Arapongas - Paraná 2017
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO
EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES
JOICE LOURES GUERRA
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Neospora caninum EM
SOROS DE BOVINOS ABATIDOS NA REGIÃO NORTE DO
Ficha catalográfica elaborada, com dados fornecidos pelo (a) autor (a) BibliotecaUNOPAR / Arapongas- Maria Luci JulianiGranoCRB – 9/776
GUERRA, JOICE LOURES
Detecção de anticorpos anti-neospora caninum no soro de bovinos abatidos na região norte do Paraná. Arapongas: UNOPAR, 2017. 45p.
Orientador: João Luis Garcia.
Dissertação (Mestrado)UNOPAR/UEL -Medicina Veterinária - Saúde e Produção de Ruminantes, 2017.
1. Medicina Veterinária- Dissertação de mestrado – UNOPAR/UEL.2. Saúde e Produção de Ruminantes.3. Bovinos -Reação da Imunofluorescência Indireta (RIFI).4.Bovino de corte - anticorpos anti-N. caninum. 5. Sorologia. I. Garcia, João Luis II. Titulo.
Arapongas - Paraná 2017
JOICE LOURES GUERRA
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Neospora caninum EM
SOROS DE BOVINOS ABATIDOS NA REGIÃO NORTE DO
PARANÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.
JOICE LOURES GUERRA
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Neospora caninum EM
SOROS DE BOVINOS ABATIDOS NA REGIÃO NORTE DO
PARANÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Dr. João Luis Garcia
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________ Prof. Dr. Alexey L. G. Bogado
Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Dr. Andreas Lazaro Chryssafidis
Universidade Estadual de Londrina
Dedico aos meus pais, meus irmãos e ao meu marido e filhos, por quem tenho profundo
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo dom da vida e por estar sempre guiando meu caminho.
Aos meus pais Ana Rita de Mello Loures Guerra e Sidnei Dutra Guerra, que sempre me incentivaram e estiveram ao meu lado, contribuindo para que tudo isto tornasse possível.
Aos meus irmãos Geisi e Antonio, que me ajudaram muito neste mestrado. Ao meu marido Anderson Barbieri que sempre me incentivou e compreendeu neste 2 anos de estudos e aos meus filhos Mariana Guerra Barbieri e Gabriel Guerra Barbieri .
À Camila Zanette que sempre me incentivou e obrigada pele enorme ajuda na estatística.
Ao meu orientador Prof. Dr. João Luis Garcia, pela oportunidade, orientação, atenção, paciência, compreensão, ensinamentos e confiança em mim depositada.
Aos professores, Prof. Dr. Werner Okano e Prof. Dr. Alexey Leon Bogado, que sempre estiveram dispostos a me ajudar e esclarecer dúvidas durante todo período acadêmico.
Agradeço ao Silvio, Veronez e ao Marcos Vinicius pela disponibilidade de tempo e pela ajuda no decorrer do projeto. Em especial a Daniela Furlan pela imensa ajuda neste projeto.
Aos funcionários do Laboratório de Protozoologia, Beatriz e Isabelly pela imensa ajuda, atenção e paciência.
Agradeço a toda minha família, pais, irmãos e marido pela enorme ajuda em meu experimento. E a todos que de alguma forma contribuíram por esta conquista.
"Determinação coragem e autoconfiança são fatores decisivos para o sucesso. Se estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superá-los. Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho."
GUERRA, Joice Loures. Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum no
soros de bovinos abatidos na região norte do Paraná. 2017. 45 f. Dissertação de
Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes (Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2017.
RESUMO
O N. caninum, parasita de hábito intracelular obrigatório, ganhou grande importância principalmente por estar associado aos abortos na cadeia produtiva de bovinos. Apresentando distribuição mundial, é responsável por grandes perdas econômicas, aparece de forma silenciosa e pode acometer todo o rebanho, caso medidas de prevenção e controle não forem instituídas. A neosporose bovina tem como hospedeiro definitivo, basicamente, o cão doméstico e os bovinos como hospedeiro intermediário. Sua patogenia não é claramente conhecida, mas sabe-se que o bovino é infectado quando ingere fezes com oocistos eliminadas pelos cães. A prevalência pode variar geograficamente, por questões de manejo, tamanho do rebanho e da propriedade. Técnicas sorológicas são de suma importância para o conhecimento da soropositividade ou não do rebanho e desta forma, implementar medidas profiláticas e fazer o controle da doença, como o descarte adequado de restos fetais. Uma das técnicas laboratoriais mais acessíveis é a técnica de imunofluorescência indireta, permitindo a detecção de anticorpos anti-N. caninum. O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos abatidos na região norte do Paraná. Foram coletadas no total de 401 amostras de sangue, 281 amostras no município de Rolândia - Pr e o restante no municipio de Borrazopolis - Pr, durante os meses de abril de 2015 e novembro de 2016, sendo 289 amostras de fêmeas e 112 amostras de machos, na faixa etária de um ano e meio até oito anos de idade. Após a obtenção do soro, foi encaminhado para a realização da Reação da Imunofluorescência Indireta (RIFI), e o ponte de corte utilizado foi de 1:100 para detecção da imunofluorescência periférica completa. Em seguida foram tabulados para análise estatística (Testes exato de Fisher e do Qui-Quadrado, P≤0,05). A análise mostrou que das 401 amostras, 37 foram positivas para o N. caninum, indicando uma prevalência de 9,23%. Das 37 amostras positivas 9 (8,04%) foram de machos e 28 (91,96%) de fêmeas. Embora a amostragem de fêmeas tenha sido maior se comparada aos machos, não apresentou diferença. Os títulos encontrados nos animais soropositivos foram 1:100 (16), 1:200 (14) e 1:400 (7). Contudo, as variáveis sexo, idade e local não diferiram estatisticamente (P>0,05). Concluiu-se que, houve a detecção de anticorpos anti-N. caninum nos bovinos da região Norte do Paraná.
