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Tese de Doutorado
Natal/RN, março de 2018
Ruy Anderson Araújo de Lima
FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES EM ÁREAS COSTEIRAS NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte das exigências para obtenção do grau de Doutor em Sistemática e Evolução.
Linha de pesquisa: Taxonomia e Sistemática Orientador: Prof. Dr. Bruno Tomio Goto
Natal Março de 2018
Lima, Ruy Anderson Araújo de.
Fungos micorrízicos arbusculares em áreas costeiras no Estado do Rio Grande do Norte, Brasil / Ruy Anderson Araújo de Lima. -Natal, 2018.
121 f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Bruno Tomio Goto.
1. Glomeromycotina - Tese. 2. Micorrizas - Tese. 3. Restinga - Tese. 4. Sazonalidade Tese. 5. Metodologia - Tese. I. Goto, Bruno Tomio. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 582.288
RUY ANDERSON ARAÚJO DE LIMA
FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES EM ÁREAS COSTEIRAS NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL
Aprovado em: 26 de março de 2018
BANCA EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
Dr. Bruno Tomio Goto – Orientador
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dr. Felipe Wartchow – Examinador Interno Universidade Federal da Paraíba
Dr. Rhudson Henrique Santos Ferreira da Cruz – Examinador Externo Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dra. Carla Rejane Sousa de Lira – Examinador Externo Universidade Federal de Pernambuco
Dr. Marcelo Aloisio Sulzbacher– Examinador Externo Universidade Federal de Santa Maria
Natal Março de 2018
A minha esposa Gabriela M. Araújo, dedico.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática em Evolução – PpgSE. Especialmente às Secretárias Gisele e Gilmara Lima, e aos professores Dr. Iuri Baseia e Dr. Bruno Bellini, por todo o suporte no decorrer da minha pós-graduação.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela concessão da bolsa de doutorado e pela oportunidade de realizar parte da pesquisa em Zurique – Suiça e apreender com grandes pesquisadores na área de fungos micorrízicos arbusculares: Fritz Oehl, Marcel von der Heijden e Janusz Błaszkowski.
À Agoscope pela estrutura e pela oportunidade de aprendizado em especial a Caroline Scherrer e Fritz Oehl, pela paciência, ensinamentos e oportunudade de participar das reuniões às quartas-feiras (me renderam grandes experiências e ideias) além dos outros colaboradores e estudantes.
À Verena Säle e Verena Knorst pela recepção, paciência, amizade e me darem suporte nos mais variados aspectos durante minha estadia na Suíça.
Ao LBF – Laboratório de Biologia de Fungos, pela estrutura, essencial para o andamento da tese, e seus integrantes, pelo companheirismo;
Aos amigos Adler Santana, Ana Cláudia Palhares, Aretha Melo, Cibelly Freire, Kássia Galdino, Luis Silva, Marcus Issler, Renata Gonçalves, Xochitl Vista e Wallace São-Mateus pelo apoio e bons momentos;
Ao Prof. Dr. Alexandre Souza e aos Ms. José Luiz Silva, pelas sugestões e ensinamentos em bioestatística;
Ao Herbario da UFRN, em especial ao Prof. Dr. Leonardo Versieux e seus alunos Arthur Soares, Edweslley de Moura e Jaerton, pela ajuda na identificação do material vegetal;
Aos Membros Títulares da banca de defesa, Dra. Carla Lira, Prof. Dr. Felipe Wartchow, Prof. Dr. Marcelo Sulzbacher e Dr. Rhudson Cruz, pela disponibilidade, atenção e valiosas sugestões;
Aos membros suplentes Prof. Dra. Camila Nobre e Prof. Dra. Tiara Cabral pela disponibilidade e atenção;
Em especial a minha esposa Gabriela Araújo, pelo suporte durantes esse período desgastante e por me ajudar a não levar os problemas do doutorado para casa.
“Quanto mais conheço as pessoas, mais gosto do meu cachorro.”
RESUMO
Dois estudos sobre a influência de fatores ambientais na distribuição de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) foram conduzidos em duas áreas costeiras no estado do Rio Grande do Norte, entre os anos de 2013 a 2015. As coletas de material biológico ocorreram durante os períodos de chuva e estiagem. O primeiro estudo ocorreu em uma área de Mata Atlântica, em duas fitofisionomias distintas, onde foi avaliado se a comunidade de FMA local respondia à variação na concentração de elementos do solo, sob a hipótese de que a deficiência nutricional poderia favorecer a diversidade de FMA e está diretamente associada ao padrão de distribuição desses organismos. Divergente do esperado, os FMA da localidade não se mostraram significativamente influenciados pelas variáveis edáficas observadas, apresentando indícios de sua distribuição estar positivamente relacionada à diversidade vegetal da localidade onde estão inseridos. Nesse estudo foi encontrado o primeiro registro de Septoglomus furcatum para áreas de Mata Atlântica. O segundo estudo ocorreu em região de dunas costeiras que apresenta uma vegetação de Caatinga, no qual foi observada a distribuição dos FMA em áreas alagáveis e não alagáveis por influência fluvial hipersalina. Nesse estudo, foi observado que as águas fluviais atuam como um filtro ambiental influenciando na distribuição das espécies de FMA. Das espécies registradas no segundo estudo, três representam novos registros para a ciência (Scutellospora sp. Cetraspora sp. e Rhizoglomus sp.), uma espécie é considerada rara (Acaulospora spinosissima) e duas são de descrição original antiga (Glomus nanolumem e Rhizoglomus microaggregatum). No decorrer dos estudos alguns esporos foram descritos como “sp.” devido à baixa quantidade de glomerosporos obtidos, por peneiramento úmido e centrifugação em água e sacarose, levando a busca por um aprimoramento desses métodos ou proposta de novos processos de extração de FMA do solo, sendo sugerido a metodologia aqui batizada de “wet shaking” que se mostrou mais eficiente em relação as metodologias anteriormente mencionadas.
