AÇÃO DE EXTRATOS AQUOSO E ALCOÓLICO DE PRÓPOLIS SOBRE Malassezia spp ISOLADAS DO CONDUTO AUDITIVO DE CÃES
ANA CAMILA TURINI RIBEIRO
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Flávio Quaresma Moutinho
Nome do Autor: Ana Camila Turini Ribeiro
Título: AÇÃO DOS EXTRATOS AQUOSO E ALCOÓLICO DE PRÓPOLIS SOBRE
Malassezia spp ISOLADAS DO CONDUTO AUDITIVO DE CÃES
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Flávio Quaresma Moutinho Presidente e Orientador
Departamento de Clínica FMVZ – UNESP – Botucatu/SP
Prof. Luiz Henrique de Araújo Machado Membro
Departamento de Clínica FMVZ – UNESP – Botucatu/SP
Prof. Dr. Carlos Artur Lopes Leite Membro
Departamento de Medicina Veterinária UFLA – Lavras/MG
Aos meus pais, ao meu marido Juliano, ao meu orientador Prof. Dr. Flávio Quaresma, ao Prof. Dr. Carlos Artur Lopes Leite e ao Prof. Dr. Geraldo Márcio da Costa,
AGRADECIMENTOS:
Meus Pais: Apesar de não poderem frequentar escolas, souberam salientar a importância dos estudos aos seus filhos e, acima de tudo, ensinaram a matéria mais importante da vida que é a honestidade, a dignidade, a humildade e, principalmente, o amor ao próximo.
Deus: O que seria do ser humano sem os ensinamentos Dele? As graças que recebo diariamente e o dom de cuidar com amor dos animais devo a Ele.
Meu querido Juliano: Quem mais poderia mudar seus planos para realizar sonhos de outra pessoa? Sempre me apoiou em tudo, e me fortaleceu nos momentos mais difíceis sendo, além de marido, companheiro e amigo.
Irmãos, Cunhados, Sobrinhos e Sogros: A maior riqueza de uma pessoa é ter uma família feliz, vivendo em harmonia e apoiando em todos os momentos da vida.
Ao meu Bebê: Sei que está por vir, mas já quero deixar o agradecimento pela sua existência e digo que faço tudo em minha vida pensando no seu futuro e no orgulho que terá de mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Flávio Quaresma: Você aceitou me orientar depositando toda sua confiança em mim. Obrigada por tudo. Pretendo nunca desapontá-lo.
Prof. Dr. Carlos Artur Lopes Leite (Prof. Cacá): Mesmo sem palavras para expressar tudo o que você fez por mim, quero agradecer todo o apoio. Nunca pensei em seguir uma carreira acadêmica, mas você abriu meus olhos para isso e te devo todo esse projeto. Você e a Juliana são pessoas abençoadas por Deus e sempre estarão em meus pensamentos e coração.
Prof. Dr. Geraldo Márcio da Costa e Dircéia: Tiveram toda a paciência comigo ajudando em todo o processo laboratorial do meu projeto. Obrigada, queridos amigos.
A toda família “Toca dos Bichos”: Que me ajudaram toda vez que precisei me ausentar da clínica. Vocês são pessoas muito especiais.
Meus queridos animais: O sonho de ser veterinária iniciou pelo amor que senti por uma cachorrinha chamada “Lili”. Ela me ensinou o que é amar sem querer nada em troca. Hoje, continuo meu crescimento intelectual graças a Pepita, Bombom, Julieta, Chica, Nina, Perrito, Félix e Safira.
Obrigada aos anjos de luz que me acompanham em toda parte e me guiam para o melhor caminho. Ao Dr. Rogério e à Profa. Dra. Aguemi.
Por fim, quero agradecer aos meus clientes pelas palavras de incentivo e por todos que ajudaram, direta ou indiretamente, nesse momento tão importante na minha vida.
LISTA DE TABELAS
Pág. Tabela 1 - Principais compostos químicos encontrados na própolis. .... 7 Tabela 2 - Protocolo de diluição seriada para preparo de soluções de
própolis. ... 20
Tabela 3 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas concentrações aquosas de própolis. .
24
Tabela 4 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas concentrações alcoólicas de própolis.
20
LISTA DE QUADROS E GRÁFICOS
Pág. Quadro 1 - Ação da própolis sobre microrganismos diversos. ... 9 Gráfico 1 - Comportamento das medidas de diâmetro dos halos de
inibição em teste de difusão em ágar usando extrato alcoólico de própolis frente a cepas de Malassezia spp. ...
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 - Pesagem do pó de própolis para preparo da solução-mãe a 10% e posterior diluição em álcool etílico 96º. ...
19
Figura 2 - Padronização da densidade leveduriforme por meio de turbidimetria direta usando o cartão de Wickerham (escala 3+ de MacFarland). ...
21
Figura 3 - Preenchimento dos orifícios das placas de Petri com
solução diluída de extrato de própolis. ... 22
Figura 4 - Distribuição das diluições dos extratos aquoso e alcoólico de própolis para o teste de difusão em ágar. ...
23
Figura 5 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato aquoso de própolis da cepa de Malassezia sp #33. Observar a ausência de halos de inibição em torno dos
orifícios. ... 25
Figura 6 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato alcoólico de própolis da cepa de Malassezia sp #27. Observar os halos de inibição em torno de todos os
SUMÁRIO
Pág. RESUMO ... 1 ABSTRACT ... 2 1. INTRODUÇÃO ... 3 2. REVISÃO DA LITERATURA ... 4 2.1 - Própolis ... 42.1.1 - A história do uso da própolis ... 5
2.1.2 - Produção e consumo ... 6
2.1.3 - Composição ... 6
2.1.4 - A própolis na nutrição humana ... 7
2.1.5 - Propriedades terapêuticas ... 8
A - Ação antimicrobiana ... 8
B - Ação anticancerígena ... 8
C - Ação antioxidante ... 8
D - Ação cicatrizante e reparadora ... 10
E - Ação anestésica e analgésica ... 10
F - Ação imunestimulante ... 10
G - Ação cardiovascular ... 10
H - Ação no tratamento dentário ... 11
I - Ação no sistema respiratório ... 11
J - Efeito repelente ... 11
H - Contra-indicações ... 11
2.1.6 - A própolis como antimicrobiano ... 12
2.2 - Otite externa ... 13 2.3 - Malassezia spp e malasseziose ... 14 3. OBJETIVOS ... 18 3.1 - Principal ... 18 3.2 - Secundário ... 18 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 18
4.1 - Obtenção das culturas fúngicas ... 18
Pág.
