Potencialidade da aliança da espectroscopia de raios x e quimiometria na determinação de valor energetico e teores de alguns macronutrientes em amostras de farinhas para consumo humano

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

“POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA

DE RAIOS X E QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE

VALOR ENERGÉTICO E TEORES DE ALGUNS

MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS

PARA CONSUMO HUMANO”

JULIANA TERRA

Orientadora: Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveira Bueno

TESE DE DOUTORADO

Campinas – SP

2009

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Aos meus pais, Milton e Vera, e aos meus irmãos (Pedrinho e Juninho),

por todo amor, força e incentivo.

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AGRADECIMENTOS

Inicialmente gostaria de agradecer a Profª Drª Maria Izabel Maretti Silveira Bueno (BELL), que me fez compreender o significado da palavra orientação. Por toda a amizade e carinho dedicados, e principalmente por me permitir conhecer o lado humano e belo que existe por trás da profissional.

Aos meus amigos do GERX (Lidi, Guto, Karen, Vinícius e Bárbara), cujas conversas e os lanches da tarde animaram até os dias nublados. Em especial ao meu amigo Alexandre, que mesmo com sua rabugice foi de extrema importância para a conclusão desta tese.

Ao estagiário, Miguelito, meu obrigado pela ajuda técnica.

Às professoras Regina, Susi, Inês Valéria e Bel Felisbertti (e seus grupos de pesquisa) pela confiança e palavras de incentivo durante minha mudança de percurso.

Aos professores Marcelo Alexandre Prado e Celso Aparecido Bertran por disponibilizar seus equipamentos; e a técnica Cristina Boccado pela paciência e ensinamentos.

Às minhas amigas (Carmen, Mara, Acacia, Dani, Julia, Lídia, Bianca, Jana, Cléia, Sônia e Selma) e à minha turma (Vivi, Thaís, Valéria, Tânião, Camila e Mary), amigas fiéis e confidentes, pela presença em todos os momentos (alegres ou tristes).

Aos Moura e aos Terra que torceram pela vitória alcançada.

Não poderia deixar de fazer um agradecimento especial aos meus amigos e educandos da Fundação Bezerra de Menezes pela amizade e carinho verdadeiros. Ohm!

A toda direção e aos funcionários do Instituto de Química da UNICAMP pelo apoio acadêmico e técnico

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CURRÍCULUM VITAE

Pós-graduação – Mestrado na Área de Química Analítica

(Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP, Conclusão: 2005)

Graduação – Licenciatura em Química

Graduação – Bacharelado em Química

Durante a sua vida acadêmica, a autora desta tese participou de 17 eventos científicos, incluindo congressos e encontros nacionais e internacionais. Nestes eventos foram apresentados 23 trabalhos na forma de painel, sendo publicados em livros de resumo, e 1 trabalho na forma oral (sendo este relacionado com a tese aqui apresentada).

Publicou 3 artigos em revistas científicas, todos em parceria com a Prof. Dra. Adriana V. Rossi, e 1 artigo on-line pela Editora Moderna: “Sobre o desenvolvimento da Análise Volumétrica e Algumas Aplicações” (Quím. Nova 2005, 28, 166), “Volumetria como ferramenta didática no ensino superior no século XXI: aspectos conceituais e questões práticas para discussão e reflexão” (Rev. Bras. Ens. Quim. 2008, 2, 33), “Reflexões sobre o que se ensina e o que se aprende sobre densidade a partir da escolarização” (QNEsc, 2008, 30, 55-60) e “Diferentes abordagens para aulas de Química no Ensino Médio” (http://www.moderna.com.br/moderna/didaticos/em/artigos/2004/0016.htm).

Foi monitora em vários programas e eventos científicos: Programa de Estágio Docente do IQ-UNICAMP (2003, 2004 e 2006); Simpósio de Profissionais do Ensino de Química (2002 a 2007); Programa Ciência e Arte nas Férias (2003 e 2004); Encontro Paulista de Pesquisa e Ensino de Química (2004).

Ao longo do trabalho científico, a autora ministrou oficinas e cursos pedagógicos: Oficina de química para professores de Química da rede pública estadual de ensino da região de Jundiaí (2003); PROJETO TEIA DO SABER da UNICAMP nas turmas de Química do núcleo de Ciências Exatas e da Terra (2004

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e 2006), Cursos no Simpósio de Profissionais do Ensino de Química (2004 a 2006).

Também auxiliou na orientação, com supervisão da profa Maria Izabel M. S. Bueno, do projeto de iniciação científica “Uso de Quimiometria aliada a Espectroscopia de Raios-X para quantificação do teor de proteínas e valor energético em ovos”.

Para seu crescimento pessoal e profissional, a autora exerce, desde 2006, atividades voluntárias na Fundação Bezerra de Menezes, em Campinas-SP, sendo Educadora de jovens e crianças das Escolas Preparatórias para Vida (EPV) que integram a Fundação, e Secretária do Conselho de Educação.

De janeiro a junho de 2009, a autora atuou como pesquisadora da empresa KosmoSCIENCE Consultoria e Assessoria Técnica em Cosméticos na elaboração e aperfeiçoamento de métodos para verificação da eficácia de produtos cosméticos.

Para maiores detalhes, consultar o currículo Lattes.

“Cada responsabilidade que o homem assume para o bem de todos, voluntariamente, é um passo para o crescimento espiritual” (Paulo Zabeu)

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RESUMO

POTENCIALIDADE DA ALIANÇA DA ESPECTROSCOPIA DE RAIOS X E QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO E TEORES

DE ALGUNS MACRONUTRIENTES EM AMOSTRAS DE FARINHAS PARA CONSUMO HUMANO

O valor energético (VE) é uma das informações obrigatórias que devem ser fornecidas no rótulo dos alimentos pré-embalados. O VE que aparece nos rótulos corresponde a uma relação dos teores de alguns macronutrientes (proteínas, gorduras e carboidratos) presentes na amostra. A determinação destes parâmetros é oficialmente feita a partir de procedimentos analíticos distintos e todos são laboriosos, lentos e geradores de resíduos. Em geral, envolvem o uso de reagentes (alguns tóxicos), além de provocarem a destruição da amostra. Esse trabalho apresenta modelos de calibração e validação para determinar o valor energético (calorias) e o teor de carboidratos e proteínas em amostras de extratos e farinhas de vegetais para consumo humano. A modelagem foi obtida através dos métodos PCA (análise por componentes principais) e PLS (regressão por quadrados mínimos parciais) para espectros de fluorescência de raios X de amostras com parâmetros conhecidos, determinados através de métodos convencionais. Amostras originadas do milho, mandioca, leite, trigo e soja, adquiridas em supermercados brasileiros, foram avaliadas. O método proposto não gera resíduos e não necessita de qualquer tipo de solvente ou reagente, atendendo às exigências da chamada “química verde”. Além disso, a sua aplicação requer 0,2% do tempo necessário para a aplicação dos métodos convencionais. Os bons resultados da validação (erros menores que 14%) indicam que se trata de uma alternativa aos métodos analíticos convencionais, sendo muito atraente para análises de rotina, obedecendo à legislação vigente (portaria 42, resolução RDC 360, ANVISA), que permite erro máximo de 20%.

