NOVA Lite
®
Para Utilização em Diagnóstico In Vitro
ANCA (Formalin) Kit with DAPI
Código do produto: 708300
Complexidade CLIA: ElevadaUtilização prevista
Este produto destina-se a ser utilizado no rastreio e na titulação de anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA) circulantes. Estes anticorpos são marcadores para o diagnóstico e tratamento de granulomatose de Wegener e outras vasculites sistémicas.1
Resumo e Explicação do teste
Estas vasculites necrotizantes, incluindo Granulomatose com Poliangite (anteriormente conhecida por granulomatose de Wegener13), poliarterite nodosa, síndroma de Churg-Strauss, glumerulonefrite crescente idiopática e vasculite sistémica "sobreposta" são um grupo de doenças relacionadas que variam consideravelmente na sua apresentação clínica e provocam, consequentemente, problemas de diagnóstico. A Granulomatose com Poliangite é uma doença vascular grave caracterizada por granulomas necrotizantes do trato respiratório e glomerulonefrite focal. O diagnóstico atempado é importante uma vez que a terapia com imunossupressores rápida tem um efeito importante no resultado renal, mas, muitas vezes, os sintomas iniciais na apresentação e no exame histológico através de biopsias não são específicos.2
Em 1982 Davies et al descreveu a presença de anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA) no soro de doentes com glumerulonefrite necrotizante.3 Foi seguida por uma publicação em 1985 de van de Woude
et al que descobriu que, de 27 doentes com granulomatose ativa com poliangite, 25 exibiram o padrão de
coloração citoplasmática clássico (c-ANCA) em imunofluorescência indireta.1 O padrão c-ANCA clássico em neutrófilos fixados em etanol mostra coloração citoplásmica granular característica com coloração mínima dos lobos nucleares. O principal antigénio alvo c-ANCA é a proteinase 3, uma serina protéase.
Um segundo padrão de coloração ANCA (perinuclear, p-ANCA) foi descrito em 1988 por Falk et al em doentes renais com vasculite sistémica.4 Pensa-se que o maior antigénio alvo c-ANCA seja o mieloperoxidase, apesar de muitos outros antigénios (por exemplo, lactoferrina, elastase, catepsina G) estarem associados num grau inferior. O padrão p-ANCA em neutrófilos fixados em etanol mostra coloração perinuclear muito bem delineada.
Muitas amostras enviadas pelo teste ANCA serão também positivas para anti-dsDNA, anti-histónicas e outros auto-anticorpos (ANA) que conseguem imitar o padrão de coloração p-ANCA. Amostras de doentes positivas para ANA podem também ser positivas para p-ANCA. Obviamente, é importante distinguir c-ANCA verdadeiros e padrões de coloração p-ANCA de outros artefactos não-ANCA. Isto consegue-se utilizando uma combinação de lâminas neutrófilas fixadas com formalina e fixadas com etanol.
Fixação de etanol de resultados de neutrófilos nas proteínas dos grânulos citoplásmicos carregadas positivamente que migram para o ADN carregado negativamente do núcleo, resultando numa coloração perinuclear (p-ANCA).5 Se os neutrófilos forem tratados com um fixador de ligação cruzada como a formalina, evita-se esta migração e os grânulos citoplásmicos permanecem no citoplasma e as amostras p-ANCA verdadeiras indicarão um padrão de coloração c-p-ANCA citoplásmico granular em lâminas fixadas com formalina. As amostras positivas de ANA, quando testadas com neutrófilos fixados com formalina, tornam-se negativas ou apresentam uma intensidade de coloração muito reduzida. As amostras específicas ANA (GS– ANA) de granulócitos que produzam uma reação perinuclear ou nuclear em neutrófilos fixados com etanol ficarão negativas quando testadas em neutrófilos fixados com formalina.
A imunofluorescência indireta em lâminas de neutrófilos é o método de eleição para rastreio de ANCA. As lâminas INOVA utilizam neutrófilos humanos purificados que são preparados e fixados para conseguir padrões ótimos de coloração. As amostras positivas ANCA, ANA e com padrões de coloração atípicos devem ser tituladas.
