Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila

Texto

(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA. GISLENE FERREIRA. Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila. LORENA 2019.

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(3) GISLENE FERREIRA. Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila. Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências do Programa de PósGraduação em Biotecnologia Industrial na área de concentração de Microbiologia Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Fernando Segato. Versão Corrigida. Lorena 2019.

(4) AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado da Escola de Engenharia de Lorena, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Ferreira, Gislene Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila / Gislene Ferreira; orientador Fernando Segato Versão Corrigida. - Lorena, 2019. 128 p. Tese (Doutorado em Ciências - Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial na Área de Microbiologia Aplicada) - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. 2019 1. Fitases. 2. Fungos termofílicos. 3. Myceliophtora thermophila. 4. Expressão heteróloga. I. Título. II. Segato, Fernando , orient..

(5) Dedico essa tese a mulher da minha vida, minha inspiração e base de tudo, minha mãe e ao meu pai, que mesmo partindo tão cedo, sempre foi meu maior incentivo..

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(7) AGRADECIMENTOS. Acima de tudo e todos, agradeço a Deus, por ter me direcionado pra esse caminho, pelo propósito que somente Ele irá apontar; Ao meu orientador, prof. Dr. Fernando Segato, por toda paciência, sabedoria e alegria compartilhados durante esses quatro anos e principalmente, por sempre manter o lado humano acima de qualquer interesse; A toda minha família, em especial, à minha mãe, por sempre acreditar em mim, mesmo quando eu já não acreditava, aos meus sobrinhos, irmãos e cunhados, por todo apoio e alegria nos raros momentos em que nos encontrávamos; Aos meus companheiros e amigos de laboratório, Aline, Bruno, Awana, Bianca, Josman e meninos da iniciação científica e agregados, por toda ajuda oferecida, conhecimentos compartilhados, gargalhadas nos momentos mais difíceis e principalmente, por me aceitarem como mais uma no time, dentro e fora do laboratório, independente das diferenças; Aos grandes e verdadeiros amigos conquistados durante essa jornada, em especial, Evandro Mulinari, por todo ensinamento e ajuda, pela companhia nos filmes de terror, risadas e confidências compartilhadas e Marcelo Holanda, por sempre estar presente nos momentos em que mais precisei, sempre me ajudando com muita paciência, mesmo diante de minha frequente chatice; Às minhas pequenas, Nega e Nina, por serem as companheiras mais fieis e amorosas durante todo esse tempo, aguentando meus momentos de impaciência e desespero, mas nem por isso, deixando de me amar; Ao meu namorado Nelson, que não acompanhou o desespero das piores fases do início, mas aguentou com muito carinho e paciência essa etapa afinal; À Maura, que me acompanha há muito tempo, participando dos altos e baixos e tomando conta das meninas na hora que apertava por aqui; Ao técnico de laboratório Zé “Cobrinha”, por estar sempre de bom humor e transmitir essa alegria ao chegar no laboratório, fornecendo apelidos a todos sem perdão e principalmente, pela doação da ração; À Universidade de São Paulo e ao Departamento de Biotecnologia, pela oportunidade de desenvolver esse trabalho; Às agências de fomento CAPES, CNPq e FAPESP, pelo incentivo financeiro; Enfim, agradeço a todos, amigos, colegas, famílias, professores, funcionários, que de alguma forma contribuíram para eu chegar até essa etapa. Muito obrigada!.

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(9) RESUMO FERREIRA, G. Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico Myceliophthora thermophila. 2019. 128p. Tese (Doutorado em Ciências) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2019. Fitases são enzimas que hidrolisam o ácido fítico, substâncias orgânicas complexas amplamente encontradas na natureza, principalmente em cereais e leguminosas. Nesses alimentos vegetais, o fitato é a principal fonte de fósforo, correspondendo entre cinquenta a oitenta por cento do conteúdo de fósforo orgânico. Entretanto, o fósforo do fitato é muito pouco utilizado por humanos e outros animais monogástricos, como suínos e aves, devido à ausência ou insuficiência das enzimas que o degradam. Assim, rações contêm o fósforo orgânico do fitato e fósforo inorgânico adicionado, que é um mineral caro e não renovável. Em áreas de criação intensiva o excesso de fósforo é excretado no ambiente, causando problemas, tais como a eutrofização. Devido aos problemas ambientais e ao alto custo do fósforo inorgânico, a suplementação de enzimas, principalmente fitases, tem ganhado destaque, entre elas, as enzimas fúngicas, devido a sua estabilidade a diferentes temperaturas e pH. Além disso, técnicas de engenharia genética permitem a transferência de genes entre espécies, resultando em muitos benefícios, principalmente em relação ao aumento e melhoramento na produção de enzimas industriais. O objetivo deste trabalho foi realizar a clonagem, expressão heteróloga, purificação e caracterização bioquímica da enzima fitase (MtPhy) obtida a partir do fungo termofílico M. thermophila. O gene que codifica a enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterologamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas análises bioquímicas, apresentou pH ótimo de 5,0 e temperatura ótima de 60°C e manteve praticamente 100% de sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular e ThermoFluor, apresentou desenovelamento de sua estrutura nas temperaturas de 63 e 67°C, respectivamente. Demonstrou atividade aumentada na presença de CaCl2 e MgCl2 e foi fortemente inibida por FeCl3, CuSO3 e SDS. Sua atividade específica (954,8 U/mg) utilizando fitato de sódio foi bastante superior a de outras fitases descritas na literatura. Demonstrou-se efetiva na liberação do fósforo em rações e extremamente resistente às proteases, tripsina e pepsina, presentes no trato digestório de animais monogástricos, demonstrando dessa forma, seu elevado potencial para aplicação industrial.. Palavras-chave:. Fitases.. Expressão heteróloga.. Fungos. termofílicos.. Myceliophtora. thermophila..

(10) ABSTRACT. FERREIRA, G. Cloning, expression and characterization of phytase produced by thermophilic fungus Myceliophthora thermophyla. 2019. 128p. Thesis (Doctoral of Science) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2019. Phytases are enzymes that hidrolyse phytic acid, wich are complex organic substances, found widely in nature mainly in cereals and legumes. In plants, the phytate are the main source of phosphorus. It account for fifty to eighty percent of the total organic phosphorus. However, the phytate phosphorus is very poorly used by humans and other animals, such as swines and poultry due to the absence or insufficiency of enzymes that degrade phytate. Thus, animal feed contain phytate organic phosphorus and inorganic phosphorus added, wich is an expensive and not renovable mineral and in áreas of intensive breeding, the excess phosphorus is excreted in the environment, causing phoblems, such as, eutrophication. Due to environmental problems and the high price of inorganic phosphorus, the enzyme supplementation, mainly phytases hás been growing, among them, fungal enzymes, because of their stability at different temperature and pH. In addition, genetic engineering techniques allow the transfer of genes between species, resulting in many benefits, mainly in relation to the increase and improvement in the production of industrial enzymes. The aim of this work was to perform the cloning, heterologous expression, purification and biochemical characterization of the phytase enzyme (MtPhy) obtained from the thermofilic fungus Myceliophthora thermophila. The gene encoding this enzyme was cloned and heterologously expressed in A. nidulans A773, the MtPhy was purified and had its identity confirmed by mass spectrometry. In the biochemical analysis the MtPhy showed an optimum pH of 5.0 and optimum temperature of 60°, maintaining practically 100% of its activity at 50°C for 2 hours. The circular dichroism and ThermoFluor analysis showed a denaturation of its structure at temperatures of 63 and 67°C, respectively. The activity of MtPhy was increased in the presence of CaCl2 and MgCl2 and was highly affected by FeCl3, CuSO3 and SDS. The specific activity (954,8 U/mg) in sodium phytate was far superior to another phytases described in literature. It was effective in release of phosphorus in animal feed and extremely resistant to proteases, trypsin and pepsin, present in the digestive tract of monogastric animals, thus proving high potential for industrial application.. Keywords:. Phytases.. Heterologous expression.. Thermophilic. fungal.. Myceliophthora. thermophila..