GUERRA, Joice Loures. Detection of anti-Neospora caninum antibodies in sera
from cattle slaughtered in the north region of Paraná. 2017. 45 f. Dissertação de
Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes (Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2017.
ABSTRACT
N. caninum, a parasite of obligate intracellular habit, has gained great importance
mainly because it is associated with abortions in the productive chain of cattle. Featuring worldwide distribution, it is responsible for large economic losses, appears silently and can affect the entire herd if prevention and control measures are not instituted. Bovine neosporosis has the definitive host, basically, the domestic dog and the cattle as intermediate host. Its pathogenesis is not clearly known, but it is known that the bovine is infected when it ingests feces with oocysts eliminated by the dogs. The prevalence may vary geographically, due to management issues, herd size and property. Serological techniques are of paramount importance for the knowledge of the seropositivity or not of the herd and, in this way, implement prophylactic measures and control the disease, such as adequate disposal of fetal remains. One of the most accessible laboratory techniques is the indirect immunofluorescence technique, allowing the detection of anti-N. Caninum antibodies. Caninum.The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-N. Caninum antibodies in cattle slaughtered in the northern region of Paraná. A total of 401 blood samples were collected in the 281 samples in the city of Rolândia - Pr and the remainder in the county of Borrazópolis - Pr, during the months of april 2015 and november 2016, 289 females samples and 112 males samples, from one year and a half to eight years of age. After obtaining the serum, it was sent to the indirect immunofluorescence teste (IFAT), and the cut bridge used was 1: 100 for detection of the complete peripheral immunofluorescence. Then, they were tabulated for statistical analysis (Fisher’s exact test and Chi-square tests, p≤0.05). The analysis showed that of the 401 samples, 37 were positive for N. Caninum, indicating a prevalence of 9.23%. Of the 37 positive samples, 9 (8.04%) were from males and 28 (91.96%) from females. Although, the sample of females was larger when compared to males, there was no difference. Titres found in seropositive animals were 1: 100 (16), 1: 200 (14) and 1: 400 (7). However, the variables gender, age and location did not differ statistically (p> 0.05). It was concluded that anti-N. Caninum antibodies were detected in cattle from the northern region of Paraná.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resultado da sorologia (RIFI, ≥1:100) para Neospora caninum em
bovinos de corte na região Norte do Paraná ... 27
Tabela 2 – Representatividade do título na variável sexo em função do total de
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PI Persistentemente infectado
PR Paraná
N. Neospora
RIFI Reação de imunofluorescência indireta ELISA Ensaio Imunoenzimático
PCR Reação de Cadeia Polimerase IgG Imunoglobulina G
UNOPAR Univerdade Norte do Paraná UEL Universidade Estadual de Londrina ºC Graus Celsius cm³ Centímetro Cúbico % Porcentagem ml Mililitro µL Microlitro p.v. Peso vivo
12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 14 2 REFERENCIAL TEORICO ... 16 2.1 Classificação E Etiologia ... 16 2.2 Epidemiologia ... 16 2.2.1 Hospedeiro Definitivo ... 16 2.2.2 Hospedeiro Intermediário ... 16 2.2.3 Vias de Transmissão ... 16 2.2.4 Ocorrência de Anticorpos.. ... 17 2.3 Patogenia.... ... 18 2.4 Sinais Clínicos ... 18 2.5 Diagnóstico Sorológico ... 20 2.6 Controle E Prevenção ... 20 2.7 IMPACTO ECONÔMICO ... 21 3 OBJETIVOS ... 22 3.1 OBJETIVO GERAL ... 22 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 22
4 ARTIGO: Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum em soros de bovinos abatidos na região norte do Paraná ... 23
REFERÊNCIAS ... 32
ANEXOS ... 37
ANEXO A – Normas para preparação do artigo científico para submissão a publicação na revista Semina: Ciências Agrárias ... 38
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1 INTRODUÇÃO
A neosporose bovina é uma enfermidade causada pelo Neospora
caninum (DUBEY e SCHARES, 2011). Trata-se de um protozoário intracelular
obrigatório formador de cisto. Os animais atingidos de maior relevância são os caninos e bovinos, porém podem acometer os animais silvestres e domésticos. Sendo uma doença distribuída mundialmente e em todo o território brasileiro (PARRA et al, 2008).
A princípio, foi reconhecido por causar doenças neurológicas e músculo-esqueléticas em cães (BJERKAS et al. 1984), e só mais tarde foi identificada nos bovinos (THILSTED e DUBEY, 1989).
Na descoberta foi confundida com a toxoplasmose, pelo fato de ter as fases evolutivas semelhantes. Porém diferenças estruturais e antigênicas são observadas entre elas (DUBEY et al., 1988).
O protozoário foi descrito pela primeira vez por DUBEY et al. (1988) em cães que apresentavam encefalomielite, nos Estados Unidos. Depois em 1997, foi diagnosticada no Brasil pela primeira vez pelo teste sorológico da imunofluorescência indireta (GONDIM et al, 1999).
O parasita é responsável por grande parte dos abortamento ocorridos na bovinocultura mundial, causando grande impacto econômico, com perdas estimadas em um bilhão de dólares anuais (REICHEL et al., 2012). De acordo com Mello et al. (2008), as perdas econômicas ocorrem devido ao aborto, diminuição da produtividade leiteira, aumento da taxa de descarte e da reposição de novos animais.
Os métodos laboratoriais para identificação de animais soropositivos mais comumente utilizados são ELISA e RIFI. Esta última trata-se de uma técnica com maior especificidade e considerada o padrão ouro para o diagnóstico da neosporose (DUBEY e SCHARES, 2011). Já para o diagnóstico direto, a PCR ou a imunohistoquímica podem ser utilizadas para a detecção do parasita (DUBEY e SCHARES, 2006).
Normalmente, a investigação do N. caninum é realizada através da análise do soro sanguíneo para detecção de anticorpos, indicando ao animal a condição de portador ou não do parasita em bovinos adultos. A ressalva a isso seria a imunidade passiva (SILVA, 2005; DUBEY, 2003).