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ABSTRACT

POTENTIALITIES OF THE ALLIANCE OF X-RAY SPECTROSCOPY AND CHEMOMETRICS TO DETERMINATE ENERGETIC VALUE AND SOME MACRONUTRIENTS CONTENS OF INDUSTRIALIZES DRIED FOODS FOR

HUMAN CONSUMPTION

The energetic value (EV) is a quantitative information required on the labels of pre-packaged foods. The EV appearing on the label corresponds to the sum of the energetic contributions from food macronutrients (proteins, carbohydrates and fats). The determinations of these parameters are based on distinct analytical procedures, each one being time-consuming, laborious and producing residues. In general, these methods involve the use of reagents (some toxic) besides destroying the samples. This work presents multivariate calibration and validation models to determine the energetic value, protein and carbohydrate contents of industrialized dried foods for human consumption. The modeling was obtained by using PCA (principal component analysis) and PLS (partial least squares regression) for X-ray fluorescence spectra of samples with known parameters, determined through conventional methods. Samples from corn, casava, milk, wheat and soy, purchased in Brazilian supermarkets, were investigated. The proposed method does not generate wastes and does not require any solvent or reagent, given the demands of the "green chemistry”. Moreover, its application requires only 0.2% of the time necessary for the application of conventional methods. The good results of the validation process (errors less than 14%) indicate that this is an alternative to conventional analytical methods and is very attractive for routine analysis, according to current legislation (Executive Order 42, DRC resolution 360, ANVISA), which allows maximum errors of 20%.

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SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS... xvii

LISTA DE TABELAS... xix

LISTA DE FIGURAS... xxi

LISTA DE EQUAÇÕES... xxiii

CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO... 1

I.1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS... 3

I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X... 6

I. 2. 1. BREVE HISTÓRICO... 6

I. 2. 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS... 9

I. 3. QUIMIOMETRIA... 12

CAPÍTULO II – OBJETIVOS... 19

II.1. OBJETIVOS... 21

CAPÍTULO III – EXPERIMENTAL... 23

III.1. REAGENTES... 25

III.2. AMOSTRAS... 26

III.3. EQUIPAMENTOS... 30

III.4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL... 31

III.4.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE... 31

III.4.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X... 36

CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO... 39

IV.1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE... 41

IV.2. MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X... 51

IV.2.1. FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X: RELAÇÃO CUSTO BENEFÍCIO... 76

CAPÍTULO V – CONCLUSÃO... 79

V.1. CONCLUSÃO... 81

CAPÍTULO VI – PERSPECTIVAS... 83

VI.1. PERSPECTIVAS………... 85

CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 87

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LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português

ANVISA --- Agência nacional de

vigilância sanitária

AOAC Association of official

analytical chemists

Associação de químicos analíticos oficiais

CA Casava Mandioca

CO Corn Milho

EDXRF Energy dispersive X-ray

fluorescence

Fluorescência de raios X por dispersão de energia

EqM Mathematical equations Equações matemáticas

EV Energetic value Valor energético

FRX X-ray fluorescence Fluorescência de raios X

GERX --- Grupo de espectrometria de

raios X

IUPAC International union of pure and applied chemistry

União internacional de química pura e aplicada

LOD Limit of detection Limite de detecção

LOQ Limit of quantitation Limite de quantificação

LV Latent variable Variável latente

mf Final mass Massa final

mi Initial mass Massa inicial

MI Milk Leite

PC Principal component Componente principal

PCA Principal component analysis Análise por componentes principais

PLS Partial Least Squares Regressão por Quadrados Mínimos Parciais

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Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português PRESS Predicted residual error sum

of squares

Soma dos quadrados dos erros de previsão rcal Correlation coefficient of calibration Coeficiente de correlação da calibração RDC --- Resolução da diretoria colegiada

RMSEC Root mean square error of

calibration

Raiz quadrada do erro médio quadrático de calibração

RMSEP Root mean square error of

prediction

Raiz quadrada do erro médio quadrático de previsão rval Correlation coefficient of validation Coeficiente de correlação da validação SDV Standard deviation of validation

Desvio padrão dos erros de validação

SÊN Sensitivity Sensibilidade

SO Soy Soja

TC Carbohydrate content Teor de carboidrato

TP Protein content Teor de proteína

Vclorofórmio Volume of chloroform Volume de clorofórmio

VE Energetic value Valor energético

VP Predicted value Valor previsto

Vpipeta Volume of pipet Volume da pipeta

VR Reference value Valor de referência

WH Wheat Trigo

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Informações sobre as Figuras de Mérito utilizadas em validação

multivariada (Valderrama et al., 2007)... ₁₇

Tabela 2: Reagentes utilizados na realização dos experimentos... ₂₅ Tabela 3: Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.... 27

Tabela 4: Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e

teores de proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas... 28

Tabela 5: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de milho... ₄₆

Tabela 6: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de soja... ₄₇

Tabela 7: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de trigo... ₄₈

Tabela 8: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de mandioca... ₄₉

Tabela 9: Valores obtidos pelos métodos convencionais ± estimativa do desvio padrão dos parâmetros avaliados para as amostras de leite... ₅₀

Tabela 10: Figuras de mérito dos modelos multivariados obtidos para as

amostras de soja, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de proteína... ₆₀

Tabela 11: Valores de referência (VR), média dos valores obtidos para os

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos entre VR e VP para as amostras de soja... ₆₁

Tabela 12: Informações sobre as amostras iniciais e selecionadas para a

construção dos modelos de calibração e validação para os grupos de milho, mandioca, leite e trigo... ₆₂

amostras de milho, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de proteína... ₆₅

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parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos entre VR e VP para as amostras de milho... ₆₆

amostras de mandioca, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de proteína... ₆₈

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos entre VR e VP para as amostras de mandioca... ₆₉

amostras de leite, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de proteína... ₇₁

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos entre VR e VP para as amostras de leite... ₇₂

amostras de trigo, onde VE é o valor energético, TC o teor de carboidrato e TP o teor de proteína... ₇₄

parâmetros analisados pelo modelo de previsão externa (VP) e erros relativos entre VR e VP para as amostras de trigo... ₇₅

Tabela 21: Estimativa do custo e do tempo necessários para a obtenção

dos parâmetros estudados pelos métodos convencionais e proposto e da quantidade de resíduo líquido gerado pelos métodos... ₇₇

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Diagrama de transições de raios X e suas respectivas

denominações... 10

Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado... 32

Figura 3: Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado... 33

Figura 4: Fotografia do agitador rotatório manual utilizado... 36

Figura 5: Reações envolvidas no método de Kjeldahl... 42

Figura 6: Espectros médios sobrepostos das amostras estudadas e ampliação da região de espalhamento... 51

Figura 7: Gráficos de scores para o conjunto de todas as amostras, obtidos para PC1 x PC2 (A) e para PC2 x PC4 (B)... 53

Figura 8: Gráficos de loadings obtidos para PC1, PC2 e PC4 para o conjunto de todas as amostras... 53

Figura 9: Gráfico de scores para o conjunto das amostras na ausência do grupo da soja, obtidos para PC1 x PC2... 54

Figura 10: Representação gráfica da relação entre Resíduo de Student e Leverage para carboidrato, considerando o conjunto total de amostras e 5 variáveis latentes... 55

Figura 11: Representações gráficas da relação entre Resíduo de Student e leverage para as amostras de soja obtidas para o teor de carboidrato antes (A) e depois (B) da exclusão dos outliers... 58

Figura 12: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o conjunto de amostras de soja... 59

Figura 13: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o conjunto de amostras de milho... 64

Figura 14: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o conjunto de amostras de mandioca... 67

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Figura 15: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios

previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o conjunto de amostras de leite... 70

Figura 16: Relação entre os valores de referência (VR) e os valores médios

previstos (VP) pelo modelo de calibração interna via PLS para as variáveis analisadas para o conjunto de amostras de trigo... 73