ABSTRACT
Two studies about environmental factors influencing on arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) distribuition were conducted in two coastal areas of Rio Grande do Norte state between 2013 and 2015. Biological material collections occurred during rainy and dry periods. The first study was carried out in an Atlantic Forest area, in two distinct phytophysiognomies, where it was evaluated whether the local AMF community responded to soil component’s variation under the hypothesis that nutritional deficiency could favor AMF diversity and is directly associated with the distribution pattern of these organisms. Divergent than expected, the AMF of the locality was not significantly influenced by the observed edaphic variables, showing signs of its distribution being positively related to the plant diversity of the locality where they are inserted. In this study was found the first record of Septoglomus furcatum for Atlantic Forest areas. The second study was carried out in a coastal dune region with a Caatinga vegetation, in which the distribution of AMF was observed in floodable and non-floodable areas due to hypersaline fluvial influence. In this study, it was observed that the fluvial waters act as an environmental filter influencing the AMF species distribution. For species registered in the second study, three represent new records for science (Scutellospora sp. and Rhizoglomus sp.), one species is considered rare (Acaulospora spinosissima) and two have old original description (Glomus nanolumem and Rhizoglomus microaggregatum). In the studie’s course, some spores were described as "sp" due to the low amount of glomerospores obtained by wet sieving and centrifugation in water and sucrose, leading to the search for an improvement of these methods or proposing of AMF soil extraction processes, suggesting the methodology here called "wet shaking", which proved be more efficient in relation to aforementioned methodologies.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Visualização do arbúsculo por microscopia ótica... 20 Figura 2. Esquema da colonização de raízes por FMA... 22 Figura 3. Detalhes esporocárpicos e de glomerosporos de Glomus macrocarpum Tul. & C. Tul. À esquerda: esporos formando um arranjo esporocárpico; à direita: detalhes das camadas de parede do esporo (SWL: Spore wall layer) e da hifa de sustentação (Sh: Subtending hypha). ... 24 Figura 4. Desenvolvimento ontogenético de esporos acaulosporoides e entrofosporoides: 1: Acaulospora foveata Trappe & Janos, 2: Entrophospora infrequens (I.R. Hall) R.N. Ames & R.W. Schneid. A sequência das setas segue do surgimento do sáculo esporífero a maturação do esporo. ... 25 Figura 5. Representação de glomerosporos e placas germinativas dos principais gêneros da ordem Gigasporales. 1: Glomerosporos de Gigaspora Gerd. & Trappe e 2: Scutellospora C. Walker & F.E. Sanders; 3 – 9: placas germinativas encontradas nos esporos com bulbo suspensor, caracterizando os gêneros propostos; 3: Scutellospora; 4: Fuscutata Oehl, F.A. Souza & Sieverd.; 5: Cetraspora Oehl, F.A. de Souza & Sieverd. e Racocetra Oehl, F.A. de Souza & Sieverd.; 6: Dentiscutata Sieverd., F.A. de Souza & Oehl e Quatunica F.A de Souza, Sieverd. & Oehl; 7: Orbispora Oehl, G.A. Silva & D.K. Silva e Bulbospora Oehl, Marinho & G.A. Silva; 8: Intraornatospora B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva; 9: Paradentiscutata B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva. ... 26 Figura 6. 1: Células auxiliares de Gigaspora margarita W.N. Becker & I.R. Hall e 2: Cetraspora pellucida (T.H. Nicolson & N.C. Schenck) Oehl, F.A. de Souza & Sieverd. (Escala aproximada). ... 27 Figura 7. Árvore filogenética proposta por Schüßler, Schwarzott e Walker (2001) para o filo Glomeromycota composto por quatro ordens, sete famílias e oito gêneros. ... 28 Figura 8. Interface simbiótica do fluxo bidirecional de nutrientes nos FMA e em Geosiphon pyriformis (Kütz.) F. Wettst. ... 29 Figura 9. Representação dos diversos tipos de inserção da hifa de sustentação em esporos glomoides lato sensu. ... 31 Figura 10. Glomerosporos de Palaeospora spainii Oehl, Palenz., Sánchez-Castro & G.A. Silva. 1: Glomerosporo sem rupturas da parede; 2: Glomerosporo “quebrado” para melhor observação das paredes. Legenda: MW: Middle Wall – parede média, IW: Inner Wall – parede interna, OW: Outer Wall – parede externa, SP: septum – septo. ... 33
Figura 11. Classificação dos FMA proposta por Spatafora et al. (2016), pertencentes ao subfilo Glomeromycotina. ... 36 Figura 12. Classificação atual do subfilo Glomeromycotina. ... 37 Figura 13: Extensão atual das áreas de Mata Atlântica no Brasil. Siglas em preto: estados brasileiros com áreas de Mata Atlântica; Siglas em vermelho: estados brasileiros ausentes de Mata Atlântica. ... 43 Figura 14. Áreas de Mata Atlântica. 1: Floresta primária de Mata Atlântica; 2: Área de manguezal. ... 45 Figura 15. Áreas de Caatinga. 1: Estação Ecológica Federal Raso da Catarina; 2: Parque Nacional Cavernas do Peruaçu. ... 47 Figura 16. Distribuição dos biomas terrestres brasileiros. ... 48 Figura 17. Exemplo de áreas de restinga. 1: vegetação herbácea; 2: Vegetação arbustiva-arbórea densa. ... 50 Figura 18. Fotos das áreas de estudo (Fonte: Google Earth). CLBI: Centro de Lançamento Barreira do Inferno; MG: Município de Galinhos; TB: Tabuleiro costeiro; FR: Floresta de restinga; NA: Áreas não alagáveis; AA: Áreas alagáveis. Os circulos em vermelho, nas subfiguras 2 e 3, correspondem a marcação dos transectos. ... 56 Figura 19. Áreas de coleta do CLBI. 1: Floresta de restinga, 2: Tabuleiro costeiro. ... 57 Figura 20. Precipitação pluviométrica acumulada mensal no município de Parnamirim/RN no ano de 2013. ... 58 Figura 21. Áreas de coleta no município de Galinhos. 1: área não submetida a alagamento (NA); 2: Área submetida a alagamento (AA). ... 59 Figura 22. Precipitação pluviométrica acumulada mensal no município de Galinhos/RN nos anos de 2014 (acima) e 2015 (abaixo). ... 60 Figura 23. Esquema representativo para a primeira etapa do wet shaking. 1: foto real do equipamento e seus anexos; 2: modelo didático da montagem do equipamento, indicando as peneiras empilhadas e seus respectivos diâmetros. Legenda: A: mangueira de entrada para água deionizada; B: mangueira de saída do fluxo de água deionizada e solo não retido. ... 64 Figura 24. Representação gráfica da análise de redundância (RDA) dos dados analisados no CLBI: em azul os íons do solo, em vermelho as espécies analisadas (duas letras iniciais do gênero, seguido de underline e as três primeiras letras do epiteto específico), em preto as parcelas analisadas, sob o nome de “row”. ... 71 Figura 25. Glomerosporos de Scutellospora sp. nov. 1-3: glomerosporos; 4-8: detalhes das paredes dos esporos onde: OWL: Outer wall layer (camada da parede externa), MWL: middle
wall layer (camada da parede média) e IWL: inner wall layer (camada da parede interna); 9-12: placa germinativa: GS (germinative shield); 13-15: detalhes do bulbo. ... 78 Figura 26. Glomerosporos de Cetraspora sp. Legenda: 1-3: glomerosporos em PVLG + Reagente de Melzer, onde 1, 3: detalhes gerais do esporo, 3: detalhes das camadas do esporo; 4: glomerosporos em PVLG. 5: glomerosporos em PVLG + reagente de Melzer. OWL: Outer wall layer (camada da parede externa), MW: middle wall (camada média) e IW: inner wall (parede interna); SC: sporiferous cell (célula suspensora, bulbo suspensor). ... 81 Figura 27. Glomerosporos de Rhizoglomus sp.1-2: glomerosporos em seu arranjo esporocárpico; 3-4: visão geral do glomerosporo em PVLG, 5: esporo em reagente de Melzer e detalhes do septo; 6: detalhes em relação à distinção das camadas L1 e L2. GS: glomerospore septum (septo do glomerosporo), SH: subtending hyphae (hifa de sustentação), L: layer (camada). ... 84 Figura 28. Glomerosporos de Acaulospora spinosissima. Legenda: A, C: Glomerosporos em PVLG + reagente de Melzer; B, D, E: Glomerosporos em PVLG. Neck: pescoço; sac: sáculo esporífero; cic: cicatriz; OW: outer wall (parede externa); MW: middle wall (parede média); IW: inner wall (parede interna); P: parasitose. ... 87 Figura 29. Glomerosporos de Glomus nanolumen. A, D: Esporos montados em PVLG. B, C, E-G: Esporos montados em reagente de Melzer. Legenda: OW: outer wall (parede externa), SH: subtending hypha (hifa de sustentação), GP: glomerospore pore (poro da hifa de sustentação). ... 89 Figura 30. Glomerosporos de Rhizoglomus microaggregatum. Legenda: 1, 3 e 6: glomerosporos montados em PVLG. 2, 4 e 5: Glomerosporos montados em reagente de Melzer. L: layer (camada), SH: subtending hypha (hifa de sustentação). ... 91 Figura 31. Comparativo quantitativo entre os métodos de extração de glomerosporos: wet shaking e “método tradicional”, sob diferentes tipos de solos. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey a 0,05. ... 93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Diversidade vegetal investigada no CLBI. FR: floresta de restinga; TC: tabuleiro costeiro; 1: planta presente na região associada à FMA; 0: planta presente na região sem detecção de FMA associados. ... 66 Tabela 2. Diversidade de FMA encontrada no Centro de Lançamento Barreira do Inferno e seus respectivos valores de frequência de isolados (IF). G: geral; FR: floresta de restinga; TC: tabuleiro costeiro. ... 67 Tabela 3. Valores médios das variáveis químicas do solo no Centro de Lançamento Barreira do Inferno. DP: Desvio padrão. ... 70 Tabela 4. Índices de diversidade de similaridade de Jaccard (SJij) e de Sorensen (SOij) no