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Diante disso, é de grande importância pesquisas neste campo para o diagnóstico da doença, afim de instituir medidas de prevenção e minimizar as perdas econômicas.
O objetivo do presente estudo teve como enfoque os métodos de diagnósticos e levantamento sorológicos anti-Neospora caninum e a realização de um projeto de pesquisa no qual foi realizado a sorologia contra N. caninum de animais abatidos na Região Norte do Paraná.
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2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Classificação e Etiologia
Trata-se de um protozoário intracelular obrigatório do Filo Apicomplexa, Classe Coccidia, Sub ordem Eucoccidiorida, Família Sarcocistydae, Gênero Neospora. Esta classificação foi feita através de estudos morfológicos realizados com microscopia eletrônica, e resultados da análise da seqüência de DNA, confirmaram sua classificação (Dubey et al., 1988).
2.2 Epidemiologia
2.2.1 Hospedeiro Definitivo
De acordo com alguns autores (MCALLISTER et al., 1998; GONDIM et al., 2004; DUBEY et al., 2011; KING et al., 2010), os cães domésticos (Canis
lupus familiaris), os coiotes (Canis latrans), o lobo cinzento (Canis lupus lupus) e o
dingo (Canis lupus dingo) são os hospedeiros definitivos deste parasita.
A presença de coiotes podem aumentar em até 2,4 vezes o risco de infecção dos animais do rebanho (SIERRA et al., 2011), enquanto que os cães em até 3,21 vezes (PORTOCARRERO et al., 2015).
Cães alimentados com placentas provenientes de abortos de bovinos naturalmente infectados eliminam oocistos através das fezes (DIJKSTRA et al., 2001). Na Argentina foi observado, pela primeira vez, um cão eliminando oocistos de N. caninum devido à infecção natural (BASSO et al., 2001).
2.2.2 Hospedeiro Intermediário
O hospedeiro intermediário é infectado quando ingere oocistos do protozoário que é excretado pelas fezes do hospedeiro definitivo, estes oocistos esporulam-se no meio ambiente. Além dos bovinos, outros mamíferos podem assumir papel de hospedeiro intermediário, como: caninos, felinos, ovinos,bubalinos, aves, caprinos e equinos (DUBEY et al., 2002; DUBEY, 2007).
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2.2.3 Vias de Transmissão
O ciclo de vida é do tipo heteroxeno, acontecendo a reprodução sexuada nos hospederios definitivos e a assexuada nos hospedeiros intermediários. Cinco dias após a ingestão dos cistos com bradizoítos de tecidos infectados, o hospedeiro definitivo elimina nas fezes os oocistos na forma não esporulada, no meio ambiente estes esporulam-se em um intervalo de 24 a 72 horas, sendo influenciado pelas condições de umidade e temperatura (LINDSAY et al.,1999). Os esporocistos podem sobreviver por um grande período em condições ambientais devido à parede espessa do oocisto (GOODSWEN et al., 2013).
A transmissão do N. caninum pode ocorrer por via horizontal ou vertical. A primeira pode ocorrer pela ingestão pelo hospedeiro intermediário, de oocistos esporulados excretados por cães infectados, já a transmissão vertical acontece pela via transplacentária para o bezerro (DUBEY e SCHARES, 2011), através dos taquizoítos, que apresentam-se na forma móvel, podendo causar abortos (GOODSWEN et al., 2013). A transmissão detalhada encontra-se na Figura 1. O grau da infecção, aguda ou crônica pode-se manifestar por duas diferentes fases evolutivas, na forma de taquizoítos ou bradizoítos. As manifestações clínicas das duas formas diferem-se significativamente (AGUADO-MARTÍNEZ et al., 2009).
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Figura 1 – Esquema de transmissão da neosporose bovina.
Fonte: Dubey et al. (2006).
Nos rebanhos bovinos, a transmissão vertical (transplacentária) assume grande relevância, pois o resultado é o nascimento de animais saudáveis infectados atarvés da via congênita (TREES e WILLIAMS, 2005).
2.2.4 Ocorrência de Anticorpos
A prevalência pode ser bastante variável, sendo dependente dos tipos de amostragem, das técnicas laboratoriais utilizadas e do ponto de corte escolhido (CADORE et al., 2010). Além disso, o sistema de manejo da propriedade, a qual os animais são submetidos, podem aumentar ou diminuir os fatores de risco (MACEDO et al., 2013).
Entretanto, a prevalência de N. caninum foi maior em animais com relatos de aborto, quando comparado aos animais “normais”, demonstrando uma relação com a perda fetal (IBRAHIM; ELFAHAL; EL HUSSEIN et al., 2012).
Alguns estudos indicam que a raça pode aumentar as chaces do animal apresentar sorologia positiva para N. caninum (BARTELS et al., 2006). Porém, chama a atenção que encontros de animais positivos (DUBEY et al., 2007),
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pode estar mais intimamente associada aos sistemas de produção do que à susceptibilidade da raça em questão.
O tamanho da propriedade e a densidade de animais também pode significar um aumento na ocorrência da doença. Provavelmente devido a maior possibilidade de ingestão da pastagem contendo oocistos nas fezes de cães (GUEDES, 2006). A reposição com novilhas para matrizes de rebanhos desconhecidos também pode ser indicado como um fator de risco, uma vez que, Otranto et al. (2003) afirmam que quando a reposição é realizada com animais de uma mesma propriedade, observa-se menor frequência de animais positivos.
O clima é outro fator importante na ocorrencia de aniamis soropositivos, de acordo com Corbellini et al. (2006), regiões que apresentam maior umidade, os oocistos podem permanecer viáveis por muito mais tempo no ambiente após esporulação.