4.3 - Preparo da solução-mãe de própolis ... 19
4.4 - Diluições seriadas ... 20
4.5 - Preparo das placas de Petri ... 20
4.6 - Teste de difusão em ágar ... 20
4.7 - Preparo dos inóculos fúngicos ... 21
4.8 - Semeadura das cepas fúngicas e preenchimento dos orifícios ... 22
4.9 - Mensuração dos halos de inibição e análise dos dados ... 22
5. RESULTADOS ... 23
6. DISCUSSÃO ... 28
7. CONCLUSÕES ... 30
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 30
RIBEIRO, A.C.T. Ação de extratos aquoso e alcoólico de própolis sobre
Malassezia spp isoladas do conduto auditivo de cães. Botucatu, 2008. 47p.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu/SP, Universidade Estadual Paulista - UNESP.
RESUMO
A otite externa sempre foi um problema para cães, especialmente na presença de quadros de malasseziose. As leveduras do gênero Malassezia são patógenos oportunistas em potencial no microambiente ótico, podendo agravar um quadro de otite externa quando as condições assim o permitirem. O controle da população desses fungos normalmente é realizado com drogas de custo razoável e por um período relativamente longo, podendo trazer efeitos colaterais ao paciente. É nesse ponto que a medicina natural se faz relevante. A própolis, um produto oriundo do processamento do pólen por abelhas da espécie Apis
melifera, possui notáveis efeitos sobre diversos microrganismos, incluindo fungos
leveduriformes. Por ser uma substância complexa e composta por diversas frações antimicrobianas, é possível que sua ação também se estenda às
Malassezia spp. O objetivo desse trabalho foi verificar a eficácia de soluções
aquosa e alcoólica de própolis sobre Malassezia spp isoladas do ambiente ótico de cães. Quarenta amostras de Malassezia spp foram avaliadas frente ao teste de diluição em meio sólido, verificando-se o diâmetro dos halos de inibição e correlacionando-os com um efeito inibitório sobre o crescimento. Conclui-se que as soluções de própolis possuem efeito inibidor do crescimento in vitro de
Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães, sendo esta ação mínima no
extrato aquoso e maior em extrato alcoólico. Pode-se inferir, também, que o álcool etílico 96º isoladamente possui efeito inibidor do crescimento in vitro de
Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães.
RIBEIRO, A.C.T. Action of aqueous and alcoholic propolis extracts on Malassezia spp isolated from canine ear conduct. Botucatu, 2008. 47p. Dissertation (Master) – Veterinary and Animal Science Medical Faculty, Campus Botucatu/SP, São Paulo State University - UNESP, Brazil.
ABSTRACT
The external otitis has always been a problem for dogs, especially in the presence of malasseziasis. The yeast of the genus Malassezia is a potential opportunistic pathogen in the optical microenvironment and may aggravate the external otitis when conditions so permit. The control of the population of these fungi is usually done with reasonable cost of drugs, has a relatively long time and may bring side effects to the patient. This is where natural medicine is relevant. The propolis, a product comes from the processing of pollen by the bee Apis
melifera, has remarkable effects on different organisms, including yeast fungi. As a
substance composed of diverse and complex antimicrobial fractions, it is possible that its action also extends to Malassezia spp. The aim of this study was to assess the effectiveness of alcohol and aqueous solutions of propolis on Malassezia spp isolated from the aural environment of dogs. Forty samples of Malassezia spp were evaluated facing the test of agar dilution, whilst the diameter of halos of inhibition and correlating them with an inhibitory effect on growth. It was concluded that propolis extracts have inhibitory effect of the in vitro growth of Malassezia spp from the canine ear conduct, with minimal action by the aqueous extract and more accentuated action by alcohol extract. It is possible to infer also that the ethyl alcohol 96º alone has inhibitory effect on the in vitro growth of Malassezia spp from the canine ear conduct.
1. INTRODUÇÃO
A otite externa é uma das afecções de maior prevalência na rotina clínica de pequenos animais, possuindo características multifatoriais complexas e estreitamente inter-relacionadas. A busca por um protocolo terapêutico ideal ocorre de maneira uniforme e progressiva, variando desde métodos ortodoxos até práticas de medicina não-convencional, como homeopatia e cromoterapia, passando pela fitoterapia e terapia natural.
Apesar do desconhecimento do verdadeiro papel de levedura Malassezia em ambientes óticos de cães sadios e otopatas, sabe-se que a sua superpopulação impede a resolução de um quadro já instalado de otite (independentemente da causa). Mesmo com o amplo arsenal antifúngico disponível no mercado, muitos destes produtos possuem inconvenientes como alto custo, baixa segurança biológica e/ou inocuidade devido à resistência do microrganismo.
É nesse ponto que o emprego da própolis, uma substância natural produzida por abelhas, pode ser útil. Com reconhecidas funções terapêuticas e profiláticas sobre diversos microrganismos, o uso de extratos de própolis pode proporcionar auxílio no tratamento das otopatias em que Malassezia está presente. Todavia, se faz necessário pesquisar a real eficácia desse produto contra leveduras, vislumbrando um possível potencial no tratamento das otopatias em cães em que a levedura se encontra presente.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 - Própolis
Nos últimos anos, a própolis tem conquistado faixas cada vez mais amplas de adeptos, que a utilizam confiantes em seu poder terapêutico. Cientificamente está comprovado que os produtos apícolas podem ser usados isoladamente ou associados a produtos farmacêuticos, pois apesar de sua composição complexa, eles se caracterizam por não apresentar substâncias tóxicas dada à capacidade das abelhas em distinguir e só coletar substâncias naturais inofensivas (SZEWCZAK & GODOY, 1982).
Segundo GHISALBERTI (1979) e BANKOVA et al (1989), dentre os produtos apícolas como mel, geléia real e pólen, a própolis vem se destacando tanto pelas suas propriedades terapêuticas (atividade antimicrobiana, antiinflamatória, cicatrizante e anestésica) quanto pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica e alimentícia.
Os efeitos terapêuticos são atribuídos aos diversos compostos fenólicos que compõem a própolis (GRANGE & DAVEY, 1990). Destes, os flavonóides podem ser considerados os principais compostos, encontrando-se, ainda, alguns ácidos fenólicos e seus ésteres, aldeídos fenólicos, álcoois e cetonas (BANKOVA
et al, 1983; BANKOVA et al, 1992).
De acordo com BANKOVA et al (1999) e MARCUCCI et al (2001), a atividade antibacteriana da própolis é maior contra bactérias Gram-positivas, pela ação dos flavonóides, ácidos e ésteres aromáticos presentes na resina, os quais atuariam sobre a estrutura da parede celular desses microrganismos por meio de um mecanismo de ação ainda não elucidado.