Centro de Lançamento Barreira do Inferno (CLBI). PC: período chuvoso; PE: Período de estiagem; FR: Floresta de restinga; TC: tabuleiro costeiro. ... 70 Tabela 5. Diversidade e frequência relativa de isolados (IF) de FMA no município de Galinhos em áreas alagáveis (AA), não alagáveis (NA) e geral (G). ... 73 Tabela 6. Diversidade vegetal registrada no município de Galinhos. AA: Área alagável; NA: área não alagável; 1: vegetal analisado na área e presença de FMA associados observada; 0: vegetal analisado na área e presença de FMA associados não detectada. ... 73 Tabela 8. Variáveis químicas obtidas no município de Galinhos - RN ... 75 Tabela 7. Valores dos índices de similaridade de Jaccard (SJij) e Soresen (SOij) em Galinhos, em áreas alagáveis (AA), não alagáveis (NA), período de estiagem (PE) e período chuvoso (PC). ... 75
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1. Frequência relativa de isolados de FMA no Centro de Lançamento Barreira do Inferno e respectivos transectos na área de floresta de restinga (FR). ... 115 Apêndice 2. Frequência relativa de isolados de FMA no Centro de Lançamento Barreira do Inferno e respectivos transectos na área de tabuleiro costeiro (TC). ... 116 Apêndice 3. Organismos observados na rizosfera de Mitracarpus sp. no município de Galinhos/RN. ... 117 Apêndice 4. Matriz de presença/ausência da diversidade sazonal de FMA encontrada no município de Galinhos. NA: área não alagável; AA: área alagável; E: período de estiagem; C: período chuvoso. ... 117 Apêndice 5. Localização do município de Galinhos e da República de Benin. À esquerda: localização da cidade de Galinhos no Estado do RN (em vermelho); centro: localização do estado do RN no Brasil (vermelho); à direita: localização da República de Benin no continente africano. ... 118 Apêndice 6. Fotografias de parte das espécies obtidas no Centro de Lancamento barreira do Inferno: 1 – Acaulospora sp.; 2 – Gigaspora sp.; 3 – Glomus sp1; 4 – Glomus sp2; 5 – Simiglomus sp.; 6 – Scutellospora sp1. ... 118 Apêndice 7. Fotografias de parte das espécies obtidas no Município de Galinhos: 1 – Glomus sp1; 2 – Glomus sp2.; 3 – Racocetra sp.; 4 – Scutellospora sp2; 5 – Dentiscutata sp. ... 119
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL ... 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
2.1 FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES ... 19
2.1.1 Aspectos gerais ... 19
2.1.2 Histórico da classificação dos FMA ... 24
2.1.3 Diversidade de FMA ... 38
2.1.4 Ecologia de FMA ... 40
2.2. ECOSSITEMAS ESTUDADOS ... 42
2.2.1 Bioma Mata Atlântica ... 42
2.2.2 Bioma Caatinga ... 46
2.2.3 Áreas costeiras ... 48
2.3 FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES EM ÁREAS COSTEIRAS ... 51
3 OBJETIVOS ... 54
3.1 OBJETIVO GERAL ... 54
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 54
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 55
4.1 ÁREA DE ESTUDO ... 55
4.1.1 Centro de Lançamento Barreira do Inferno ... 55
4.1.2 Município de Galinhos ... 55
4.2 COLETA DE SOLO ... 56
4.3 EXTRAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE FMA ... 61
4.4 ANÁLISES MORFOLÓGICAS ... 61
4.5 DESCRIÇÕES DE ESPÉCIES ... 62
4.6 ANÁLISES ECOLÓGICAS ... 62
4.7 NOVA PROPOSTA DE EXTRAÇÃO DE GLOMEROSPOROS ... 64
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 66
5.1 CENTRO DE LANÇAMENTO BARREIRA DO INFERNO – CLBI ... 66
5.1.1 Diversidade de FMA ... 66
5.1.2 Frequência de isolados ... 68
5.1.3 Fatores edáficos ... 69
5.1.4 Variações nas comunidades de FMA ... 72
5.2.1 Diversidade de FMA ... 72
5.2.2 Frequência de isolados ... 74
5.2.3 Fatores edáficos ... 74
5.2.4 Variações nas comunidades de FMA ... 75
5.3 TAXONOMIA ... 76 5.3.1 Scutellospora sp nov... 77 5.3.2 Cetraspora sp nov. ... 80 5.3.3 Rhizoglomus sp nov. ... 83 5.3.4 Acaulospora spinosissima ... 85 5.3.5 Glomus nanolumen ... 88 5.3.6 Rhizoglomus microaggregatum ... 90
5.4 COMPARAÇÃO ENTRE METODOLOGIAS DE EXTRAÇÃO DE GLOMEROSPOROS ... 92
6 CONCLUSÕES ... 94
REFERÊNCIAS ... 95
1 INTRODUÇÃO GERAL
Fitofisionomias de regiões costeiras desenvolvem uma vegetação peculiar, capaz de se estabelecer em condições adversas, como baixas concentrações de nutrientes no solo ou hipersalinidade, em decorrência da proximidade com o oceano (MORAES, DELITTI e STRUFFALDI-DE-VUONO, 1999; SANTIAGO, PASSAVANTE e SILVA-CUNHA, 2005). Dentre as diferentes estratégias da vegetação local para sua sobrevivência, merece destaque a associação com os fungos micorrízicos arbusculares (FMA), atuantes principalmente por favorecer o crescimento vegetal em condições estressantes (SMITH e READ, 2008). Essa relação micorrízica é a mais difundida na natureza, ocorrendo em praticamente toda a superfície terrestre (SIQUEIRA, LAMBAIS e STÜRMER, 2002; SMITH e READ, 2008).
A ocorrência dessa relação simbiótica coincide com o próprio surgimento das plantas terrestres, sendo a maior parte dos vegetais atuais, dependentes dessa associação de forma total ou parcial para sua sobrevivência (CAIRNEY, 2000; WANG e QIU, 2006; SMITH e READ, 2008). Nessa associação as plantas beneficiam os FMA parceiros com parte de seus metabolitos fotosintetizados, enquanto os fungos simbiontes funcionam como uma extensão da raiz vegetal absorvendo macro e micronutrientes que são direcionados a planta, além de reduzir os efeitos de estresses hídricos e a atuação de parasitas (SIQUEIRA, LAMBAIS e STÜRMER, 2002; BAGO et al., 2003; MARX, 2004; SMITH e READ, 2008; PARNISKE, 2008; DRIGO et al., 2010).
Atualmente os FMA encontram-se inseridos no subfilo Glomeromycotina (SPATAFORA et al., 2016), filo Mucoromycota, com cerca de 300 espécies descritas (LABORATÓRIO DE BIOLOGIA DE MICORRIZAS, 2018). Segundo Corradi e Lildhar (2012) essa diversidade seria um resultado esperado, uma vez que não há evidências definitivas de reprodução sexuada por parte desses organismos. Outros pesquisadores consideram que essa diversidade relativamente baixa para um subfilo fúngico seria consequência da limitação dos caracteres morfológicos utilizados para delimitar as espécies do grupo, focadas no glomerosporo, além das limitações dos métodos de coleta desses organismos (BEVER et al., 2001; SOUZA, SILVA e BERBARA, 2008). Os principais argumentos que sustentam a hipótese de uma real super-diversidade de FMA se baseiam na origem ancestral da associação e o longo período de coevolução entre plantas e FMA. Ainda, estimativas apontam que a diversidade descrita para esses organismos representaria menos de 1% da diversidade real do grupo (BEVER et al., 2001; DOZTLER et al., 2006; 2009; KRINGS et al., 2007).
No entanto a observação desses organismos se limita ao glomerosporo e os períodos de produção dessas estruturas variam dependendo da espécie e de fatores externos, geralmente reduzindo conforme a disponibilidade de água e nutrientes do solo (BEVER et al., 2001; MOHAMMAD, HAMAD e MALKAWI, 2003; PANWAR e TARAFDAR, 2006; PANWAR et al., 2011).
A eficiência na coleta de glomerosporos é influenciada por vários fatores, tanto no campo, como número de amostras e condições ambientais do local (ex. clima e disponibilidade de chuvas) quanto nas culturas armadilha (ex. solo e espécie vegetal utilizada), e principalmente o método de extração dos glomerosporos (BEVER et al., 2001), com diferentes níveis de eficiência, rapidez e custo. Dessa forma, a busca por metodologias de extração mais eficientes, além de contribuir com estudos taxonômicos, favorece analises ecológicas reduzindo flutuações no numero de glomerosporos obtidos, contrubindo para analises mais precisas sobre padrões de distribuição desses organismos.