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura do ácido fítico. ....................................................................... 21 Figura 2 - Principais ligantes do ácido fítico formando o fitato .............................. 24 Figura 3 - Ação da fitase sobre o ácido fítico ........................................................ 28 Figura 4 – Hidrólise do fitato pela fitase, em inositol e fosfato, liberando micronutrientes, proteínas e amido ....................................................................... 29 Figura 5 - Vetor pEXPYR para clonagem e expressão de proteínas em A. nidulans. ................................................................................................................ 50 Figura 6 – Análise da sequência de aminoácidos da fitase de M. thermophila pelo servidor SignalP 4.1. ............................................................................................. 67 Figura 7 – Eletroforese em gel de agarose 1% mostrando o produto de PCR após amplificação do gene de interesse. ....................................................................... 69 Figura 8 - Etapas de amplificação e clonagem envolvendo a metodologia de Gibson Assembly. ................................................................................................. 70 Figura 9 – Eletroforese em gel de agarose 1%, mostrando amplificação do gene da fitase de M. thermophila, após PCR de colônia. .............................................. 71 Figura 10 – Eletroforese em SDS-PAGE 15% mostrando o perfil protéico dos extratos obtidos após cultivo por 48 h de 8 colônias transformantes de A. nidulans A773, contendo o gene Mtphy. ............................................................................. 73 Figura 11 - Análise por LC-MS/MS realizada com peptídeos gerados após digestão com tripsina da MtPhy ............................................................................ 74 Figura 12 – SDS-PAGE 15% das frações obtidas na cromatografia de troca iônica .............................................................................................................................. 75 Figura 13 – Gel SDS-PAGE 15% das frações que apresentaram pico na cromatografia de exclusão por tamanho ............................................................... 76 Figura 14 – Gráfico obtido pela análise de ThermoFluor, com as Tm da MtPhy de acordo com diferentes condições tamponantes .................................................... 78 Figura 15 – Espectros de dicroísmo circular, determinando a fração desenovelada da MtPhy e sua Tm em três diferentes tampões, no comprimento de onda 222 nm. .............................................................................................................................. 81 Figura 16 – Espectro de dicroísmo circular da enzima MtPhy no intervalo de comprimento de onda de 195 a 270 nm, com tampão acetato de sódio (50 mM). 82 Figura 17 – Espectro de dicroísmo circular da enzima MtPhy no intervalo de comprimento de onda de 195 a 270 nm, com tampão fosfato de potássio (50mM) .............................................................................................................................. 83 Figura 18 – Espectro de dicroísmo circular da enzima MtPhy no intervalo de comprimento de onda de 195 a 270 nm, com tampão fosfato de potássio (50mM), acrescido de 300 mM de NaCl .............................................................................. 83 Figura 19 – Modelo de estrutura tridimensional da MtPhy, obtido pela ferramenta I-TASSER.............................................................................................................. 84 Figura 20 - Geis de SDS-PAGE das diferentes condições de cultivo para secreção de MtPhy, em diferentes tempos, com e sem agitação......................................... 85 Figura 21 – Nova purificação da MtPhy após cultivo de 72 horas......................... 86 Figura 22 – Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática da MtPhy ..... 88 Figura 23 – Trato digestório de um suíno e seus diferentes valores de pH .......... 90.

(12) Figura 24 – Estabilidade térmica da MtPhy em diferentes temperaturas e tempo. .............................................................................................................................. 91 Figura 25 – Íons ativadores da atividade da fitase em duas diferentes concentrações ...................................................................................................... 94 Figura 26 – Especificidade da MtPhy em diferentes substratos ......................... 100 Figura 27 – Curva de liberação do produto da reação ........................................ 101 Figura 28 – Velocidade da reação enzimática de MtPhy em relação à concentração do substrato (Michaelis-Menten) .................................................. 102 Figura 29 – Ensaio in vitro de ação da MtPhy em ração a base de milho .......... 104 Figura 30 – Ensaio in vitro de ação da MtPhy em ração comercial .................... 105 Figura 31 – Resistência da MtPhy à proteólise pelas enzimas pepsina e tripsina em 37°C .............................................................................................................. 106.

(13) LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Conteúdo de ácido fítico, fósforo total, e fósforo ligado ao inositol em alguns cereais, leguminosas, oleaginosas e castanhas........................................ 23 Tabela 2 - Algumas fitases microbianas comercialmente disponíveis no mercado. .............................................................................................................................. 30 Tabela 3 - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação do gene da fitase de M. thermophila (MtPhy) .......................................................................... 48 Tabela 4 - Condições utilizadas nos ciclos e reações de PCR. ............................ 49 Tabela 5 - Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na amplificação do vetor pEXPYR. ............................................................................................................... 50 Tabela 6 – Condições utilizadas nos ciclos e reações de PCR de colônia ........... 52 Tabela 7 – Tampões utilizados para avaliar MtPhy pela técnica de ThermoFluor 59 Tabela 8 - Massa molar, ponto isoelétrico, coeficiente de extinção molar e número de aminoácidos estimado para a fitase de M. thermophila (MtPhy) ...................... 68 Tabela 9 – Diferentes tampões, em diferentes pHs, com ou sem adição de NaCl e temperatura de Melting apresentada pela enzima MtPhy em cada condição ....... 79 Tabela 10 – Efeito de vários compostos iônicos na atividade enzimática da MtPhy .............................................................................................................................. 93 Tabela 11 – Efeito de outros aditivos na atividade da fitase ................................. 96 Tabela 12 – Parâmetros cinéticos determinados para a enzima MtPhy ............. 102.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS Coeficiente de extinção molar  BLAST Basic Local Alignment Search Tool CD Dicroísmo Circular dNTP Deoxi ribonucleotídeo trifosfato DNA Ácido desoxirribonucleico DNAg DNA genômico DMSO Dimetilsulfóxido DSPS Double Strength Protoplasting Solution DTT Ditiotreitol EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid 5-FOA 5-Fluoroorotic acid GA Gibson Assembly GE General Electric HCl Ácido clorídrico HAP Fosfatase histidina ácida JGI Joint Genome Institute Kcat Turn over number kDa Kilo Dalton Km Constante de Michaelis-Menten LB Luria-Bertani (meio de cultura) LC MS/MS Cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas L Litro M Molar mg Miligrama mL Mililitro mM Milimolar MM Meio mínimo (meio de cultura) MW Massa molar m/v Massa/volume MPa Mega Pascal MgCl2 Cloreto de Magnésio MtPhy Enzima fitase de Myceliophthora thermophila Mtphy Gene codificante da enzima MtPhy do fungo M. thermophila MtPhy + Xyl Enzima fitase de M. thermophila + xilanase NCBI National Center for Biotechnology Information ng Nanograma nm Nanômetro NaCl Cloreto de sódio pb Pares de base PCR Polymerase chain reaction PEG Polietilenoglicol pI Ponto isoelétrico pyrG gene que codifica a orotidina-5’-monofosfato descarboxilase de A. niger pEXPYR Vetor utilizado para clonagem e expressão de proteínas em A. nidulans.

(15) PMSF rpm SDS SDS-PAGE Electrophoresis SOC STC TAE TCA Tm T5 U/kg U v/v µg µL TRIS. Fluoreto de fenilmetilsufonil Rotações por minuto Dodecil sulfato de sódio Sodium Dodecyl Sulfate. Polyacrylamide. Super Optimal Broth Sorbitol Tris Calcium Solution Tris, Ácido acético, EDTA Ácido tricloacético Temperatura de Melting Enzima 5’-T5-exonuclease Unidades da enzima/quilo de ração Atividade enzimática Volume/volume Micrograma Microlitro Tris (hydroxymetyl)aminomethane. Gel.