Princípios do procedimento
Este produto utiliza uma técnica de imunofluorescência indireta6. As amostras de doentes e controlos adequados são incubados com o substrato de neutrófilo. Os anticorpos sem reação são lavados e, em seguida, aplica-se um conjugado adequado marcado com fluoresceína. O conjugado não ligado é lavado como anteriormente. As lâminas são observadas com um microscópio de fluorescência e as amostras positivas são observadas como florescência verde maçã, correspondente a áreas do neutrófilo onde se encontrou o anticorpo.
Reagentes
1. ANCA (Formalina), lâminas QR - 12 poços/lâmina, com dessecante 2. Conjugado IgG FITC com DAPI, contendo 0,09 % de azida de sódio
3. cANCA Positivo, 1 frasco de tampão contendo 0,09 % de azida de sódio e anticorpos de soro humano para antigénios cANCA, pré-diluído
4. pANCA Positivo, 1 frasco de tampão contendo 0,09 % de azida de sódio e anticorpos de soro humano para antigénios pANCA, pré-diluído
5. Controlo Negativo Sistema IFA, 1 frasco com solução tampão contendo 0,09% de azida de sódio e sem anticorpos de ANCA de soro humano pré-diluídos.
6. Concentrado PBS II (40x)
7. Meio de Montagem, contendo 0,09 % de azida de sódio 8. Lamelas
Advertências
1. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos de HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum método de teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de VIH, VHB, VHC ou outros agentes infecciosos. Portanto, o pANCA Positivo, o cANCA Positivo e o Controlo Negativo do Sistema IFA devem ser manipulados da mesma forma que qualquer material potencialmente infeccioso.14
2. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de canalizações de chumbo ou cobre formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias.
3. Usar equipamento de proteção individual apropriado para trabalhar com os reagentes fornecidos. 4. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações
ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos.
Precauções
1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro.
2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes.
3. A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de
processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis.
5. Uma grande variedade de fatores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Estes incluem a temperatura inicial dos reagentes, a resistência da lâmpada do microscópio usada, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e a duração dos tempos de incubação durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis.
6. Com o tempo, a cor do conjugado pode alterar-se devido à exposição à luz. No entanto, a alteração da cor não afeta o desempenho do ensaio.
Condições de conservação
1. Conservar todos os reagentes do kit a 2-8 °C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada no rótulo da caixa, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo.
2. Quando remover as lâminas de uma embalagem de proteção, deve utilizá-las imediatamente. 3. A solução tampão PBS pode ser armazenada até um mês a 2-8 °C.
4. Sempre que possível, os conjugados do kit deverão ser mantidos ao abrigo da luz solar, fluorescente ou U.V.
Colheita da amostra
Este procedimento deve ser efetuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação microbiana, que sofreram tratamento térmico ou que contêm partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras de soro muito hemolizadas ou lipémicas devem ser evitadas. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A4 da CLSI (anteriormente NCCLS) recomenda as seguintes condições de conservação para as amostras: 1) Não conservar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8 °C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a -20 °C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Deve evitar-se o congelamento e descongelamento sucessivo.
Procedimento
Materiais fornecidos
708300
20 ANCA (Formalina), lâminas QR - 12 poços 1 15 mL Conjugado IgG FITC com DAPI 1 0,5 mL cANCA Positivo
1 0,5 mL pANCA Positivo
1 0,5mL de Controlo Negativo do Sistema IFA 2 25 mL Concentrado PBS II (40x)
1 7 mL Meio de Montagem 1 20 Lamelas
1 Folheto de Instruções
Material adicional necessário mas não fornecido
1. Água destilada
2. Recipiente de 1L (para diluir o PBS) 3. Micropipetas e pontas descartáveis 4. Câmara húmida
5. Frascos de apertar ou pipetas Pasteur
6. Frasco Coplin
7. Microscópio fluorescente
Método
Antes de iniciar
1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 °C) e ser bem misturados.