As propriedades biológicas da própolis estão diretamente ligadas à sua composição química. Esse fato se torna o maior problema para o uso desta substância em fitoterapia, tendo em vista que a sua composição química varia com a flora da região e época da colheita, com a técnica empregada e com a espécie da abelha produtora (RAMOS, 1995).
As investigações sobre as propriedades antibióticas da própolis são conduzidas na área médica e também veterinária, em que o produto tem demonstrado uma eficiente atividade bacteriostática e bactericida em gêneros de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas diversas (BIANCHINI & BEDENDO,1988).
ROJAS & LUGO (1988) demonstraram a presença de atividade antifúngica do extrato alcoólico da própolis contra 23 amostras de leveduras do gênero
Candida isoladas de diferentes materiais biológicos, com ação fungistática na
concentração de 0,55mg/mL. Resultados similares também foram obtidos por AZEVEDO et al (1999) ao trabalharem com Candida isolada da cavidade bucal de pacientes humanos, hígidos e doentes.
A própolis é uma resina coletada por abelhas da espécie Apis mellifera de diversas partes das plantas como botões florais, brotos, folhas e cascas das árvores. Durante a coleta da própolis, as abelhas misturam a cera e a própolis coletada, juntamente com enzimas presente na sua saliva, enriquecendo-a com componentes próprios. Essa combinação tem propriedades antibacterianas e produz efeitos fungicidas que servem para proteger a colméia contra doenças e agentes climáticos (GREENWAY et al, 1990).
A própolis para consumo humano é extraída de colméias construídas de madeira, em que o produto bruto sofre um processamento secundário para a remoção da cera e de outras impurezas antes de ser aproveitado para os mais diversos fins dentro da área de saúde (RAMOS, 1995).
2.1.1- A história do uso da própolis
A palavra própolis vem da língua grega pro (antes de) e polis (cidade), por que os apicultores notaram que as abelhas construíam uma pequena parede de própolis para proteger a entrada dianteira da colméia, que geralmente ficavam à frente (antes de) das colônias (cidade) dos apicultores. Antigos textos gregos referem-se à substância como um "curador para hematomas e chagas suporadas". Em Roma, a própolis foi usada como emplastros para os mais
diversos fins. A palavra própolis em dialeto hebraico é tzori, e suas propriedades terapêuticas estão mencionadas por todo o Antigo Testamento. Registros europeus datados do século XII descrevem preparados que tinham como sua base principal a própolis para tratamento de infecções de boca e garganta, além de cáries dentárias (GHISALBERTI, 1979).
2.1.2- Produção e consumo
Dentre os maiores produtores de própolis no mundo, podem ser incluídos a China, o Brasil, os EUA, a Austrália e o Uruguai (RAMOS, 1995).
São tratadas por mês cerca de 200 toneladas de própolis finais para consumo mundial. O Japão é um dos maiores consumidores de própolis como complemento alimentar.
Na Nova Zelândia a produção anual de própolis é de 9,9 milhões de doses diárias.
2.1.3- Composição
Pelo menos 180 compostos diferentes foram identificados até agora na própolis. Uma lista das substâncias encontradas na própolis está descrita na tabela 1.
Um dos elementos importantes farmacologicamente ativos presentes na própolis são as flavonas, flavonol e flavanona (coletivamente chamados de flavonóides), e vários compostos fenólicos.
Pelo menos 38 tipos de flavonóides são encontrados na própolis, incluindo galangina, caempferol, quercetina, pinocembrina, artepeana e crisina (GRANGE & DAVEY, 1990). Entre os fenólicos, podem ser encontrados álcool cinâmico, ácidos anâmico e fenílico.
Tabela 1 - Principais compostos químicos encontrados na própolis.
Classe de Composto Substâncias encontradas Quantidade (%) Resinas Flavonóides, ácidos fenólicos e
ésteres 45-55
Ceras e ácidos gordurosos
Cera e elementos de origem das
plantas 25-35
Elementos essenciais
lubrificantes Voláteis 10
Pólen
Arginina e prolina (46%). Dezesseis tipos de proteínas liberam os
aminoácidos
5
Outros elementos orgânicos e refrigerantes
14 traços de elementos refrigerantes. Ferro e zinco são os mais comuns. Também são encontrados cetonas, lactonas, quinonas, esteróides, ácido
benzóico, vitaminas e açúcares
5
A composição química da própolis é bastante variável devido à variedade de vegetação produtora de pólen existente no momento do preparo. Adicionalmente, a composição da própolis também é influenciada pelo tipo de abelha que a produz (alguns constituintes da própolis, como os açúcares, dependem do metabolismo dos próprios insetos).
De acordo com GREENWAY et al (1990), existem cerca de 67 espécies de plantas principais que servem para a extração da própolis, como álamos, alders e bétulas castanha e cinza, além de vários prunos e salgueiros. No Brasil ainda não há uma descrição pormenorizada de floradas ou espécies vegetais constituintes da própolis, estando cada própolis sujeita ao bioma em que as abelhas subsistem.
2.1.4 - A própolis na nutrição humana
A própolis possui valor nutricional direto, pois compreende pequenas quantidades de proteínas, aminoácidos, elementos refrigerantes, açúcares e vitaminas (A, B1, B2, B6, C e E). Porém, ela é utilizada na dieta de seres humanos
2.1.5 - Propriedades terapêuticas
A - Ação antimicrobiana
Devido à sua forte ação antimicrobiana, a própolis é utilizada como "antibiótico natural". Estudos realizados por BANKOVA et al (1983), GRANGE & DAVEY (1990) e BANKOVA et al (1999) demonstraram que a própolis possui grande eficiência contra diversos microrganismos (quadro 1).
B - Ação anticancerígena
Desde 1992 estudos in vitro vêm sendo realizados com a própolis para o combate e inibição do aumento do carcinoma de câncer de útero (RAMOS, 1995). Em estudos in vitro empregando ratos, houve controle de células neoplásicas de ovário, mama, colo uterino, pulmão e estômago.
A substância reagente isolada na própolis e responsável por esse efeito modulador em neoplasias é conhecida como artepelina C, porém mais estudos necessitam ser realizados para elucidar o verdadeiro papel dessa proteína na gênese e desenvolvimento de neoplasias.
C - Ação antioxidante
Estudos da década de 1980 comprovaram que a própolis possui um poderoso antioxidante natural, capaz de liberar radicais que protegem os lipídios e compostos vitamínicos (como o ácido ascórbico) de serem oxidados ou destruídos no organismo humano (RAMOS, 1995).