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LISTA DE EQUAÇÕES

EQUAÇÃO 1: Equação de Atwater... 04

EQUAÇÃO 2: Decomposição da matriz de dados (X) resultante de

aplicação da análise por componentes principais... 13

EQUAÇÃO 3: Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra

(hcrit). k = número de componentes principais e n = número de espectros do

conjunto de calibração... 38

EQUAÇÃO 4: Cálculo da porcentagem de proteína. CHCl=concentração de

HCl, MN = massa atômica do nitrogênio, VHCl=volume gasto de HCl e mi=

massa inicial da amostra... 43

EQUAÇÃO 5: Cálculo da porcentagem de carboidrato... 43

EQUAÇÃO 6: Cálculo da porcentagem de umidade. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mf=massa da amostra seca após o período na estufa... 44

EQUAÇÃO 7: Cálculo da porcentagem de cinzas. mi=massa da amostra

inicialmente pesada e mcinzas=massa de cinzas pesada após a carbonização

da matéria orgânica... 45

EQUAÇÃO 8: Cálculo da porcentagem de gordura. Vclorofórmio=volume de

clorofórmio utilizado para a extração da gordura (20,00 mL), Vpipeta=volume

da pipeta (5,00 mL), mi=massa de amostra inicialmente pesada e mf=massa de gordura pesada após evaporação do solvente... 45

(17)

INTRODUÇÃO

I

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INTRODUÇÃO

I. 1. ROTULAGEM DE ALIMENTOS

A ciência da nutrição tenta entender como e por que aspectos específicos da dieta influenciam a saúde. Deficiências, excessos e descontroles na dieta podem causar impactos negativos à saúde, ocasionando muitas vezes doenças como o escorbuto, obesidade ou osteoporose, assim como problemas psicológicos e comportamentais. Os nutrientes nos alimentos são agrupados em várias categorias. Os macronutrientes são as gorduras, proteínas e carboidratos. Os micronutrientes englobam os minerais e as vitaminas. Além disso, os alimentos contêm água e fibras. O conhecimento da composição dos alimentos consumidos por uma população é fundamental para avaliar o suprimento e o consumo alimentar de um país, verificar a adequação nutricional da dieta de indivíduos, estabelecer relações entre dieta e doença, etc. (Kays et al., 1996; Torres et al., 2000).

A rotulagem nutricional é exigida na maioria dos alimentos pré-embalados e contém um conjunto de propriedades nutricionais do alimento que deve ser apresentado ao consumidor (Agarwal et al., 2006; Kays et al., 1996).

Nos diversos países em que existem, as legislações relacionadas à obrigatoriedade de informações nutricionais em produtos industrializados exigem como descrição mínima o valor energético (ou caloria ou energia) e a quantidade de proteína, carboidrato (glicídio), gordura (lipídio) e fibras alimentares (Celeste, 2001). Informações sobre outros componentes podem ser exigidas, dependendo da classificação e do tipo de alimento (Kays et al., 1996).

A energia metabolizada de um alimento é geralmente expressa como valor energético (VE). O método oficial para a obtenção de VE envolve calorimetria direta. Neste procedimento, o conteúdo energético é obtido por meio da combustão completa do alimento, requerendo, portanto, o uso de uma bomba calorimétrica, muitas vezes não encontrada em laboratórios de pesquisa e de indústria (Harris, 2001).

(19)

INTRODUÇÃO

Como alternativa para a obtenção de VE, Bryant e Atwater estudaram a disponibilidade de macronutrientes nos alimentos a partir de dados experimentais sobre a digestão de proteínas, gorduras e carboidratos. O valor de energia metabolizada obtido por Bryant e Atwater é referido hoje em dia como “fatores gerais de Atwater” e leva em consideração, portanto, o calor de combustão e a digestibilidade do alimento. A equação estabelecida por Atwater (Equação 1) está exposta a seguir, na qual P, G e C correspondem, respectivamente, a proteína, gordura e carboidrato, estando todas estas variáveis expressas em grama. VE é o valor energético, em kcal (Buchholz e Schoeller, 2004).

G 9 P 4 C 4 VE= + +

Equação 1: Equação de Atwater.

Desta forma, na maioria das vezes, o cálculo de VE é realizado a partir dos valores de proteínas, lipídios (gorduras) e carboidratos da amostra analisada, conforme Equação 1. A determinação destes macronutrientes é feita a partir de procedimentos analíticos distintos.

Os carboidratos compreendem a maior parcela da matéria seca de plantas, sendo os componentes mais abundantes e amplamente distribuídos entre os alimentos. Além da importância nutricional, os carboidratos são adoçantes naturais, matéria prima para produtos fermentados e estão associados às propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal (Fennema, 1996; Cecchi, 1999).

O teor de carboidrato pode ser calculado pela diferença entre 100 e a soma das porcentagens de água, proteína, lipídios, álcool (quando presente) e cinzas (Anvisa, 2003).

As proteínas são polímeros altamente complexos, formados a partir de um conjunto de aminoácidos, arranjados em várias sequências específicas. As propriedades funcionais das proteínas em alimentos variam conforme suas

(20)

INTRODUÇÃO

estruturas e propriedades físico químicas. Estes compostos apresentam funções estruturais catalíticas, regulatórias, de defesa, etc (Fennema, 1996; Lehninger, 1990).

O teor de proteína pode ser calculado a partir da quantidade de nitrogênio. A Association of Official Analytical Chemists (AOAC International, 1996) recomenda a determinação do nitrogênio pelo método de Kjeldahl. Este método foi desenvolvido em 1883 por Johan Kjeldahl, e consiste de uma completa digestão das amostras em ácido sulfúrico concentrado, com catalisadores tais como sais de cobre, em alta temperatura.

Os lipídios são biomoléculas orgânicas insolúveis em água, que podem ser extraídas de células e tecidos por solventes orgânicos não polares. Os lipídios possuem várias funções biológicas importantes; entre elas, são componentes estruturais de membranas e estão relacionados ao armazenamento e transporte de combustível metabólico (Lehninger, 1990).

Vários são os métodos encontrados na literatura para determinar a quantidade de lipídios nas amostras. Entre estes métodos, o Bligh-Dyer (Bligh e Dyer, 1959) é o mais simples, pois utiliza apenas tubos de ensaio, não dependendo de nenhum equipamento específico ou sofisticado. Por outro lado, para sua execução, são necessários solventes orgânicos tóxicos, uma vez que o procedimento utiliza uma mistura de clorofórmio-metanol-água. A amostra é misturada com metanol e clorofórmio numa proporção em que formam uma só fase. Adiciona-se mais clorofórmio e água, promovendo a formação de duas fases distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e a outra de metanol e água, contendo substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada e, após a evaporação do solvente, obtém-se a quantidade de gordura por pesagem.

Todos os procedimentos descritos anteriormente apresentam aspectos negativos para análises de rotina, pois são laboriosos, lentos e geradores de

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INTRODUÇÃO

resíduos. Em geral, envolvem o uso de ácidos concentrados ou outros reagentes orgânicos tóxicos (AOAC International, 1996; Prentice, 2005).

I. 2. ESPECTROMETRIA DE FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X

I.2.1. BREVE HISTÓRICO

Os raios X foram descobertos em 8 de novembro de 1895 pelo físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen durante alguns estudos que fazia sobre a condutividade dos gases. Por serem desconhecidos, Röntgen chamou tais raios de X (Birks, 1969; Jenkins, 1999).