De acordo Dubey et al. (2007), o aumento da idade e do número de gestações pode aumentar as chances do animal ser soropositivo O escore corporal também pode influenciar no número de casos positivos da doença. Animais com escore corporal ruim apresentam maior número de casos positivos (53,8%), quando comparados aqueles com escore corporal bom (34,2%) (SILVA et al., 2008).
O estudo da prevalência da neosporose, têm sido realizado mundialmente, encontrando-se números altos em sua maioria, expressando sua grande importância na questão do aborto e às perdas econômicas associadas na cadeia produtiva bovina (DUBEY et al., 2007).
2.3 Patogenia
Sua patogenia ainda não está totalmente elucidada, devido a alta complexidade da relação parasita hospedeiro podendo ser parcialmente compreendida. Sabe-se que é fundamental que ocorra um contato primário da vaca prenhe com o parasita (exógena) ou a reativação do protozoário (endógena), que pode ser encontrado encistado nos tecidos. Posteriormente, é seguida pela parasitemia atingindo a placenta e por fim o feto (DUBEY et al., 2006).
A gravidade do dano causado pela infecção será influenciada pela resposta do sistema imunológico ao parasita e vice-versa (ENTRICAN, 2002). Geralmente, o sistema imune não é capaz de produzir uma resposta que o proteja,
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desta forma, as vacas não emprenham ou as consequências reprodutivas se dão ao longo de sua vida (MORALES et al., 2001; GARCIA-VAZQUEZ et al., 2002; BIELSA et al., 2004).
Acredita-se que uma vaca soropositiva prenhe, pode dar a luz a um bezerro fraco, porém persistentemente infectado ou simplesmente abortar (MARQUES et al., 2011). A infecção pelo N. caninum pode afetar vários órgãos como cérebro, coração, pulmões, fígado e rins (CORBELLINI et al., 2000).
As perdas reprodutivas, normalmente caracterizam-se por morte embrionária e aborto no primeiro e segundo terço gestacional (DUBEY et al., 2003). No entanto, quando a infecção se dá no terço final, os animais na maioria das vezes nascem saudáveis, porém persistentemente infectados, conhecidos como PIs. Por isso, o diagnóstico da neosporose é de suma importância para a detecção da doença e seu controle (CAMILLO et al., 2011).
2.4 Sinais Clínicos
O sinal clínico mais comumente observado nos bovinos, é o aborto entre o quinto e o sétimo mês gestacional. As vacas soropositivas são mais susceptíveis ao aborto, quando comparado as vacas soronegativas (CAMPERO et al., 2003). Podem ainda ser observados anestro temporário, estro repetitivo e abortos sucessivos (BRUHN et al., 2013).
Os fetos infectados congenitamente podem morrer no útero, serem reabsorvidos, mumificados ou autolisados. Nestes bezerros infectados pode-se verificar baixo peso ao nascer, nascimento de animais clinicamente normais, porém cronicamente infectados, ou apresentarem distúrbios neurológicos como ataxia, exoftalmia, membro flexionado ou hiperestendido (FERRE et al., 2003).
Quando não ocorre aborto, os sinais clínicos observados nos bezerros soropositivos ao nascimento são: exoftalmia ou aparência assimétrica dos olhos, hidrocefalia e disfunção neuromotora (PARÉ et al., 1996). Ainda podem apresentar fraqueza, diminuição da massa muscular, baixo peso, dispnéia e dificuldade ao se levantar. Porém, de maneira geral, os bezerros infectados nascem assintomáticos (FERRE et al., 2003).
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2.5 Diagnóstico Sorológico
O diagnóstico da neosporose pode ser realizado pelo Teste de aglutinação, ELISA e RIFI. A técnica de ELISA exige materiais mais caros e laboratórios mais equipados, o que acaba limitando seu uso. A RIFI é o teste mais comumente utilizado, considerado um teste padrão, que se baseia na pesquisa de anticorpos IgG em soro sanguíneo (GHALMI et al., 2014).
O ELISA e a RIFI apresentam boa especificidade e sensibilidade (CAMILLO et al., 2010). Todavia, os resultados negativos devem ser examinados com cautela, pois uma queda no limiar de anticorpos anti-Neospora caninum pode passar despercebido como negativo, isso pode ser explicado pela oscilação no título de anticorpos.
A ocorrência de abortos sempre deve estar associada às pesquisas sorológicas, para que se possa obter um diagnóstico mais preciso da doença e desta forma lançar mão das medidas de controle e prevenção (PAZ et al., 2007).
2.6 Controle e Prevenção
A melhor maneira de erradicar ou minimizar a ocorrência da doença na propriedade é através da pesquisa de anticorpos e descarte dos animais positivos (BARROS et al., 2010). É necessário realizar o descarte adequado dos envoltórios fetais ou dos fetos abortados, impedindo o acesso aos hospedeiros definitivos (BRUHN et al., 2013). Do mesmo modo, evitar o contato dos mesmos com água e comida fornecidos aos bovinos (GHALMI et al., 2012; IMRE et al., 2012).
Quanto ao controle, ainda é importante a adoção de estratégias em relação aos fatores de risco do rebanho se infectar e desenvolver o aborto (DUBEY; SCHARES; ORTEGAMORA, 2007; DUBEY; SCHARES, 2011). Segundo Sousa et al., (2012), em propriedades onde o material resultante de abortos (infectado) não são devidamente descartados, o risco de transmissão da neosporose aumenta em 3,04 vezes, quando comparadas às propriedades que apresentam um bom manejo sanitário.
O programa de controle deve ser feito, considerando o tipo de rebanho (leite ou corte), o sistema de manejo, a prevalência e a transmissão. Deve ser considerado ainda o custo benefício, comparando as despesas dos testes
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diagnósticos e das medidas de controle, com a redução das perdas econômicas, ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e reprodutivo do rebanho (DUBEY; SCHARES; ORTEGA-MORA, 2007).
2.7 IMPACTO ECONÔMICO
Acredita-se que os prejuízos decorrentes das enfermidades reprodutivas causados por este parasita possa ter ultrapassado aos causados por outras doenças como brucelose e leptospirose.