É provável que essa oxidação/destruição esteja envolvida em alterações como doenças cardiovasculares, artrite, câncer, diabete melito, mal de Parkinson e doença de Alzheimer.
Quadro 1 - Ação da própolis sobre microrganismos diversos.
MICRORGANISMO AÇÃO
BACTÉRIAS
Bacillus subtilis Destruição da célula
Bacillus larvas Destruição da célula
Bacteroides nodosus Destruição da célula
Escherichia coli Inibição no crescimento
Helicobacter pylori Inibição no crescimento
Klebsiella pneumoniae Inibição no crescimento
Mycobacterium tuberculosis Inibição no crescimento
Salmonella spp Tratamento em potencial
Staphylococcus spp Inibição no crescimento
S. aureus Redução no crescimento
S. aureus multi-resistentes Inibição no crescimento
Streptococcus spp Inibição no crescimento
Streptomyces spp Inibição no crescimento
S. sobrinus,S. mutans, S.cricetus Inibição no crescimento FUNGOS
Ascosphaera apis Inibição no crescimento
Aspergillus niger Inibição no crescimento
Botrytis cinerea Inibição no crescimento
Candida albicans Redução no crescimento
Saccharomyces cerevisiae Redução no crescimento VÍRUS
Herpes Inibição no crescimento
Doença de Newcastle Redução no crescimento
Vírus da batata Inibição no crescimento PROTOZOÁRIOS
D - Ação cicatrizante e reparadora
A própolis tem se mostrado um grande estimulante para diversas enzimas do corpo humano responsáveis pelo metabolismo, circulação sanguínea e formação de colágeno. Também foi documentada a melhor recuperação de feridas provocadas por queimaduras. Acredita-se que o resultado satisfatório nos tratamentos reepitelizantes seja devido a uma substância encontrada na própolis e denominada arginina (CRISAN et al, 1995).
E - Ação anestésica e analgésica
Alguns agentes contidos na própolis propiciam efeito anestésico. Isso explica por que a própolis é usada há séculos no tratamento de dores de garganta e feridas de qualquer extensão.
Essa substância é amplamente utilizada desde 1984, em forma de pomada anestésica/analgésica, no tratamento dentário.
F - Ação imunestimulante
Estudos realizados no Japão demonstraram que a própolis ajuda a estimular o sistema imunológico em seres humanos, ativando células que produzem citocinas (GHISALBERTI, 1979).
Isso ajuda a explicar o efeito que a própolis produz na redução de tumores e também como coadjuvante natural na repressão do vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV).
G - Ação cardiovascular
calmante. Os diidroflavonóides contidos na própolis auxiliam no combate à hipertensão.
H - Ação no tratamento dentário
A própolis também é muito utilizada para tratamentos dentários, atuando como uma proteção no esmalte dos dentes (além do seu efeito analgésico, citado anteriormente).
Diluída em água e com seu uso feito através de bochechos, ela reduz o crescimento de microrganismos bucais e promove a prevenção de cáries.
Também é bastante recomendada para o tratamento de gengivites, reduzindo as hemorragias e auxiliando na remoção da placa bacteriana (AZEVEDO et al, 1999).
I - Ação no sistema respiratório
A própolis também demonstrou efeitos positivos no tratamento de bronquites crônicas, rinites alérgicas, faringites e rinofaringolaringites, além de atuar como expectorante natural quando há formação de catarro (AZEVEDO et al, 1999).
J - Efeito repelente
Com os últimos surtos de dengue no Brasil, estudos realizados pelo biólogo Gilvan Barbosa Gama (Florianópolis/SC), revelaram que a própolis, ao ser ingerida em intervalos constantes pelo ser humano, possui efeito repelente do vetor da doença, podendo ser útil no controle dessa endemia no país.
H - Contra-indicações
O uso da própolis não apresenta contra-indicações para seres humanos e animais. (RAMOS, 1995).
na literatura mundial. Esse produto é considerado pela medicina, desde os tempos remotos, como um agente benéfico para a saúde, sem a presença de efeitos desagradáveis ou indesejáveis.
2.1.6 - A própolis como antimicrobiano
Existem diversas preparações de extratos de própolis descritas na literatura científica e leiga, variando de acordo com o agente diluente, a concentração do solvente e do soluto e o período de extração. Como não há uma padronização na confecção desses extratos, os resultados obtidos com testes antimicrobianos são os mais diversos e antagônicos possíveis.
Os trabalhos que testaram a eficácia dos efeitos da própolis utilizaram esse produto em forma de tintura e, geralmente, em porcentagens altas (acima de 20-30%).
Em 1999, FRANCO & BUENO propuseram que para a obtenção de um extrato de própolis adequado, a concentração mais consistente é de 10%, tendo como líquido extrator o álcool etílico 93,7º.
SZEWCZAK & GODOY (1982), através de estudos que utilizaram preparações somente com etanol 96º em diferentes temperaturas, e preparações que misturavam o etanol 96º com propilenoglicol e éter etílico, constataram que a temperatura e a técnica de preparo das tinturas constituem fator importante na ação inibidora da própolis ao Staphylococcus. Esses autores colocam, ainda, que os solventes utilizados no preparo das tinturas não exerceram ação inibidora sobre os microrganismos do estudo.
Em uma avaliação laboratorial buscando as propriedades antimicrobianas da própolis sobre bactérias (especialmente Escherichia coli, Pseudomonas spp e
Staphylococcus aureus), ENDLER et al (2003) utilizaram extratos aquosos e
alcoólicos com diluições entre 15 e 30%. Os resultados obtidos naquela pesquisa demonstraram que a solução alcoólica de própolis foi eficiente no controle de bactérias patogênicas das vias respiratórias em ambas as diluições. Os autores colocam, ainda, que o álcool isoladamente não exerceu influência na inibição da
levedura, exceto quando presente associado à própolis.
No trabalho realizado por LONGHINI et al (2007), os resultados obtidos mostraram que a própolis apresenta atividade antifúngica mesmo em quantidades muito pequenas. Observou-se a inibição de vários tipos de leveduras até a diluição de 1:256 (cerca de 0,04mg/mL), com concentrações de própolis variando entre 5% e 30% e utilizando álcool etílico 93,7º.
Segundo CRUZ (1992), o extrato alcoólico de própolis apresenta atividade antifúngica na concentração de 1,25g/mL, no entanto, apresenta apenas atividade inibitória parcial para o desenvolvimento de leveduras nas concentrações estudadas 1,25g/mL, 2,5g/mL e 5g/mL.