Segundo o que contam os historiadores da ciência, Röntgen estava numa sala totalmente escura. A certa distância da válvula de gases havia uma folha de papel, usada como tela, tratada com platinocianeto de bário. Röntgen viu a tela brilhar, emitindo luz, fato que o espantou, uma vez que a válvula estava coberta por uma cartolina negra e nenhuma luz ou raio catódico poderia ter vindo dela. Então, ele fez várias investigações; entre elas, colocou diversos objetos entre a válvula e a tela e viu que todos pareciam transparentes. Mas, ao colocar a sua mão, ele observou na tela o registro de seus ossos perfeitamente visíveis (Chassot, 1995).

Meses após seus estudos, Röntgen apresentou à Sociedade Físico – Médica de Wurzburg, na Alemanha, um relatório descrevendo sua nova descoberta. Com as perspectivas das várias aplicações que a nova descoberta teria, Röntgen foi laureado, em 1901, com o primeiro prêmio Nobel de Física (Bertin, 1970; Chassot, 1995; Jenkins, 1999).

Os estudiosos ligados à medicina viram na nova descoberta a possibilidade de se ver o interior do corpo humano sem precisar abri-lo e novas investigações sobre os “misteriosos” raios passaram a ser feitas (Chassot, 1995).

(22)

INTRODUÇÃO

Em 1911, Barkla mostrou que um elemento, quando estimulado pela radiação X, emite uma radiação característica. Barkla evidenciou a série de linhas de emissão, a qual designou de K, L, M, N, etc. (Barkla, 1911).

Estas novas descobertas auxiliaram Henry Moseley nos seus estudos para obter uma relação entre o nº atômico, o comprimento de onda e as linhas espectrais de raios X. Tal relação, determinada em 1913, estabelecia a base qualitativa e quantitativa da análise espectroquímica por raios X (Birks, 1969).

Apesar de toda atenção destinada aos raios X, apenas em 1912, com os trabalhos de Max von Laue e de Friedrich e Knipping, foi esclarecido que os raios X eram resultados da colisão entre raios catódicos e os elétrons do cátodo (Chassot, 1995).

O primeiro equipamento de raios X foi apresentado por Moseley, mas este era ainda muito primitivo, sendo otimizado aos poucos. Coolidge (1913) introduziu o filamento quente. Soller (1924) construiu um espectrofotômetro com colimadores e Geiger e Muller (1928) desenvolveram o tubo detector preenchido com gás.

As aplicações dos raios X em Química Analítica foram iniciadas por Hadding (1922), com estudos sobre a determinação qualitativa e quantitativa de metais com número atômicos superiores a 12, a partir dos espectros de fluorescência obtidos após a excitação por radiação X. Foi Hadding, portanto, quem realizou a primeira análise envolvendo o espectro de raios X, dando início a técnica de fluorescência de raios X, o que permitiu Coster e von Hevesy (1923) descobrirem o elemento háfnio em 1923.

Os métodos analíticos de análise envolvendo a radiação X se desenvolveram de maneira lenta, mesmo após a já constatação da aplicabilidade dos mesmos por Hadding, Coster e von Hevesy. Provavelmente, isto tenha ocorrido devido a maior aceitação por técnicas e métodos já consolidados, como aqueles chamados de clássicos, como a gravimetria e volumetria (Szabadváry, 1966).

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INTRODUÇÃO

O primeiro protótipo de um instrumento comercial para fluorescência de raios X (FRX) foi proposto somente em 1948 (Friedman e Birks, 1948), mas estudos usando esta técnica continuaram. Em 1929, já se tinha conhecimento do espalhamento inelástico que os fótons de raios X poderiam sofrer ao interagir com a matéria (Compton, 1929). Tal fenômeno ficou conhecido como espalhamento Compton, em homenagem ao seu descobridor, Arthur Holly Compton, cujo trabalho foi também reconhecido com o recebimento do prêmio Nobel de física.

As décadas de 1950 e 1960 foram marcadas por estudos na busca de melhorias nos componentes dos equipamentos de FRX e otimização da técnica. Então, com o passar dos anos, laboratórios de indústrias e centros de pesquisas se interessaram mais pela técnica, principalmente à medida que suas vantagens, como rapidez, precisão, exatidão e reprodutibilidade, foram sendo definidas. É claro que, assim como os demais métodos ditos instrumentais, os avanços da eletrônica e da computação contribuíram para popularizar os métodos envolvendo a FRX. No entanto, é provável que o fato destes métodos não serem destrutivos e não requererem preparo de amostra tenha sido a principal causa para a sua aceitação (Bertin, 1970; Harris, 2001).

Por volta de 1970, estudiosos começaram a constatar que um novo efeito de espalhamento (posteriormente chamado de Raman) aparecia em espectros de raios X de amostras contendo elementos leves, para determinados ângulos entre a amostra e o feixe. Devido a grande quantidade de espalhamento de raios X promovida por amostras orgânicas, a técnica de FRX era considerada inadequada para esta classe de amostras (Mizuno e Ohmura, 1967).

Com o objetivo de minimizar esta deficiência, vários estudos começaram a ser feitos, principalmente a partir da década de 1990. A união da FRX às ferramentas quimiométricas mostrou ser muito útil, aumentando assim a versatilidade da técnica para diferentes tipos de amostras (Alexandre e Bueno, 2006; Bortoleto et al., 2007; Bueno et al., 2005; Goraieb et al., 2007; Molt e

(24)

INTRODUÇÃO

Schramm, 1999; Pereira e Bueno, 2008; Swerts et al., 1993; Terra et al., 2008a; Terra et al., 2008b; Vasquez et al., 2002; Verbi et al., 2005, Wang et al., 1990).

I.2.2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

A fluorescência de raios X (FRX) é uma técnica de análise relacionada com a medida de energia e intensidade características da radiação X emitida por uma amostra irradiada com radiação eletromagnética (IUPAC, 2008).

O fenômeno fotoelétrico é o principal processo que ocorre junto com os efeitos de espalhamento dos raios X, sendo estes últimos observados especialmente quando a matriz é composta por elementos de baixo número atômico.

O efeito fotoelétrico é verificado quando a fonte de raios X promove a ejeção de elétrons da camada mais interna do átomo que foi submetido ao processo de irradiação, o que gera uma situação extremamente instável. Então, para estabilizar esta situação, elétrons de camadas mais externas se deslocam e ocupam as vacâncias geradas pela emissão. Neste deslocamento há liberação de energia que pode ser utilizada na determinação qualitativa de um elemento, uma vez que ela é característica de cada elemento químico. Paralelamente, a quantificação do elemento pode ser realizada pela intensidade da radiação emitida, pois ela é proporcional à concentração da espécie (Jenkins e De Vries, 1970; Skoog et al., 2002).

Conforme as camadas envolvidas neste “deslocamento” dos elétrons, as emissões de raios X recebem uma nomenclatura específica. A camada a ser preenchida pelo elétron é que determina a nomenclatura da emissão. Além disso, se o elétron se desloca para a camada mais próxima, a emissão do fóton de raios X será denominada de α e as camadas posteriores sucessivamente de β, γ, δ, etc, conforme esquematizado na Figura 1 (Jenkins, 1999).

(25)

INTRODUÇÃO

Figura 1: Diagrama de transições de raios X e suas respectivas denominações.

Entre as vantagens tradicionais é possível destacar que a FRX: (i) é rápida, (ii) envolve baixo custo operacional, (iii) não promove a destruição da amostra, e, finalmente, (iv) pode fornecer simultaneamente resultados qualitativos e quantitativos (Bertin, 1970; Skoog et al., 2002).

Estas diversas vantagens da FRX, associadas ao fato da análise envolver mínimo (ou nenhum) preparo da amostra, fazem com que esta técnica tenha uma ampla aplicação não só na área de química, mas também em outras ciências, tais como medicina (Farquharson e Geraki, 2004), geologia (Schimidt et al., 2002), biologia (Alexandre e Bueno, 2006; Bode et al., 2008), arqueologia (Calza et al., 2006; Calza et al., 2007), etc.