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(17) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 19 2.1 Fósforo ........................................................................................................... 19 2.2 Ácido fítico..................................................................................................... 20 2.2.1 Nomenclatura do ácido fítico ........................................................................ 21 2.2.2 Fontes de fitato ............................................................................................ 21 2.2.3 Efeitos prejudiciais do fitato.......................................................................... 23 2.2.4 Efeitos benéficos do fitato ............................................................................ 25 2.2.5 Problemas ambientais .................................................................................. 27 2.3 Fitases ............................................................................................................ 28 2.3.1 Histórico das fitases ..................................................................................... 29 2.3.2 Classificação das fitases .............................................................................. 30 2.3.3 Aplicações das fitases .................................................................................. 33 2.3.4 Fontes de fitases .......................................................................................... 35 2.3.5 Fatores que influenciam a atividade das fitases........................................... 38 2.4 Fungos termofílicos ...................................................................................... 42 2.5 Clonagem e expressão heteróloga .............................................................. 43 3 OBJETIVOS....................................................................................................... 46 3.1 Objetivo geral ................................................................................................ 46 3.2 Objetivos específicos ................................................................................... 46 4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 47 4.1 Linhagens ...................................................................................................... 47 4.2 Seleção das sequências gênicas da fitase de M. thermophila.................. 47 4.3 Construção dos oligonucleotídeos (primers) de interesse ....................... 47 4.4 Extração de DNA genômico (DNAg) de M. thermophila ............................ 48 4.5 Amplificação do gene que codifica a MtPhy e do vetor pEXPYR ............. 49 4.6 Inserção do gene de Interesse no vetor ...................................................... 50 4.7 Transformação de E. coli quimiocompetentes ........................................... 51 4.8 PCR de colônia .............................................................................................. 52 4.9 Purificação do DNA plasmidial .................................................................... 53 4.10 Transformação em A. nidulans A773 ........................................................ 53 4.10.1 Obtenção de protoplastos .......................................................................... 53 4.10.2 Transformação dos protoplastos mediada por PEG .................................. 54.

(18) 4.10.3 Screening e seleção dos transformantes ................................................... 55 4.11 Análise por espectrometria de massas .................................................... 55 4.12 Produção e purificação da enzima ............................................................ 56 4.12.1 Cromatografia de troca iônica e de exclusão por tamanho ........................ 57 4.13 Determinação da concentração da fitase e atividade enzimática........... 57 4.14Estabilidade térmica da MtPhy por ThermoFluor ..................................... 58 4.15 Espectroscopia de Dicroísmo circular...................................................... 60 4.16 Determinação da melhor condição de expressão.................................... 61 4.17 Caracterização bioquímica da fitase ......................................................... 62 4.17.1 Determinação de temperatura e pH ótimos ............................................... 62 4.17.2 Estabilidade térmica................................................................................... 63 4.17.3 Efeitos de compostos iônicos e outros aditivos sobre a atividade da fitase .............................................................................................................................. 63 4.17.4 Determinação da especificidade ao substrato ........................................... 64 4.17.5 Determinação dos parâmetros cinéticos .................................................... 64 4.18 Hidrólise in vitro em ração comercial para aves ...................................... 65 4.19 Resistência à proteólise ............................................................................. 66 5 RESULTADOSE DISCUSSÃO ......................................................................... 67 5.1 Seleção da sequência proteica .................................................................... 67 5.2 Construção dos primers e clonagem dos genes ...................................... 68 5.3 Transformação bacteriana e PCR de colônia ............................................. 69 5.4 Transformação em A. nidulans A773 e screening dos transformantes ... 71 5.5 Espectrometria de massas .......................................................................... 73 5.6 Purificação de fitase de A. nidulans recombinante ................................... 74 5.7 ThermoFluor .................................................................................................. 77 5.8 Dicroismo circular (CD) ................................................................................ 80 5.10 Determinação de temperatura e pH ótimos .............................................. 87 5.11 Efeitos de compostos iônicos e outros aditivos sobre a atividade da fitase .................................................................................................................... 92 5.13 Determinação da especificidade ao substrato ......................................... 99 5.14 Parâmetros cinéticos da MtPhy ............................................................... 101 5.15 Hidrólise in vitro em rações para aves ................................................... 103 5.16 Resistência à proteólise ........................................................................... 105 6 CONCLUSÕES ............................................................................................... 108 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 109.

(19) 17. 1 INTRODUÇÃO O fósforo é um dos mais importantes macroelementos das células vivas, envolvido em numerosos processos celulares, sendo considerado essencial para o crescimento, desenvolvimento e metabolismo de todos os organismos vivos (SULEIMANOVA et al., 2015; EMMENES et al., 2018; WANG et al., 2018; VILLAMIZAR, et al., 2019a; VERARDI et al., 2019). No entanto, sua disponibilidade na natureza é limitada, uma vez que grande parte deste mineral se encontra ligada ao ácido fítico, que dificulta sua utilização (AGUILAR, ZEA, VILCHEZ, 2018; CHHABRA, 2019) e de vários outros minerais, para os animais monogástricos que não possuem ou apresentam baixa quantidade de enzimas que o hidrolisam, afetando assim, a qualidade nutricional dos alimentos. Por esse motivo, o ácido fítico é conhecido como um importante “fator antinutricional” (SINGH, JOSHI, GUPTA, 2013; SAVITA et al., 2017; VASUDEVAN et al., 2019). O ácido fítico, um grupo complexo de componentes naturais, encontrado em plantas e no solo (ROSTAMI; GIRI, 2013; MITTAL et al, 2013), é considerado a maior forma de armazenamento do fósforo nos alimentos vegetais (cerca de 50 a 80%), especialmente os cereais e leguminosas (FARHADI et al., 2019; SHARIDEH et al., 2019; VASUDEVAN et al., 2019), principais ingredientes das rações para aves e suínos (WANG et al, 2018; VASUDEVAN et al, 2019). Dessa forma, alimentos e rações a base de grãos e cereais contêm uma parte do fósforo presente em sua composição orgânica ligado ao ácido fítico, sendo este excretado no ambiente (VIER et al., 2018a), resultando na necessidade de suplementar suas dietas com fósforo inorgânico, a fim de alcançar as recomendações dietéticas deste nutriente (ARREDONDO et al., 2019). Como consequência ao alto nível de fósforo excretado no solo e mananciais, ocorre um aumento no índice de poluição ambiental em áreas de criação intensiva de aves e suínos, resultando na morte de muitas espécies aquáticas (VILLAMIZAR et al., 2019b; VIDYASAGAR et al., 2019). Assim, problemas ambientais, aliadas a aspectos econômicos, vêm impulsionando a investigação de estratégias para reduzir a suplementação de minerais inorgânicos em rações animais, bem como a excreção do fósforo não absorvido na natureza (VIDYASAGAR et al., 2019). Dentre as principais.

(20) 18. estratégias, destaca-se a utilização de enzimas exógenas, como as fitases, para melhorar a digestão do ácido fítico e, consequentemente, a liberação e absorção do fósforo, (ABBASI et al., 2019). As fitases são enzimas que hidrolisam o ácido fitico, liberando o fósforo e minerais associados, permitindo sua absorção em animais monogástricos (AJITH et al., 2018; ABBASI et al., 2019). Apesar destas enzimas serem amplamente produzidas na natureza e encontradas em plantas, animais e microrganismos (SINGH, JOSHI, GUPTA, 2013; AJITH et al., 2019), análises de fitases de diferentes origens mostraram eficiência superior das enzimas microbianas em relação às demais fontes (SATO, 2015). Fitases produzidas por fungos filamentosos têm recebido atenção especial, por serem de natureza extracelular, ao contrário das fitases bacterianas e de leveduras, que são intracelulares (SINGH, SATYANARAYANA, 2011). Fungos. termofílicos. são. microrganismos. que. crescem. em. altas. temperaturas, cujas enzimas extracelulares podem ser ativas e estáveis sob condições de temperaturas superiores às enzimas produzidas por fungos mesofílicos, mostrando estabilidade em temperaturas próximas de 70 a 80°C, fornecendo dessa forma, vantagens econômicas na aplicação industrial (SINGH, 2016; WANG et al., 2015). Dessa forma, considerando o aumento na produção de ração animal nas últimas décadas e a baixa disponibilidade do fósforo nos cereais e leguminosas, presentes nas rações, levando à necessidade de adição de fósforo inorgânico, que pode aumentar os custos de produção, além de contribuir para a contaminação. ambiental,. faz-se. necessário. estudar. alternativas. para. o. aproveitamento do fósforo naturalmente disponível nestes alimentos, através da produção e extração de enzimas fitases por fungos termofílicos, cuja estabilidade em altas temperaturas, pode possibilitar um maior tempo de armazenamento e reação, resultando em menores custos no produto final..

