campinas. Para o tratamento com os ligantes naturais foram utilizados camundongos normolipidêmicos (background C57BL/6) transgênicos para o gene humano da CETP, sob regulação da região promotora natural, linhagem 5203 (Jiang et al. 1992). Os efeitos dos ligantes sintéticos foram analisados em camundongos hipertrigliceridêmicos (CIII/CETP) obtidos pelo cruzamento dos transgênicos para o gene da CETP com camundongos transgênicos para o gene humano da apoCIII, linhagem 3707 (Walsh et al., 1993). Os animais foram tipados segundo seus respectivos fenótipos: atividade da CETP no plasma (>15% nos Tg e <
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5% nos não-Tg) e concentração de triglícerídios no plasma (Tg > 300 mg/dL e controles < 100 mg/dL).
II. Tratamento dos animais
O protocolo experimental deste estudo foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CCEA-IB-UNICAMP) e Comissão Interna de Biossegurança (CIBio/IB/Unicamp) e está delineado no fluxograma abaixo.
Camundongos (machos e fêmeas) de 3 meses de idade foram mantidos em condições controladas de temperatura (22 ± 2°C), luminosidade (ciclos de claro e escuro de 12 horas), recebendo água e ração (Nuvital CR1, Colombo, Brasil) ad libtum. A dieta era composta por 23% de proteína, 4,5% de gordura total, 33% carboidratos e 21% de fibra, no total de 263 Kcal/100 g. Os animais foram distribuídos nos diferentes grupos de tratamento de maneira aleatória.
Os camundongos CETP foram suplementados diariamente por meio de entubação orogástrica com 0,1 ml/10 g peso corpóreo de salina (0,9% NaCl), óleo de peixe ou de milho (Sigma-Aldrich) durante 2 semanas. A composição de ácidos graxos por 100 g de gordura dos óleos usados para suplementação está descrita na tabela 1. Para evitar oxidação lipídica, os óleos de peixe e milho foram separados em alíquotas de 1,5 ml, guardados sob atmosfera de nitrogênio, vedados e armazenados no escuro. A ração e os animais foram pesados duas vezes por semana, a fim de acertar a dose de suplemento.
Os camundongos CIII/CETP foram tratados diariamente por via oral (entubação orogástrica) durante duas semanas com 3 diferentes fibratos: fenofibrato micronizado, da Allergan (FENO); gemfibrozil, da Roche (GEM) e bezafibrato, da Parke-Davis (BEZA), nas doses de 100 mg/kg, 200 mg/kg e 100 mg/kg, respectivamente, definidas a partir de dados da literatura (Fourcade, 2001; Kojo, 1996; Watanabe, 1989). Os controles receberam apenas o veículo (goma arábica 2%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante o mesmo intervalo de tempo e sob as mesmas condições experimentais que os tratados.
Antes do início e no final do período de tratamento foi coletado sangue da cauda dos animais em jejum para determinação de lipídios no plasma e glicemia. A atividade da CETP, concentrações de leptina, adiponectina e as
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frações de lipoproteínas foram verificadas apenas após os tratamentos, a partir do sangue total coletado pelo plexo retro-orbital dos camundongos anestesiados (Ketamina 50 mg/Kg associado a xilazina 10 mg/Kg de peso). Para obtenção do plasma, o sangue foi coletado com auxílio de capilares heparinizados, centrifugado a 12000 rpm por 15 minutos a 4°C. Ao sangue coletado pelo plexo retro-orbital foi adicionado um coquetel antiproteases (Sigma-Aldrich, catálogo P2714) e armazenado no bio-freezer (-80°C), a fim de garantir a integridade das lipoproteínas das amostras.
No final do tratamento, também foram coletados e pesados os fígados e tecidos adiposos perigonadal e subcutâneo visível (região mediana do abdomem). O fígado foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado em bio-freezer à –80°C, para posterior extração de RNAm.
Tabela 1. Composição de ácidos graxos por 100 g de gordura dos óleos usados para suplementação dietética.
unidade Óleo de peixe Óleo de milho 14:0 Ácido mirístico g 6-9 1,4 16:0 Ácido palmítico g 15-20 10,2 16:1 Ácido palmitoléico g 9-14 1,5 18:0 Ácido esteárico g 3-4 3 18:1 Ácido oléico (n-9) g 5-12 49,6 18:2 Ácido linoléico (n-6) g < 3 34,3 18:3 Ácido linolênico (n-3) g < 3 ___ 18:4 Ácido octadecatetraenóico g 2-4 ___ 20:4 Ácido araquidônico (n-6) g < 3 ___ 20:5 Ácido eicosapentaenóico (n-3) g 10-15 ___ 22:6 Ácido docosahexaenóico (n-3) g 8-15 ___ Colesterol* mg 521 0
Fonte: Sigma-Aldrich, product information
III. Fluxograma: Protocolos de tratamento.
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38 IV. Análises bioquímicas
Os lipídios plasmáticos foram determinados utilizando-se kits enzimáticos-colorimétricos: colesterol total e triglicerídios por kits da Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Alemanha), e os e ácidos graxos livres por kit Wako Chemicals (Neuss, Alemanha), conforme instruções do fabricante. A glicemia foi medida com auxílio de glicosímetro Accu-Chek Advantage (Roche Diagnostic, Suíça). Para determinação de leptina e adiponectina plasmáticas foram utilizados kits de ELISA comerciais da LINCO Research, (St. Charles, Missouri, EUA).
V. Extração lipídica do fígado
Para a extração da gordura total do fígado, aproximadamente 0,5 g de tecido foi macerado em tubos de ensaio de 7.5 mL, onde foi adicionada na proporção de 1:2 uma solução de metanol e clorofórmio, de acordo com método de Folch (1957). Os tubos foram deixados em repouso à temperatura ambiente por uma noite, tempo suficiente para decantação dos resíduos do tecido delipidado. No dia seguinte, o extrato foi filtrado em papel de filtro tipo 50 para frascos de 20 mL. Após a completa secagem sob fluxo de nitrogênio, os extratos foram pesados em balança analítica de precisão para determinação de lípides totais.
VI. Atividade da CETP no plasma
Uma mistura de VLDL+LDL foi obtida por ultracentrifugação de plasma de doadores humanos normolipidêmicos e utilizada como lipoproteínas aceptoras. HDL também obtida por ultracentrifugação de plasma de doadores normolipidêmicos foi marcada radioativamente com 14C-colesteril-éster (14CCE) de acordo com Oliveira & Quintão (1996). O ensaio isotópico consistiu em uma reação contendo 50 µg de proteína de VLDL+LDL, 10000 dpm de 14CCE-HDL e