Estudos sobre a diversidade de FMA são predominantes nos ambientes terrestres, entretanto ambientes aquáticos apresentam uma elevada proporção de taxa virtuais (MOORA et al., 2016). Nessas condições, os FMA podem apresentar estratégias próprias para favorecer seus parceiros vegetais, principalmente em regiões de estresse salino (RUIZ-LOZANO e AZCÓN, 2000; EVELIN, KAPOOR e GIRI, 2009). Nesses ambientes, pouco se sabe sobre a atuação desses simbiontes (MILLER, 2000; YPSILANTIS, 2007; WANG et al., 2010). Os experimentos conduzidos em situações de alagamento focam na colonização radicular, carecendo em estudos voltados a diversidade (MILLER, 2000; BAUER et al., 2003), podendo fornecer informações preciosas, contribuindo com o conhecimento sobre a origem a filogenia desses organismos (MOORA et al., 2016).
De forma geral, os FMA são organismos essenciais para os ecossistemas onde se encontram inseridos, reduzindo os efeitos de materiais tóxicos no solo, facilitando a absorção de nutrientes e reduzindo o uso de fertilizantes na agricultura, os caracterizando como ferramentas úteis na recuperação de áreas degradadas (PARNISKE, 2008; HELGASON e FITTER, 2005; SMITH e READ, 2008; GONZÁLEZ-CHÁVEZ et al., 2004).
O estudo dos FMA é fundamental para a compreensão das comunidades vegetais, uma vez que esses organismos são essenciais para a estabilização destas, notadamente em regiões onde a fertilidade do solo é fator limitante como em áreas de restinga (van der van der HEIJDEN, BARDGETT e van STRAALEN, 2008, SOUZA et al., 2010).
Novas descobertas podem ser úteis para melhor entender e delimitar os representantes desse subfilo (SOUZA, 2003; HELGASON e FITTER, 2005), auxiliando na compreeensão
das complexas interações das comunidades da microbiota do solo (RODRIGUES e GANDOLFI, 2004; CAVALCANTE et al., 2009; MAIA et al., 2010; PAGANO et al., 2011). Isso contribui de forma significativa na política de desenvolvimento sustentável e na manutenção de ecossistemas, uma vez que os FMA constituem recurso biológico utilizado na manutenção da diversidade e produtividade das plantas, especialmente em solos tropicais pobres, podendo ainda ser considerados indicadores da qualidade do solo (CAVALCANTE, GOTO e MAIA, 2009; MAIA et al., 2010; PAGANO et al., 2011).
Dessa forma este trabalho foi composto por três objetivos principais: a) determinar a composição de FMA em uma área costeira de Mata Atlantica (Centro de Lançamento Barreira do Inferno) e avaliar se a composição química do solo exerce influencia sobre a distribuição desses organismos nas comunidades onde estão inseridos; b) determinar a diversidade de FMA em uma área costeira de Caatinga (Peninsula de Galinhos) e avaliar a influencia do alagamento na composição desses fungos; c) testar uma nova metodologia de extração de glomerosporos (aqui batizada wet shaking) como uma nova alternativa de obtenção dessas estruturas, com maior eficiência para tal.
Portanto esse trabalho visa contribuir não apenas com novos dados acerca da diversidade de FMA em lugares ainda não explorados, mas também contribuir com respostas sobre padrões ecológicos desses organismos, e propor uma nova alternativa para obtenção desses organismos, aumentando a precisão de estudos ecológicos no grupo.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES
2.1.1 Aspectos gerais
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA), subfilo Glomeromycotina (SPATAFORA et al., 2016), são simbiontes obrigatórios de raízes de um vasto número de táxons vegetais, colonizando desde briófitas, pteridófitas, até gimnospermas e angiospermas (SMITH e READ, 2008). Esses fungos promovem aos vegetais associados uma maior tolerância a estresses bióticos e abióticos, favorecendo o crescimento desses organismos por translocar uma maior quantidade de íons de baixa mobilidade no solo, essencialmente o fósforo (P), para o vegetal, enquanto se beneficiam dos carboidratos produzidos, pois são incapazes de saprotrofia (HELGASON e FITTER, 2005; SMITH e READ, 2008).
A micorriza arbuscular é um tipo de associação extremamente difundida na natureza (SIQUEIRA, LAMBAIS e STÜRMER, 2002; SMITH e READ, 2008), ocorrendo desde áreas árticas (CABELLO, GASPAR e POLLERO, 1994), desérticas (YANG, CHEN e LI, 2008), até áreas de floresta boreal (ÖPIK et al., 2008) e tropical (GOTO et al., 2011), favorecendo o estabelecimento de comunidades vegetais, especialmente quando a fertilidade do solo é o fator limitante, como nos trópicos (van der HEIJDEN, BARDGETT e van STRAALEN, 2008; SOUZA et al., 2010).
Dentre os diferentes tipos de associações micorrízicas existentes, a micorriza arbuscular é o tipo ancestral predominante em plantas terrestres ocorrendo em várias linhagens, desde as mais antigas, como as hepáticas até as angiospermas (SMITH e READ, 2008). Essa ancestralidade sugere que a origem dessa associação coincide com a das plantas terrestres (CAIRNEY, 2000; WANG e QIU, 2006; SMITH e READ, 2008). Essa relação é considerada o direcionador da colonização vegetal no ambiente terrestre além de permitir elevadas taxas, em escala global, de transferência de nutrientes e sequestro de carbono (SMITH et al., 2010; BONFANTE e GENRE, 2010). Além disso, relações filogenéticas de genes vegetais associados ao transporte de fósforo (P) indicam seu envolvimento no transporte do íon por centenas de milhares de anos com grande conservação da expressão gênica (KARANDASHOV e BUCHER, 2005).
Registros fósseis sugerem que essa relação pode ter surgido entre 400 e 460 milhões de anos atrás, compreendendo do período Ordoviciano ao Devoniano, provavelmente uma etapa essencial para que as plantas colonizassem o ambiente terrestre (REDECKER; KODNER; GRAHAM, 2000; DOZTLERET al., 2006; 2009; SILVA, 2008; SMITH e READ,
2008). Esses dados servem de base para a possibilidade dessa associação ter evoluído de ambientes aquáticos, uma vez que as primeiras plantas terrestres encontraram um ambiente pobre em nutrientes e vulnerável à desidratação (BLACKWELL, 2000). Além disso, suas raízes eram desprovidas de pêlos radiculares ou ramificações, originando estruturas similares a rizoides, sem tecidos vasculares, semelhante às pteridófitas e briófitas atuais (RAVEN e EDWARDS 2001; DOTZLER et al., 2006; 2009; BERBARA, SOUZA e FONSECA, 2006).
Nesse ambiente ancestral, os FMA foram imprescindíveis para tornar o ambiente terrestre favorável ao desenvolvimento vegetal, melhorando as condições do solo para plantas associadas, ao estabilizar agregados (BORIE, RUBIO e MORALES, 2008) e permitir uma maior aeração e drenagem de água (WRIGHT e UPADHYAYA, 1998).
Figura 1. Visualização do arbúsculo por microscopia ótica.
Fonte: http://mycor.nancy.inra.fr/.
O nome “arbuscular” refere-se às estruturas características do grupo, os arbúsculos (Figura 1), formados a partir da diferenciação de hifas intracelulares ocorrentes no tecido cortical de raízes vegetais colonizadas por FMA (GIANINAZZI-PEARSON, 1996). Essas estruturas têm por função o transporte de nutrientes entre os envolvidos na simbiose, onde o fungo facilita a absorção de água e nutrientes, como fosfatos e nitrogênio, para a planta simbionte e, em troca, recebe cerca de 20-30% dos fotossintéticos vegetais na forma de carboidratos ou lipídios (SIQUEIRA, LAMBAIS e STÜRMER, 2002; BAGO et al., 2003; MARX, 2004; SMITH e READ, 2008; PARNISKE, 2008; DRIGO et al., 2010).
Os vegetais associados apresentam melhor desempenho na absorção de nutrientes devido as hifas serem geralmente 10 vezes mais finas que as raízes, dessa forma, o custo para a planta produzir uma unidade de comprimento de hifas é, pelo menos, 100 vezes menor que o da produção de uma mesma unidade de comprimento de raiz. Assim é possível para a planta uma maior área de absorção de nutrientes, através do micélio externo do fungo, com um menor custo energético para sua produção (HELGASON e FITTER, 2005; PARNISKE, 2008).