(21) 19. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 2.1 Fósforo O fósforo encontra-se entre os elementos químicos mais abundantes da natureza e um importante macroelemento das células vivas. É um componente essencial de moléculas importantes como, a adenosina difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP), glicose-6-fosfato, entre outras, que participam de reações específicas nos sistemas biológicos, estando envolvidas no crescimento, divisão e metabolismo das células (ARIF et al., 2018; DIPTA et al., 2019, FERNÁNDEZ; CHÁRRAGA; ÁVILA-GONZALEZ, 2019), bem como na síntese de ácidos nucleicos e fosfolipídios (SATO; JORGE; GUIMARÃES, 2016, BARREIRO; MARTÍNEZ-CASTRO, 2019). No reino vegetal sua atuação não é diferente, sendo extremamente importante para o crescimento das plantas (CHHABRA, 2019). Um suprimento adequado de fósforo estimula a formação inicial de raízes, iniciação de flores, desenvolvimento de sementes e maturação da planta, além de resistência às pragas, por fornecer compostos de alta energia que controlam os processos de fotossíntese, respiração, síntese de proteínas e ácidos nucléicos, transporte de nutrientes através da parede celular, entre outros (DIPTA et al., 2019). Dessa forma, sob o ponto de vista biológico, o fósforo é um dos mais importantes macronutrientes para os organismos vivos, uma vez que é essencial para a grande maioria das biomoléculas (BARREIRO; MARTÍNEZ-CASTRO, 2019) e por estar envolvido em numerosos processos celulares vitais. Sua reserva mundial é de extrema importância para atender a demanda global crescente. de. alimentos,. devido. ao. intenso. crescimento. da. população. (VILLAMIZAR et al., 2019b). Atualmente, o fósforo é o terceiro ingrediente mais caro de rações para aves e suínos (ABBASI et al., 2019), e cada vez mais, maiores quantidades desse mineral têm sido exigidas para satisfazer as crescentes necessidades agroalimentares do mundo. O fósforo é um recurso mineral limitado, baseado em sua disponibilidade no ambiente e na forma como está disponível para as plantas (CHHABRA, 2019), encarecendo ainda mais sua suplementação na ração animal e fertilizantes de plantas nas últimas décadas (VILLAMIZAR et al., 2019b)..

(22) 20. No solo, esse mineral pode ser encontrado sob duas formas: fósforo orgânico e inorgânico (VIEIRA et al., 2019; DIPTA et al., 2019). O inorgânico representa entre 35 a 70% do fósforo total dos solos e é encontrado principalmente em complexos minerais insolúveis (DIPTA et al., 2019), sendo o fosfato bicálcico a forma mais utilizada como suplemento na nutrição de animais, com disponibilidade equivalente a 100% desse mineral (RIBEIRO, 2019). No entanto, as fontes inorgânicas são limitadas e não renováveis, além de ser uma das mais onerosas entre os elementos minerais (RIBEIRO, 2019; VIEIRA et al., 2019; PUPPALA et al., 2019). Apesar disso, continuam amplamente utilizadas na produção animal e vegetal, com reservas economicamente exploradas projetadas para se esgotarem entre os anos de 2060 e 2130 (VIEIRA et al., 2019). Por outro lado, o fósforo orgânico, representando em torno de 20 a 80% do total do solo, é encontrado na forma de fitinas, fosfatos de inositol ou ácido fítico, fosfolipídios, polifosfatos, entre outros, cuja disponibilidade geralmente é baixa, dependendo de vários fatores, como tipo de solo, microrganismos presentes no ambiente, etc. (DIPTA et al., 2019). Nos alimentos, as maiores fontes desse mineral são os vegetais e a água que contêm fósforo (BUJNA, 2014). Nos vegetais, o ácido fítico (mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato) é a principal forma de estoque de fósforo, encontrado principalmente em sementes, raízes e tubérculos, onde é utilizado como fonte de energia para germinação e crescimento (ROSTAMI; GIRI, 2013; DAHIYA, 2016).. 2.2 Ácido fítico Os fosfatos de inositol consistem de um anel de inositol, onde um ou mais grupo hidroxila é substituído por pelo menos um grupo fosfato, sendo a forma mais comum o mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato, onde seis grupos fosfatos se ligam ao anel de inositol, como mostrado na Figura 1 (ROSTAMI; GIRI, 2013, DUONG, LAPSLEY, PEGG, 2018)..

(23) 21. ác fítico. Figura 1 - Estrutura do ácido. Fonte: (PuBChem, 2019). 2.2.1 Nomenclatu nclatura do ácido fítico Na literatura ra podem po ser encontradas diversas nomencla enclaturas aceitas para o. ácido. fítico,. hexaquisfosfato,. pod podendo. ser. denominado. mio-inositol1,2,3,4,5,6 mio. ácido. de. mio-ino inositol. 1,2,3,4,5,6-. hexafosfór fosfórico,. mio-inositol. hexaquisfosfato, Ins (1,2,3,4,5,6)P6, (1 InsP6 ou IP6 (BERWAL; WAL; GOYAL; CHUGH, 2018; CHEN et al., ., 2018; 2 DUONG; LAPSLEY; PEGG,, 2018; 201. ZHU; HONG;. WAKISAKA, 2019). Os fitatos são sais s de ácido fítico, resultantes de sua interação com íons: fitato de cálcio, zinco, inco, magnésio, m potássio ou sódio (DUONG, NG, LAPSLEY, PEGG, 2018; DAHDOUH et al., a 2019). Por ocorrerem simultaneam neamente em diversos alimentos, geralmente ente não n se faz nenhuma distinção de nomen omenclatura para essas duas formas (MONTEIR NTEIRO, 2011). O prefixo “hexaq hexaquis” é usado no lugar de “hexa”, indican ndicando que os grupos fosfatos não são ligados ligado internamente o que torna esse compo omposto um ligante em potencial, com mais ais de um sítio de ligação para átomoss de metal (ROSTAMI; GIRI, 2013). f 2.2.2 Fontess de fitato O fitato é a forma form de armazenamento de fósforo nas plantas, p encontrado em altas concentraçõe trações em sementes, cereais e leguminosas inosas (SINGH, JOSHI, GUPTA, 2013; HUSSA SSAIN et al., 2017; BENINCASA et al.,, 2019 2019, BABATUNDE et.