Pode-se afirmar que a FRX já está bem consolidada quando aplicada a determinações inorgânicas em elementos cuja absorção dos raios X apresenta valores significativos (Z>11). Por outro lado, nos últimos anos vem ganhando destaque a aplicação de FRX em estudos de amostras orgânicas, nas quais a radiação X é intensamente dispersada (espalhada) e não apenas absorvida (efeito fotoelétrico).

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INTRODUÇÃO

Simultaneamente ao efeito fotoelétrico, na FRX ocorrem os efeitos Rayleigh, Compton e Raman, relacionados ao espalhamento do feixe incidente. O processo de espalhamento ocorre quando um fóton de raios X interage com os elétrons dos elementos químicos, sem que haja absorção ou emissão. Todos os átomos espalham fótons de raios X, mas a intensidade destes fenômenos depende do número atômico e da composição da amostra (Jenkins, 1999).

O efeito Rayleigh, também chamado de espalhamento coerente, é resultado da interação elástica de fótons de raios X com o meio. Neste caso, portanto, não há perda de energia durante o processo de colisão, o que justifica o fato do valor do pico máximo de energia observado no espectro de raios X para esse efeito ser igual a do elemento utilizado na fonte de raios X (Jenkins, 1999; IUPAC, 2008).

Já o efeito Compton (ou espalhamento incoerente) está associado ao espalhamento inelástico de fótons de raios X, ou seja, parte da energia do fóton é dispersada após a colisão, sendo transferida para os elétrons da camada de valência, que sofrem excitação (Jenkins, 1999; IUPAC, 2008).

Outro espalhamento inelástico que ocorre do feixe de raios X é o Raman. Neste caso, a perda de energia de fótons é acompanhada pela migração de elétrons da camada K (Jenkins, 1999). Estudos mais detalhados sobre este espalhamento (Mizuno e Ohmura, 1967; Suzuki, 1967) permitiram constatar que o seu comportamento é variável em função do ângulo de incidência, de maneira que, a 90º, não é observada a banda referente ao espalhamento Raman. Isto ocorre porque, neste ângulo de incidência, o Raman fica totalmente encoberto pelos espalhamentos Compton e Rayleigh.

Devido ao fato do espalhamento Raman não ser observado nos espectros obtidos por fluorescência de raios X por energia dispersiva, muitos estudiosos ignoram a sua existência ou acreditam que ele não forneça informações relevantes.

(27)

INTRODUÇÃO

Hoje, entretanto, já se sabe que, com o auxílio de ferramentas quimiométricas, a região de espalhamento da FRX pode revelar detalhes importantes sobre as amostras, uma vez que é dependente de várias características da amostra como composição, estrutura cristalina e concentrações relativas de seus componentes.

Em especial, amostras que possuam muitos elementos considerados leves (Z<11), como é o caso de amostras orgânicas, o espalhamento Raman é muito intenso. Isto justifica o porquê da técnica de FRX sempre ter sido considerada inadequada para estes compostos (Alexandre, 2007).

I. 3. QUIMIOMETRIA

Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais sofisticados, a possibilidade de aquisição de dados envolvendo a geração de uma quantidade grande de informações, muitas vezes complexas e variadas, aumenta proporcionalmente. Na área de química isto não é diferente, o que é comprovado pela quantidade de variáveis que podem ser medidas em um único equipamento para uma única amostra. Diante destes dados, a quimiometria foi ganhando espaço e se estabelecendo, uma vez que ela passou a auxiliar os químicos na interpretação dos resultados obtidos (Antunes, 2000; Ferreira et al., 1999; Luo, 2006; Swerts et al., 1994).

A quimiometria, segundo a Sociedade Internacional de Quimiometria, é a área da química que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada, fornecendo o máximo de informações químicas com a análise dos dados (ICS, 2008).

A região de espalhamento da FRX é dependente de várias características da amostra, fornecendo muitas informações sobre ela. Então, para explorar tal região e obter o máximo de informações sobre amostras orgânicas, o acoplamento

(28)

INTRODUÇÃO

da FRX e da quimiometria tem mostrado resultados muito promissores, fortalecendo ainda mais esta união.

Diversos são os métodos estatísticos usados no tratamento dos dados multivariados. Entre estes estão a análise por componentes principais (PCA – do inglês, Principal Component Analysis) e a regressão por quadrados mínimos parciais, o PLS (do inglês, Partial Least Squares).

A PCA consiste na redução da dimensionalidade do conjunto de dados a partir de combinações lineares das variáveis originais (Beebe et al., 1998). Então, novas variáveis são geradas e recebem diversos nomes como, por exemplo, fator, componente principal, autovalores, etc. As componentes principais são ortogonais entre si, ou seja, as informações contidas em uma são diferentes das contidas na outra. Além disso, a obtenção destas variáveis ocorre segundo uma ordem decrescente de quantidade de informação estatística que descrevem, ou seja, a primeira componente principal é aquela que descreve a maior parte da informação estatística da amostra (Moita e Moita, 1998).

A análise por componentes principais é um método de agrupamento que, além de reduzir a dimensionalidade da matriz de dados, permite verificar a existência de amostras anômalas e as de maior importância, eliminar ruídos experimentais, classificar as amostras e/ou agrupá-las conforme suas semelhanças, etc. A sua aplicação implica em decompor a matriz de dados (X) em

duas outras matrizes: a de scores (T) e a de loadings transposta (P’), conforme a

Equação 2, onde E é a matriz de erros ao realizar esta decomposição (Ferreira et al., 1999; Wold et al., 1987).

E ' TP X==== ++++

Equação 2: Decomposição da matriz de dados (X) resultante de aplicação da

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INTRODUÇÃO

A matriz de scores expressa a relação entre as amostras, apresentando as suas coordenadas em um novo sistema de eixos. Já a matriz de loadings expressa a relação entre as variáveis, identificando o quanto cada uma delas contribuiu na formação das componentes principais (Ferreira et al., 1999; Wold et al., 1987).

Estabelecer uma relação entre a variável de interesse e as informações (propriedades) que se tem das amostras significa construir um modelo matemático cuja equação resultante represente tal relação. Neste modelo, a variável de interesse é uma grandeza mensurável e o modelo é chamado de calibração (obtido por métodos quantitativos).

Entre os métodos quantitativos para análise de dados multivariados destaca-se o PLS. Modelos obtidos por PLS tendem a ser robustos, isto é, seus parâmetros praticamente não se alteram com a inclusão de novas amostras no conjunto de calibração. O PLS tem se tornado uma ferramenta extremamente útil e importante em muitos campos da química, como a físico química, a química analítica, a química medicinal, ambiental e ainda no controle de inúmeros processos industriais (Beebe et al., 1998).

A regressão PLS estabelece uma relação quantitativa entre o conjunto das respostas instrumentais (por exemplo, dados espectrais) e uma ou mais propriedades físicas ou químicas das amostras de interesse (concentração, índice de doçura, acidez, viscosidade, etc.), desenvolvendo um modelo matemático que correlaciona estas informações. Este procedimento engloba duas etapas: calibração e validação. A etapa de calibração estabelece uma relação entre a matriz inicial de dados X (sinais instrumentais, variáveis independentes) e as

propriedades conhecidas de amostras de referência (variáveis dependentes) organizados na matriz Y. A validação permite verificar se o modelo é capaz de

prever as propriedades de novas amostras - valores de incógnitas (Geladi e Kowalski, 1986).