Os micélios externos dos FMA formam um entrelaçado de hifas e produzem uma glicoproteína denominada glomalina, que atua na agregação do solo e seus nutrientes, assim como matéria orgânica, impedindo desgaste do solo, além de reduzir o efeito de componentes tóxicos (WRIGHT et al., 1996; WRIGHT e UPADHYAYA, 1998; GONZÁLEZ-CHÁVEZ et al., 2004; SMITH e READ, 2008).
Na micorriza arbuscular, uma determinada espécie fúngica pode colonizar raízes de grupos vegetais variados, incluindo espécies de interesse econômico como: milho, sorgo, Citrus, entre outras (SIQUEIRA, 1994; BAGO et al., 2003; MARX, 2004; SMITH e READ, 2008). Eventos recentes na evolução da simbiose micorrízica de plantas ancestrais e fungos de vida livre podem ter requerido um conjunto de mutações recíprocas para ambos envolvidos, possibilitando a evolução de sistemas de reconhecimento que facilitassem a colonização das plantas terrestres atuais por seus respectivos taxa de FMA (CAIRNEY, 2000). Essa colonização se dá através de uma constante troca de moléculas sinalizadoras, principalmente estrigolactona, como sinalizador vegetal, estimulando o metabolismo do fungo, e este produz sinais moleculares como os “Myc Factors” que desencadeiam respostas na raiz vegetal, permitindo a formação de endomicorrizas (Figura 2) por parte do FMA (PARNISKE, 2008).
A formação dessa associação é favorecida por alguns fatores, como a deficiência de nutrientes no solo e presença de parasitas, tornando as plantas mais susceptíveis a formação da micorriza arbuscular, além disto, fatores como competição com outros vegetais influenciam na colonização por FMA, e estes influenciam a diversidade e a eficiência vegetal (VERESOGLOU, MENEXES e RILLIG, 2012). Esses fungos diferem em sua morfologia extra e intrarradicular, assim como em seus efeitos na nutrição vegetal, crescimento e susceptibilidade a colonização por outros fungos do solo e possuem a habilidade de proteger as plantas de patógenos como fungos e nematoides atuando como controladores biológicos (VERESOGLOU e RILLING, 2012), sendo os glomerosporos glomóides os mais específicos para esta função (KLIRONOMOS, 2000).
Figura 2. Esquema da colonização de raízes por FMA.
Fonte: Parniske, 2008 (modificado).
Cada micorriza arbuscular apresenta características próprias que variam em função das espécies fúngicas e vegetais envolvidos. Esses fatores influenciam não apenas a morfologia, mas a taxa de absorção e transferência de nutrientes da associação (FEDDERMANN et al., 2010), mostrando que há geralmente uma ou mais combinações ótimas entre espécie de planta e espécie de FMA, medidas pelo desempenho da planta. Essas evidências sugerem que alguns fungos querem entregar mais "benefícios", tanto na forma de proteção a patógenos quanto na transferência de nutrientes a seus “anfitriões”, ou propondo um menor custo em relação aos seus competidores. Entretanto, as grandes diferenças funcionais que existem entre os FMA atuais podem sugerir que algumas associações planta/FMA podem apresentar um maior caráter mutualista ou parasitário em relação a outras (JOHNSON, GRAHAM e SMITH, 1997; HELGASON e FITTER, 2009) e que alguns desses fungos apresentariam uma possibilidade para tendências de parasitar o parceiro vegetal, absorvendo os metabólitos vegetais, mas sem fornecer quaisquer benefícios em troca (JOHNSON, GRAHAM e SMITH, 1997; HELGASON e FITTER, 2009).
Como consequência dessas relações de “mutualismo/parasitismo”, algumas plantas desenvolveram estratégias de “negar acolhimento” ao fungo ou atuar em uma coevolução mais íntima com o FMA, sendo mais específica. No último caso, o desempenho do fungo estaria diretamente associado ao da planta, sugerindo que esta tenha a capacidade de
selecionar seu parceiro “preferido”, formando associações específicas (van der HEIJDEN et al., 1998; van der HEIJDEN, WIEMKEN e SANDERS, 2003; KIERS e van der HEIJDEN, 2006).
Portanto, essa associação apresenta uma regulação bidirecional, podendo as plantas detectarem, discriminarem ou recompensarem seus melhores parceiros com mais carboidratos, enquanto que os fungos, por sua vez, transferem mais nutrientes para as raízes que fornecem mais carboidratos, tornando esse mutualismo evolutivamente estável em função da regulação mutua existente na associação (KIERS et al., 2011).
Sendo assim, a seleção natural estaria elegendo, sincronicamente, fungo e vegetal ao longo da história evolutiva dos simbiontes. Essa relação entre plantas e FMA é frequentemente assumida como mutualismo, devido à aptidão de ambos os parceiros ser maior na associação em relação ao crescimento independente. No caso dos fungos, esse é comprovadamente verdadeiro, pois eles não podem crescer de forma independente (HELGASON e FITTER, 2009; SMITH e READ, 2008).
As comunidades vegetais são majoritariamente influenciadas pela comunidade de FMA. Estes não são necessariamente específicos em sua colonização, porém algumas combinações podem não resultar na formação da micorriza devido especificidades em suas funções ecofisiológicas, não podendo ser considerados generalistas. Devido essas singularidades, deve ser enfatizada a necessidade de considerar a diversidade de FMA um ponto importante na manutenção e restauração de comunidades vegetais (KLIRONOMOS, 2000).
Portanto, a diversidade de FMA estaria associada à identidade dos vegetais associados, onde o fungo deve manter uma oferta de fosfatos nos arbúsculos, aumentar o fluxo de carbono (C) na raiz e interagir com os mecanismos vegetais de sinalização (HELGASON e FITTER, 2009; BERBARA, SOUZA e FONSECA, 2006). No entanto, também se deve considerar a interação dos FMA com o solo, sendo este um fator mais influente na especiação do grupo, porém uma área ainda carente de estudos. Sabe-se que as principais influências no processo são os fatores físicos, tais como estresse hídrico e de temperatura; fatores químicos como pH, toxinas e disponibilidade de nutrientes e fatores bióticos, como pastagem de Collembola e parasitismo por Chytridiomycota (OLSSON et al., 1999; OLSSON e JOHANSEN, 2000; HELGASON e FITTER, 2009).
Os FMA podem atuar estimulando a atividade microbiológica, elevando a fertilidade e atividades de enzimas do solo e tem um papel importante em melhorar o sequestro de carbono
do solo, o que é muito importante para solos recuperados ou em estado de recuperação (KUIMEI¸ LIPING e NINGNING, 2012).
2.1.2 Histórico da classificação dos FMA
O registro mais antigo dos fungos micorrízicos arbusculares data de 1844 com a criação do gênero Glomus Tul. & C. Tul. e a descrição de duas espécies: G. macrocarpus Tul. & C. Tul. e G. microcarpus Tul. & C. Tul. por Tulasne e Tulasne (Figura 3), sendo estas espécies posteriormente transferidas para Endogone Link, em 1851, pelos mesmos autores. Posteriormente, Berkeley e Broome (1873) descrevem o segundo registro destes organismos, propondo o gênero Sclerocystis Berk. & Broome, ambos os gêneros pertencentes, na época, à família Endogonaceae, ordem Mucorales.
Figura 3. Detalhes esporocárpicos e de glomerosporos de Glomus macrocarpum Tul. & C. Tul. À esquerda: esporos formando um arranjo esporocárpico; à direita: detalhes das camadas de parede do esporo (SWL: Spore wall layer) e da hifa de sustentação (Sh: Subtending hypha).
Fonte: http://www.zor.zut.edu.pl.
Quase meio século depois, Thaxter (1922) realizou a primeira revisão taxonômica da família Endogonaceae, na época contendo os gêneros Endogone, Sclerocystis, Glaziella Berk. e Sphaerocrea Sacc. & Ellis, onde os dois últimos não formavam micorriza arbuscular. Posteriormente, em 1974, Gerdemann & Trappe, propuseram uma nova classificação, transferindo todas as espécies atualmente consideradas FMA contidas em Endogone para Glomus e criando os gêneros Acaulospora Gerdemann & Trappe e Gigaspora Gerdemann & Trappe, sendo o primeiro criado a partir de uma espécie nova para a ciência, cujo esporo se desenvolve lateralmente a um sáculo esporífero (Figura 4.1), e o segundo gênero criado a partir de espécies transferidas de Endogone, cujo esporo apresenta crescimento a partir do bulbo suspensor (Figura 5).