Na América do Sul, os custos podem chegar a US$ 239,7 milhões ao ano. Destes aproximadamente 21,4% refere-se a cadeia leiteira e 42,1% a cadeia produtiva da carne, tomando como base às publicações científicas sobre a incidência do parasito (REICHEL et al., 2013).
Um levantamento realizado no estado do Mato Grosso do Sul, relatou que o aborto e a baixa taxa de desfrute associados à doença significam uma perda econômica de 27,34% na receita total, no momento da venda dos bezerros, onde muitas vezes este prejuízo não é observado pelo produtor (BARROS et al., 2010).
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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos de corte abatidos na região norte do Paraná.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a ocorrência de anticorpos contra o N. caninum pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI);
Associar as variáveis sexo, idade e procedência com a soropositividade dos animais.
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4 ARTIGO
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Neospora caninum EM SOROS DE BOVINOS ABATIDOS NA REGIÃO NORTE DO ESTADO DO PARANÁ
Redigido segundo as normas da revista Semina: Ciências Agrárias, com exceção do idioma.
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos abatidos na região norte do Paraná. Foram coletadas no total de 401 amostras de sangue, 281 amostras no município de Rolândia - Pr e o restante no municipio de Borrazopolis - Pr, durante os meses de abril de 2015 e novembro de 2016, sendo 289 amostras de fêmeas e 112 amostras de machos, na faixa etária de um ano e meio até oito anos de idade. Após a obtenção do soro, foi encaminhado para a realização da Reação da Imunofluorescência Indireta (RIFI) utilizando ponte de corte de 1:100 para detecção da imunofluorescência periférica completa. Em seguida foram tabulados para análise estatistica (Testes exato de Fisher e do Qui-Quadrado, P≤0,05). A análise mostrou que das 401 amostras, 37 foram positivas para o N. caninum, indicando uma prevalência de 9,23%. Das 37 amostras positivas 9 (8,04%) foram de machos e 28 (91,96%) de fêmeas. Embora a amostragem de fêmeas tenha sido maior se comparada aos machos, não apresentou diferença estatisticamente. Os títulos de anticorpos encontrados nos animais soropositivos foram 100 (16), 200 (14) e 400 (7). Contudo, as variáveis sexo, idade e local não diferiram estatisticamente (P>0,05). Concluiu-se que, houve a detecção de anticorpos anti-N. caninum nos bovinos da região Norte do Paraná.
Palavras-chave: N. caninum, prevalência, sorologia, RIFI, bovino de corte.
Abstract
The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-n. Caninum antibodies in cattle slaughtered in the northern region of paraná. A total of 401 blood samples were collected in the 281 samples in the city of rolândia-pr and the remainder in the county of borrazópolis-pr, during the months of april 2015 and november 2016, 289 females samples and 112 males samples. Males, from one year and a half to eight years of age. After obtaining the serum, it was sent to the indirect immunofluorescence teste (ifat), and the cut bridge used was 1: 100 for detection of the complete peripheral immunofluorescence. Then, they were tabulated for statistical analysis (fisher’s exact test and chi-square tests, p≤0.05). The analysis showed that of the 401 samples, 37 were positive for n.
Caninum, indicating a prevalence of 9.23%. Of the 37 positive samples, 9 (8.04%) were from males
and 28 (91.96%) from females. Although, the sample of females was larger when compared to males, there was no difference. Titres found in seropositive animals were 1: 100 (16), 1: 200 (14) and 1: 400 (7). However, the variables gender, age and location did not differ statistically (p> 0.05). It was concluded that anti-n. Caninum antibodies were detected in cattle from the northern region of Paraná.
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Introdução
A neosporose bovina é uma das enfermidades reprodutivas com importância mundial em rebanhos bovinos (MARQUES et al., 2011). É causada pelo Neospora caninum, protozoário intracelular obrigatório e pertencente ao filo Apicomplexa (DUBEY et al., 1988). Desde sua descoberta, a doença se manifesta com caráter grave, atingindo bovinos e cães pelo mundo todo. A mortalidade neonatal e o abortamento é o maior problema causado pelo N.
caninum (DUBEY e SCHARES, 2011).
O N. caninum no Brasil tem sido notificado em diferentes Estados, indicando que a neosporose possui ampla distribuição geográfica. A infecção por N. caninum em bovinos apresenta importância na reprodução destes animais, sendo responsável por causar aborto, mumificação fetal, repetição de cio, diminuição da taxa de desfrute, além do nascimento de natimortos e/ou de animais sadios, mas persistentemente infectados, que poderão manter o parasito na propriedade por meio da infecção vertical. A prevalência do N. caninum está ligada a animais com histórico de aborto, do que naqueles aparentemente normais, o que demonstra a relação da neosporose com a perda fetal (IBRAHIM; ELFAHAL; EL HUSSEIN et al., 2012).
O presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de anticorpos anti-N.
caninum em bovinos de corte na região norte do Paraná.
Material e Métodos
Caracterização do local de estudo
O presente estudo foi realizado nos municípios de Rolândia e Borrazopolis. Em Rolandia foi realizada a coleta no Frigorífico São Martinho e em Borrazopolis no Abatedouro Municipal. No Frigorífico de São Martinho a procedência dos animais compreendia os seguintes municípios Cambé, Conselheiro Mairink, Floraí, Florestópolis, Guaraci, Ibiporã, Jaquapitã, Lobato, Londrina, Nova Londrina, Rolândia,Sabáudia, Sapopema e Tamarana e no Abatedouro Municipal de Borrazopolis a procedência era do próprio município e de Kaloré. Como mostra a Figura 2.
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Figura 2 - Mapa demonstrativo do estado do Paraná em destaque municípios que tiveram animais abatidos no Frigorífico de São Martinho - Rolândia e no Abatedouro Municipal de Borrazópolis.