VARGAS NETO (2004), verificou o efeito antifúngico da própolis sobre leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal. Nesse estudo foi utilizada tintura de própolis a 30 % e dentre outros extratos fitoterápicos testados, a própolis foi a mais eficaz, inibindo o crescimento de 72,2% das amostras.
A aplicação da própolis nos diversos segmentos da medicina é ampla, porém não existem estudos conclusivos sobre a sua ação antifúngica em
Malassezia spp presente no conduto auditivo de cães. Uma pesquisa conduzida
por SILVA et al (2006) revelou ter a própolis um forte efeito inibitório sobre o crescimento de Malassezia spp isoladas de condutos auditivos de cães, atingindo concentração inibitória mínima (CIM) de 1:20 (extrato aquoso) e 1:40 (extrato alcoólico). A diferença encontrada entre os dois extratos provavelmente se deu, segundo os autores, devido à interferência do álcool sobre as leveduras.
2.2 - Otite externa
As otites, ou afecções do sistema vestibulococlear, são afecções comuns na rotina veterinária de pequenos animais, respondendo por 5-20% dos casos atendidos (MULLER et al, 1989). Dependendo do quadro clínico apresentado, muitos pacientes padecem da enfermidade por anos, ou até mesmo são conduzidos à eutanásia devido à gravidade da doença e a não-resposta da otopatia frente aos procedimentos terapêuticos instaurados (CARLOTTI, 1991).
A otite externa pode ser conceituada como uma inflamação (aguda ou crônica) do meato acústico externo com o envolvimento de diferentes agentes etiológicos (LEITE et al, 2003).
Segundo AUGUST (1993), existem três grupos de fatores relevantes em otopatias que devem ser considerados, sendo eles: primários, predisponentes e perpetuantes.
Os fatores perpetuantes são representados por agentes oportunistas ou alterações estruturais progressivas do próprio sistema vestibulococlear. Os principais representantes desse grupo são microrganismos como fungos filamentosos (exceto o grupo dos dermatófitos) e leveduriformes, além de bactérias diversas.
Os fungos estão presentes tanto na microbiota normal quanto na alterada de caninos otopatas (LEITE, 1995). Dois grandes grupos são encontrados no ambiente auricular: os fungos filamentosos e os leveduriformes (incluindo os chamados fungos dimórficos). A flora fúngica do conduto auditivo enfermo de caninos é variável (MULLER et al, 1989) e muita controvérsia tem sido levantada com relação ao verdadeiro papel destes microrganismos na patogênese das otites.
As otites fúngicas primárias são raras em animais domésticos, e quando ocorrem, são causadas por Candida spp e Malassezia pachydermatis
(JUNGERMAN & SCHWARTZMAN, 1972). Outras leveduras e fungos dimórficos também estão presentes no ambiente auricular de caninos otopatas. SAPATERRA & LEITE (1997) apontaram Malassezia pachydermatis, Candida spp e Geotrichum spp (este último um fungo dimórfico) como elementos microbianos leveduriformes presentes em caninos não-otopatas.
2.3 - Malassezia spp e Malasseziose
As primeiras descrições do gênero Malassezia ocorreram há mais de um século (EICHSTED, 1846). Essa levedura foi isolada pela primeira vez do meato acústico externo de cães por Gustafson em 1955 (AKERSTEDT & VOLLSET,
1996).
Em 1925, WEIDMAN isolou de lesões de pele de rinocerontes indianos uma levedura lipofílica não-dependente com gemulação unipolar em formato de "garrafa", sendo primeiramente denominada como Pityrosporum pachydermatis, posteriormente P. canis e, atualmente, conhecida como Malassezia pachydermatis (CHANG, 1998).
Em seres humanos, as leveduras do gênero Malassezia estão relacionadas aos quadros patológicos como pitiríase versicolor, dermatite seborréica e dermatite atópica, que anteriormente eram apenas associados à espécie
Malassezia furfur (SCHLOTTFELDT et al, 2002).
Os microrganismos do gênero Malassezia pertencem à família
Cryptococcaceae, classe Blastomyces e subdivisão Deuteromycotina. A
classificação taxonômica de Malassezia (inicialmente Pytirosporum) foi revista por GUÉHO et al em 1996, possuindo atualmente sete espécies: M. furfur, M.
globosa, M. obtusa, M. pachydermatis, M. restricta, M. slooffiae e M. sympodialis.
A M. pachydermatis é considerada um habitante normal e patógeno oportunista do meato acústico externo de mamíferos, também podendo ser encontrada no reto, região interdigital, tegumento, sacos anais e vagina (KENNIS
et al,1996; BOND et al, 2000; NASCENTE et al, 2004).
As diferenças em sua densidade populacional em determinadas regiões do organismo, podem ser reflexos de alterações impostas aos hospedeiros, como mudanças nas condições físicas, químicas e/ou imunológicas do animal (CRESPO et al, 2002). Dessa maneira, os principais fatores condicionantes da malasseziose são terapia antibacteriana prolongada, uso de substâncias glicocorticóides, estados de hipersensibilidade (alergias), distúrbios da ceratinização (seborréia), distúrbios nutricionais ou hormonais e enfermidades intercorrentes (como neoplasias).
A detecção de fungos leveduriformes pode ser feita pela observação microscópica direta do material suspeito (WHITE, 1992) e cultura dos agentes em meios especiais (HUANG & LITTLE, 1993).
fungo deve ser feita em meios contendo uma fonte lipídica como promotora de crescimento, já que o fungo não se desenvolve satisfatoriamente em meios micológicos simples. Esses autores aconselharam a adição de ácidos graxos constituintes do cerúmen canino (ácidos esteárico, linoléico, margárico e oléico) como lipídios preferenciais na preparação do meio de cultura. Para a produção de energia, as leveduras do gênero Malassezia utilizam, preferencialmente, lipídios como fontes de carbono, ou seja, são microrganismos lipodependentes. Isso faz com que o substrato em que se desenvolvem seja caracterizado por uma alta concentração de ácidos graxos de cadeias longas (COUTINHO, 2002). Entretanto,
M. pachydermatis é a única exceção no grupo, pois embora lipofílica, não é
lipodependente. O acréscimo de ácidos graxos ao meio de cultura usado para o isolamento de M. pachydermatis apenas estimula o seu desenvolvimento, mas a ausência dessas fontes lipídicas não impede o seu crescimento (COUTINHO, 2002).
O isolamento da levedura é realizado em meio de cultivo com ágar Sabouraud ou ágar malte. A temperatura de incubação varia entre 25º e 41ºC por 24 a 48 horas (AKERSTEDT & VOLLSET, 1996). As colônias são opacas, de coloração amarelo-creme, passando à marrom-alaranjado conforme o envelhecimento; a superfície é redonda e a medida transversal é de 1-3mm; a textura é seca, friável, granulosa e, algumas vezes, gordurosa (GUILLOT et al, 1996).
A detecção de Malassezia em exsudato de ouvidos enfermos é variável. As diferenças entre os métodos de detecção do microrganismo fazem com que a prevalência do fungo não seja a mesma nos diversos estudos. Entretanto, como regra geral, a concentração dessa levedura no conduto auditivo é sempre mais baixa naqueles caninos que não apresentam otopatia clinicamente detectável (LEITE, 2003).
Por serem consideradas leveduras patogênicas oportunistas, Malassezia spp possuem alto poder de infectividade, aumentando acentuadamente o número de células fúngicas em animais que apresentem condições de umidade e calor no meato acústico externo e na pele, assim como em casos de distúrbios
imunológicos (FRASER, 1965; AIZAWA et al, 1999).
Considerando a complexidade do quadro clínico, é fundamental tratar a causa-base, porém é importante um tratamento eficaz para a malasseziose para essa não se tornar um fator perpetuante da otite externa (LOBELL et al, 1995; MOTA et al, 2000; MACHADO et al, 2003; NASCENTE et al, 2005).
A Malassezia pachydermatis é uma levedura isolada de meato acústico externo hígido de cães, assim como do inflamado, pois prolifera quando este microambiente sofre alterações que permitam o seu desenvolvimento seletivo. As condições que levam à produção excessiva de cerúmen ou aumento do pH no interior do meato acústico (infecções bacterianas) favorecem o desenvolvimento dessa levedura (WOODY & FOX, 1987).
O significado da Malassezia na etiologia da otite externa foi questionado durante muito tempo, mas atualmente já se conhece melhor o seu papel na patogênese dessa enfermidade (XAVIER E NASCENTE, 2003).
Embora a otite externa não represente uma ameaça à vida do animal, é dolorosa e requer tratamento imediato. Porém, a resposta ao tratamento eleito pode ser complicada devido à etiologia multifatorial que concorre para o estabelecimento desta enfermidade. O sucesso no tratamento requer a identificação e, se possível, a eliminação de todos os fatores envolvidos (BALBI & RAMADINHA, 1994).
O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma alternativa eficaz e econômica (CRISAN et al, 1995). É nesse sentido que a própolis pode ser benéfica como coadjuvante na terapia de otopatias externas cujo envolvimento de M. pachydermatis esteja patente.
3. OBJETIVOS
3.1 - Principal
Testar a capacidade antimicrobiana de extratos aquoso e alcoólico de própolis sobre Malassezia spp isoladas do conduto auditivo de cães.
3.2 - Secundário
Verificar se o álcool utilizado no preparo dos extratos de própolis (como agente de diluição da substância-base) possui alguma interferência na possível eficácia contra Malassezia spp.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Obtenção das culturas fúngicas
Foram isoladas 40 amostras de Malassezia spp, obtidas a partir de condutos auditivos de cães atendidos no Hospital Veterinário do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Lavras (HV-DMV/UFLA), em Lavras/MG.
O cerúmen foi colhido por meio de swabs estéreis, introduzidos no conduto auditivo até a transição anatômica entre porções vertical e horizontal (“joelho” ou “cotovelo” do ouvido). O material colhido foi imediatamente semeado em placas com ágar Sabouraud modificado (ASM) acrescido de cloranfenicol (50µg/ml-1).
4.2 - Processamento inicial em laboratório
Ao chegar ao Laboratório de Micologia do DMV/UFLA, as placas semeadas foram incubadas a 33°C por 48-72 horas, em busca de crescimento leveduriforme.
As colônias compatíveis com Malassezia (colônias foscas, com aspecto cremoso branco-fosco e textura macia e friável) foram repicadas em placas contendo ASM, e novamente incubadas a 33°C por 48-72 horas.
4.3 - Preparo da solução-mãe de própolis
O extrato seco moído de própolis foi adquirido no Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Lavras (DEF/UFLA), basicamente oriundo de florada de eucaliptos e mata nativa regional.
O pó de própolis foi diluído em álcool etílico 96° na proporção de 20mg de pó para cada 120mL de álcool (solução-mãe a 10%), inicialmente por maceração e depois com o auxílio de bastão de vidro (figura 1). Após um período de 24 horas, a solução passou por coagem em papel de filtro n°40 e posterior estocagem em frascos de cor âmbar, mantidos sob refrigeração (4-6°C).
Figura 1 - Pesagem do pó de própolis para preparo da solução-mãe a 10% e posterior diluição em álcool etílico 96º. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
4.4 - Diluições seriadas
A solução de própolis passou por diluições de 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25 % e 0,625%, distribuídas em tubos de ensaio estéreis 20x150mm, conforme disposto na tabela 2.
Cada amostra leveduriforme foi testada frente a duas baterias distintas, de acordo com o diluente utilizado: água destilada estéril ou álcool 96º.
O grupo-controle foi composto por tubos contendo álcool etílico 96° a 60% e água destilada estéril.
Tabela 2 - Protocolo de diluição seriada para preparo de soluções de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
CONCENTRAÇÃO PRÓPOLIS DILUENTE*
(%) (mL) (mL) 20 2,0000 8,0000 10 1,0000 9,0000 5 0,5000 9,5000 2,5 0,2500 9,7500 1,25 0,1250 9,8750 0,625 0,0625 9,9375
* Álcool ou Água Destilada
4.5 - Preparo das placas de Petri
Para realização do método de difusão em meio sólido, foram utilizadas placas de Petri contendo 25mL de ASM, em cuja superfície foram confeccionados sete orifícios de 5mm de diâmetro com o auxílio de uma pipeta de Pasteur estéril, em espaçamento regular.
4.6 - Teste de difusão em ágar
O teste de difusão em ágar foi realizado de acordo com o método recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute, com algumas
modificações (CLSI, 2006).
Essa prova é baseada na presença ou ausência de um halo de inibição, considerando o diâmetro do halo em milímetros. Esse método é rotineiramente utilizado para determinar a sensibilidade de microorganismos patógenos aos antibióticos.
4.7 - Preparo dos inóculos fúngicos
As cepas testadas foram provenientes de inóculos de 48 horas, oriundos das culturas de estoque. Por meio de um alça de platina, foram realizadas diluições do microrganismo em tubos de ensaio contendo salina fisiológica estéril, até se alcançar a concentração 3+ da escala de McFarland utilizando o cartão de Wickerham (figura 2). Esse procedimento visou padronizar a densidade fúngica, evitando uma possível interferência do número de microrganismos na formação do halo de inibição.
Figura 2 - Padronização da densidade leveduriforme por meio de turbidimetria direta usando o cartão de Wickerham (escala 3+ de MacFarland). DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
4.8 - Semeadura das cepas fúngicas e preenchimento dos orifícios
Com o auxílio de um swab estéril, cada inóculo de levedura foi semeado em duplicata nas placas de Petri contendo ASM. Após a semeadura, e com o auxílio de uma micropipeta, foram adicionados em cada orifício, 50 a 80µL das diluições de própolis (figura 3). Para cada levedura semeada em duplicata, foi montada uma placa com uma série alcóolica e outra com uma série aquosa (figura 4). Em seguida, as placas foram incubadas por 48-72 horas à temperatura de 33ºC.
Figura 3 - Preenchimento dos orifícios das placas de Petri com solução diluída de extrato de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
4.9 - Mensuração dos halos de inibição e análise dos dados
Após incubação das placas, foi realizada a mensuração, em milímetros (por meio de um escalímetro digital), dos halos de inibição de cada orifício e anotados para posterior comparação.
Para maior fidelidade estatística, foram utilizados testes não-paramétricos, pressupondo-se o desconhecimento da distribuição das variáveis na população estudada (em qualquer nível de mensuração).
As análises estatísticas foram realizadas pelo Teste do Qui-quadrado (AYRES & AYRES Jr., 1987), utilizando quatro apresentações de acordo com o número da amostra e de categorias, além das freqüências esperadas.
0,625% 1,25% 2,5% 5% 10% 20% Controle
Figura 4 - Distribuição das diluições dos extratos aquoso e alcoólico de própolis para o teste de difusão em ágar. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
5. RESULTADOS
Nas tabelas 3 e 4 estão dispostos os dados de mensuração dos halos de inibição para as baterias aquosa e alcoólica, respectivamente.
O extrato aquoso de própolis exerceu efeito inibidor do crescimento em 23 amostras (57,5% da população) na concentração a 20%, e em duas cepas (5% da população) na concentração a 10%; nas demais diluições de própolis, não houve nenhuma interferência no crescimento da levedura. Na figura 5 pode-se observar amostra que não apresentou nenhuma formação de halo de inibição, atestando a ausência de efeitos das diluições aquosas de própolis usadas neste experimento com relação às Malassezia spp.
Controle composto apenas por água destilada estéril ou álcool 96º Sentido da leitura
Tabela 3 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas concentrações aquosas de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
CONCENTRAÇÃO DE PRÓPOLIS (%) CEPA CTR-H 20 10 5 2,5 1,25 0,625 1 0 10 0 0 0 0 0 2 0 11 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 4 0 11 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 6 0 10 0 0 0 0 0 7 0 9 0 0 0 0 0 8 0 10 0 0 0 0 0 9 0 8 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 15 0 10 0 0 0 0 0 16 0 10 0 0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 0 19 0 11 0 0 0 0 0 20 0 11 0 0 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 0 22 0 0 0 0 0 0 0 23 0 11 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 26 0 0 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 0 0 0 28 0 7 0 0 0 0 0 29 0 9 7 0 0 0 0 30 0 11 0 0 0 0 0 31 0 10 0 0 0 0 0 32 0 9 0 0 0 0 0 33 0 11 0 0 0 0 0 34 0 0 0 0 0 0 0 35 0 10 8 0 0 0 0 36 0 8 0 0 0 0 0 37 0 0 0 0 0 0 0 38 0 12 0 0 0 0 0 39 0 12 0 0 0 0 0 40 0 10 0 0 0 0 0 Média 0,00 8,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 DP 0,00 5,12 1,66 0,00 0,00 0,00 0,00
CTR-H = Controle aquoso; DP = Desvio-padrão
Figura 5 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato aquoso de própolis da cepa de Malassezia sp #33. Observar a ausência de halos de inibição em torno dos orifícios. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
As 40 amostras de Malassezia spp testadas foram inibidas pela solução alcóolica de própolis, principalmente em altas concentrações (Figura 6). Apenas oito amostras (20,0% do total) apresentaram crescimento em diluição de 1,25% e 12 amostras (30,0% da amostragem) apresentaram crescimento na solução de própolis 0,625%.
Os halos de inibição apresentaram maior diâmetro conforme ocorria aumento da porcentagem da solução alcóolica de própolis (gráfico 1). Em alguns casos, ocorreram diâmetros maiores que os obtidos para o controle, constituído apenas por álcool (figura 6).
Tabela 4 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas concentrações alcoólicas de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
CONCENTRAÇÃO DE PRÓPOLIS (%) CEPA CTR-A 20 10 5 2,5 1,25 0,625 1 13 18 13 13 11 10 9 2 11 13 13 11 9 10 0 3 8 12 11 9 9 10 8 4 8 14 13 13 11 11 10 5 9 11 10 10 12 9 0 6 10 15 11 10 10 11 11 7 8 13 10 11 10 0 0 8 9 17 14 11 12 0 0 9 7 12 12 11 9 7 0 10 10 15 12 10 9 13 10 11 10 17 12 11 10 9 11 12 8 14 9 9 8 0 0 13 9 14 11 9 10 0 0 14 8 12 10 10 9 8 0 15 11 15 11 10 12 0 0 16 8 15 13 13 11 9 10 17 9 17 14 15 12 0 10 18 8 16 10 10 11 9 9 19 9 14 12 12 12 10 11 20 10 15 12 12 12 9 9 21 10 12 12 10 10 10 8 22 10 14 10 10 8 10 10 23 7 14 10 10 11 9 9 24 7 14 12 9 10 0 0 25 7 12 8 9 9 0 0 26 9 14 8 8 7 8 7 27 8 14 12 8 8 8 7 28 7 14 11 10 10 7 0 29 10 15 11 11 7 9 10 30 8 15 13 11 9 10 8 31 7 13 10 11 8 8 0 32 7 14 13 13 8 11 8 33 8 12 11 12 9 9 9 34 7 15 12 12 8 8 9 35 7 13 12 14 11 6 7 36 8 12 10 10 8 8 8 37 8 12 11 13 8 7 7 38 9 15 14 13 11 10 9 39 8 15 14 15 10 10 10 40 10 17 16 11 8 8 9 Média 8,00 14,00 12,00 11,00 10,00 9,00 8,00 DP 1,39 1,68 1,69 1,74 1,51 3,90 4,39
CTR-A = Controle alcóolico; DP = Desvio-padrão
Figura 6 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato alcoólico de própolis da cepa de Malassezia sp #27. Observar os halos de inibição em torno de todos os orifícios. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
Gráfico 1 - Comportamento das medidas de diâmetro dos halos de inibição em teste de difusão em ágar usando extrato alcoólico de própolis frente a cepas de Malassezia spp. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
6. DISCUSSÃO
A própolis tem sido utilizada pela população como um medicamento alternativo à alopatia, de forma abusiva e sem indicação médica. Esse produto é alvo constante de estudos com o objetivo de se obter o maior número de informações ao seu respeito. O caráter crônico das otopatias e a dificuldade de absorção das drogas disponíveis, aliados ao elevado custo dos antifúngicos clássicos, são condições limitantes para o sucesso terapêutico nas malassezioses óticas, justificando a busca por opções mais acessíveis.