(24) 22. al., 2019; DAHDOUH et al., 2019), provavelmente servindo como estoque para garantir a efetiva germinação das sementes e crescimento das plantas, utilizando seus próprios nutrientes, incluindo o fósforo armazenado (LEI et al., 2013; DAHDOUH et al., 2019). De maneira geral, o estoque de ácido fítico ocorre na forma de uma mistura de sais, os fitatos, que se encontram quelados a diferentes minerais carregados positivamente. Durante o processo de germinação, a enzima fitase endógena que degrada o fitato, é ativada, liberando o fósforo estocado, mioinositol e minerais para serem utilizados pela planta (BERWAL; GOYAL; CHUGH, 2018). Conforme a quantidade de fitato diminui, a biodisponibilidade de fósforo e outros minerais aumenta. O conteúdo dos principais macroelementos no milho, como sódio, potássio, magnésio, cálcio e fósforo, tende a aumentar após alguns dias do período de germinação, assim como alguns microminerais (BENINCASA et al., 2019). Dessa forma, a maioria dos alimentos vegetais, principalmente os cereais, leguminosas, castanhas e oleaginosas, possui entre 50 a 80% de seu conteúdo total de fósforo na forma de fitato, demonstrando que esta substância funciona como um verdadeiro estoque de fósforo e outros nutrientes para as plantas (SINGH, JOSHI, GUPTA, 2013; HUSSAIN et al., 2017; GOURLEY et al., 2018). No entanto, o conteúdo de fósforo ligado ao inositol nos vegetais varia amplamente, sendo descrito um teor de 30 a 95% para os cereais e leguminosas e uma faixa menor para as oleaginosas e castanhas entre 25 a 75%, mostrando que os cereais e leguminosas são as principais fontes de ácido fítico (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018; ABBASI et al., 2019). Nas plantas, o ácido fítico geralmente se encontra em maior quantidade nas substâncias ou órgãos de reserva, como no caso dos grãos de cereais, castanhas e nozes, cuja maior concentração é observada na camada aleurona da semente e nas leguminosas, onde é encontrado no cotilédone dos grãos (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018; ABBASI et al., 2019; LAMID et al., 2019; VASUDEVAN et al., 2019). A Tabela 1 descreve o conteúdo de ácido fítico em 100 g de peso seco de alguns alimentos (cereais, leguminosas, oleaginosas e castanhas), assim como, o percentual de fósforo total e ligado ao ácido fítico (P-inositol)..

(25) 23. Tabela 1 - Conteúdo de ácido fítico, fósforo total, e fósforo ligado ao inositol em alguns cereais, leguminosas, oleaginosas e castanhas Alimento. Ácido fítico (g/100g) (em peso seco). Total fósforo (%). Total de P-inositol (%). 6,39 2,10 – 7,30 1,14 – 3,91 2,56 – 8,7 0,38 – 1,16 0,42 – 1,16 0,54 – 1,46. 0,33 1,09 0,30 1,78 0,32 0,37 0,36. 0, 21 0,83 0,21 1,41 0,19 0,25 0,24. 0,61 – 2,38 0,22 – 1,22 0,28 – 1,60 0,27 – 1,51. 0,29 0,41 ND ND. 0,08 0,24 ND ND. 1,00 – 2,22 2,15 – 3,69 1,44 – 5,36. 0,73 ND ND. 0,33 ND ND. 3,90 – 4,30. ND. ND. 0,17 – 4,47 0,35 – 9,42 0,20 - 6,69 0,19 – 4,98. ND ND ND ND. ND ND ND ND. Cereais Germe de milho Farelo de trigo Germe de trigo Farelo de arroz Cevada Aveia Centeio Leguminosas Feijão Ervilha Grão de bico Lentilhas Oleaginosas Soja Linhaça Semente de gergelim Farinha de girassol Castanhas Amendoim Amêndoas Nozes Castanha de caju. Fonte: Adaptado de (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019) e (ABBASI et al., 2019) Nota: ND: Conteúdo não determinado. 2.2.3 Efeitos prejudiciais do fitato Embora a presença do fitato seja desejada para a maioria dos alimentos vegetais, por ser uma importante fonte de fósforo e outros nutrientes necessários para seu crescimento e desenvolvimento (BENINCASA et al., 2019; DAHDOUH et al., 2019), o fitato é considerado a principal causa de redução e deficiência de minerais em alimentos e rações derivadas de vegetais, atuando como um fator antinutricional, por se quelar fortemente com íons metais, como Ca2+, Mg2+, Zn2+ e Fe2+(SINGH; JOSHI; GUPTA, 2013; PRIYODIP; PRAKASH; BALAJI, 2017; MAURYA; PARASHAR; SATYANARAYANA, 2017; VASUDEVAN et al., 2019; BENINCASA et al., 2019), além de manganês (BERWAL; GOYAL; CHUGH, 2018; BENINCASA et al., 2019), cobre (SREEDEVI; REDDY, 2012; COBAN; DEMIRCI, 2014), e molibdênio (SREEDEVI; REDDY, 2012), formando complexos mineraisfitato, e assim afetando a absorção de nutrientes para o homem e outros animais.

(26) 24. monogástricos (SINGH; SATYANARAYANA, SAT 2010; MITTAL et al., 2013; BERWAL; GOYAL; CHUGH, H, 2018). 20 A alta carga negativa iva co conferida pela presença dos seis grupos upos fosfato em sua molécula, mesmo em diferentes difere faixas de pH, fornece uma forte rte afinidade afi por nutrientes carregados positivamente, positiv favorecendo assim, a formação form de complexos com íons cátions tions (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018; 018; BERWAL; GOYAL; CHUGH, 2018; BENINCASA BEN et al., 2019), em sua grande grand maioria insolúveis e resistentes à ação aç do trato intestinal em animais is e humanos, reduzindo assim, a disponibilid nibilidade desses nutrientes (KALSI et al., ., 2016; 20 NIU et al., 2017). nega do fitato em diferentes valores de pH, pH também Além disso, a carga negativa confere grande potenciall para interagir com proteínas, carboidratos ratos e lipídios, carregados. positivamente, nte,. reduzindo. a. solubilidade,. funcionalidade, funci. digestibilidade e biodisponibilid ilidade destes nutrientes nos alimentos os (HUSSAIN (HU et al, 2017; DUONG; LAPSLEY; LEY; PEGG, 2018; KUMAR, SINHA, KAJB KAJBAF, 2019; VASUDEVAN et al., 2019) 9) (Figura (Fig 2). No caso das proteínas, essas sas interações podem afetar sua estrutura,, reduzindo red ou inibindo sua atividade (SATO; (SATO JORGE; GUIMARÃES, 2016; MAURY AURYA; PARASHAR; SATYANARAYANA, NA, 2017) e consequentemente, levando ndo à inibição de várias enzimas digestiv igestivas, como tripsina,. amilase,. pepsina, ina,. pancreatina,. lipases,. entre. SATYANARAYANA, 2010; DUONG; DUO LAPSLEY; PEGG, 2018). Figura 2 - Principais ligantes do ácido ác fítico formando o fitato. Fonte: (adaptado de FREIRE et al., al 2008). outras utras. (SINGH;.

(27) 25. Dessa forma, a presença do fitato nos alimentos e rações, pode alterar a secreção de compostos endógenos, como enzimas digestivas, ácido clorídrico (HCl do estômago), mucina, etc., além de formar quelatos com nutrientes essenciais à saúde, levando à redução na sua disponibilidade e consequente, valor nutritivo do alimento (VASUDEVAN et al., 2019). Por outro lado, pesquisas recentes têm demonstrado que o inositol-6P, bem como seus diferentes intermediários produzidos na hidrólise sequencial do fitato estão presentes em grandes proporções nas células eucarióticas e podem desenvolver importantes funções fisiológicas (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018). 2.2.4 Efeitos benéficos do fitato Embora o interesse inicial na ação do fitato tenha sido baseado no seu efeito adverso na absorção de minerais e outras substâncias, esta mesma habilidade em se ligar aos minerais, particularmente ao ferro, tem sido estudada com relação aos efeitos benéficos para o organismo humano, (MAYRINCK JUNIOR, 2014) como sua ação antioxidante e anticarcinogênica (MITTAL et al, 2013; DAHIYA, 2016; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018; KUMAR, SINHA, KAJBAF, 2019). Por este ser um potente inibidor na formação de radicais livres, tornando-os cataliticamente inativos, ao se quelarem ao ferro, mantendo-o na sua forma férrica, o fitato oferece proteção contra danos oxidativos, já que o Fe3+ é a forma mais inerte deste metal, comparada ao Fe2+, que produz oxiradicais e peroxidação de lipídios (MAYRINCK JUNIOR, 2014; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018). Outros efeitos antioxidantes do fitato também já foram reconhecidos, como a inibição na proliferação de células cancerosas, angiogênese e inflamação (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018). O ácido fítico pode ser desfosforilado enzimaticamente, produzindo intermediários de menores tamanhos, como pentafosfato (IP5), tetrafosfato (IP4), trifosfato (IP3) e, provavelmente, o inositol difosfato (IP2), cujos graus de fosforilação determinam em qual proporção a absorção dos minerais pode ser inibida, aumentada, ou não afetada (RAGHAVENDRA; HALAMI, 2009). Os menores fosfatos de inositol (IP1 a IP4) e o próprio mio-inositol têm mostrado diferentes papeis biológicos benéficos (DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018); e o.