(30)

INTRODUÇÃO

Da mesma forma que a PCA, o PLS realiza combinações das variáveis originais, gerando novas variáveis, geralmente chamadas de variáveis latentes. Na construção dos modelos de regressão, a escolha do número de variáveis latentes é uma etapa muito importante. O número ideal de variáveis latentes é aquele que permite a construção de um modelo com boa capacidade de previsão para amostras externas, sem super ajustar o modelo nem promover a modelagem de ruídos (Martens e Naes, 1996).

A validação cruzada é um dos métodos mais utilizados para a determinação do número de variáveis latentes. Neste procedimento, a calibração é repetida n vezes, sendo que, em cada uma destas vezes, é feita a previsão das variáveis para uma i-ésima parte do conjunto de calibração. Ou seja, uma amostra é retirada do conjunto de n amostras e então é feita a calibração para as n-1 amostras restantes. Na sequência, a amostra não usada na calibração tem sua variável prevista pelo modelo. O processo é repetido até que todas as amostras tenham sido excluídas (Martens e Naes, 1996).

Os valores previstos pelo modelo são comparados com os valores de referência e os erros são calculados. A partir destes, é obtida a soma dos quadrados dos erros de previsão (PRESS, Predicted Residual Error Sum of Squares) para cada variável latente. Após a construção do modelo de calibração, amostras são utilizadas para verificar a capacidade de previsão do modelo (Martens e Naes, 1996).

Com o objetivo de facilitar a visualização dos resultados, na maioria das vezes, são realizados pré-processamentos nos dados originais ao realizar o tratamento quimiométrico. O pré-processamento mais simples e mais utilizado nos dados de espectrometria consiste em centrar os dados na média. Este procedimento implica na subtração do elemento de cada coluna pelo valor médio dos elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz na qual todas as colunas têm média zero.

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INTRODUÇÃO

Em algumas situações, são realizadas transformações nos espectros para remover matematicamente fontes de variação indesejáveis. Entre estas transformações destacam-se as técnicas de alisamento que visam aumentar a razão sinal-ruído, e as correções da linha base, que minimizam as variações sistemáticas presentes no sistema.

Para verificar a adequação de um procedimento analítico ou de um modelo proposto, é realizado um processo chamado de validação. A validação permite constatar se o procedimento ou modelo apresenta um desempenho adequado para as condições em que será aplicado. A sua realização pode envolver a determinação de parâmetros que são conhecidos como figuras de mérito (Sena et al., 2007).

Poppi e colaboradores (Valderrama et al., 2007) propuseram o cálculo de algumas figuras de mérito. Na Tabela 1 estão expressas as fórmulas para obtenção de tais parâmetros.

(32)

INTRODUÇÃO

Tabela 1: Informações sobre as figuras de mérito utilizadas em validação multivariada

(Valderrama et al., 2007).

Figuras de Mérito

Relação Matemática Definição

SÊN

k

b 1

SÊN= Fração do sinal responsável pelo acréscimo _{de uma unidade de concentração à} propriedade de interesse.

γγγγ

x

SÊN

δ

γ = Razão entre a sensibilidade e o ruído instrumental RMSEP v lv 1 i 2 ^ i i l y y RMSEP

∑

=       − =

Grau de concordância entre o valor estimado pelo modelo e o valor tido como

verdadeiro ou de referência LOD SÊN 1 3 b 3 LOD= δ_x _k = δ_x

Menor valor de sinal líquido (ou concentração) detectável para que as probabilidades de um falso negativo (α) e

um falso positivo (β) sejam iguais a 0,05.

LOQ SÊN 1 10 b 10 LOQ= δ_x _k = δ_x

Valor de concentração analítica (ou sinal) que irá produzir estimativas com um determinado desvio padrão, usualmente

10%. tBias SDV l Bias t_Bias = v

bias é a diferença entre a média e o seu valor verdadeiro. Um teste t pode ser utilizado para se avaliar, quantitativamente,

se o bias incluso no modelo é ou não significativo

bk é o vetor dos coeficientes de regressão estimados pelo PLS

δx é uma estimativa do desvio padrão da flutuação do sinal analítico

v lv 1 i ^ i i l y y Bias

∑

=       − = e 1 l Bias y y SDV v 2 i ^ i −       −       − =

∑

Iv é o número de amostras do conjunto de validação

(33)

OBJETIVOS

I

(34)

OBJETIVOS

II. 1. OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho foi verificar a potencialidade de um novo procedimento a partir da aliança entre a FRX e a quimiometria para a quantificação do valor energético e o teor de alguns macronutrientes (proteínas e carboidratos) contidos em amostras comerciais de farinhas e extratos para consumo humano, visando minimizar os aspectos negativos dos métodos convencionais e obter resultados que se enquadrem na legislação vigente no Brasil, isto é, com erro máximo de 20% (RDC 360, portaria 42, de 23 de dezembro de 2003 - ANVISA).

(35)

EXPERIMENTAL

I

(36)

EXPERIMENTAL

III. 1. REAGENTES

Todos os experimentos foram realizados com reagentes de pureza analítica (Tabela 2), seguindo-se procedimentos recomendados pela literatura (Baccan et al., 2001; Jeffery et al., 1992). Para a preparação das soluções, foi utilizada água destilada (destilador de vidro) como solvente, exceto para o preparo das soluções de fenolftaleína, verde de bromocresol e vermelho de metila, para o qual foi usado álcool comercial 99,3°, Chemco. As soluções foram utilizadas com prazo máximo de 7 dias após a data do preparo

.

Tabela 2: Reagentes utilizados na realização dos experimentos.

Regentes Marca

Ácido bórico Synth

Ácido clorídrico Merck

Ácido sulfúrico Ecibra

Carbonato de sódio Synth

Clorofórmio Synth

Etanol Nuclear

Fenolftaleína Nuclear

Hidróxido de sódio Dinâmica

Peróxido de hidrogênio 30% Ecibra

Sulfato cúprico Ecibra

Sulfato de potássio Ecibra

Sulfato de sódio Vetec

Verde de bromocresol Carlo Erba

(37)

EXPERIMENTAL

III. 2. AMOSTRAS

Foram utilizadas neste trabalho 55 amostras comerciais de farinhas e extratos para consumo humano de marcas variadas. Esta quantidade foi estipulada em função da disponibilidade de amostras em supermercados da região de Campinas-SP (Brasil) na ocasião da aquisição das mesmas. As amostras foram agrupadas conforme a sua origem: milho (COrn), soja (SOy), trigo

(WHeat) e mandioca (CAsava). Também foram incluídas no conjunto amostral,

farinhas lácteas de cereais que, além de cereais, possuem leite em sua composição. Para efeito de agrupamento, a origem destas amostras foi atribuída ao leite (MIlk), pois na maior parte destas, mais de um vegetal estava presente.

Para alguns produtos, foi analisada mais de uma marca. As amostras flocadas foram trituradas com auxílio de almofariz e pistilo antes de serem utilizadas.

A descrição das amostras, com base nas informações dos fabricantes, pode ser verificada na Tabela 3. Já na Tabela 4, são apresentados os valores de rótulo das amostras para os parâmetros analisados. Estes valores foram convertidos para 100 g de amostra, uma vez que cada produto apresentava os valores para uma quantidade diferente de amostra.

(38)

EXPERIMENTAL

Tabela 3: Descrição das amostras de alimento utilizadas para cada grupo.