2. Diluir o Concentrado PBS: IMPORTANTE: Diluir o Concentrado PBS 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do Concentrado PBS a 975 mL de água destilada ou desionizada e misturar cuidadosamente. Utiliza-se a solução tampão PBS para diluir amostras do doente e como um tampão de lavagem. Pode conservar-se a solução tampão diluída durante 4 semanas a 2-8 °C.
3. Diluir as Amostras do Doente:
a. Rastreio inicial: Diluir as amostras do doente a 01:20:00 com solução tampão PBS diluído (ou seja, adicionar 50μL de soro a 950μL de solução tampão PBS).
b. Titulação: Fazer duas vezes diluições de série a partir da diluição de teste inicial para todas as amostras positivas com solução tampão PBS (ou seja, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc.). Por exemplo: Retirar 100μL da diluição 1:20, misturar com 100μL de PBS para obter uma diluição 1:40. Repetir para mais diluições.
Procedimento de Ensaio
3. Lavagem das Lâminas: Após a incubação, utilizar um frasco de plástico de apertar ou pipetar para lavar suavemente o soro com solução tampão PBS diluída. Oriente a lâmina e o fluxo de solução tampão PBS de forma a minimizar a lavagem de amostras entre poços. Evitar dirigir o fluxo diretamente para os poços para evitar causar danos ao substrato. Se desejar, colocar as lâminas num frasco Coplin de solução tampão PBS diluída até 5 minutos.
4. Adição de Conjugado Fluorescente: Agitar a solução tampão PBS em excesso. Colocar novamente a lâmina na câmara húmida e cobrir imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incubar as lâminas durante mais 30 + 5 minutos no escuro.
5. Lavagem das Lâminas: Repetir o Passo 3.
6. Lamela: Os procedimentos com lamelas variam de laboratório para laboratório; no entanto, recomenda-se o procedimento seguinte:
a. Colocar uma lamela sobre um guardanapo de papel.
b. Aplicar meio de montagem numa linha contínua na extremidade inferior da lamela.
c. Agitar a solução tampão PBS em excesso e tocar com a extremidade inferior da lâmina na extremidade da lamela. Baixar suavemente a lâmina sobre a lamela, de forma que o meio de montagem corra para a extremidade superior da lâmina sem formação ou bloqueio de bolhas de ar.
7. Observar as lâminas ao microscópio de fluorescência: As lâminas terminadas devem ser armazenadas a 2-8 °C e observadas logo que possível.
Controlo de qualidade
Um controlo positivo (cANCA Positivo ou pANCA Positivo) e o Controlo Negativo Sistema IFA devem ser testados em todas as lâminas para garantir que todos os reagentes e procedimentos são realizados de forma adequada. Outros controlos adequados podem ser preparados efetuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -70 °C. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, os resultados do teste devem ser considerados inválidos e o ensaio repetido.
1. O cANCA Positivo não diluído tem de ser > 3+. 2. O pANCA Positivo não diluído tem de ser > 3+.
3. O Controlo Negativo do Sistema IFA tem de ser negativo.
Se os controlos não aparecerem como descritos, o teste é considerado inválido e deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
Reatividade negativa. Uma amostra é considerada negativa se a coloração nuclear e citoplásmica específica for igual ou inferior ao Controlo Negativo do Sistema IFA. As amostras podem exibir vários graus de coloração de fundo devido aos anticorpos heterófilos ou a auto-anticorpos de nível baixo para constituintes citoplásmicos, como as proteínas contráteis.
Reatividade Positiva. Uma amostra é considerada positiva se se verificar que a coloração citoplásmica específica, conforme descrita abaixo, é superior ao controlo negativo e que a intensidade da coloração é 1+ ou superior.