Ames e Schneider (1979) observando esporos de Glomus infrequens Hall, concluíram que estes aparentavam maior semelhança com esporos de Acaulospora, porém o desenvolvimento destas estruturas ocorre internamente ao sáculo esporífero, dando origem ao nome do novo gênero proposto: Entrophospora Ames & Schneid. (Figura 4.2).
Figura 4. Desenvolvimento ontogenético de esporos acaulosporoides e entrofosporoides: 1: Acaulospora foveata Trappe & Janos, 2: Entrophospora infrequens (I.R. Hall) R.N. Ames & R.W. Schneid. A sequência das setas segue do surgimento do sáculo esporífero a maturação do esporo.
Fonte: http://invam.caf.wvu.edu (modificado pelo autor).
Walker e Sanders (1986) analisando esporos de Gigaspora, quanto à estrutura da parede, características germinativas e ornamentação das células auxiliares, propuseram a criação de Scutellospora Walker & Sanders. A principal característica do novo gênero seria a presença de uma estrutura denominada placa germinativa ou escudo (Figura 5), porém, outra diferença reside na forma das células auxiliares, equinuladas em Gigaspora e nodosa Scutellospora (Figura 6).
Em 1989, Pirozynski & Dalpé descreveram a primeira família composta apenas por FMA: Glomaceae, incluindo os gêneros Glomus e Sclerocystis, com base em evidências fósseis, incluindo esporos intrarradiculares fossilizados de 400 Milhões de anos, análogos a esporos de Glomus e Sclerocystis.
No ano seguinte, Morton e Benny (1990), baseando-se no trabalho de Morton (1990), sugerem uma nova classificação, sustentada por dados ontogenéticos e modo de germinação dos esporos, segregando Endogonales e dando origem a Glomales, composta exclusivamente por organismos formadores da micorriza arbuscular. O que não ocorre em Endogone, que apresenta organismos sapróbios ou ectomicorrízicos facultativos. Ainda reforçando o caráter monofilético dos FMA, Cavalier-Smith (1998) propôs a criação de Glomeromycetes, elevando-os a categoria de classe.
Dez anos depois, Redecker, Morton e Bruns (2000), iniciando o uso de dados moleculares para FMA, propuseram a sinonimização do gênero Sclerocystis com Glomus, transferindo Sclerocystis coremioides Berk. & Broome, para Glomus, passando este a ser o único gênero abrigando espécies esporocárpicas. Além disso, nesse trabalho se iniciam as evidências de que os esporos glomóides não formam um clado monofilético.
Figura 5. Representação de glomerosporos e placas germinativas dos principais gêneros da ordem Gigasporales. 1: Glomerosporos de Gigaspora Gerd. & Trappe e 2: Scutellospora C. Walker & F.E. Sanders; 3 – 9: placas germinativas encontradas nos esporos com bulbo suspensor, caracterizando os gêneros propostos; 3: Scutellospora; 4: Fuscutata Oehl, F.A. Souza & Sieverd.; 5: Cetraspora Oehl, F.A. de Souza & Sieverd. e Racocetra Oehl, F.A. de Souza & Sieverd.; 6: Dentiscutata Sieverd., F.A. de Souza & Oehl e Quatunica F.A de Souza, Sieverd. & Oehl; 7: Orbispora Oehl, G.A. Silva & D.K. Silva e Bulbospora Oehl, Marinho & G.A. Silva; 8: Intraornatospora B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva; 9: Paradentiscutata B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva.
Fonte: Oehl, Souza e Sieverding, 2008; Silva et al., 2008, Goto et al., 2012a.
Também utilizando dados moleculares, Morton e Redecker (2001) propuseram as famílias Archaeosporaceae e Paraglomaceae, com os gêneros Archaeospora Morton & D. Redecker e Paraglomus Morton & Redecker, respectivamente. Por outro lado, os novos
táxons foram caracterizados morfologicamente de forma limitada, principalmente Paraglomus, porém os autores exploram uma nova abordagem na caracterização, como os aspectos relacionados a formação micorrízica e a reação das hifas ao azul de tripano.
Figura 6. 1: Células auxiliares de Gigaspora margarita W.N. Becker & I.R. Hall e 2: Cetraspora pellucida (T.H. Nicolson & N.C. Schenck) Oehl, F.A. de Souza & Sieverd. (Escala aproximada).
Fonte: http://invam.wvu.edu/ (modificado pelo autor)
O grande passo nessa nova etapa de uso de ferramentas moleculares ocorreu quando Schüßler, Schwarzott e Walker (2001), através de análises de pequenas subunidades (SSU- Small subunit) de RNA ribossomal (rRNA), confirmaram o caráter monofilético dos FMA, agora elevando o grupo a categoria de filo (Glomeromycota), e dividindo o táxon em quatro ordens: Archaeosporales, Diversisporales, Glomerales e Paraglomerales (Figura 7). Nessa nova proposta, a ordem Archaeosporales apresenta a família Archaeosporaceae, na época considerada parafilética, e a família monoespecífica Geosiphonaceae com Geosiphon pyriforme (Kütz.) F. Wettst. que forma endossimbiose com cianobactérias do gênero Nostoc (SCHÜßLER et al., 1994), apresentando uma interface simbiótica semelhante, em alguns pontos, à micorriza arbuscular (Figura 8).
Oehl e Sieverding (2004) propuseram a criação do gênero Pacispora Sieverd. & Oehl, com base em dados morfológicos do modo de germinação dos esporos, incluindo-o na família Glomeraceae. O gênero é caracterizado pela formação dos esporos terminalmente à hifa de sustentação (glomóides), característica compartilhada com Glomus, Diversispora C. Walker & A. Schüßler emend. G.A. Silva, Oehl & Sieverd. e Paraglomus, porém a germinação ocorre diretamente pela parede do esporo, a partir de uma estrutura especializada de germinação (orb), característica partilhada com Acaulospora, Scutellospora e Entrophospora. Outra característica peculiar deste táxon consiste na produção de células auxiliares produzidas
dentro e fora das raízes, de aspecto nodoso, semelhante às produzidas em Scutellospora (BLASZKOWSKI, 2003).
Figura 7. Árvore filogenética proposta por Schüßler, Schwarzott e Walker (2001) para o filo Glomeromycota composto por quatro ordens, sete famílias e oito gêneros.
Fonte: Schüßler, Schwarzott e Walker (2001).
No mesmo ano, Walker et al. (2004) descreveram o gênero Gerdemanniae C. Walker, Błaszk., Schüßler & Schwarzott, da nova família Gerdemanniaceae, utilizando análises SSU rDNA e características morfológicas, como a hifa de sustentação e reação em Melzer, parâmetros similares aos utilizados por Oehl e Sieverding (2004). Essa família monogenérica seria caracterizada por esporos glomóides, com parede interna de componentes amilóides, sofrendo reação em contato com o reagente de Melzer e germinação a partir de uma placa. Porém esta proposta foi considerada inválida pelo princípio da prioridade do Código de Nomenclatura Botânica, uma vez que a espécie tipo utilizada, Glomus scintillans S.L. Rose & Trappe, à época denominada Gerdemannia scintillans (S.L. Rose & Trappe) C. Walker, Blaszk., A. Schüßler & Schwarzott, é a mesma utilizada por Oehl e Sieverding (2004) para propor Pacispora Oehl & Sieverd quatro meses antes.
Analisando espécies de Entrophospora, Sieverding e Oehl (2006) descreveram os gêneros Kuklospora Oehl & Sieverd. (K. colombiana (Spain & N.C. Schenck) Oehl & Sieverd. e K. kentinensis (C.G. Wu & Y.S. Liu) Oehl & Sieverd.) e Intraspora (I. schenckii (Sieverd. & S. Toro) Oehl & Sieverd.) dentro da nova família Entrophosporaceae, baseados na morfologia dos esporos e nas características de colonização radicular. A criação desta família se deu em função das diferenças morfológicas de Entrophospora e os esporos de Acaulosporaceae: Acaulospora e Kuklospora.
Figura 8. Interface simbiótica do fluxo bidirecional de nutrientes nos FMA e em Geosiphon pyriformis (Kütz.) F. Wettst.
Fonte: Schüßler et al., 2006.
Ainda no mesmo ano, Spain, Sieverding e Oehl (2006) propuseram a criação do gênero Appendicispora Spain, Oehl & Sieverd. e da família Archaeosporaceae J.B. Morton & D. Redecker com base em análises morfológicas. A diferença entre Appendicispora e Archaeospora seria que o primeiro apresenta três paredes no esporo acaulosporoide, enquanto que o segundo apresenta apenas duas paredes.
Walker et al. (2007a), através de dados morfológicos e moleculares, elucidam o polifiletismo da família Archaeosporaceae, devido sua relação com Geosiphonaceae (SCHÜßLER, SCHWARZOTT e WALKER, 2001) (Figura 7), propondo a família Ambisporaceae, caracterizada por FMA capazes de produzir esporos glomoides,
acaulosporoides ou ambos. Entretanto, os autores reconheceram que a proposta de Ambispora C. Walker, Vestberg & A. Schüßler e Ambisporaceae não é considerada válida, pois a revisão de Spain, Sieverding e Oehl (2006) da família Archaeosporaceae é favorecida pelo princípio da prioridade do Código Internacional de Nomenclatura Botânica, propondo então a criação da família Appendicisporaceae em vez de Ambisporaceae. Posteriormente Walker (2008) observa que Appendicispora é um homônimo de Appendicospora K.D. Hyde (1995) gênero monoespecífico do filo Ascomycota Caval.-Sm. (CAVALIER-SMITH, 1998), consequentemente legitimando os nomes Ambispora e Ambisporaceae.
Palenzuela et al., (2008) propuseram o gênero Otospora Oehl, J. Palenzuela & N. Ferrol, dentro da família Diversisporaceae, caracterizado por esporos acaulosporóides constituídos de duas paredes, caráter compartilhado com Archaeospora. A diferença entre os gêneros decorre de o primeiro apresentar parede externa mais complexa, com quatro camadas. Oehl, Souza e Sieverding (2008) através de sequências de rRNA 18S e 25S, e dados morfológicos, como o número de paredes e a morfologia das placas germinativas, reorganizaram as espécies de Scutellospora em três novas famílias e cinco novos gêneros: Scutellosporaceae (Scutellospora), Racocetraceae (Racocetra Oehl, F.A. de Souza & Sieverd., Cetraspora Oehl, F.A. de Souza & Sieverd.) e Dentiscutataceae (Dentiscutata Sieverd., F.A. de Souza & Oehl, Fuscutata Oehl, F.A. Souza & Sieverd. e Quatunica F.A de Souza, Sieverd. & Oehl) (Figura 5.3-6). Dois anos depois, Morton e Msiska (2010), com base em análises moleculares de genes 25S rRNA e β-tubulina concatenados argumentam que, dos clados propostos por Oehl, Souza e Sieverding (2008), apenas Racocetra seria um clado bem sustentado. Porém Oehl et al. (2011c) refutam estes dados argumentando que os genes 25S rRNA e β-tubulina possuem taxa de substituição dos nucleotídeos diferentes, sendo mais apropriado analisar as sequências isoladamente.
Em 2010, Schüßler e Walker revisam o filo Glomeromycota a partir de dados predominantemente moleculares, propondo a nova família Claroideoglomeraceae a partir de Glomeraceae, família esta que adquiriu dois novos gêneros: Funneliformis C. Walker & A. Schüßler e Rhizophagus P.A. Dang. Além disso, desconsiderando a sinonimização de Glomus e Sclerocystis proposta por Redecker, Morton e Bruns (2000), foi proposto o gênero Redeckera, inserido em Diversporaceae. Devido a predominância de análises moleculares, muitas espécies permaneceram como “espécies de posição incerta” sendo descritas em seus gêneros originais. Além de propor novos táxons os autores não consideram a proposta Oehl, Souza e Sieverding (2008), argumentando que os caracteres morfológicos analisados eram
insubsistentes (MORTON e MSISKA, 2010) e sinonimizam Intraspora e Archaeospora conforme proposto por (KAONONGBUA, MORTON e BEVER, 2010).
Oehl et al. (2011a) revisando as ordens Glomerales e Diversisporales, reorganiza as espécies de desenvolvimento glomóides, por meio de análises de sequências ribossomais combinadas a análises morfológicas, propondo os gêneros Simiglomus Sieverd., G.A. Silva & Oehl, Septoglomus Sieverd., G.A. Silva & Oehl e Viscospora Sieverd., Oehl & G.A. Silva. A principal característica para distinção destes gêneros consiste na forma da inserção entre a hifa de sustentação e o glomerosporo (Figura 9). Desta forma, ampliando a análise de caracteres morfológicos nos FMA em vez de focar apenas no glomerosporo, dando suporte para futuras propostas de gêneros glomoides lato sensu, Oehl et al. (2011c), Sieverding et al. (2014), Blaszkowski et al. (2015) e Oehl et al. (2011a) propuseram a invalidação de Sclerocystis e Rhizophagus, por não apresentarem suporte filogenético.
Figura 9. Representação dos diversos tipos de inserção da hifa de sustentação em esporos glomoides lato sensu.
Fonte: Oehl et al. 2011a (modificado).
Oehl et al. (2011b) descreveram o gênero Orbispora Oehl, G.A. Silva & D.K. Silva, dentro da família Scutellosporaceae. O gênero proposto é caracterizado, principalmente, por apresentar glomerosporos com uma placa germinativa monolobada de coloração variando de hialina a sub-hialina (Figura 5.7).
Oehl et al. (2011c), utilizando sequências parciais de β-tubulina e rRNA (SSU e LSU) obtidas de bancos de dados públicos ou isoladamente, propuseram as classes
Archaeosporomycetes e Paraglomeromycetes, além de elevar os esporos gigasporóides lato sensu a categoria de ordem, propondo Gigasporales.
Oehl et al. (2011d) através, principalmente, de análises de genes ribossomais, demonstraram que o gênero Entrophospora não é monofilético, e que sua espécie tipo E. infrequens (I.R. Hall) R.N. Ames & R.W. Schneid., se encontra mais relacionada com as espécies de Claroideoglomus C. Walker & A. Schüßler, dando suporte à transferência da família Entrophosporaceae da ordem Diversisporales para Glomerales, assim como as espécies consideradas ancestrais de Claroideoglomus para Albahypha Oehl, G.A. Silva, B.T. Goto & Sieverd. gen. nov. (Diversiporaceae) e propondo dois novos gêneros: Tricispora Oehl, Sieverd., G.A. Silva & Palenz. e Sacculospora Oehl, Sieverd., G.A. Silva, B.T. Goto, I.C. Sánchez & Palenzuela. Albahypha (Entrophosporaceae) difere do gênero Claroideoglomus pela sua hifa de sustentação hialina e em forma de funil, característica do gênero, Tricispora (Diversisporaceae) é caracterizada por duas cicatrizes conspícuas observadas após a remoção do sáculo esporífero, Sacculospora foi caracterizada por seu sáculo esporífero reduzido e foi inserido em Sacculosporaceae fam. nov.
Goto et al. (2012a) através de análises de LSU rRNA, propuseram a criação da família Intraornatosporaceae B.T. Goto & Oehl, e dois gêneros: Intraornatospora B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva e Paradentiscutata B.T. Goto, Oehl & G.A. Silva, este composto pelas espécies P. bahiana Oehl, Magna, B.T. Goto & G.A. Silva e P. maritma B.T. Goto, D.K. Silva, Oehl & G.A. Silva, além de mover Racocetra intraornata B.T. Goto & Oehl, para Intraornatospora. Os dois novos gêneros são caracterizados pela presença de camadas ornamentadas, sendo Intraornatospora caracterizada pela presença de ornamentações na superfície interna da parede externa e Paradentiscutata, pela presença de ornamentação da parede interna da camada média. Outra característica de Paradentiscutata está em sua placa germinativa que, embora similar a Dentiscutata, apresenta lóbulos maiores e menos numerosos (Figura 5.6-9), enquanto que Intraornatospora apresenta placa germinativa similar a Racocetra, porém com menor quantidade de lóbulos (4 - 6) (Figura 5.5), enquanto que Racocetra apresenta de 4 a 12 lóbulos e placa germinativa de arranjo ondular (Figura 5.8).