Grupo Amostras Descrição do Alimento Aspecto Físico

da Amostra

Milho (CO)

CO1-CO2, Fubá de Milho pó

CO3-CO5, CO7, CO9 Farinha de Milho floco

CO6, CO11 Farinha de Milho grânulo

CO8, CO12 Amido de Milho pó

CO10 Sêmola de Milho grânulo

Soja (SO)

SO1-SO3, SO9-SO10 Extrato de Soja pasta

SO4-SO6 Alimento Instantâneo com

Proteína de Soja pó

SO7 Fibra de Soja pó

SO12 Fibra de Soja grânulo

SO8, SO11 Farinha de Soja pasta

Trigo (WH)

WH1, WH6, WH9 Farinha de Trigo pó

WH2-WH3, WH5 Farinha de Rosca grânulo

WH4 Farelo de Trigo Integral grânulo

WH7 Farinha de Trigo Integral pó

WH8 Gérmen de Trigo Tostado grânulo

WH10-WH12 Fibra de trigo grânulo

Mandioca (CA)

CA1-CA2 Farinha de Mandioca

Temperada grânulo

CA3, CA8, CA11 Farinha de Mandioca Crua grânulo CA4-CA5, CA12 Farinha de Mandioca

Torrada grânulo

CA6, CA9 Polvilho Doce pó

CA7, CA10 Fécula de Mandioca pó

Leite (MI)

MI2, MI4, MI6 Farinha Láctea pó

MI3 Farinha Láctea grânulo

MI1, MI7 Farinha Láctea de Cereais floco MI5 Farinha Láctea de Cereais

(39)

EXPERIMENTAL

Tabela 4: Valores apresentados nos rótulos para valor energético (VE) e teores de

proteína (TP) e carboidrato (TC) para as amostras analisadas.

Grupo Amostra VE (kcal/100g) TP (g/100g) TC (g/100g)

Milho CO1 340 8,0 78 CO2 340 8,0 78 CO3 327 7,1 69 CO4 338 7,1 73 CO5 350 7,5 80 CO6 350 7,5 80 CO7 350 7,5 82 CO8 340 0 85 CO9 381 6,7 86 CO10 350 7,5 80 CO11 365 7,5 78 CO12 400 0 90 Soja SO1 413 40 28 SO2 442 31 42 SO3 490 25 40 SO4 355 36 47 SO5 500 37 38 SO6 469 26 37 SO7 200 37 12 SO8 460 37 31,0 SO9 433 40 21,0 SO10 460 21 31 SO11 500 45 28 SO12 200 37 12

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EXPERIMENTAL

Trigo WH1 360 0 76 WH2 370 10,3 77 WH3 370 10,3 77 WH4 340 14,0 72 WH5 373 12,3 80 WH6 360 10,0 76 WH7 360 13,8 73 WH8 340 27,0 37 WH9 344 10,0 76 WH10 180 15,0 20 WH11 150 16,0 22 WH12 150 20 72 Mandioca CA1 357 3 77 CA2 357 0 77 CA3 356 1,6 88 CA4 380 1,8 92 CA5 358 0 88 CA6 350 0 85 CA7 355 0 90 CA8 360 2 86 CA9 355 0 90 CA10 345 0 85 CA11 338 1,8 83 CA12 380 1,8 93

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EXPERIMENTAL

Leite MI1 332 9,8 82 MI2 410 13,0 73 MI3 600 10,0 73 MI4 433 6,7 83 MI5 393 12,7 70 MI6 397 12,7 73 MI7 358 10,4 75

III. 3. EQUIPAMENTOS

Balança analítica, marca Ohaus, modelo Analytical Plus;

Bloco digestor MicroKjeldahl para 40 provas, marca Tecnal, modelo TE-40-25; Destilador MicroKjeldahl, marca Tecnal, modelo TE-036/1;

Espectrômetro de fluorescência de raios X por dispersão de energia (EDXRF) marca Shimadzu, modelo EDX-700, constituído por um tubo de Rh e um detector semi-condutor de Si(Li);

Estufa com circulação de ar, marca Nova Ética, modelo 400/3ND, série 0766/00; Mufla, marca Fornitec Rebert Shaw Pyrotec.

(42)

EXPERIMENTAL

III. 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

III. 4. 1 – MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE

Todos os procedimentos descritos a seguir foram realizados em triplicata para cada uma das amostras.

A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL (AOAC International, 1996)

O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação.

• Digestão:

Em 1 tubo de microKjeldahl de 100 mL foram adicionados 200 mg de amostra pesados em balança analítica, 1,5 g de mistura de catalisador (96% K2SO4 + 4% CuSO4.5H2O) e 3 mL de H2SO4 concentrado, adicionados com

proveta.

Em seguida, o tubo foi colocado no bloco digestor (Figura 2), que foi aquecido até 100 ºC, permanecendo nesta temperatura por 30 minutos. A temperatura foi então elevada de 20 em 20 ºC, permanecendo por 15 minutos em cada temperatura, para evitar que a amostra levantasse fervura bruscamente e espirrasse.

Quando a temperatura do bloco atingiu 360 ºC, o tubo foi retirado do bloco e colocado para esfriar a temperatura ambiente. Se ainda eram observados resíduos carbonizados, algumas gotas de peróxido de hidrogênio 30% eram adicionadas ao tubo para auxiliar na digestão dos mesmos; o tubo era novamente aquecido, elevando a temperatura aos poucos, até atingir 360 ºC.

(43)

EXPERIMENTAL

Figura 2: Fotografia do bloco digestor utilizado

• Destilação:

O tubo de microKjeldahl contendo a amostra digerida e sem resquícios de resíduos carbonizados foi colocado em uma das extremidades do destilador de Kjeldahl. Na saída do destilador, foi colocado um erlemmeyer de 250 mL contendo 10 mL de ácido bórico 20 g L-1, 4 gotas de vermelho de metila 1 g L-1 e 6 gotas de verde de bromocresol 1 g L-1. A ponta do destilador ficou totalmente mergulhada na solução ácida.

Em seguida, o destilador foi ligado e aproximadamente 10 mL de NaOH 400 g L-1 foram adicionados ao sistema por uma válvula localizada na parte superior do destilador (Figura 3). Prosseguiu-se com a destilação até obtenção de aproximadamente 100 mL de destilado.

(44)

EXPERIMENTAL

Figura 3: Fotografia do destilador de microKjeldahl utilizado.

• Titulação:

O destilado obtido na etapa de destilação foi titulado com ácido clorídrico 0,02 mol L-1, previamente padronizado, conforme recomendado na literatura (Baccan et al., 2001).

Foi calculado então o teor de proteína presente na amostra.

(45)

EXPERIMENTAL

B – QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATO - MÉTODO DA DIFERENÇA (ANVISA, 2003)

O teor de carboidrato foi calculado pela diferença entre 100 e a soma das porcentagens de proteína, umidade, cinzas e lipídios determinadas pelos procedimentos apresentados nos itens III.4.1A, III.4.1B1, III.4.1B2 e III.4.1B3, respectivamente.

• B1 – QUANTIFICAÇÃO DE UMIDADE (AOAC International, 1996)

Cadinhos de alumínio e suas respectivas tampas foram limpos e secos em estufa com circulação de ar, por 30 minutos, a 110 ºC. Os cadinhos e tampas foram colocados em dessecador para esfriar, antes de terem suas massas medidas.

Em seguida, foram adicionados 2 g de amostras, pesados em balança analítica. O cadinho com a amostra foi colocado na estufa, sem tampa, por 4 h, a 105 ºC. Decorrido este período, o cadinho foi retirado da estufa, tampado para evitar a absorção de umidade do meio, e colocado em dessecador. Quando frio, foi pesado novamente com a tampa.