(28) 26. efeito negativo na biodisponibilidade de minerais parece estar mais associado ao penta e hexafosfato de inositol (RAGHAVENDRA; HALAMI, 2009). Várias ações benéficas à saúde e efeitos terapêuticos, como redução no risco de câncer de cólon e redução nos níveis sanguíneos de colesterol, triglicérides e glicose; adjuvante no tratamento das doenças de Parkinson, Alzheimer, esclerose múltipla, diabetes e litíase renal já foram estudados e atribuídos a esses compostos, (SINGH; SATYANARAYANA, 2010; BUJNA, 2014; BHAGYAWANT et al., 2018; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018; KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). Alguns. desses. efeitos. possivelmente. promovidos. pelo. fitato. são. frequentemente observados em populações de países em desenvolvimento, que têm como característica comum, uma alimentação baseada em vegetais com grandes quantidades de ácido fítico e que apresentam baixa prevalência nas patologias descritas; diferente do que ocorre em países desenvolvidos, onde essas doenças são comuns e as dietas são ricas em alimentos processados e industrializados, com baixo conteúdo de fitato (MITTAL et al, 2013; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018). Dessa forma, uma nova perspectiva em relação ao ácido fítico e sua ação no organismo, tanto de humanos, quanto animais vêm sendo criada, incentivando o desenvolvimento de pesquisas que envolvam a prevenção de doenças crônicodegenerativas, relacionadas à ação do fitato por impedir a absorção de minerais e desta forma, inibir o acúmulo de substâncias indesejáveis no organismo, como a formação de cristais de hidroxiapatita e consequentemente, a formação de cálculos renais (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). Além disso, deve-se considerar o papel do ácido fítico como a principal reserva de fósforo em sementes e grãos, responsável pelo armazenamento de até 90% desse mineral (SANNI; LAWALA; ENUJIUGHAB, 2019). Atualmente, os cereais e leguminosas são os principais ingredientes de rações animais, sendo o milho e a soja os maiores representantes desse grupo de alimento na maioria das formulações para suínos (VEUM; LIU, 2018) e frangos (ALAGAWANY; ELNESR; FARAG, 2018), tornando o ácido fítico a maior reserva de fósforo para esses animais (ARREDONDO; CASAS; STEIN et al., 2019; CHEN et al., 2019). No entanto, o fósforo ligado ao ácido fítico é muito pouco absorvido pelo trato digestório de animais monogástricos, como os humanos, cachorros, porcos,.

(29) 27. frangos e peixes (ZHANG et al., 2013; BERWAL; GOYAL; CHUGH, 2018), pois enquanto os ruminantes possuem bactérias específicas em seu intestino, que liberam enzimas para degradar o fitato de sua dieta (COBAN; DEMIRCI, 2014), os animais monogástricos não possuem ou produzem de forma deficiente tais enzimas, tornando o fósforo de sua dieta indisponível para absorção (SINGH; JOSHI; GUPTA, 2013; AARHUS UNIVERSITET 2017; BERWAL; GOYAL; CHUGH, 2018; VASUDEVAN, et al., 2019). 2.2.5 Problemas ambientais Para assegurar os requerimentos nutricionais diários de fósforo dos animais, principalmente em áreas de criação intensiva de suínos e frangos, as rações a base de soja e milho vêm sendo enriquecidas com fósforo inorgânico, um mineral não renovável e de alto custo (AARHUS UNIVERSITET 2017; VIEIRA et al., 2019; CHEN et al., 2019). Consequentemente, o fósforo não absorvido ligado ao fitato, bem como o excesso de fósforo inorgânico adicionado às rações, são excretados nas fezes desses animais, causando sérios problemas (ZAREI, 2007; MAURYA; PARASHAR; SATYANARAYANA, 2017), uma vez que no solo encontram-se microrganismos que podem degradar o fitato e, desta maneira, aumentar a liberação de fósforo no ambiente (ZHAO et al., 2007; DAHIYA, 2016). Este fósforo liberado pode ser transportado até mananciais e contribuir para a eutrofização de rios e lagos (GULATI; CHADNA; SAINI, 2007), os quais podem ser utilizados para irrigar áreas de agricultura intensiva (ZHANG et al., 2010). A eutrofização resulta na depleção de oxigênio devido ao crescimento excessivo de microrganismos, em especial as algas que habitam a superfície aquática (DAHIYA, 2016), ocasionando a morte de peixes e outros animais, levando a uma alteração da fauna e da flora local (ROSTAMI; GIRI, 2013; COBAN; DEMIRCI, 2014). Dessa. forma,. considerando. o. efeito. adverso. da. propriedade. antinutricional do fitato, a poluição ambiental crescente em áreas de criação intensiva de animais e o valor oneroso do fósforo inorgânico (VIDYASAGAR et al., 2019; VASUDEVAN et al., 2019; VIEIRA et al., 2019; BRODACKI; BATKOWSKA; DRABIK, 2019), que eleva o custo da ração para cerca de 60 a 70% dos custos da produção pecuária (VASUDEVAN et al., 2019), torna-se necessário encontrar.

(30) 28. alternativas mais eficientes e econômicas para melhorar a utilização do fósforo presente no ácido fítico em dietas a base de cereais e leguminosas. Neste contexto, a adição de enzimas que hidrolisam o fitato, promovendo a liberação do fósforo na ração, tem se destacado (AFIFY et al., 2011). Dentro do mercado de enzimas para alimentação animal, as fitases são as mais comumente utilizadas em rações de aves e suínos, pois têm proporcionado melhor aproveitamento dos nutrientes, melhor digestibilidade das proteínas e consequentemente, redução na contaminação ambiental causada pelo fosfato (MANTRANA, 2015; DERSJANT-LI et al., 2019).. 2.3 Fitases As enzimas fitases ou mio-inositol hexaquisfosfato fosfohidrolase (3-fitase [EC 3.1.3.8], 4- ou 6-fitase [EC 3.1.3.26] e 5-fitase [EC 3.1.3.72] são fosfatases que hidrolisam ligações fosfomonoester do fitato, liberando de forma sequencial grupos fosfatos de diferentes tamanhos (mio-inositol, pentaquis- tetraquis-tris-bise mono-fosfatos, assim como o fosfato inorgânico e inositol) (Figura 3) (GOURLEY, 2017; GESSLER et al., 2018; KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019; SHARIDEH et al., 2019). Figura 3 - Ação da fitase sobre o ácido fítico. 6 PO43-. Fonte: Adaptado de MITTAL et al.(2011).. Apesar da ação da fitase ocorrer diretamente nas ligações onde se encontram os grupos fosfato, ela possui efeito indireto na disponibilidade de outros nutrientes, como proteínas, minerais e carboidratos, por eliminar a propriedade anti-nutricional do fitato, ao hidrolisar o mioinositol hexaquisfosfato (IP6) até IP5 ou IP4 no início do trato digestório (ABBASI et al., 2019; SHARIDEH et al., 2019) (Figura 4)..

(31) 29. Figura 4 – Hidrólise do fitato pela fitase, em inositol e fosfato, liberando micronutrientes, proteínas e amido. Fonte: Adaptado de REDDY et al. (2013).. 2.3.1 Histórico das fitases Estudos com fitase datam de mais de 100 anos, desde a sua descoberta em 1907 (ZHANG et al., 2010; LI et al., 2019), quando foi identificada em grãos de arroz e micélio do fungo Aspergillus niger (GESSLER et al., 2018) quatro anos após a primeira citação científica sobre o ácido fítico, aparecer na literatura (LEI et al., 2013). No entanto, apenas em 1968 sua atividade na hidrólise do fitato foi descrita por Nelson e colaboradores (NELSON et al., 1968; GESSLER et al., 2018; ABBASI et al., 2019), e mesmo após sua descoberta e descrição de sua atividade, por muito tempo, não se deu importância à enzima, devido ao seu alto custo de produção e uso, que competia com os fosfatos inorgânicos (BABATUNDE et al., 2019). Somente no final da década de 1980 a produção de fitase alcançou escala comercial, possibilitando redução no seu custo e viabilizando sua utilização nas dietas de animais monogástricos (SATO, 2015). Mesmo assim, apenas nos últimos 15 anos, com aumento da poluição ambiental e a alta no preço do fosfato inorgânico, as fitases tornaram-se um dos mais importantes suplementos alimentares. para. animais. monogástricos,. (GREINER, 2017; VIEIRA et al., 2019).. principalmente. suínos. e. aves.

(32) 30. Atualmente, cerca de 70% das dietas para aves e suínos contém fitase e seu mercado vem se tornando cada vez mais competitivo, com um crescente número de fitases comercializadas (GREINER, 2017). A primeira fitase comercial produzida pela BASF, foi lançada no mercado em 1991 (MITTAL et al., 2013), possibilitando a redução na excreção de fósforo pelos animais monogástricos (SINGH; JOSHI; GUPTA, 2013). Em 1993, uma fitase produzida por Aspergillus ficuum foi adicionada pela primeira vez na dieta de aves de corte (frangos), obtendo um aumento linear no ganho de peso dos animais e no conteúdo de cinzas dos ossos, concluindo que as aves conseguiram absorver de maneira eficiente, tanto o fósforo do fitato, quanto o fósforo inorgânico (NELSON, 1968; KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). Desde então, como mostrado na Tabela 2, vários outros produtos comerciais vêm sendo lançados no mercado (MITTAL et al., 2013). Tabela 2 - Algumas fitases microbianas comercialmente disponíveis no mercado. Empresa. Origem da Enzima Aspergillus niger. Cepa Produtora Aspergillus niger. Tipo. Subtipo. BASF. Nome Comercial Natuphos®. HAPhy. 3. AB Enzymes. Finase® P/L. Aspergillus niger. Trichoderma reesei. HAPhy. 3. Novozymes. Bio-Feed®. Peniophora lycii. Aspergillus oryzae. HAPhy. 6. Escherichia coli. Schizosaccharomyces. HAPhy. 6. Phytase Dupont Industrial. Phyzyme ®. Biosciences. pombe. Fonte: Adaptado de LEI et al.(2013) e MANTRANA (2015).. 2.3.2 Classificação das fitases Vários critérios são utilizados para a classificação das fitases. Com base em suas diferenças estruturais e mecanismo de ação catalítica, as fitases podem ser classificadas em fosfatases ácido histidina (HAP, fitases ácidas), -propeller fitases (BPP, fitases alcalinas), fosfatases ácido púrpuras (PAP, metaloenzimas) e proteínas fosfatase tirosina (PTP, fitases cisteínas) (BELGAROUI et al., 2016). As HAP são as fitases mais estudadas e utilizadas, sendo as únicas que possuem uma sequência conservada de heptapeptídeo (RHGARAP) e um dipeptídeo (HD) em seu sítio ativo (MAURYA; PARASHAR; SATYANARAYANA,.

(33) 31. 2017; NIU et al., 2017) e hidrolisam fitatos livre de metal com pH ótimo na faixa de 3 a 5 (SULEIMANOVA et al., 2015). Existem dois tipos de fitases ácidas (HAP) encontradas principalmente em microrganismos, sendo uma com ampla variedade de substratos, mas com baixa atividade específica sobre o ácido fítico e outra, com baixa variedade de substratos, mas com alta atividade específica sobre o fitato (SATO, 2015). Essas diferenças podem ser atribuídas, em parte, pela composição variada de aminoácidos no centro de ligação ao substrato, já que o sítio catalítico dessas enzimas é bastante conservado; além de seu tamanho, que parece ser relativamente grande para acomodar vários substratos fosforilados, como AMP (adenosina monofosfato), ATP (trifosfato de adenosina), frutose-1,6-difosfato, glicose-6P, entre outros (SULEIMANOVA et al., 2015). Apesar das fitases ácidas serem a classe de enzimas mais amplamente utilizadas na indústria, algumas desvantagens de seu uso devem ser consideradas, tais como, sua incapacidade de hidrolisar fitato ligado a metais, sua ampla especificidade aos substratos e sua baixa termoestabilidade (CHEN; YU; YE, 2016). As fitases -propeller (BPP) presentes no gênero Bacillus, possuem estrutura molecular de beta-folha e não apresentam nenhuma relação com as HAPs e outras fosfatases: elas requerem o íon Ca2+ tanto para sua atividade, como para termoestabilidade e possuem um pH ótimo na faixa de 7,0-8,0, sendo que não foi demonstrado até o momento fosfatases com esse tipo de estrutura (YAO et al., 2011; SATO, 2015). As fitases alcalinas pertencentes às espécies de Bacillus têm sido uma ótima. alternativa. na. suplementação. de. rações,. devido. a. sua. alta. termoestabilidade, habilidade em hidrolisar fitato ligado a metais e alta especificidade, no entanto, comparada às HAPs, apresentam desvantagem de ter atividade específica muito menor mesmo sob condições ótimas de reação (CHEN; YU; YE, 2016). As fosfatases ácido púrpuras são metaloenzimas, que contém ferro ou zinco em seu sítio catalítico (MONTEIRO, 2011), foram isoladas principalmente de vegetais e possuem uma atividade hidrolítica específica relativamente baixa para o ácido fítico, quando comparadas às fitases ácidas (NAVES, 2009), no entanto, a função destas fosfatases nos vegetais é pouco conhecida (LI et al., 2017). Provavelmente, essa baixa atividade em vegetais seja devido ao processo de.

(34) 32. germinação das sementes necessitar de uma hidrólise mais lenta do ácido fítico por um período de tempo mais prolongado (DAHDOUH et al., 2019). As proteínas fosfatases tirosina (PTPs), são uma nova classe de fitases, recentemente isoladas de várias bactérias anaeróbias do rúmen de gado (NAKASHIMA et al., 2007). As PTPs estão envolvidas na desfosforilação de uma variedade de substratos, com frequente implicação na sinalização celular de vírus (GRUNINGER et al., 2014). Outra classificação bastante conhecida e descrita das fitases leva em consideração o local onde se inicia a desfosforilação do ácido fítico, nas diferentes posições do anel de inositol, podendo ser assim classificadas: - 3-fitases (EC 3.1.3.8, mio-inositol hexaquisfosfato-3-fosfohidrolase): hidrolisa moléculas de ácido fítico na terceira posição de mio-inositol hexaquisfosfato, liberando mio-inositol-1,2,4,5,6-pentaquisfosfato e ortofosfato; -. 5-fitases. (EC. 3.1.3.72,. mio-inositol. hexaquisfosfato-5-fosfohidrolase):. hidrolisa a ligação éster na quinta posição do mio-inositol hexaquisfosfato, liberando mio-inositol-1,2,3,4,6-pentaquisfosfato e ortofosfato; - 6-fitases (EC 3.1.3.26, mio-inositol hexaquisfosfato-6-fosfohidrolase): quebra a ligação éster do mio-inositol hexaquisfofasto na sexta posição, liberando mio-inositol-1,2,3,4,5-pentafosfato e ortofosfato. (KUMAR, SINHA, KAJBAF, 2019). O maior grupo das fitases, pertence às 3-fitases, isoladas de fungos e bactérias (MONTEIRO, 2011). De um modo geral, as 6-fitases são classificadas como enzimas vegetais e as 3-fitases, enzimas microbianas (SULEIMANOVA et al., 2015). Entretanto, fitases de Escherichia coli e Peniophora lycii são exceções, pois constituem 6-fitases (NAVES, 2009). As 5-fitases foram isoladas de alfafa, feijão, ervilha e de bácterias presentes no rúmen, as Selenomonas ruminantium (YAO et al., 2011). Fitases também podem ser classificadas de acordo com seu pH ótimo de atividade, podendo ser agrupadas em fitases ácidas, que incluem as enzimas fosfatase ácida histidina (HAPs), fosfatases ácida púrpura (PAPs) e proteínas fosfatases tirosina (PTP). As enzimas de Bacillus, as -propeller (BPPs) são as únicas classificadas como fitases alcalinas (YAO et al., 2011)..