- municípios que abateram animais no Frigorífico de São Martinho;
- municípios que abateram animais no Abatedouro Municipal de Borrazopolis; - Frigorífico São Martinho - Rolândia;
- Abatedouro Municipal - Borrazopolis.
Amostras
Para o cálculo do número de amostras, foi utilizado o Programa Epi Info, versão 6 (CDC, Atlanta, GA,USA), utilizando uma prevalência de 50 %, erro de 5% e nível de confiança de 95 %. Foi calculado um total de 384 amostras de sangue de bovinos.
Durante os meses de abril de 2015 a novembro de 2016, foram coletadas 401 amostras de sangue, das quais 221 amostras em um abatedouro no município de Rolândia e 180 amostras no abatedouro municipal de Borrazópolis, PR. Do total das amostras, 289 eram de fêmeas e 112 de machos, com idade variando de um ano e meio a oito anos de idade.
As amostras de sangue foram coletadas no momento da sangria na linha de inspeção, na veia jugular e artéria carótida. Em uma planilha anotava-se a raça, a idade, o sexo e a
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procedência de cada animal, para tabulação e análise estatística para correlacionar os resultados da sorologia com as varáveis analisadas.
Após a colheita, as amostras eram encaminhada para o laboratório da UNOPAR, onde era realizada a separação. Após a obtenção do soro, este foi mantido a -20ºC em tubos de 1,5 ml até o processamento.
Sorologia
As amostras de soros foram submetidas à reação de imunofluorescência indireta e avaliadas para N. caninum (CONRAD et al., 1993). As amostras de soro inicialmente passou por uma triagem dos soros nas diluições de 1:50 e 1:100 e, a partir desse título, as amostras positivas foram novamente testadas em diluições seqüenciais na base dois até 1:400, para avaliar a última diluição que apresentasse fluorescência periférica completa.
Todas as etapas de produção de antígenos de N. caninum e confecção das lâminas de imunofluorescência foram realizadas no Laboratório de Protozoologia Veterinário da UEL.
Comitê de ética
O presente trabalho foi aprovado pelo “Comitê de Ética Para Uso de Animais da Universidade Norte do Paraná – UNOPAR” sob o protocolo de número 007/14.
Análise Estatística
A análise de associação entre as variáveis foi realizada pelo teste de Qui-quadrado (χ²), considerando o nível de significância estatística de 5% utilizando o “software” EpiInfo, versão 6 (CDC, Atlanta, GA, USA).
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Resultados e Discussão
Do total de 401 amostras de soro analisadas, 37 (9,23%) foram positivas para a presença de anticorpos contra N. caninum. Este resultado foi semelhante a valores encontrados por Aguiar et al., (2006). Este autor, trabalhou com rebanhos de bovinos de leite e corte, encontrou prevalência de 10,4% para bovinos de corte.
Estudos epidemiológicos indicam que existem consideráveis diferenças na prevalência da neosporose entre países, dentro dos países, entre regiões, entre gado de leite e gado de corte e entre sistemas de manejo. Contudo, deve-se ter muito cuidado ao comparar esses resultados por causa das diferenças das técnicas sorológicas e do ponto de corte, do modelo de estudo e do tamanho da amostra utilizada (DUBEY; SCHARES, 2011).
Não foi observada diferença significativa com relação a variável município, apesar de alguns municípios terem apresentado prevalência nula ou muito abaixo da média global de 9,23%, podendo-se citar Florestópolis, Ibiporã, Londrina, Sapopema e Tamarana, onde não foi observada a incidência do parasito (Tabela 1). Este fato pode ser explicado pelo menor de número de amostras coletadas neste municípios. Contrastando com este quadro, temos o município de Sabáudia e Conselheiro Mairink, onde foi encontrada uma maior porcentagem de animais apresentando anticorpos contra N. caninum (18,18%), porém com um número de 11 animais para Sabáudia e 22 animais para Conselheiro Mairink, não permitindo inferir uma maior soroprevalência nestes municípios. Diferenças geográficas na distribuição de animais infectados por N. caninum já foram relatadas em outros estudos e podem estar relacionadas, entre outros fatores, a abundância relativa do hospedeiro definitivo (canídeos) assim como aos sistemas de manejo (NASIR et al., 2012).
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Tabela 1 - Resultado da sorologia (RIFI, ≥1:100) para Neospora caninum em bovinos de
corte na região Norte do Paraná.
Variáveis Categorias Animais Positivo Negativo N % N % n % M u n icíp ios Borrazópolis 95 23,69 6 6,32 89 93,68 Kaloré 85 21,20 4 4,71 81 95,29 Cambé 10 2,49 1 10,00 9 90,00 C. Mairink 22 5,49 4 18,18 18 81,82 Floraí 26 6,48 3 11,54 23 88,46 Florestópolis 4 1,00 0 0 4 100 Guaraci 51 12,72 7 13,73 44 86,27 Ibiporã 3 0,75 0 0 3 100 Jaguapitã 37 9,23 6 16,22 31 83,78 Lobato 7 1,75 1 14,29 6 85,71 Londrina 14 3,49 0 0 14 100 Nova Londrina 10 2,49 1 10,00 9 90,00 Rolândia 18 4,49 2 11,11 16 88,89 Sabáudia 11 2,74 2 18,18 9 81,82 Sapopema 7 1,75 0 0 7 100 Tamarana 1 0,25 0 0 1 100 Sexo Macho 112 27,93 9 8,04 103 91,96 Fêmea 289 72,07 28 9,69 261 90,31 Idade (anos) < 3 307 76,56 30 9,77 277 90,23 3 a 5 73 18,20 6 8,22 67 91,78 > 5 21 5,24 1 4,76 20 95,24 Total - 401 100 37 9,23 364 90,77
A idade não influenciou estatisticamente (P>0,05) a ocorrência de anticorpos contra N.
caninum, apesar de diferirem numericamente (Tabela 1). Tais resultados não permitem
identificar se a transmissão horizontal ou a vertical é a principal rota de infecção e manutenção do N. caninum no gado de corte da região.