Na sequência, o cadinho foi levado por mais 30 minutos na estufa a 105 ºC; sendo pesado novamente depois deste tempo. Este procedimento foi repetido até a obtenção de massa constante.

Foi feito o cálculo do teor de umidade na amostra, levando em consideração as três replicatas.

• B2 – QUANTIFICAÇÃO DE CINZAS (AOAC International, 1996)

Cadinhos de porcelana foram previamente limpos e aquecidos a 550 ºC, por 30 minutos, em mufla. Os cadinhos foram colocados em dessecador para esfriar, antes de terem suas massas medidas.

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EXPERIMENTAL

Em seguida, 2 g de amostra, pesados em balança analítica, foram transferidos para um cadinho, que foi levado novamente a 550 ºC em mufla.

A amostra só foi retirada da mufla após toda parte orgânica ter sido carbonizada (obtenção de um material esbranquiçado ou cinzento). O cadinho foi deixado em dessecador para esfriar, sendo pesado logo em seguida, em balança analítica.

Foi feito o cálculo do teor de cinzas na amostra.

• B3 - QUANTIFICAÇÃO DE GORDURA - BLIGH-DYER (Bligh e Dyer, 1959) Medidos em balança analítica, 3 g de amostra foram adicionados em um tubo de ensaio de 70 mL com tampa de rosca. A este tubo foram transferidos, com auxílio de buretas, 10 mL de clorofórmio, 20 mL de metanol e 8 mL de água destilada.

O tubo tampado foi então agitado por 30 minutos em um agitador rotatório manual (Figura 4). Em seguida, foram adicionados com buretas 10 mL de clorofórmio e 10 mL de solução de sulfato de sódio 15 g L-1. O tubo foi agitado por mais 2 minutos e deixado em descanso por 40 minutos em geladeira para separação das fases.

As fases foram separadas, sendo a que continha metanol e água descartada devidamente e a com clorofórmio, mantida no tubo de ensaio. Foi adicionado aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro no tubo, que foi tampado e agitado para remover possíveis traços de água que tivessem permanecido. O conteúdo do tubo foi filtrado, utilizando funil de vidro e papel de filtro contendo aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro.

Com o auxílio de pipeta volumétrica, 5 mL do filtrado foram transferidos para um béquer de 50 mL previamente, limpo, seco e pesado. O béquer foi colocado em estufa a 105 ºC até evaporação total do solvente. Após resfriado em

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EXPERIMENTAL

dessecador, o béquer foi novamente pesado e o teor de gordura na amostra foi calculado.

Figura 4: Fotografia do agitador rotatório manual utilizado.

C – QUANTIFICAÇÃO DE VALOR ENERGÉTICO (Buchholz e Schoeller, 2004) O cálculo de VE foi realizado conforme a Equação 1 (p. 4), a partir dos valores de proteínas, carboidratos e lipídios (gorduras) da amostra analisada, determinados pelos procedimentos descritos nos itens III.4.1 A, III.4.1 B e III.4.1 B3, respectivamente.

III. 4. 2 – MÉTODO PROPOSTO: FLUORESCÊNCIA DE RAIOS X

• Medidas Analíticas:

Celas de FRX (Chemplex 1300, diâmetro externo de 30,7 mm e volume interno de 7 cm3) foram montadas com seu fundo sustentado por um filme de Mylar (Chemplex 100), de espessura de 2,5 µm.

As celas foram preenchidas com a amostra, garantindo completa absorção do feixe de raios X (modo de espessura infinita). A voltagem aplicada no tubo de raios X foi igual a 50 kV, com 25% de tempo morto. Os espectros foram obtidos

(48)

EXPERIMENTAL

sequencialmente, com uma resolução de 0,02 keV, de 0 a 40 keV. O tempo de irradiação foi de 120 s e para cada amostra foram preparadas 3 celas de FRX, resultando em 165 espectros.

• Tratamento dos dados:

O tratamento dos dados foi realizado com o programa computacional Pirouette® 3.11 (Infometrix Co., 2003).

Os dados do espectro inteiro (incluindo a região de espalhamento de raios X) foram submetidos a tratamento quimiométrico por PCA e PLS, para a construção dos modelos de calibração e validação. Para todos os casos, o pré-processamento utilizado foi o de dados centrados na média, o que, de maneira geral, consiste em subtrair o elemento de cada coluna pelo valor médio dos elementos dessa coluna, obtendo-se como resultado uma matriz de emissão de raios X. Os espectros não sofreram qualquer tipo de transformação.

Para a PCA, todos os 165 espectros foram usados para verificar a possibilidade de separação entre as amostras de cada classe (milho, trigo, soja, mandioca e leite). O número adequado de componentes principais foi determinado pela porcentagem de variância acumulada e, uma vez selecionado este número, foi examinado o gráfico dos scores para verificar a distribuição das amostras.

Foi verificada a possibilidade de construção de modelos de calibração, utilizando-se todas as amostras num único conjunto. Para este conjunto, foram primeiramente identificados os outliers, através de duas grandezas complementares: leverage e resíduo de Student.

A leverage é uma medida da influência de uma amostra no modelo de regressão. Um valor de leverage pequeno indica que a amostra em questão influencia pouco na construção do modelo de calibração. Por outro lado, se as medidas experimentais de uma amostra são diferentes de outras do conjunto de calibração, ela provavelmente terá alta influência no modelo, que poderá ser

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EXPERIMENTAL

negativa. Em geral, amostras com leverage maior do que hcrit (Equação 3) devem

ser consideradas suspeitas e analisadas cautelosamente (Ferreira et al., 1999).

n k 3 hcrit =

Equação 3: Cálculo da leverage máxima admissível de uma amostra (hcrit). k =

número de componentes principais e n = número de espectros do conjunto de calibração.

O resíduo de Student é calculado pela validação cruzada e está relacionado ao resíduo da variável dependente. Amostras mal modeladas terão resíduos altos. Supondo-se que os resíduos são normalmente distribuídos, e sabendo-se que eles são definidos em unidades de desvio padrão do valor médio, os valores com

± 2,5 são considerados altos sob as condições usuais de estatísticas. Ferreira e colaboradores (1999) descrevem a maioria das fórmulas associadas à leverage e resíduo de Student para os modelos de calibração, sendo aqui citados como referência para mais informações sobre este tópico.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

I

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e discussão serão apresentados em itens, conforme os métodos e procedimentos realizados. Para os métodos convencionais (item IV.1), os valores obtidos para todas as variáveis estudadas estão apresentados nas Tabelas 5 a 9, no final deste item.

IV. 1. MÉTODOS CONVENCIONAIS DE ANÁLISE

A – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA - MÉTODO MICROKJELDAHL

O método microKjeldahl envolveu 3 etapas: digestão, destilação e titulação. Na etapa de digestão, o nitrogênio da proteína foi transformado em sulfato de amônio, resultando num produto de cor verde esmeralda, sem resíduos carbonizados. A digestão completa de cada amostra demorou aproximadamente 4 horas.

A amostra digerida foi acoplada ao destilador de Kjeldahl. O sistema foi aquecido e hidróxido de sódio concentrado foi adicionado, para proporcionar a liberação da amônia. Cabe ressaltar que o destilador é um sistema fechado, e, portanto, impede a perda de amônia por volatilização. A amônia foi liberada em uma solução de acido bórico de concentração conhecida, formando o borato de amônio. A etapa de destilação demorou cerca de 10 minutos por amostra.

Finalmente, o borato de amônio foi titulado com uma solução de HCl padronizada, para a quantificação do nitrogênio presente na amostra.

Todas as reações envolvidas nas etapas do método de Kjeldahl estão apresentadas na Figura 5: