UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
FELIPE TORRES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS VIAS COLINÉRGICA E NITRÉRGICA NO
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA CORRENTE
INTERFERENCIAL EM MODELO ANIMAL DE DOR
INFLAMATÓRIA
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2019
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2019
FELIPE TORRES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS VIAS COLINÉRGICA E
NITRÉRGICA NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA
CORRENTE INTERFERENCIAL EM MODELO
ANIMAL DE DOR INFLAMATÓRIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profª. Drª. Josimari Melo de Santana
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2019
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
O48a
Oliveira, Felipe Torres de
Avaliação das vias colinérgicas e nitrérgica no efeito antinociceptivo da corrente interferencial em modelo animal de dor inflamatória / Felipe Torres de Oliveira ; orientadora Josimari Melo de Santana. – São Cristóvão, SE, 2019.
72 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) – Universidade Federal de Sergipe, 2019.
1. Estimulação elétrica - Tratamento. 2. Dor. 3. Receptores muscarínicos. 4. Dor nociceptiva. 5. Analgesia. 6. Óxido nítrico. I. Santana, Josimari Melo de. II. Título.
FELIPE TORRES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS VIAS COLINÉRGICA E
NITRÉRGICA NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA
CORRENTE INTERFERENCIAL EM MODELO
ANIMAL DE DOR INFLAMATÓRIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
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Presidente da banca: Profª. Drª. Josimari Melo de Santana
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Examinador 1: Prof. Dr. Richard Eloin Liebano
__________________________________________________
DEDICATÓRIA
Dedico essa dissertação à vida, que me ensinou a ter paciência e persistência durante toda a trajetória acadêmica.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus, inteligência suprema, que permitiu que eu chegasse até aqui. Aos meus guias espirituais que iluminaram minhas ideias, me instruíram nos momentos de dúvida e me fortaleceram nas dificuldades.
Aos meus pais, Soares e Cristina, que sempre batalharam para que eu pudesse um dia possuir o grau de bacharel, e que não mediram esforços para que eu fosse além e chegasse até aqui. Que fizeram o possível e o impossível, mesmo na dificuldade. Obrigado, por serem uns dos maiores incentivadores da minha carreira.
À minha estimada orientadora, Profª. Drª Josimari Melo de Santana, por toda confiança depositada em mim durante todos esses anos. Obrigado por ter me aceitado como seu orientando, por todas as broncas, oportunidades e, principalmente, pelos ensinamentos transmitidos.
À minha noiva, Gabrielle Dantas, por ter me incentivado a seguir esse caminho. Obrigado pelos 5 anos que estamos juntos, por acreditar em mim durante todo esse tempo, e por ser uma grande incentivadora. Você acredita mais em mim do que eu mesmo.
Agradeço aos meus sogros, Jucilene e Antônio, que também incentivaram a inscrição no mestrado e estiveram sempre ao meu lado durante essa caminhada aconselhando e apoiando nas horas difíceis.
Aos meus amigos do LAPENE que me auxiliaram direta ou indiretamente para que eu finalizasse mais essa etapa. Primeiramente quero agradecer a Kamilla Cruz, pelo apoio nas horas que as dúvidas surgiam e pela colaboração com o projeto. Quero agradecer também a Maiara Simões, peça fundamental para a finalização desse projeto, que além da colaboração sempre esteve me incentivando quando as coisas pareciam dar errado. Ivana, Eliana, André, Camila Perete, Camilla Dalan, Mayara Tavares, Annanda e Larissa também não poderia deixar de agradece-los por todo o auxílio.
À minha família, especialmente, minha tia Conceição, que nas horas mais difíceis estavam sempre dispostos a ajudar.
Aos meus amigos agradeço pela compreensão quando necessitei me ausentar dos encontros, e por apoiarem as minhas decisões.
Agradeço a Universidade Federal de Sergipe e a todos os integrantes do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, especialmente ao secretário Renivan, figura mais
solícita e dedicada que eu já conheci. Também gostaria de agradecer aos professores do programa e da banca de acompanhamento ao aluno por toda a ajuda intelectual.
Aos professores Enilton Camargo e Sara Thomazzi pelas contribuições de materiais essenciais para o projeto, e aos professores Patrícia Marques e Leandro Marques pela compreensão quando precisávamos dividir os horários no laboratório. Agradeço aos laboratório de pesquisa do PROCFIS e a seus integrantes que permitiram utilizar de seus equipamentos quando necessário.
Por fim, mas não menos importante, aos animais, que tem grande importância para a pesquisa científica e para a conclusão desse trabalho. As agências de fomento, CAPES e FAPITEC, pelo aporte financeiro e subsídio das bolsas que me mantiveram voltado exclusivamente para a execução dessa pesquisa.
“...Because limits, like fears, are often just an illusion” (Jordan, Michael)
RESUMO
Avaliação das vias colinérgica e nitrérgica no efeito antinociceptivo da corrente interferencial em modelo animal de dor inflamatória, Felipe Torres de oliveira, São Cristóvão, 2019.
Introdução: Estudos mostram a eficácia da corrente interferencial (CI) na redução da dor em
diversas doenças. No entanto, ainda há necessidade de trabalhos que evidenciem os mecanismos fisiológicos pelos quais a analgesia é promovida pela CI. O presente trabalho visa investigar a ativação central das vias colinérgica e nitrérgica pela ação antinociceptiva da corrente interferencial em modelo animal de inflamação articular. Material e Métodos: Trinta e seis ratos Wistar machos foram alocados em 6 grupos, levando-se em consideração o tratamento e os fármacos ou veículos administrados (controle salina, CI + salina, L-arginina, betanecol, CI + L-NNA e CI + atropina). Para a via nitrérgica, foram utilizados os fármacos L-arginina e Nω-Nitro-L-arginina (L-NNA). A via colinérgica foi avaliada utilizando-se atropina e betanecol. Todos os fármacos e veículos foram administrados por injeção intratecal. Para a realização do estudo, foi utilizado modelo animal de inflamação articular aguda, a qual foi induzida na articulação do joelho esquerdo. O tratamento com a CI foi realizado na articulação inflamada. As variáveis limiar mecânico de retirada da pata (von Frey eletrônico) e distância percorrida (monitor de atividades) foram analisadas nos momentos basal (animais hígidos), pré-tratamento (24h após a indução da inflamação articular) e pós-tratamento (60 min após o tratamento). Os animais passaram por um período de aclimatação no von Frey eletrônico por dois dias prévios ao experimento. Resultados: Para o limiar mecânico de retirada da pata, todos os grupos apresentaram redução significativa após a indução da inflamação articular (p<0,0001). Na comparação intragrupos entre os momentos pré e pós-tratamento, os grupos CI + salina (p<0,0001), CI + L-NNA (p=0,0017), L-arginina (p=0,0001) e betanecol (p=0,0073) apresentaram aumento do limiar. A comparação intergrupos no pós-tratamento indica que o limiar do grupo controle salina foi significativamente menor do que os grupos CI + salina (p=0,0014), CI + L-NNA (p=0,0010), L-arginina (p<0,0001) e betanecol (p=0,0002). Os grupos CI + atropina e controle salina não foram significativamente diferentes no pós-tratamento. Os Valores da distância percorrida reduziram significativamente em todos os grupos após a indução. Comparando-se os momentos pré e pós-tratamento os grupos CI + Salina (p=0,0303) e CI + L-NNA (p=0,0034) a presentaram redução da distância percorrida, porém não foram significativamente diferentes do grupo controle salina no pós-tratamento. O grupo CI + salina apresentou tamanho de efeito insignificante e muito grande quando comparado, respectivamente, com os grupos CI + L-NNA (d=0,04) e CI + atropina (d=1,68) no pós-tratamento. Conclusão: A corrente interferencial ativa via colinérgica espinal para promover seu efeito antinociceptivo. A via do óxido nítrico não é ativada pela ação hipoalgésica da corrente.
Descritores: Terapia por Estimulação Elétrica; Dor; Nocicepção; Analgesia; Receptores
ABSTRACT
Cholinergic and nitrergic pathways in the antinociceptive effect of interferential current in the animal model of inflammatory pain, Felipe Torres de Oliveira, São Cristóvão, 2019.