Estudo realizado no Pará, não observaram relação entre faixa etária com a soropositividade para neosporose (SILVA et al., 2015). No Peru, não encontraram correlação entre a idade e a procedência (P>0,05) dos animais com a sorologia, tendo sido registrado uma prevalência de 18,8%, onde os fatores de risco associados à soroprevalência de N.
caninum em bovinos foram a presença de mais de três cães no rebanho, o descarte de restos
de animais no meio ambiente e um tamanho do rebanho maior do que 100 animais (PORTOCARRERO et al., 2015). Marques et al. (2011) estudaram 159 amostras provenientes da região norte do estado do Paraná e relataram que a prevalência de N. caninum em vacas
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não aumentou proporcionalmente com a idade do animal infectado, reforçando os dados encontrados neste trabalho.
Embora a amostragem de fêmeas tenha sido maior, se comparado aos machos, a variável sexo não apresentou diferença estatisticamente significativa (Tabela 1). Das 37 amostras positivas 9 (24,3%) foram de machos e 28 (75,67%) de fêmeas. Os títulos encontrados nos animais soropositivos foram 1:100 (16), 1:200 (14) e 1:400 (7) (Tabela 2).
Tabela 2 - Representatividade do título na variável sexo em função do total de amostras
positivas por sexo.
Título Sexo Total Macho Fêmea n % n % n % 100 3 33,33 13 46,43 16 43,24 200 5 55,56 9 32,14 14 37,84 400 1 11,11 6 21,43 7 18,92 Total 9 100 28 100 37 100
Poucos são os trabalhos que tratam da soroprevalência de anticorpos contra N.
caninum em bovinos de corte, especificamente. Alguns dados no Brasil apontam, para
bovinos de corte, prevalências de 12,6% para vacas e 16,7% para os fetos, nos estados de Pernambuco e Alagoas (AMARAL et al., 2012); de 14,6% em fêmeas prenhes e 15,8% em não prenhes no estado do Paraná (MARQUES et al., 2011). Discordando desses valores, Nascimento et al. (2014), relataram prevalência de 30,3% para anticorpos anti-N. caninum em vacas zebus prenhas no estado do Paraná, com taxa de transmissão vertical de 29%, e risco de 26,25 vezes maiores de uma vaca soropositiva efetuar a transmissão vertical em relação à uma soronegativa.
Embora no presente estudo não tenha sido possível avaliar índices reprodutivos, relatos da literatura mostram que a infecção por N. caninum em gado de corte pode representar prejuízos. No Brasil, Andreotti et al. (2010) observaram que a soroprevalência de
N. caninum em animais com problemas na gestação foi maior do que em vacas cuja gestação
chegou a termo, e que as taxas de desfrute para as novilhas soropositivas são reduzidas em animais infectados quando comparadas com animais soronegativos para N. caninum. Entretanto, tais resultados evidenciam que há necessidade de estudos mais amplos para que sejam avaliadas, com mais fidedignidade, a distribuição geográfica e a importância econômica na pecuária brasileira.
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Conclusão
Os resultados permitem concluir que anticorpos contra N. caninum estão presentes nos bovinos da região Norte do Paraná.
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ANEXO A
Normas para preparação do artigo científico para submissão a publicação na revista Semina: Ciências Agrárias
Diretrizes para Autores
ATENÇÃO AUTORES:
A PARTIR DE 01/04/2014 FORAM ALTERADAS AS DIRETRIZES PARA AUTORES DA SEMINA: CIÊNCIAS AGRÁRIAS. ASSIM, RECOMENDAMOS QUE OS AUTORES AS CONSULTEM ATENTAMENTE, POIS NÃO SERÃO ACEITOS TRABALHOS QUE NÃO ESTEJAM RIGOROSAMENTE DE ACORDO COM AS REFERIDAS DIRETRIZES.
Taxa de Submissão de novos artigos: RS 80,00. Em caso de rejeição do artigo, esta taxa não será
devolvida.
A Taxa de Publicação (trabalhos aprovados) será de acordo com o número de páginas do manuscrito: Até 9 páginas: R$ 150,00
De 10 a 14 páginas: R$ 200,00 De 15 a 19 páginas: R$ 250,00 De 20 a 25 páginas: R$ 300,00
Em caso de aceite do artigo para publicação, o valor pago de R$ 80,00 referente à taxa de submissão, não será deduzido da taxa de publicação.
O comprovante de depósito deverá ser digitalizado e anexado no sistema como documento suplementar
Depósito em nome do Instituto de Tecnologia e Desenvolvimento Econômico e Social (ITEDES), CNPJ: 00.413.717/0001-65, em uma das três contas abaixo:
Banco do Brasil (001)
Agência: 1212-2
Conta corrente: 43509-0
Caixa Econômica Federal (104)
Agência: 3076 Conta corrente: 0033-4 Operação: 003 Itaú (341) Agência: 3893 Conta corrente: 29567-9
Normas editoriais para publicação na Semina: Ciências Agrárias, UEL.
A partir de 01 de abril de 2014, os artigos poderão ser submetidos em português ou
inglês, mas somente serão publicados em inglês. Os artigos submetidos em português, após o aceite,
deverão ser obrigatoriamente traduzidos para o inglês.
Os artigos enviados para a revista até esta data e que estão em tramitação poderão ser publicados em português, entretanto, se traduzidos para o inglês terão prioridade na publicação.
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Todos os artigos, após o aceite deverão estar acompanhados (como documento suplementar) do comprovante de tradução ou correção de um dos seguintes tradutores:
American Journal Experts Editage
Elsevier
http://www.proof-reading-service.com http://www.academic-editing-services.com/ http://www.publicase.com.br/formulario.asp
O autor principal deverá anexar no sistema o documento comprobatório dessa correção na página de submissão em “Docs. Sup.”