(35) 33. 2.3.3 Aplicações das fitases Atualmente, a principal aplicação das enzimas fitases é, sem dúvida, na indústria de rações animais, devido a sua capacidade em degradar o ácido fítico, liberando fósforo. Cerca de 70% das enzimas comerciais usadas para nutrição animal são fitases, que acumulam uma receita anual em torno de US$ 350 milhões (GREINER, 2017; MAURYA; PARASHAR; SATYANARAYANA, 2017). A ação da fitase permite a utilização do mineral fósforo, presente naturalmente nos cereais e leguminosas (base alimentar das rações), uma vez que este se encontra ligado. ao. fitato. e,. portanto,. indisponível. para. absorção.. Em. animais. monogástricos esta enzima está ausente ou em quantidade insuficiente, levando à excreção de todo o ácido fítico contido na ração no ambiente, bem como, o fósforo inorgânico adicionado em excesso como suplemento (BUJNA, 2014; TINH; DIEP; GIANG, 2014; CHEN; YU; YE, 2016). A suplementação de rações animais com a fitase reduz os custos finais da dieta, por diminuir a necessidade de adição de fósforo inorgânico e aumentar a biodisponibilidade do fósforo naturalmente presente para digestão (OLSTORPE; SCHNÜ RER; PASSOTH, 2009; SREEDEVI; REDDY, 2012; CHAROENRAT et al., 2016). Além da preocupação com os custos da ração animal, mais recentemente, a adição de fitase tem sido feita também com o objetivo de reduzir o nível de poluição ambiental acarretada pelo excesso de fósforo excretado em áreas de criação intensiva de animais, visto que a enzima favorece a utilização do fósforo fítico e consequentemente, reduz sua eliminação fecal em até 50% (HUSSIN et al., 2007; YIN et al., 2007; YAO et al., 2011; SINGH; JOSHI; GUPTA, 2013; LEI et al., 2013; DE OLIVEIRA et al.; 2014; NUGE et al., 2014). De acordo com Lei et al. (2013), a importância dessa redução, pode ser observada quando se considera, por exemplo, a produção anual em torno de 60 milhões de porcos nos Estados Unidos e a excreção média de 1,23 kg de fósforo no ambiente por cada animal, durante todo seu ciclo de vida. Essa importância é ainda mais elevada, quando se destaca que os benefícios descritos servem também para a criação de aves e peixes. As fitases possuem grande potencial para aplicação em diferentes setores industriais, como na nutrição animal, alimentação humana, aquicultura e farmácia (SATO;. JORGE;. GUIMARÃES,. 2016),. pois. além. de. melhorarem. a.

(36) 34. biodisponibilidade do fósforo, possibilitam um melhor aproveitamento de aminoácidos, proteínas e outros minerais que se ligam ao ácido fítico, além de potencializar o valor energético da dieta (MAZZOLA, 2017). A aplicação da fitase na alimentação de humanos está sendo considerada tão importante quanto a observada nas rações animais, considerando a grande capacidade quelante do ácido fítico, que pode gerar possíveis e graves deficiências de minerais essenciais à saúde humana, como ferro, zinco e cálcio, principalmente em populações onde a base da alimentação são os vegetais, como é o caso dos vegetarianos e veganos, ou mesmo populações de países em desenvolvimento, que consomem grande quantidade de vegetais (TROESCH et al., 2011; LEI et al., 2013; BUJNA, 2014). A fitase também pode ser usada em fórmulas infantis e alimentos processados a base de cereais (LEI et al., 2013). Estudos demonstraram que a adição de fitases em alimentos aumenta significativamente a digestibilidade de proteínas e melhora a utilização de fósforo, cálcio e ferro (MITTAL et al., 2013). Recentemente, outros efeitos benéficos da fitase vêm sendo descritos, em função da liberação sequencial de mio-inositol fosfatos de diferentes tamanhos, durante a hidrólise do ácido fítico. Esses intermediários têm demonstrado diversos efeitos terapêuticos e farmacológicos à saúde humana (SREEDEVI; REDDY, 2012; BUJNA, 2014; NUGE et al., 2014), tais como, prevenção de complicações do diabetes (SREEDEVI; REDDY, 2012), efeitos anti-inflamatórios, antiangiogênicos, antitumorais (SREEDEVI; REDDY, 2012; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018) e efeitos antioxidantes (BHAGYAWANT et al., 2018; DUONG; LAPSLEY; PEGG, 2018). Também foi relatado associação desses intermediários na redução do risco de câncer de cólon e nos níveis de colesterol e triglicérides sanguíneos em testes com animais (BUJNA, 2014). O número e a posição dos resíduos de fosfato nos intermediários do ácido fítico, liberados durante a sua hidrólise, determinam o efeito de cada um dos isômeros de mio-inositol (KUMAR, SINHA, KAJBAF, 2019), mas é certo que, cada vez mais o uso da fitase vem demonstrando excelentes perspectivas de atuação na saúde humana e medicina (LEI et al., 2013).Como exemplo, no estudo de Pagano et al. (2007) foi testada a suplementação de fitase na alimentação de porcos jovens, com o objetivo de verificar sua ação na formação da massa óssea em humanos, uma vez que os suínos são utilizados como modelos para pesquisa.

(37) 35. de osteoporose e demonstraram que a enzima pode ser eficaz para tratar ou prevenir essa doença. Maller et al. (2016), analisaram a suplementação de fitases de Aspergillus japonicus na mineralização e fortalecimento ósseo em frangos e demonstraram que a enzima favoreceu a formação da estrutura óssea e desempenho dos frangos, uma vez que os ossos fortalecidos resultaram em um aumento no desenvolvimento muscular, mostrando que a fitase foi eficaz em fornecer fosfato e outros minerais presentes na dieta. Koshy et al. (2012), analisaram em 77 pessoas o efeito da suplementação de zinco e fitase, no tempo de efeito da toxina botulínica no tratamento estético facial e observaram aumento na duração do tratamento de espasmos, hemifacial, blefarospasmo ou tratamentos cosméticos de rugas. Outras aplicações da fitase são na indústria de papel e polpa (SREEDEVI; REDDY, 2012), e de produção e processamento de biocombustíveis (LEI et al., 2013). Deste modo, é possível observar que a utilização de fitases oferece inúmeros benefícios, mas de uma forma geral, três deles são mais importantes: o aumento da biodisponibilidade de fósforo e minerais na dieta de animais, preservação de fósforo inorgânico de fontes não renováveis e de alto custo e a redução na poluição do ambiente, incentivando cada vez mais o desenvolvimento de pesquisas que busquem novas formas e fontes de obtenção da enzima (MONTEIRO et al., 2015). 2.3.4 Fontes de fitases Fitases são amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em plantas, animais e microrganismos (HUSSIN et al., 2007; RAGHAVENDRA; HALAMI, 2009; RANI; GHOSH, 2011; YAO et al., 2011; SREEDEVI; REDDY, 2012; BUJNA, 2014; SULEIMANOVA et al., 2015; NIU et al., 2017). O crescente mercado da fitase, gerado pelas suas inúmeras e importantes aplicações, tem impulsionado a busca por uma boa fonte da enzima, que possa atender aos diversos processos industriais (HUSSIN et al., 2007) e para isso uma grande variedade de tecidos animais, vegetais e microrganismos vem sendo prospectados (QUAN, et al., 2001; YAO et al., 2011), objetivando isolar e caracterizar novas fitases de diferentes fontes (KALSI et al., 2016)..