Introduction: Studies show the effectiveness of interferential current in reducing pain in
various diseases. However, there is still a need for studies that highlight the physiological mechanisms by which analgesia is promoted by IC. The present work aims to investigate the central activation of cholinergic and nitrergic pathways by antinociceptive action of interferential current in animal model of joint inflammation. Material and methods: Thirty-six male Wistar rats were allocated to 6 groups, taking into consideration treatment and drugs or vehicles administered (control saline, CI + saline, L-arginine, bethanechol, CI + L-NNA and CI + atropine). For the nitrergic pathway, the drugs L-arginine and Nω-Nitro-L-arginine (L-NNA) were used. Cholinergic pathway was evaluated using atropine and bethanechol. All drugs and vehicles were administered intrathecally. Inflammation was induced in the left knee joint, and IC treatment was performed on the inflamed joint. The variables mechanical paw withdrawal threshold (PWT) and motor performance were analyzed at baseline, pre-treatment and post-treatment. Results: mechanical paw withdrawal threshold in all groups showed significant reduction after induction of joint inflammation (p <0.0001). In the intragroup analyzes between the pre and post-treatment moments, the CI + saline (p <0.0001), CI + L-NNA (p=0.0017), L-arginine (p = 0.0001) and bethanechol groups (p=0.0073) showed an increase in the threshold. Post-treatment intergroup comparison indicates that the control saline group threshold was significantly lower than the CI + saline (p=0.0014), CI + L-NNA (p=0.0010), L-arginine (p<0.0001) and bethanechol (p=0.0002). The CI + atropine and control saline groups were not significantly different after treatment. The values of the motor performance decreased significantly in all groups after induction. Comparing the pre and post-treatment moments, the CI + Saline (p=0.0303) and CI + L-NNA (p=0.0034) groups presented a reduction in the motor performance, but were not significantly different from the control saline group after treatment. The CI + saline group presented insignificant and very large effect size when compared, respectively, with the CI + L-NNA (d=0.04) and CI + atropine (d=1.68) groups after treatment. Conclusion: The results of the present study indicate that the antihyperalgesic effect of interferential current includes activation of spinal muscarinic receptors. Nitrergic pathway is not activated by the hypoalgesic action of the current.
Keywords: Electrical Stimulation Therapy; Interferential Current; Pain; Nociception;
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Via do óxido nítrico na nocicepção... 26
Figura 2. Via do óxido nítrico na antinocicepção... 27
Figura 3. Modulação do sinal nociceptivo pela via colinérgica... 29
Figura 4. Representação do local da injeção de carragenina e aplicação da corrente... 34
Figura 5. von Frey eletrônico... 35
Figura 6. Monitor de atividades... 36
Figura 7. Delineamento experimental... 39
Figura 8. Limiar mecânico de retirada da pata (via do óxido nítrico)... 41
Figura 9. Limiar mecânico de retirada da pata (receptores muscarínicos)... 43
Figura 10. Distância percorrida (via do óxido nítrico)... 45
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Fármacos utilizados e suas respectivas vias... 37
Quadro 2. Alocação dos animais e número de animais por grupo... 38
Quadro 3. Dose dos fármacos utilizados, tempo de efeito e veículo para diluição... 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tamanho do efeito intragrupo para a via do óxido nítrico... 42
Tabela 2. Tamanho do efeito intergrupo para a via do óxido nítrico... 42
Tabela 3. Tamanho do efeito intragrupo para a via colinérgica... 43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh - Acetilcolina ADC – Adenilato ciclase
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ANOVA – Análise de variância
ATP – Trifosfato de adenosina AVE – Acidente vascular encefálico
CEPA – Comitê de Ética em Pesquisa Animal CGRP - Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal CI – Corrente interferencial
DMSO – Dimetilsulfóxido
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial FAM – Frequência de amplitude modulada GABA – Ácido gama aminobutírico GMPc – Guanosina monofosfato cíclico GTP – Guanosina trifosfato
i.t. – Intratecal IL-1 – Interleucina 1 IL-8 – Interleucina 8
iNOS – Óxido nítrico sintase indutível IP3 –Inositol trifosfato
K+/ATP – Canais de potássio sensíveis a ATP L-NA – Nω-nitro-L-arginina
mACHR- Receptores colinérgicos muscarínicos nACHR- Receptores colinérgicos nicotínicos
NADPH - Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido nítrico sintase
PA – Potencial de ação p – Nível de significância PKG- Proteína quinase G PLC- Fosfolipase C
RVM – Bulbo rostral ventromedial sGC – Guanilato ciclase solúvel
SIN-1 - NO 3-morpholinosydnonimine SP – Substância P
TENS – Estimulação elétrica nervosa transcutânea TNF-alfa – Fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO……… 19 2. REVISÃO DE LITERATURA….………... 22 2.1. Neurociência da Dor………... 22 2.2. Óxido Nítrico………... 23 2.3. Receptores Colinérgicos………... 27 2.4. Corrente Interferencial………. 29 3. OBJETIVOS………. 32 3.1. Objetivos Gerais………... 32 3.2. Objetivos Específicos ………... 32 4. MATERIAL E MÉTODOS…..………... 33 4.1. Animas………. 334.2. Indução da inflamação articular………... 33
4.3. Aplicação da Corrente Interferencial………... 33
4.4. Testes comportamentais………... 34
4.4.1. Aclimatação………... 34
4.4.2. Mensuração do limiar mecânico de retirada da pata..……….………. 34
4.4.3. Mensuração da distância percorrida..………... 35
4.5. Tratamento farmacológico..………... 36 4.6. Grupos………... 37 4.7. Injeção Intratecal………. 37 4.8. Delineamento experimental………..………...………… 38 4.9. Análise estatística……… 40 5. RESULTADOS………. 41
5.1. Limiar mecânico de retirada da pata…...………. 41
5.1.1. Via do óxido nítrico……….. 41
5.1.2. Receptores muscarínicos……….. 42
5.2. Distância percorrida………. 44
5.2.1. Via do Óxido nítrico………. 44
5.2.2. Receptores muscarínicos……….. 44
6. DISCUSSÃO………. 46
REFERÊNCIAS………... 54 APÊNDICE A……… 66 ANEXO A……….. 72
1. INTRODUÇÃO
A corrente interferencial (CI) é um recurso eletroterapêutico não farmacológico e não invasivo utilizado para alívio da dor na prática clínica (Lindsay et al., 1990; Pope et al., 1995; Robertson e Spurritt, 1998; Poitras et al., 2005; Chipchase et al., 2009; Ladeira et al., 2015). Por ser formada através da interferência de duas correntes alternadas de média frequência (Ganne, 1976; Goats, 1990; Ozcan et al., 2004), a CI é caracterizada por apresentar maior penetração tecidual, através da redução da impedância da pele, promovendo menor desconforto para o paciente, quando comparada a correntes de baixa frequência (Beatti et al., 2011; Alqualo-Costa et al., 2018).
Estudos evidenciam que a CI é um recurso eficaz para redução da dor em condições como osteoartrite (Gundog et al., 2012; Zeng et al., 2015), síndrome do túnel do carpo (Koca et al., 2014; Huisstede et al., 2018), fibromialgia (Almeida et al., 2003; Moretti et al., 2012; Araújo, 2015), dor no ombro em indivíduos hemiplégicos (Suriya-amarit et al., 2014), além de modular a espasticidade e promover melhora na marcha e equilíbrio de pacientes pós acidente vascular encefálico (AVE) (Suh et al., 2014).
Por meio de estudos in vitro com promielócitos humanos, verificou-se que a corrente interferencial, utilizada em diferentes frequências de amplitude modulada (FAM), pode estimular ou inibir a liberação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e das citocinas IL-1β e IL-8 (Sontag, 2000), além de exercer mudança das concentrações de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), de acordo com a frequência utilizada (Sontag e Dertinger, 1998). Dois estudos pré-clínicos investigaram os efeitos da CI na redução da hiperalgesia (Jorge et al., 2006; DeSantana et al., 2011), porém ambos não avaliaram como esse efeito ocorreu fisiologicamente. Apesar de ser amplamente utilizada como recurso eletroanalgésico, estudos que investigam os mecanismos pelos quais a corrente interferencial exerce essa função são escassos, contrastando com a estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS), que possui uma gama de evidências comprovando seu efeito antinociceptivo por ação central (Sluka KA et al., 1999; Kalra et al., 2001; Radhakrishnan e Sluka, 2003; Radhakrishnan et al., 2003; Sluka et al., 2005; Maeda et al., 2007) e periférica (King et al., 2005; Sabino et al., 2008). Sabe-se, até o presente momento, que a CI promove antinocicepção por meio da ativação de receptores α2 adrenérgicos, colinérgicos muscarínicos, e através da via NO/GMPc/K+ ATP (Cruz, 2019),
mas não há distinção clara se estas vias são moduladas em regiões periféricas ou centrais espinais ou supraespinais.
No sistema nervoso central, o controle descendente da dor acontece através de diferentes vias e das interações entre elas,inibindo os sinais excitatórios ascendentes no corno dorsal da medula espinal (Sandkühler, 1996; Millan, 2002; Heinricher et al., 2009; Xie et al., 2009). Neurotransmissores como peptídeos, serotonina, norepinefrina, dopamina, acetilcolina (ACh), ácido gama-aminobutírico (GABA), e o neuromodulador óxido nítrico (NO) estão caracterizados, na literatura, por integrarem o sistema inibitório descendente (Yoshimura e Furue. 2006; Cury et al., 2011; Taniguchi et al., 2011; De Angelis e Tata, 2016; Stein, 2016; Mercado-Reyes et al., 2019). Duas classes mais comuns de receptores podem ser alvos dos neurotransmissores inibitórios, os receptores metabotrópicos e os canais iônicos ativados por ligantes, porém o óxido nítrico, por ser uma molécula lipossolúvel, acopla-se, no interior da célula, a guanilato ciclase solúvel (GCs) (Montfort et al., 2017).
O óxido nítrico é uma molécula importante que desempenha diversas funções no organismo (Flora filho e Zilberstein, 2000; Esplugues, 2002). Como neuromodulador, possui papel controverso nas vias nociceptivas, podendo exercer efeito excitatório ou inibitório (Cury et al., 2011). Diversos estudos investigam o papel do NO na antinocicepção central (Galdino et al., 2015a; Galdino et al., 2015b; de Los Monteros-Zuñiga et al., 2016).
A modulação da resposta nociceptiva também pode ser mediada por ativação de receptores colinérgicos espinais e supraespinais (Naser e Kuner, 2018). Embora evidências mostrem o papel de receptores nicotínicos na modulação da dor (Takeda et al., 2003; Genzen e McGehee, 2005), a classe de receptores muscarínicos tem grande importância para ação central de fármacos analgésicos (Greig et al., 2013; De Angelis e Tata, 2016) e de terapias não farmacológicas como a TENS (Radhakrishnan e Sluka, 2003).
Diante da importância da corrente interferencial como recurso eletroanalgésico para a prática clínica, da compreensão das vias antinociceptivas pelas quais a CI promove analgesia, e do papel do NO e acetilcolina (Ach) como neurotransmissores inibitórios, o presente estudo visa investigar se o óxido nítrico e os receptores muscarínicos espinais participam do efeito anti-hiperalgésico promovido pela CI, em modelo animal de dor inflamatória. Portanto, hipotetizamos que o bloqueio intratecal, por meio de antagonistas, da via NO-GMPc-K+ATP e de receptores muscarínicos reduz o efeito antinociceptivo da corrente interferencial.
A eletroterapia é muito utilizada na prática clínica com fins analgésicos, entretanto, como é o caso da CI, a prática clínica costuma ser realizada sem os devidos conhecimentos acerca dos mecanismos de ação da corrente para promover analgesia e das contraindicações que impedem a utilização da técnica. Portanto, esse estudo se faz de grande valia para a prática clínica, já que se propõe investigar as vias ativadas pela corrente interferencial. A comunidade científica também poderá se beneficiar desse trabalho para guiar futuros estudos.
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Neurociência da dor
A Associação Internacional para o Estudo da Dor conceitua dor (IASP) como experiência sensorial e emocional desagradável associada ao dano tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal dano (Loeser e Treede 2008). Um dos componentes fisiológicos da dor é a nocicepção, definina como o processo de codificação e processamento do estímulo nocivo (Loeser e Treede 2008). Se faz importante ressaltar que dor e nocicepção podem acontecer de forma independente (Loeser e Treede 2008; Garland, 2012).
A nocicepção ocorre por meio da ativação dos nociceptores pelos estímulos nociceptivos térmicos, químicos e mecânicos (Woolf e Ma, 2007). Os nociceptores são componentes dos neurônios nociceptivos periféricos, que conecta o sistema nervoso periférico ao central através de suas fibras mielinizadas (fibras Aδ) e não-mielinizadas (fibras C) (Schaible e Richter, 2004, Garland, 2012). Após a codificação do estímulo pelos nociceptores, o potencial de ação (PA) é conduzido pelo neurônio nociceptivo periférico até o corno dorsal da medula espinal, onde fazem sinapse com neurônios de projeção (Schaible e Richter, 2004).
O estímulo nociceptivo será percebido como dor ao atingir áreas corticais (Moseley, 2003). Os tratos espino-talâmico e espino-reticular são responsáveis por conduzir os sinais até regiões supraespinais (Schaible e Richter, 2004; Willis, 2007). A percepção da dor ocorre através da ativação de diferentes estruturas corticais como córtex somatossensorial, córtex frontal, córtex cingulado, ínsula e amígdala (Legrain et al., 2011; Fenton et al., 2015). Portanto, pode-se dizer que a dor é o resultado da interpretação cerebral influenciada por fatores sensoriais, cognitivos e emocionais (Tracey e Mantyh, 2007).
A dor pode ser classificada quanto ao tipo. Entre eles podemos destacar a dor nociceptiva, da qual faz parte a dor inflamatória (Loeser e Treede 2008). A dor nociceptiva é definida como um tipo de dor causada por lesão que ativa nociceptores periféricos (Loeser e Treede 2008). Após uma lesão, a resposta inflamatória é ativada, promovendo a liberação de substâncias como acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrienos, substância P, fator de ativação de plaquetas, radicais ácidos, íons potássio, prostaglandinas, tromboxanos, interleucinas, fator de necrose tumoral (TNFα), fator de crescimento neuronal (NGF) e monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), os quais são responsáveis por sensibilizar os nociceptores (Rocha et al., 2007). A sensibilização persistente dos nociceptores promove uma
condição conhecida como sensibilização periférica, que irá acarretar na redução do limiar excitatório do neurônio nociceptivo periférico (Rocha et al., 2007).
Em alguns casos, pode ocorrer respostas centrais adaptativas, resultando em hipersensibilidade a dor (Arendt-Nielsen, 2015). Dessa forma, a dor pode permanecer mesmo após o cessamento do estímulo periférico, o que caracteriza um quadro de sensibilização central (Woolf, 1983;Woolf, 2011). Neurotransmissores como substância P (SP), peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), glutamato e aspartato são responsáveis pela propagação do sinal nociceptivo ao longo do sistema nervoso central e, consequentemente, pela sensibilização central (Sluka e Westlund, 1992; Rocha et al., 2007). A liberação desses neurotransmissores pode ser potencializada pelo neuromodulador óxido nítrico (Miclescu e Gordh, 2009; Cury et al., 2011).
As alterações centrais induzidas por estímulo periférico podem ser verificadas em modelos animais de artrite, como, por exemplo, o modelo de carragenina (3%) e caolina (3%), que mimetiza alterações vistas em humanos (Sluka e Westlund, 1993). A injeção intra-articular de carragenina e caolina promove danos na cartilagem, inflamação sinovial com exsudato (Neugebauer et a., 2007) e sensibilização periférica (Coggeshall et al., 1983; Neugebauer e Schaible 1988) e central (Neugebauer e Schaible 1988; Neugebauer e Schaible 1990). Sluka e Westlund (1993) evidenciaram que a indução do modelo promoveu redução da latência térmica (LT), e que a hiperalgesia térmica está positivamente correlacionada com as concentrações de glutamato. Além disso, os autores observaram aumento nas concetrações de SP e CGRP.
Da mesma forma que a transmissão nociceptiva e percepção da dor ocorrem no sistema nervoso central, também irá ocorrer a regulação dos sinais nociceptivos, pelo sistema descendente inibitório, que chegam no corno dorsal da medula (Sandkühler, 1996). Áreas como substância cinzenta periaquedutal (PAG), bulbo rostral ventromedial (RVM) e núcleo do trato solitário (NTS) estão relacionadas com a inibição descendente (Millan, 2002). A estimulação dessas áreas estimula a liberação de neurotransmissores inibitórios que irão suprimir o sinal nociceptivo que chega na medula espinal (Millan, 2002). Sabe-se que a liberação de ACh (De Angelis e Tata, 2016) e a ativação da via do NO (Curry et al., 2011; Galdino et al., 2015) no corno dorsal da medula espinal são importantes na antinocicepção.
O óxido nítrico está presente no organismo com importante papel regulatório em diversos mecanismos fisiológicos como regulação da pressão arterial, formação de memória, cicatrização e nocicepção (Snyder e Bredt, 1992; Flora Filho e Zilberstein, 2000; Schwentker et al., 2002; Cury et al., 2011; González-Sánchez et al., 2019). A biossíntese dessa molécula ocorre a partir de um aminoácido precursor, a L- arginina, como uma etapa intermediária da reação para formação de nitrito e nitrato (Marletta et al., 1988; Flora Filho e Zilberstein, 2000).
Inicialmente, a L-arginina é convertida em NG-hidroxi-L-arginina, na presença de
NADPH e Ca2+, que posteriormente será convertida em L-citrulina e NO, na presença NADPH e O2 (Flora Filho e Zilberstein, 2000). O processo de síntese de óxido nítrico é dependente de
enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), hemiproteínas da família P450-like (Flora Filho e Zilberstein, 2000). Essas enzimas são classificadas em três tipos, denominadas de óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), e óxido nítrico sintase induzível (iNOS) (Flora Filho e Zilberstein, 2000).
Durante um certo tempo acreditava-se que as nNOS e eNOS eram encontradas habitualmente nas células neuronais e endoteliais respectivamente, e que a terceira não era encontrada espontaneamente, sendo necessários processos que induzissem sua produção (Schmidt et al., 1991; Stuehr et al., 1991; Flora Filho e Zilberstein, 2000). Contudo, sabe-se que essa classificação quanto a localização é mais complexa. A literatura aponta que as três isoformas podem ser induzidas por diferentes tipos de estímulos, assim como podem ser expressas por algumas células ou tecidos (Weiner et al., 1994; Lundberg et al., 1995; Förstermann et al., 1998).
A classificação dessas enzimas, embora seja uma forma simplificada, ainda pode ser determinada pelas concentrações de cálcio (Alderton et al., 2001), podendo ser cálcio-dependentes ou cálcio-incálcio-dependentes (Nathan e Xie, 1994; Flora Filho e Zilberstein, 2000). O aumento da concentração de Ca2+ intracelular ativa os três tipos de NOS, contudo a diminuição na concentração de Ca2+ irá inibir as eNOS e nNOS, mas não a iNOS (Flora Filho e Zilberstein, 2000).
É sabido que o NO possui importantes funções como mensageiro intracelular, não necessitando de receptores transmembrana devido a sua característica de alta difusibilidade (Flora e Zilberstein, 2000). Essa molécula possui como receptor uma heme proteína heterodimérica citosólica denominada guanilato ciclase solúvel (GCs), que ao ser ativada induz
conversão de guanosina trifosfato (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) (Montfort et al., 2006). Seu papel no sistema nociceptivo é confuso e necessita de atenção, já que está envolvido no processo de dor e analgesia central e periférica (Cury et al., 2011). No sistema nervoso central, o óxido nítrico encontra-se nas regiões espinal (Meller et al., 1992; Aronov et al., 2005; Schmidtko, 2015) e supraespinal (Snyder e Bredt, 1991; Salter et al., 1995; Buhler et al., 2018).
A contribuição do NO com aumento da nocicepção é dependente da ativação de receptores NMDA (Cury et al., 2011; Choi et al., 2019). Quando o potencial de ação (PA) chega ao terminal pré-sináptico das fibras C nociceptivas, estimula a liberação de neurotransmissores excitatórios como substância P (SP), peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), neurocinina, e glutamato (Miclescu e Gordh, 2009; Cury et al., 2011). O acoplamento do glutamato a seu receptor estimula a liberação de cálcio intracelular, gerando uma cascata de eventos que inclui a ativação da NOS e, consequentemente, o aumento da síntese de NO no terminal pós-sináptico (Cury et al., 2011). O NO sintetizado no terminal pós-sináptico pode deslocar-se para o meio extracelular, onde atuará como neurotransmissor retrógrado, estimulando a liberação de neurotransmissores excitatórios no terminal pré-sináptico (Cury et al., 2011) (Figura 1).
A atuação do NO como mediador do processo doloroso na periferia está relacionada a fatores como citocinas, ciclooxigenase, prostaglandinas e NOS (Cury et al., 2011). Estudos obsevaram que a inflamação é um fator desencadeante para a formação de óxido nítrico, pois irá estimular a ativação das nNOS nos nervos periféricos e das iNOS pelas células inflamatórias (Omote et al., 2001; Toriyabe et al., 2004; Cury et al., 2011). Outro fator importante na inflamação é a interação entre citocinas e óxido nítrico (Cury et al., 2011).
Os mecanismos pelos quais o NO está envolvido no processo antinociceptivos são dependentes da ativação de uma sinalização intracelular, envolvendo os canais de potássio (K+) sensíveis a adenosina trifosfato (ATP) (Chi et al., 2007). A ligação do óxido nítrico ao seu receptor, guanilato ciclase solúvel, estimula a conversão de guanosina trifosfato (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) (Cury et al., 2011). O GMPc pode estimular os canais de potássio sensíveis a ATP direta ou indiretamente, via proteína quinase G (PKG) (Cury et al., 2011) (Figura 2).
As evidências mostram que o óxido nítrico contribui para os mecanismos de ação de analgésicos opióides, anti-inflamatórios e outras drogas analgésicas (Ferreira et al., 1975; Minneman e Iversen, 1976;Bhargava e Bian, 1997). Ademais, a via L-arginina/NO-GMPc possui um papel fundamental na antinocicepção promovida por terapias não farmacológicas como treinos aeróbicos e de resistência (Galdino et al., 2015a; Galdino et al., 2015b).
Figura 1: Via do óxido nítrico na nocicepção. A ativação de canais NMDA pelo glutamato permite o influxo de
cálcio (Ca2+), ativando a enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e, consequentemente, aumentando as
concentrações de NO. O NO sintetizado se difunde para o neurônio pré-sináptico e células da glia. No neurônio pré-sináptico, estimulará maior liberação de neurocinina A (NKA), substância P (SP), peptídeo relacionado ao gene da calcitoninda (CGRP) e glutamato. Na célula da glia, o NO induz a ativação da óxido nítrico sintase indutível (iNOS). Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências – UFS.
Figura 2: Via do óxido nítrico na antinocicepção. A ativação da óxido nítrico sintase (NOS) dá início a síntese do
óxido nítrico (NO), que acopla-se à guanilato ciclase solúvel (GCs), seu receptor intracelular. Consequentemente haverá aumento nas concentrações de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), ativando a proteína quinase G
(PKG). A PKG irá fosforilar os canais de potássio dependentes de adenosina trifosfato (K+ATP), promovendo a
abertura do canal e consequente hiperpolarização da célula. Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências – UFS.
2.3. Receptores colinérgicos
O principal neurotransmissor responsável pela ativação dos receptores colinérgicos nos sistemas nervosos central e periférico é a acetilcolina (ACh) (De Angelis e Tata, 2016). Por meio desse neurotransmissor as regulações autonômicas simpáticas e parassimpáticas são realizadas em seus respectivos órgãos-alvo (Tiwari et al., 2013). A acetilcolina também pode atuar, no sistema nervoso central, como neuromodulador (Naser e Kuner, 2018).
O sistema colinérgico possui importância na regulação de diversas funções fisiológicas (Picciotto et al., 2012; Ramanathan et al., 2015; Rang e Dale, 2016; Zhang et al., 2016; VanPatten e Al-Abed, 2017), dentre elas a participação no sistema nociceptivo já está bem descrita na literatura (Zhuo e Gebhart, 1991; Millan, 2002; Radhakrishnan e Sluka, 2003). A
modulação da nocicepção pelo sistema colinérgico se dá por meio da ativação de vias inibitórias descendentes colinérgicas ou não colinérgicas, e pela ativação de interneurônios inibitórios no corno dorsal da medula espinal (Millan, 2002). Na região espinal, os receptores colinérgicos regulam a nocicepção através de mecanismos pré e pós-sinápticos (Naser e Kuner, 2018).
Dois tipos de receptores colinérgicos são ativados pela acetilcolina: receptores nicotínicos (nAChR) e receptores muscarínicos (mAChR) (Greig et al, 2013). A classe de receptores nAChR pertence a família de receptores ionotrópicos, e são divididos de acordo com a localização, apresentando subunidades musculares e neuronais (Gahring e Rogers, 2006; Zhang et al., 2017). A ativação de receptores nicotínicos pode promover efeitos pró-nociceptivos (Khan et al., 1998; Genzen e McGehee, 2003) ou antipró-nociceptivos (Marubio et al., 1999; Takeda et al., 2003; Genzen e McGehee, 2005), a depender da subunidade ativada (Cordero-Erausquin et al., 2004).
Os receptores colinérgicos pertencentes a classe muscarínica são receptores metabotrópicos acoplados a proteína G, divididos em 5 subunidades (M1-M5) (Naser e Kuner, 2018). As subunidades M1, M3 e M5 estão acopladas a proteína Gq que exerce sua função por meio da ativação da fosfolipase C (PLC), promovendo consequente elevação da concentração de cálcio intracelular (Nathanson, 2000; Ishii e Kurachi, 2006). As subunidades pares M2 e M4 acoplam-se, preferencialmente, a proteína Gi, inibindo a adenilato ciclase (AC), resultando em diminuição da atividade celular (Nathanson, 2000; Michal et al., 2001; Ishii e Kurachi, 2006).
Os mecanismos propostos para a ação antinociceptiva dessas unidades são: (1) receptores M2 regulam a liberação sináptica de glutamato nos neurônios aferentes primários (Zhang et al., 2007; Chen et al., 2014); (2) receptores M2 e M4 regulam a ação de interneurônios glutamatérgicos na meduda espinal (Zhang et al., 2007), bem como a estimulação de interneurônios gabaérgicos e glicinérgicos (Zhang et al., 2007; Wang et al., 2006) (Figura 3). Embora as subunidades M2 e M4 sejam relatadas comos as principais envolvidas no processo regulação do sinal nociceptivo (Chen et al., 2005; Cai et al., 2009), evidencias mostram que as subunidades M1 e M3 também exercem papel regulatório no sistema inibitório (Gillberg et al., 1989; Radhakrishnan e Sluka, 2003; Zhang et al., 2007).
Figura 3: Sinapse entre aferentes primários e neurônios do corno dorsal da medula. A liberação de substância P
(SP) e glutamato contribuem para a sensibilização central por meio da ativação de proteínas quinases (PKA e PKC) e formação do óxido nítrico (NO). Receptores muscarínicos M2/M4 em neurônios glutamatérgicos e M2/M3/M4 em neurônios gabaérgicos modulam a liberação de glutamato e ácido gama-aminobutírico (GABA), respectivamente. O neurotransmissor GABA também modula a liberação de glutamato ao acoplar-se em receptores gabaérgicos localizados em neurônios glutamatérgicos. Dessa maneira, ocorre redução na liberação de glutamato e da transmissão nociceptiva. Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências – UFS.
2.4. Corrente interferencial (CI)
A utilização da eletroterapia como ferramenta para promover analgesia teve início na antiguidade, através da utilização, pelos egípcios, de minerais como magnetita e âmbar, e peixes elétricos para tratamento de diversas condições dolorosas (Schechter, 1991; Macdonald, 1993) Posteriormente, entre os séculos XVIII e XIX esses meios naturais de eletroterapia foram substituídos por dispositivos, desenvolvidos pelo homem, capazes de gerar eletricidade (Steinberg, 2011; Heidland et al., 2013).
Ao longo do século XX, devido ao crescimento das investigações científicas na eletroterapia, foram desenvolvidas novas modalidades que se distinguiam em intensidade, frequência, duração e padrões da corrente (Heidland et al., 2013). Dentre essas modalidades, pode-se destacar a corrente interferencial.A CI foi introduzida pelo Dr. Nemec na década de 1950, com a premissa de diminuir a resistência tecidual, facilitando a penetração no tecido e, dessa forma, produzindo menos desconforto (Ganne, 1976; Jarit et al, 2003; Ozcan et al., 2004). O aparato é composto por um circuito gerador de dupla corrente de média frequência de formato sinusoide, com frequências portadoras que variam de 1 a 10 KHz (Goats, 1990; Ward et al., 2009; Venancio et al., 2013). A interferência entre essas correntes de média frequência gera uma corrente de amplitude modulada em baixa frequência, com valores entre 0 e 250 Hz (De domenico, 1982; Palmer et al., 1999).
O uso da corrente interferencial pode variar por meio da aplicação da corrente ou através dos parâmetros selecionados. Duas formas de aplicação são evidenciadas na literatura, o modo quadripolar ou bipolar, também conhecidos como CI verdadeira ou pré-modulada, respectivamente (Ozcan et al., 2004; Beatti et al., 2011). Na CI verdadeira, as correntes de média frequência são liberadas separadamente pelo aparelho e sofrem interferência no interior do tecido. Já na CI pré-modulada, a frequência de amplitude modulada é gerada no interior do aparato (Ozcan et al., 2004; Beatti et al., 2011).
Tendo em vista os possíveis parâmetros a serem utilizados para alívio da dor, estudos têm mostrado que frequências portadoras menores tem melhor efeito hipoalgésico; em contrapartida, frequências mais elevadas geram menos desconforto (Venancio et al., 2013; Corrêa et al., 2016). Apesar da frequência de amplitude modulada no valor de 100Hz ser amplamente utilizada para analgesia (Cheing e Hui-Chan, 2003; McManus et al., 2006; Atamaz et al., 2012; Kadi et al., 2019), evidências mostram que não há diferença no efeito analgésico da CI quando diferentes FAMs são comparadas (Johnson e Tabasam, 2002; Fuentes et al., 2010; Gundog et al., 2012).
Potencial efeito terapêutico da CI para redução da dor tem sido destacado por meio de ensaio clínicos e revisões sitemáticas, em condições agudas e crônicas (Jarit et al., 2003; Tugay et al., 2007; Fuentes et al., 2010; Lindblad et al., 2016; Albornoz-Cabello et al., 2017; Almeida et al., 2018). Sontag e colaboradores, por meio de uma série de estudos, evidenciaram o efeito da CI em células sanguíneas jovens, promielócitos humanos (Sontag e Dertinger, 1998; Sontag, 2000; Sontag, 2001; Sontag, 2004).
No estudo publicado em 1998, Sontag e Dertinger avaliaram a influência da corrente interferencial, administrada em diferentes FAM (10 Hz, 16 Hz, 20 Hz, 25 Hz, 50 Hz, 75 Hz, 100 Hz e 125 Hz) nos níveis de AMPc, Monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e cálcio intracelular. Seus resultados indicam que, nas frequências utilizadas, a CI não alterou os níveis de cálcio intracelular, reduziu os níveis de GMPc, e promoveu variação nos níveis de AMPc para mais ou para menos, de acordo com a frequência aplicada.
Estudos com animais também investigaram o efeito analgésico da CI (Jorge et al., 2006; DeSantana et al., 2011). Jorge e colaboradores (2006), utilizando um modelo animal de inflamação, avaliaram o efeito da corrente interferencial nas varáveis dor e edema. Os autores observaram que a CI apresentou efeito antinociceptivo, porém não reduziu edema. O estudo realizado por DeSantana e colaboradores (2011) objetivou aferir as ações analgésicas da TENS e da CI em modelo de dor crônica musculoesquelética difusa de característica não inflamatória, evidenciando, em seus resultados, que ambas as correntes são capazes de produzir efeito antinociceptivo no modelo utilizado.
Buscando investigar os meios pelos quais a corrente interferencial promove analgesia, estudos com CI, utilizando séries de bloqueios farmacológicos centrais (Cruz, 2014) e sistêmicos (Cruz, 2019), avaliou diferentes vias relacionadas a modulação da resposta nociceptiva. Concomitantemente comparou o efeito hipoalgésico da CI quando aplicada em diferentes intensidades. Seus estudos evidenciam que: 1) a corrente interferencial administrada em intensidade motora apresentou melhor efeito antihiperalgésico; 2) a corrente interferencial não atua por meio da ativação de receptores opioidérgicos centralmente (espinal e supraespinal); 3) há ativação, sistêmica, de receptores α2 adrenérgicos, colinérgicos
muscarínicos e da via do óxido nítrico (NO); 4) embora a intensidade motora tenha apresentado melhor efeito antihiperalgésico, os animais apresentaram redução do desempenho motor após o tratamento.
3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral
Investigar o efeito do bloqueio espinal das vias nitrérgica e colinérgica na antinocicepção promovida pela CI em modelo animal de dor inflamatória.
3.2. Objetivos específicos
• Avaliar a ativação espinal da óxido nítrico sintase na ação antinociceptiva da CI em modelo animal de dor inflamatória.
• Avaliar a ativação espinal de receptores muscarínicos na ação antinociceptiva da CI em modelo animal de dor inflamatória.
4. Material e métodos 4.1. Animais
O projeto foi desenvolvido de acordo com os aspectos éticos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Sergipe (CEPA/UFS nº 84/2018 – Anexo A). Foram selecionados para esse estudo 36 ratos Wistar machos, com massa corporal entre 250-350 g (Biotério Setorial do Laboratório de Pesquisa em Neurociências da Universidade Federal de Sergipe). Os animais foram mantidos em ambiente controlado com temperatura a 22ºC, ração (Nuvilab CR-1, QUIMTIA S.A, Colombo, PR, Brasil) e água disponíveis ad libitum, e um ciclo claro-escuro de 12h. Todos os testes comportamentais foram realizados durante o ciclo claro
4.2. Indução da inflamação articular
Para indução da inflamação articular, os animais foram anestesiados com isoflurano (BioChimico®, Itatiaia, RJ, Brasil), inicialmente, com uma concentração de 5%, e mantido a uma concentração de 2%. O processo inflamatório articular foi induzido de acordo com o modelo utilizado por Sluka e Westlund (1993), pela injeção de 3% de caolina (Kaolin, K7375, Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil) e 3% de carragenina (Lambda-Carrageenan, 22049, Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil) (0,1 mL em salina estéril, pH 7,2 a 7,4) no interior do joelho esquerdo do animal (Figuras 4A e 4B).
4.3. Aplicação da corrente interferencial
Para aplicação da corrente interferencial foram utilizados equipamentos de CI do modelo Neurovector (Ibramed®, Amparo, São Paulo, Brasil). Eletrodos de carbono e silicone (1,7 cm de largura x 1,1 cm de altura) foram fixados na pele do animal com gel aquoso, nas regiões medial e lateral do joelho, após tricotomia (Figura 4C). A corrente foi aplicada durante 20 minutos, em modo bipolar, contínuo, com intensidade motora e frequência de amplitude modulada (FAM) de 100 Hz. Os animais permaneceram sob anestesia com isoflurano (BioChimico®, Itatiaia, RJ, Brasil) a 5% e mantidos em 2% durante a administração da corrente. A intensidade foi definida como motora a partir do momento em que se visualizava a contração muscular, e ajustada a cada 5 minutos para evitar habituação (Pantaleão et al., 2011).
Para o ajuste da intensidade, chegado o tempo determinado, observava-se se a contração muscular estava ocorrendo. Caso a contração houvesse cessado, a intensidade era elevada até o
momento que a contração muscular ocorresse novamente. Se, no momento do ajuste, a musculatura do animal ainda estivesse contraindo, a intensidade era reduzida em 1 mA para observar se haveria respostas musculares após a redução, e então ajustava-se novamente para o valor prévio. Os valores das intensidades utilizadas estão representados no apêndice A.
Figura 4: A. Injeção de carragenina; B. Local de inflamação e edema; C. Eletrodos e local de aplicação da corrente
interferencial (CI). Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências – UFS.
4.4. Testes comportamentais
4.4.1. Aclimatação
O processo de aclimatação foi realizado para habituar os animais ao ambiente e aos aparelhos para avaliação nociceptiva (von Frey eletrônico). A princípio, os animais foram aclimatados em suas caixas na sala de comportamento por 20 minutos. Decorrido o tempo determinado, os animais foram aclimatados para o teste de sensibilidade mecânica cutânea, sendo deixados no equipamento por 30 minutos, enquanto são realizadas estimulações na superfície plantar das patas traseiras a cada 15 minutos (Vivancos et al., 2004). Esse processo foi realizado por dois dias consecutivos, previamente ao experimento.
4.4.2. Mensuração do limiar mecânico de retirada da pata
O limiar mecânico de retirada da pata foi avaliado por meio do von Frey eletrônico (modelo EFF 301, Insight®, Ribeirão Preto, SP, Brasil). O aparato é composto por uma caixa de amplificadores e um transdutor, o qual apresenta uma capacidade aferir valores entre 0 g (0 mN) a 1000 g (10000 mN). Para a realização do teste, os animais permaneceram no interior de um cubículo de acrílico sob uma superfície gradeada de acordo com a Figura 5. Um estímulo
foi aplicado nas patas traseiras, de forma contínua, com o transdutor até que o animal apresentasse o comportamento de retirada da pata. O estímulo foi repetido por cinco vezes e a média das três repetições mais próximas foi registrada. Esse valor foi convertido para mN e determinado como limiar mecânico de retirada da pata. A redução do valor foi interpretada como hiperalgesia mecânica secundária (Vivancos et al., 2004).
Para a análise dos dados foram determinados os valores em mN da pata esquerda, local da indução da inflamação e de aplicação da CI. Animais que apresentassem redução do limiar da pata direita foram substituídos.
Figura 5: Von Frey eletrônico. Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências - UFS.
4.4.3. Mensuração da distância percorrida
Para avaliação da função motora, foi utilizado o software “Monitor de Atividades IR” (modelo EP 149, Insight®, Ribeirão Preto, SP, Brasil). O aparelho é composto pelo software juntamente com a caixa de atividades (comprimento: 50 cm, altura: 48 cm, profundidade: 50 cm) (Figura 6). A caixa de atividade possui 6 barras com 16 sensores infravermelhos, em cada barra, que detectam a posição do animal na caixa. Por meio desse equipamento foi captada a distância percorrida. Cada animal foi colocado individualmente na caixa de atividades, onde permanecia durante 5 minutos para realização do teste (Viacava et al., 2014).
Figura 6: Monitor de atividades. Fonte: Arquivo do Laboratório de Pesquisa em Neurociências - UFS.
4.5. Tratamento farmacológico
Para que o estudo pudesse ser executado, a avaliação da participação da via L-arginina/NO-GMPc e dos receptores muscarínicos no efeito antinociceptivo da CI foi realizada por meio de administração farmacológica espinal. Para tal, foi utilizada a L-arginina (A5006, Sigma-Aldrich®, São Paulo, SP, Brasil), fármaco precursor da síntese do óxido nítrico, o Nω-Nitro-L-arginina (L-NNA) (N5501, Sigma-Aldrich®, São Paulo, SP, Brasil), inibidor da óxido nítrico sintase.
Para avaliação da via colinérgica, foi utilizada a Atropina (Farmace®, Barbalha, CE, Brasil) antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, e o Betanecol (C5259, Sigma-Aldrich®, São Paulo, SP, Brasil), agonista de receptores muscarínicos. L-arginina, L-NNA, atropina e betanecol foram diluídos em solução salina fisiológica (Fresenius Kabi®, Aquiraz, CE, Brasil) (0,9% NaCl), O Quadro 1 apresenta os fármacos utilizados e as vias inibidas ou estimuladas.
Quadro 1: Fármacos utilizados no experimento. Para a via nitrérgica, foi utilizado o inibidor da NO sintase (L-NNA) e o precursor da síntese do NO (L-arginina). A via colinérgica foi avaliada utilizando-se antagonista de receptores muscarínicos (atropina) e agonista de receptores muscarínicos (betanecol). L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina.
4.6. Grupos
A alocação dos animais foi realizada de forma cautelosa para que um número grande de animais da mesma caixa ou mesma ninhada não coincidisse em um mesmo grupo. Os animais foram alocados em 6 grupos, com um nº de 6 animais por grupo (Quadro 2). Os grupos L-arginina, betanecol, CI + L-NNA e CI + atropina receberam aplicação de seus respectivos fármacos.
Os animais alocados nos grupos CI + salina e controle salina receberam a administração do veículo salina (0,9% NaCl). Nos grupos CI, a corrente foi aplicada de acordo com os parâmetros descritos anteriormente (item 4.3). Em contrapartida, no grupo controle, os eletrodos foram posicionados na articulação, porém não havia passagem de corrente. Os animais dos grupos betanecol e L-arginina receberam apenas o tratamento farmacológico.
4.7. Injeção intratecal
A injeção intratecal (i.t.) foi administrada no espaço subaracnóideo, entre as vértebras L5 e L6, em um volume de 20 microlitros (μL) (de Los Monteros-Zuñiga et al., 2016), utilizando-se uma seringa hipodérmica estéril de 1 mL (Saldanha Rodrigues Ltda®, Manaus, AM, Brasil) com agulha hipodérmica de 22 Gauge (WILTEX, Yangzhou Medline Industry Co, Yangzhou, China).
Para esse procedimento, o animal foi anestesiado com isoflurano (BioChimico®, Itatiaia, RJ, Brasil) inicialmente a 5% e mantido em 2%. Verificava-se o posicionamento correto da agulha quando o animal apresentava o reflexo da cauda (Mestre et al., 1994). Previamente ao experimento, um grupo teste foi utilizado para confirmação da eficácia da técnica. Para tal,
Via Fármacos
NO sintase L-NNA / L-argininaL-arginina
20 μL de lidocaína (4%) foram administrados via i.t., acarretando em paralisia temporária dos membros posteriores (Galdino et al., 2015).
Quadro 2: Alocação dos animais nos grupos controle salina, controle DMSO, CI + salina, CI + DMSO, L-arginina,
CI + L-NNA, CI + ODQ, CI + glibenclamida, CI + atropina e betanecol. Cada grupo tinha um total de 6 animais. CI: corrente interferencial. L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina.
4.8.Delineamento experimental
Previamente ao experimento, foram utilizados 2 dias de aclimatação (D-2 e D-1). No dia 0, foi realizada a avaliação basal e, logo após, a indução do modelo inflamatório. Vinte e quatro horas após a indução, no dia 1, foram realizados, na seguinte ordem, a avaliação comportamental pré-tratamento, a administração farmacológica do antagonista ou agonista, o tratamento e, por fim, a avaliação comportamental pós tratamento (Figura 7). A avaliação comportamental após o tratamento foi realizada com um intervalo de 60 minutos, com o objetivo de reduzir qualquer influência que o anestésico possa exercer no comportamento dos animais. O tempo entre a aplicação do fármaco e o tratamento foi determinado de acordo com a literatura (Quadro 3). Um único avaliador realizou os testes comportamentais e foi mascarado para a administração farmacológica e para o tratamento com a CI.
Grupos Número de animais (n)
Controle salina 6 CI + salina 6 L-arginina 6 CI + L-NNA 6 CI + atropina 6 Betanecol 6
Figura 7: Delineamento experimental para o bloqueio intratecal. D-2/D-1: aclimatação realizada dois dias prévios
ao início do experimento. D0: primeiro dia do experimento. D1: segundo dia de experimento, 24 h após a indução da inflamação articular.
Quadro 3: Dose dos fármacos administrados por via intratecal, tempo para gerar os efeitos desejados e veículos
utilizados para diluição. L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina.
Alvo Fármaco
(dose)
Tempo
(min) Veículo Referência
NO sintase
L-arginina
(40 µg) 10 Salina Chen et al., 2015 L-NNA
(30 µg) 10 Salina Yamamoto et al., 1993
Receptores Muscarínicos
Betanecol
(40 µg) 15 Salina Prado e Segalla, 2004
Atropina
(30 µg) 0 Salina
Radhakrishnan e Sluka, 2003
4.9. Análise estatística e interpretação dos dados
Os resultados foram analisados através do software GrapahPad Prism 7.03 (GraphPad Software®, San Diego, CA, United States of America) e expressos em média ± erro padrão da média (Apêndices A e B). Primeiramente foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Como houve distribuição normal, o teste estatístico utilizado foi a análise de variância de duas vias (ANOVA two-way). As comparações intragrupos foram realizadas por meio da análise de variância de duas vias com medidas repetidas, seguido pelo post hoc test de Tukey. Já as comparações intergrupos foram realizadas através da ANOVA de duas vias para medidas independentes com post hoc test de Tukey. O nível de significância p≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Por fim, foi realizado o cálculo do tamanho do efeito (d) da intervenção sob o limiar mecânico de retirada da pata, de acordo com a fórmula proposta por Cohen (Cohen, 1977). Os resultados do tamanho do efeito foram interpretados de acordo com os valores expressos no Quadro 4, levando-se em consideração a metodologia utilizada no estudo. Foi ainda realizado cálculo do percentual de inibição da dor (expresso em %) pela corrente interferencial, utilizando-se como referência os controles positivos.
Quadro 4: Valores de referência para o tamanho do efeito, segundo Cohen (1977) e Rosenthal (1996).
Insignificante Pequeno Médio Grande Muito grande
5. RESULTADOS
5.1. Limiar mecânico de retirada da pata 5.1.1. Ativação da óxido nítrico sintase
Houve redução significativa do limiar mecânico de retirada da pata 24 horas após indução da inflamação articular (momento pré-tratamento) em todos os grupos (p<0,0001), sugerindo hiperalgesia mecânica (Figura 8). A análise intragrupos exibiu aumento significativo do limiar mecânico de retirada da pata nos grupos CI + salina (p<0,0001), CI + L-NNA (p=0,0017) e L-Arginina (p=0,0001) no momento pós-tratamento quando comparado ao momento pré-tratamento, enquanto o grupo controle salina (p=0,8361) não apresentou diferença estatisticamente significativa. Interação: F(6, 40)=4,432; p=0,0016. Fator tempo: F(2, 40)=430,4; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 20)=5,292; p=0,0075.
Figura 8: Limiar mecânico de retirada da pata (mN) do membro esquerdo dos animais pertencentes aos grupos
controle salina, CI + salina, CI + L-NNA e L-arginina nos momentos basal (previamente a indução da inflamação), pré-tratamento (24 h após indução) e pós-tratamento (após aplicação da corrente). Dados apresentados como média ± erro padrão da média. ANOVA de duas vias, com post hoc de Tukey, *p<0,0001 em relação ao basal; **p≤0,0017 em relação ao pré-tratamento; †p≤ 0,0014 comparado ao controle salina no pós-tratamento.
O grupo controle salina apresentou limiar mecânico de retirada da pata significativamente menor do que os grupos CI + salina (p=0,0014), CI + L-NNA (p=0,0010) e L-arginina (p<0,0001) no momento pós-tratamento. Interação: F(6, 60)=2,88; p=0,0156. Fator tempo: F(2, 60)=279,7; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 60)=8,999; p<0,0001. Os valores do
tamanho do efeito nas análises intragrupo, entre os momentos pré e pós-tratamento, e intergrupos, no momento pós-tratamento, podem ser encontrados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. Utilizando-se como referência o grupo L-arginina, o percentual de inibição da dor pela corrente interferencial foi de 90,42 %.
Tabela 1: Tamanho do efeito, intragrupo, da diferença entre os momentos pré e pós-tratamento dos grupos CI +
salina, controle salina, CI + L-NNA e L-arginina.
CI: corrente interferencial. L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina.
Tabela 2: Tamanho do efeito das comparações intergrupos que apresentaram diferenças significativas no
momento pós-tratamento. Grupo controle salina, L-arginina e CI + L-NNA. CI: corrente interferencial. L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina.
CI: corrente interferencial. L-NNA: Nω-Nitro-L-arginina. 5.1.2. Receptores muscarínicos
O limiar mecânico de retirada da pata reduziu significativamente (p<0,0001) em todos os grupos do momento basal para o pré-tratamento, indicando hiperalgesia mecânica após a indução da inflamação (Figura 9). Os grupos CI + salina (p<0,0001) e betanecol (p=0,0073) apresentaram aumento significativo do limiar mecânico de retirada da pata, comparando-se os momentos pré e pós-tratamento. Controle salina (p=0,8702) e CI + atropina (p=0,3480) não apresentaram aumento estatisticamente significativo ao comparar-se os momentos pré e pós-tratamento. Interação: F(6, 40)=4,427; p=0,0016. Fator tempo: F(2, 40)=387,6; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 20)=5,628; p=0,0058.
Comparação
Intragrupo Tamanho do efeito (d) Classificação
CI + salina 2,22 Muito grande
Controle salina 0,3 Pequeno
CI + L-NNA 1,72 Muito grande
L-arginina 2,69 Muito grande
Comparação
Intergrupo Tamanho do efeito (d) Classificação
CI + salina x controle salina 1,97 Muito grande L-arginina x controle salina 4,24 Muito Grande
CI + L-NNA x controle
Figura 9: Limiar mecânico de retirada da pata (mN) do membro esquerdo dos animais pertencentes aos grupos
controle salina, CI + salina, CI + atropina e betanecol nos momentos basal (previamente a indução da inflamação), pré-tratamento (24 h após indução) e pós-tratamento (após aplicação da corrente). Dados apresentados como média
± erro padrão da média. ANOVA de duas vias, com post hoc de Tukey, *p<0,0001 em relação ao basal;
**p≤0,0073 em relação ao pré-tratamento; †p≤ 0,0077 comparado ao controle salina no pós-tratamento.
Por meio da comparação intergrupos, no momento pós-tratamento, observa-se que os valores obtidos nos grupos CI + salina e betanecol são significativamente maiores do que os grupos controle salina (p=0,0077; p=0,0002, valores expressos, respectivamente, para CI + salina e betanecol) e CI + atropina (p=0,0139; p=0,0003). Interação: F(6, 60)=2,717; p=0,0211. Fator tempo: F(2, 60)=237,9; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 60)=9,977; p<0,0001. O tamanho do efeito para a via colinérgica está representado nas tabelas 3 e 4. O percentual de inibição da dor pela corrente interferencial, utilizando-se como referência o grupo betanecol, foi de 90,49 %
Tabela 3: Tamanho do efeito intragrupo da diferença entre os momentos pré e pós-tratamento dos
grupos CI + salina, controle salina, CI + atropina e betanecol.
CI: corrente interferencial. Comparação
Intragrupo Tamanho do efeito (d) Classificação
CI + salina 2,22 Muito grande Controle salina 0,3 Pequeno
CI + atropina 0,79 Médio
Tabela 4: Tamanho do efeito das comparações intergrupos que apresentaram diferenças significativas
no momento pós-tratamento. Grupo: controle salina, betanecol e CI + atropina. CI: corrente interferencial.
CI: corrente interferencial.
5.2. Distância percorrida 5.2.1. Via do óxido nítrico
Vinte e quatro horas após indução da inflamação articular, os grupos controle salina (p=0,0001), CI + salina (p=0,0019), CI + L-NNA (p<0,0001) e L-arginina (p<0,0001) apresentaram redução significativa da distância percorrida. Comparando-se os momentos pré e pós-tratamento, os grupos CI + salina (p=0,0303) e CI + L-NNA (p=0,0034) apresentaram aumento significativo da distância percorrida (Figura 10). Interação: F(6, 40)=0,4866; p=0,8144. Fator tempo: F(2, 40)=101,4; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 20)=1,028; p=0,4012.
Não houve diferenças significativas entre os grupos no momento pós-tratamento. Interação: F(6, 60)=0,2096; p=0,9724. Fator tempo: F(2, 60)=43,67; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 60)=2,199; p=0,0974.
5.2.2. Receptores muscarínicos
Comparando-se os momentos basal e pré-tratamento dos grupos controle salina (p=0,0005), CI + salina (p=0,0056), CI + atropina (p<0,0001) e betanecol (p=0,0019), observa-se que há redução significativa da distância percorrida em cada grupo (Figura 11). As análiobserva-ses intragrupos (Interação: F(6, 40)=0,563; p=0,7570. Fator tempo: F(2, 40)=71,49; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 20)=0,3856; p=0,7646) e intergrupos não mostraram diferenças significativas (Interação: F(6, 60)=0,2504; p=0,9573. Fator tempo: F(2, 60)=31,8; p<0,0001. Fator grupo: F(3, 60)=0,8137; p=0,4913).
Comparação
Intergrupo Tamanho do efeito (d) Classificação
CI + salina x controle salina 1,97 Muito grande CI + salina x CI + atropina 1,68 Muito grande Betanecol x CI + atropina 3,23 Muito grande Betanecol x controle salina 4,15 Muito grande
Figura 10: Distância percorrida (mm) pelos animais dos grupos controle salina, CI + salina, CI + NNA e
L-arginina nos momentos basal (previamente a indução da inflamação), pré-tratamento (24 h após indução) e pós-tratamento (após aplicação da corrente). Dados apresentados como média ± erro padrão da média. ANOVA de duas vias, com post hoc de Tukey, *p≤0,0019 em relação ao basal; **p≤0,0034 em relação ao pré-tratamento.
Figura 11: Distância percorrida (mm) pelos animais dos grupos controle salina, CI + salina, CI + atropina e
betanecol nos momentos basal (previamente a indução da inflamação), pré-tratamento (24 h após indução) e pós-tratamento (após aplicação da corrente). Dados apresentados como média ± erro padrão da média. ANOVA de duas vias, com post hoc de Tukey, *p≤0,0056 em relação ao basal.
6. Discussão
Analisando-se os resultados do presente estudo, nota-se que a corrente interferencial exerceu efeito antihiperalgésico, que não foi bloqueado com uso do L-NNA, inibidor da enzima óxido nítrico sintase. Em contrapartida, o antagonismo dos receptores muscarínicos, pela atropina, impediu que a CI exercesse seu efeito para redução da hiperalgesia. Os dados obtidos para análise da distância percorrida indicam que a administração farmacológica e a aplicação da CI não exerceram efeito no desempenho motor dos animais.
A corrente interferencial é bastante usada para obtenção de analgesia. Sabe-se que ela exerce efeito hipoalgésico em estudos com humanos (Gundog et al., 2012; Koca et al., 2014; Zeng et al., 2015; Huisstede et al., 2018) e animais (Cruz, 2019; Jorge et al., 2006; DeSantana et al., 2011). Nosso trabalho mostrou que o grupo tratado com a CI obteve redução da hiperalgesia, com percentual de inibição de 90,4% em relação aos controles positivos utilizados. Além disso, apresentou um tamanho de efeito muito grande em relação aos animais que não receberam a corrente. Dessa forma, corroborando a literatura prévia, o atual trabalho evidencia o efeito antinociceptivo da corrente interferencial.
O presente estudo mostrou que uma única dose de 40 μg de L-arginina, administrada via intratecal, exerceu efeito antihiperalgésico. Esse dado também é confirmado pelo cálculo do tamanho do efeito, que indica um efeito muito grande do agonista L-arginina em relação ao grupo controle salina.
O óxido nítrico é uma molécula que, dentre seus diversos efeitos nas funções fisiológicas, atua no sistema nociceptivo (Flora Filho e Zilberstein, 2000; Esplugues, 2002; Cury et al., 2011), exercendo função pró e antinociceptiva (Cury et al., 2011). A literatura a respeito dos doadores ou precursores do óxido nítrico é contraditória, apontando aumento (Przewklocka et al., 1994; Inoue et al., 1997; Aley et al., 1998;) ou redução da hiperalgesia (Kawabata et al., 1992a; Kawabata et al., 1992b; Nakamura et al., 1996; Safaripour et al., 2018) após administração farmacológica, fortalecendo a premissa acerca da dupla função do NO nas vias nociceptivas. Contudo, alguns estudos indicam que o efeito antinociceptivo é dependente da dose administrada (Sousa e Prado, 2001; Li e Qi, 2010).
Souza e Prado (2001), utilizando modelo animal de dor neuropática, observaram que o doador de NO 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), quando administrado em doses de 0,1 a 2,0 μg, produz redução da alodinia mecânica, enquanto doses mais elevadas não alteram (5 ou 100