OBSERVAÇÕES:
1) Os manuscritos originais submetidos à avaliação são inicialmente apreciados pelo Comitê Editorial da Semina: Ciências Agrárias. Nessa análise, são avaliados os requisitos de qualidade para publicação na revista, como: escopo; adequação às normas da revista; qualidade da redação; fundamentação teórica; atualização da revisão da literatura; coerência e precisão da metodologia; contribuição dos resultados; discussão dos dados observados; apresentação das tabelas e figuras; originalidade e consistência das conclusões. Se o número de trabalhos com manuscrito ultrapassar a capacidade de análise e de publicação da Semina: Ciências Agrárias é feita uma comparação entre as submissões, e são
encaminhados para assessoria Ad hoc, os trabalhos considerados com maior potencial de contribuição para o avanço do conhecimento cientifico. Os trabalhos não aprovados nesses critérios são arquivados e os demais são submetidos a análise de pelo menos dois assessores científicos, especialistas da área técnica do artigo, sem a identificação do(s) autor(es). Os autores cujos artigos forem arquivados, não terão direito à devolução da taxa de submissão.
2) Quando for o caso, deve ser informado que o projeto de pesquisa que originou o artigo foi executado obedecendo às normas técnicas de biosegurança e ética sob a aprovação da comissão de ética
envolvendo seres humanos e/ou comissão de ética no uso de animais (nome da Comissão, Instituição e nº do Processo).
NÃO SERÃO ACEITOS MANUSCRITOS EM QUE:
a) O arquivo do artigo anexado do trabalho contenha os nomes dos autores e respectiva afiliação; b) Não tenha sido realizado o cadastro completo de todos os autores nos métodos de submissão; Exemplo: Nome completo; Instituição/Afiliação; País; Resumo da Biografia/Titulação/função
c) Não tenha sido incluído no campo COMENTÁRIOS PARA O EDITOR, um texto que aponte a relevância do trabalho (importância e diferencial em relação a trabalhos já existentes), em até 10 linhas;
d) Não estejam acompanhados de documento comprobatório da taxa de submissão, em documento suplementar “Docs. Sup.” no ato da submissão;
e) Não estejam acompanhados dos seguintes documentos suplementares: gráficos, figuras, fotos e outros, EM VERSÃO ORIGINAL. (Formato JPEG; TIFF; EXCEL)
f) Não constem no artigo original: título, resumo e palavras-chave em português e inglês, tabelas e figuras.
RESTRIÇÃO POR ÁREA:
PARA A ÁREA DE AGRONOMIA NÃO SERÃO ACEITOS MANUSCRITOS EM QUE:
a) Os experimentos com cultura in vitro sejam limitados ao melhoramento dos protocolos já padronizados ou que não forneçam novas informações na área;
b) Os experimentos de campo não incluam dados de pelo menos dois anos ou de várias localidades dentro do mesmo ano;
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c) Os experimentos se refiram apenas a testes sobre a eficiência de produtos comerciais contra agentes bióticos, abióticos ou estresses fisiológicos;
d) Envolvam apenas bioensaios (screening) de eficácia de métodos de controle de insetos, ácaros ou doenças de plantas, exceto se contiverem contribuição importante sobre mecanismos de ação numa perspectiva de fronteira do conhecimento;
e) O objetivo seja limitado a registrar a ocorrência de espécies de pragas ou patógenos ou associações entre hospedeiros em novas localidades dentro de regiões geográficas onde eles já sejam conhecidos. Registros de espécies ou associações conhecidas só serão considerados em novas zonas ecológicas. Os registros de distribuição devem se basear em ecossistemas, e não em fronteiras políticas.
PARA A ÁREA DE VETERINÁRIA
a) A publicação de relatos de casos é restrita e somente serão selecionados para tramitação àqueles de grande relevância ou ineditismo, com real contribuição ao avanço do conhecimento para a área
relacionada.
Categorias dos Trabalhos
a) Artigos científicos: no máximo 20 páginas incluindo figuras, tabelas e referências bibliográficas; b) Comunicações científicas: no máximo 12 páginas, com referências bibliográficas limitadas a 16 citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma figura;
b) Relatos de casos: No máximo 10 páginas, com referências bibliográficas limitadas a 12 citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma figura;
c) Artigos de revisão: no máximo 25 páginas incluindo figuras, tabelas e referências bibliográficas.
Apresentação dos Trabalhos
Os originais completos dos artigos, comunicações, relatos de casos e revisões podem ser escritos em português ou inglês no editor de texto Word for Windows, em papel A4, com numeração de linhas por página, espaçamento 1,5, fonte Times New Roman, tamanho 11 normal, com margens esquerda e direita de 2 cm e superior e inferior de 2 cm, respeitando-se o número de páginas, devidamente numeradas no canto superior direito, de acordo com a categoria do trabalho.
Figuras (desenhos, gráficos e fotografias) e Tabelas serão numeradas em algarismos arábicos e devem
ser incluídas no final do trabalho, imediatamente após as referências bibliográficas, com suas respectivas chamadas no texto. Alem disso, as figuras devem apresentar boa qualidade e deverão ser anexadas nos seus formatos originais (JPEG, TIF, etc) em “Docs Supl.” na página de submissão. Não serão aceitas figuras e tabelas fora das seguintes especificações: Figuras e tabelas deverão ser apresentadas nas larguras de 8 ou 16 cm com altura máxima de 22 cm, lembrando que se houver a necessidade de dimensões maiores, no processo de editoração haverá redução para as referidas dimensões.
Observação: Para as tabelas e figuras em qualquer que seja a ilustração, o título deve figurar na parte
superior da mesma, seguida de seu número de ordem de ocorrência em algarismo arábico, ponto e o respectivo titulo.
Indicar a fonte consultada abaixo da tabela ou figura (elemento obrigatório). Utilizar fonte menor (Times New Roman 10).
Citar a autoria da fonte somente quando as tabelas ou figuras não forem do autor. Ex: Fonte: IBGE (2014), ou Source: IBGE (2014).