Determine o grau de fluorescência ou a intensidade utilizando estes critérios: 4+ Fluorescência verde maçã brilhante
3+ Fluorescência verde maçã viva
2+ Fluorescência positiva manifestamente distinta
1+ Fluorescência específica mais baixa que permita à coloração nuclear e/ou citoplásmica ser claramente diferenciada da fluorescência de fundo
Interpretação do Padrão. Podem exibir-se vários padrões de coloração citoplásmica, dependendo dos tipos e das quantidades relativas de auto-anticorpos presentes na amostra. Podem observar-se os seguintes tipos de padrões de coloração:
Coloração cANCA ou citoplásmica: Lâminas fixadas com formalina, amostras c-ANCA positivas exibirão
fluorescência citoplásmica granular generalizada. Este padrão é normalmente produzido por anticorpos que reagem com a enzima granular primária Serina Protéase 3 (PR3) ou mieloperoxidase (MPO).
U
Coloração nuclear
Em lâminas fixadas com formalina, a maior parte dos antigénios nucleares, foi destruída. Assim, as amostras ANA positivas exibirão fluorescência negativa ou muito reduzida no núcleo.
Limitações do procedimento
1.
Amostras inativadas pelo calor, hemolizadas, com contaminação microbiana ou desfibrinadas de forma incompleta podem provocar coloração elevada do fundo e dificultar a interpretação. Obtenha uma amostra nova e volte a testar. Adicionar albumina 2 % ou soro de bovino ao tampão PBS utilizado para diluir amostras pode reduzir a coloração de fundo de amostras problemáticas.2.
Resultados IFA positivos devem ser confirmados por imuno-ensaios enzimáticos de mieloperoxidase (MPO) e proteinase 3 (PR3) (EIA).P11,12
P
Lâminas ANCA fixadas com formalina podem também contribuir para a determinação de especificidade de auto-anticorpos, especialmente em amostras de título moderado a elevado.
3.
Nem sempre as amostras ANCA positivas podem ter resultado positivo para mieloperoxidase (MPO) ou proteinase serina 3 (PR3) utilizando EIA, uma vez que vários antigénios granulados primários podem ser responsáveis por padrão de coloração positivo p- ou c-ANCA. Estes incluem elastase, lactoferrina, catepsina G, proteína catiónica 57 e outros como antigénios neutrófilos ainda não identificados.4.
Os anticorpos anti-músculo liso (actina) podem reagir com os neutrófilos humanos fixados com formalina bem como com os aloanticorpos como Mart ou NB175.
As amostras podem conter mais do que um anticorpo, por exemplo, c-ANCA e p-ANCA ou c-ANCA e ANA.. A actina ou os anticorpos de músculo liso reagem com citoplasma de neutrófilos proporcionando um padrão de coloração c-ANCA homogéneo e não um padrão de coloração com salpicado grosso típico. Os aloanticorpos reagem também com o citoplasma de neutrófilos proporcionando um padrão de coloração com salpicado fino. Tipicamente, apenas 40 % das células ou menos ficará fluorescente.
6.
Os anticorpos reativos de neutrófilos podem também ser encontrados no soro de doentes com doença inflamatória intestinal ou colite ulcerosa87.
A utilização de reagentes de outros tipos de kits de anticorpos fluorescentes (especialmente conjugados) pode afetar de forma adversa a sensibilidade e a especificidade das lâminas de substrato de neutrófilo fixado em etanol.. Em lâminas neutrófilas fixadas com etanol, estas amostras aparecem como um padrão p-ANCA com coloração perinuclear muito acentuada. Em lâminas neutrófilas fixadas com formalina, estas amostras parecem negativas ou proporcionam uma fluorescência muito reduzida.
8.
A fonte de luz, os filtros e as lentes de diferentes fabricantes de microscópio de fluorescência influenciarão a sensibilidade do kit. O desempenho do microscópio é significativamente influenciado pela manutenção correta, especialmente a centragem da lâmpada de vapor e pela substituição da lâmpada após o período de tempo recomendado.9.
Para rotular as lâminas só pode usar-se um lápis. A utilização de qualquer outro utensílio de escrita pode causar coloração artifatual.10.
Todos os frascos Coplin usados para lavagem da lâmina não deverão conter qualquer resíduo de corante. A utilização de frascos Coplin com resíduos de corante pode causar coloração artifatual.11.
Por si só, este teste não deve ser considerado um diagnóstico. Deve ter também em consideração todos os outros fatores, incluindo o histórico clínico do doente e outros resultados de biópsia ou serológicos.12.
As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro.Características de desempenho
Valores esperados
% positivo
Grupo de doentes N.º p-ANCA c-ANCA
Pessoas saudáveis 30 0 0
Doença de Crohn 80 25 0
Colite ulcerosa 46 46 0
Colangite esclerosante primária com doença inflamatória intestinal 17 58 0
Cirrose biliar primária 25 28 0
Hepatite autoimune 15 33 0
Granulomatose de Wegener 30 0 100
Poliarterite nodosa * 5 0 100
Todas as informações acima derivaram de Seibold et al9, exceto as assinaladas com *, que foram obtidas através de estudos internos na The Binding Site Ltd.
Precisão
Testaram-se nove vezes dez soros de doentes (três p-ANCA positivos, três c-ANCA positivos, dois ANA positivos e dois negativos) (em triplicado em três lotes de kits à parte). O padrão de coloração para cada amostra diferiu em não mais do que uma unidade de coloração (com base numa escala de 1+ (coloração mais fraca) a 3+ (coloração forte)).
Estudo de comparação
Testaram-se 100 amostras de soros clínicos e 40 soros de adultos dadores normais (20 homens, 20 mulheres) no kit combi ANCA da Binding Site e num kit de lâminas da concorrência. Os resultados foram os seguintes:
The Binding Site
C o n c o rr ê n c
ia c-ANCA p-ANCA ANA Neg. p-/c-ANCA
c-ANCA 60 3 0 0 0
p-ANCA 3 27 0 0 0
p-/c-ANCA 0 0 0 0 1
Referências
1. Van der Woude F.J. et al (1985) Autoantibodies against neutrophils and monocytes: Tool for diagnosis and marker of disease activity in Wegener’s granulomatosis. Lancet I, 425-9.
2. Goeken J. A. (1991) Antineutrophil cytoplasmic antibody – a useful serological marker for vasculitis, J. Clin. Immunol. 11, 161-174.
3. Davies D. J. et al (1982) Segmental necrotizing glomerulonephritis with antineutrophil antibody: possible arbovirus aetiology? Br. Med. J. 285, 606.
4. Falk R. J. and Jenette J. C. (1988) Antineutrophil cytoplasmic auto antibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic neutotizing and crescentic glomerlonephritis N. Engl. J. Med. 318, 1651-7.
5. Charles L. A., Falk R. J. and Jenette J. C. (1989) Reactivity of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with HL-60 cells. Clin. Immunol. Immunpathol. 53, 243-253.
6. Weller T. H. and Coons A. H. (1954) Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med 86, 789-794.
7. Stroncek D. F. et al (1993) Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false – positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am. J. Kidney Dis. 21, 368-373.
8. Hardarson S. et al (1992) Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99, No. 3.
9. Seibold, F. et al (1992) Clinical significance of antibodies against neutrophils in patients with inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis. Gut 33, 657-662.
10. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3rd
11. Savige J, Gillis D, Benson E, Davies D, Esnault V, Falk RJ, Hagen EC, Jayne D, Jennette JC, Paspaliaris B, Pollock W, Pusey C, Savage CO, Silvestrini R, van der Woude F, Wieslander J, Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) Am J Clin Pathol. 1999 Apr;111(4):507-13. Review.
Edition) 2004. Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
12. Savige J, Dimech W, Fritzler M, Goeken J, Hagen EC, Jennette JC, McEvoy R, Pusey C, Pollock W, Trevisin M, Wiik A, Wong R; International Group for Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases. Am J Clin Pathol. 2003 Sep;120(3):312-8. Review.
13. Falk R.J., Gross W.L., Guillevin L, Hoffman G.S., Jayne DR, Jennette J.C., Kallenberg C.G., Luqmani R., Mahr A.D., Matteson E.L., Merkel P.A., Specks U., Watts R.A. (2011) Granulomatosis with polyangiitis (Wegener's): an alternative name for Wegener's granulomatosis. Arthritis Rheum. 63(4), 863-4.
14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition
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