O uso de diferentes concentrações da própolis, diluídas tanto em água como em álcool, torna-se necessário para se descobrir o efeito do solvente orgânico alcoólico na inibição do crescimento de Malassezia spp. Nesse sentido, pode-se identificar o verdadeiro efeito da própolis sobre as leveduras, desconsiderando uma possível interferência com o álcool.
No presente trabalho, o extrato de própolis foi preparado em uma solução de estoque (solução-mãe) de 10%, utilizando o álcool etílico 96º como diluente e líquido extrator. Dessa forma, obteve-se diluições-testes de soluções aquosas e alcoólicas a 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25% e 0,625%. Observou-se que a diluição do pó de própolis ocorreu sem problemas, de forma progressiva, rápida e sem
0 5 10 15
deixar resíduos ou depósitos. Portanto, adicionalmente aos trabalhos de FRANCO & BUENO (1999), sugere-se que o extrato de própolis possa ser preparado, também, com álcool etílico 96º, apesar de não ser possível uma comparação direta da eficácia entre as duas soluções que utilizaram alcoóis diferentes, devido principalmente à dissimilaridade dos dados entre aquela pesquisa e esta dissertação.
Ao se buscar uma análise geral dos resultados obtidos, verificou-se que o maior percentual de sensibilidade de Malassezia spp ocorreu nos meios em que foi acrescida solução alcoólica de própolis. Contrariamente às afirmações de SZEWCZAK & GODOY (1982) e ENDLER et al (2003), provou-se, neste experimento, que o álcool possui um efeito inibitório sobre o crescimento de
Malassezia spp, o que pode ser comprovado pelos halos de inibição presentes em
todos os orifícios-controles das placas em que os extratos alcoólicos foram adicionados (tabela 4).
É interessante frisar que em 100% das amostras testadas frente ao extrato alcoólico de própolis, o diâmetro dos halos de inibição foi maior na diluição de 20% (composto por álcool e própolis) que no orifício-controle (constituído apenas de álcool), como atestado pelos dados da tabela 3. Esse fato permite afirmar que ocorreu um efeito somatório na inibição de crescimento de Malassezia spp quando o álcool e a própolis foram utilizadas na mesma solução.
O extrato aquoso de própolis não apresentou inibição em concentrações baixas (tabela 4), porém essa inibição ocorreu à medida que a concentração de solução de própolis foi elevada a 20%. Essa discrepância entre o efeito inibitório dos extratos alcoólico e aquoso pode ser devido à própria natureza diluente de substâncias orgânicas voláteis dos alcoóis, já que os componentes ativos da própolis (fenólicos, flavonóides, ácidos e outros) não são solubilizados pela água, conforme verificado por MARCUCCI et al (1999) e DANTAS et al (2000). É provável que tal fato se deva, então, à saturação do líquido extrator e ao fato do álcool dissolver bem mais a resina do que a mistura aquosa (LONGHINI et al, 2007).
extratos alcoólicos e baixa em extratos aquosos, não se podendo generalizar a eficácia para qualquer extrato, como afirmam LONGHINI et al (2007). Os dados dessa dissertação permitem uma comparação qualitativa com a pesquisa de CRUZ (1992), que sugeriu concentrações pré-estabelecidas mais próximas das trabalhadas no presente estudo. Mesmo assim, há diferenças metodológicas entre os dois experimentos que, talvez, impeçam um grau de similitude maior.
VARGAS NETO (2004) verificou a grande eficácia da tintura de própolis a 30% sobre Candida spp isoladas da cavidade bucal. Mesmo não se podendo comparar quantitativamente os resultados daquele experimento com os obtidos nesta dissertação, pode-se inferir que a ação da própolis sobre o crescimento de leveduras é um fato a ser destacado (e mais pesquisado).
As diferenças nos tamanhos dos halos de inibição observada no extrato alcoólico se devem, provavelmente, a maior ou menor adaptação das leveduras ao solvente (lembrando a alta tolerância das leveduras ao ambiente com a presença de álcool, já que as mesmas possuem um caráter metabólico fermentativo proeminente); porém, ao se comparar amostras dentro da mesma diluição, não houve diferença estatística significativa (p<0,05).
Inferindo-se diretamente em uma das principais características do gênero
Malassezia, ou seja, sua lipoafinidade, pode-se suspeitar que o álcool etílico
possa ter removido a fonte de gordura do meio, dificultando (ou mesmo impedindo) o metabolismo normal do microrganismo. Esse fato, também, pode estar relacionado com os tamanhos dos halos de inibição discutidos no parágrafo anterior.
7. CONCLUSÕES
Com base nos dados desta Dissertação, pode-se concluir que:
* as soluções de própolis possuem efeito inibidor do crescimento in vitro de
extrato aquoso e maior em extrato alcoólico;
* o álcool etílico 96º isoladamente possui efeito inibidor do crescimento in
vitro de Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães.
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Infelizmente o volume de trabalhos versando sobre a ação de extratos de própolis sobre Malassezia spp é insuficiente para se tecer considerações a respeito da real eficácia desta substância sobre a levedura.
Muito se tem para fazer nessa área, como estabelecer tipo de diluente usado, temperatura de fabricação do extrato e tempo de extração dos princípios ativos.
Todavia, os dois aspectos mais importantes nessa linha de pesquisa ainda são determinar qual(is) a substância(s) química(s) responsável(is) pelo efeito antileveduriforme (juntamente com seu modo de ação) e proceder aos testes in
vivo com extratos de própolis para se conhecer, em um verdadeiro teste de
campo, como se comporta um produto com reconhecida atividade antifúngica in
vitro, neste tipo de ambientação.
Projeto aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal (protocolo nº 52/2006-CEEA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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