Blaszkowski (2012) descrevem o gênero monoespecífico Corymbiglomus Blaszk. & Chwat, posteriormente Blaszkowski e Chwat (2013), através de análises de LSU, transferem as espécies Glomus globiferum Koske & C. Walker e G. tortuosum N.C. Schenck & G.S. Sm. para o novo clado, caracterizado por glomerosporos formados a partir de esporóforos ramificados, raramente singulares no solo com a produção de esporóforos diretos.
Marinho et al. (2014) descrevem o gênero monoespecífico Bulbospora Oehl & G. A. Silva, apresentando placa germinativa orbital similar a Orbispora (Figura 5.7), porém com esporos e bulbo suspensor considerados menores. Filogeneticamente, formando um clado ancestral em relação à Orbispora e Scutellospora (Figura 12).
Ainda no mesmo ano, Sieverding et al., propuseram o gênero Rhizoglomus Sieverd. G.A. Silva & Oehl principalmente como reforma para o gênero Rhizophagus (SCHÜßLER e WALKER, 2010), nome originalmente dado a um gênero de fungos patógenos não componentes do filo Glomeromycota (DANGEARD, 1896; SIEVERDING et al., 2014). Organismos desse gênero são caracterizados por produzir glomerosporos em abundância no solo e no interior das raízes associadas, constituídos de uma hifa geralmente cilíndrica ou, raramente, com leve forma afunilada na base do esporo, poro na base do esporo geralmente aberto, raramente fechado por um septo. A parede do esporo forma mais de uma, geralmente duas ou três, até cinco camadas distintas.
A partir de espécies anteriormente descritas como Glomus, Blaszkowski et al., (2015) propuseram a criação dos gêneros Dominikia Błaszk., Chwat & Kovács e Kamienskia Błaszk., Chwat & Kovács, através de análises moleculares e estudos morfológicos dos glomerosporos e estruturas micorrízicas. A principal característica destas novas propostas se baseia na produção de esporos considerados pequenos (50-70 μm diâmetro), agregados em cachos, com coloração variando de hialino a pálido.
Figura 10. Glomerosporos de Palaeospora spainii Oehl, Palenz., Sánchez-Castro & G.A. Silva. 1: Glomerosporo sem rupturas da parede; 2: Glomerosporo “quebrado” para melhor observação das paredes. Legenda: MW: Middle Wall – parede média, IW: Inner Wall – parede interna, OW: Outer Wall – parede externa, SP: septum – septo.
Fonte: Oehl et al., 2014 (modificado pelo autor).
Oehl et al. (2015) propuseram o gênero monoespecífico Palaeospora Oehl, Palenz., Sánchez-Castro & G.A.Silva, os argumentos para a nova proposta, além do suporte molecular, se basearam nas características morfológicas de seus esporos acaulosporóides, que não
apresentam pedicelo conectando a estrutura ao esporo, além disso seus esporos apresentam características ecológicas diferenciadas, pois são tolerantes a altas variações de fósforo (P) no solo, o que não ocorre com seu clado irmão (Figura 10 e Figura 12).
Em 2016, Spatafora et al. propuseram que os FMA sejam agrupados no subfilo Glomeromycotina (C. Walker & A. Schüßler) Spatafora & Stajich, (filo Mucoromycotina), composto apenas pela classe Glomeromycetes e quatro ordens: Archaeosporales, Diversisporales, Glomerales e Paraglomerales.
Symanczik et al. (2017) descrevem o gênero Desertispora Błaszk., Kozłowska, Ryszka, Al-Yahya’ei & Symanczik, a partir da espécie orginalmente descrita como Diversispora omaniana Symanczik, Błaszk. & Al-Yahya’ei (SYMANCZIK et al., 2014) o novo gênero seria caracterizado por esporos com paredes laminadas reativas ao Melzer, além de sequencias genômicas específicas.
Błaszkowski et al. (2017), analisando glomerosporos de Paraglomus majewskii Blaszk. & Kovács, concluem estarem tratando de um novo gênero, propondo-o como Innospora Błaszk., Kovács, Chwat & Kozłowska, inserindo-o na família Paraglomeraceae. Os mesmos autores ainda propuseram Pervetustus Błaszk., Chwat, Kozłowska, Symanczik & Al-Yahya’ei, formado a partir de espécies novas e inserindo-o na família nova Pervetustaceae. Os dois gêneros descritos integram a ordem Paraglomerales. Apesar de diferenças morfológicas entre os táxons, os autores enfatizam que os clados apresentam sequências “altamente divergentes” entre si, dando suporte à nova proposta.
Os avanços nas análises de dados moleculares ajudaram a elucidar muitos fatos a respeito da história evolutiva dos FMA, principalmente sobre seu posicionamento filogenético. Enquanto Schüßler, Schwarzott e Walker (2001) elevaram estes fungos a categoria de filo, tendo como clado irmão o sub-reino Dikarya (JAMES et al., 2006) e não mais Zygomycota (Figura 7), Hirose et al. (2014) transferiram Glomus pubescens (Sacc. & Ellis) Trappe & Gerd., morfologicamente semelhante a esporos de Glomus e formador de esporocarpos, à sua proposta inicial Sphaerocreas pubescens Sacc. & Ellis (SACCARDO, 1882) dentro do filo Zygomycota.
Em contrapartida, o avanço e ênfase no uso de ferramentas moleculares faz com que novos táxons sejam propostos sem suporte para o reconhecimento em esporos de campo, como no caso de Paraglomus (MORTON e REDECKER 2001). Na época de sua descrição era diferenciado de Glomus pela reação de suas estruturas micorrízicas em certos corantes, dificultando a identificação dos esporos obtidos em campo. Essa situação foi solucionada posteriormente por Oehl et al. (2011a), através de uma análise morfológica mais profunda
agregada a dados moleculares de esporos glomoides lato sensu, que serviram para um maior suporte morfológico a Paraglomus e a propostas posteriores (OEHL et al., 2011c; SIEVERDING et al., 2014, BLASZKOWSKI et al., 2015) (Figura 12).
Outra vertente que ajuda a esclarecer a história evolutiva dos FMA, consiste na agregação de dados ecológicos, como por exemplo, Morton e Benny (1990) ao organizarem os fungos gigasporoides lato sensu, consideravam “óbvio”, que Gigaspora seria basal em relação aos outros clados do grupo. Entretanto, evidências moleculares, bem como sua estratégia de colonização mais eficiente, colocam Gigaspora como um clado relativamente derivado dentro do grupo (Figura 12). Oehl et al. (2014) também utilizada dados ecológicos, ao propor Palaeospora, usando atributos de tolerância ambiental em concordância com dados moleculares e morfológicos.
2.1.2.1. Classificação atual
Atualmente o subfilo Glomeromycotina é subdividido em uma classe, quatro ordens, 16 famílias e 41 gêneros (Figura 12). Porém, esta filogenia não é um consenso na comunidade científica, gerando críticas por parte de alguns pesquisadores, alegando inconsistência de clados específicos, propondo sinonimizações (MORTON e MSISKA, 2010; KAONONGBUA, MORTON e BEVER, 2010), discordando sobre a proposta de alguns clados (SOUZA, 2015) ou, principalmente, com relação a proposta de clados monoespecíficos (REDECKER et al., 2013).
Figura 11. Classificação dos FMA proposta por Spatafora et al. (2016), pertencentes ao subfilo Glomeromycotina.
Figura 12. Classificação atual do subfilo Glomeromycotina.
2.1.3 Diversidade de FMA
Os FMA têm sua importância claramente reconhecida tanto do ponto de vista econômico quanto ambiental (SIQUEIRA, LAMBAIS e STÜRMER, 2002; GONZÁLEZ-CHÁVEZ et al., 2004; SMITH e READ, 2008), porém pouco se conhece sobre sua ecologia e diversidade (SOUZA, SILVA e BERBARA, 2008; BEVER et al., 2001). Atualmente são reconhecidas 305 espécies de FMA (LABORATÓRIO DE BIOLOGIA DE MICORRIZAS, 2018). Essa relativa baixa diversidade taxonômica para um filo fúngico pode ser justificada, em parte, como consequência de sua especialização nutricional, recursos naturais (BUSCOT, 2015), ou então por sua reprodução assexuada, ocasionando uma baixa variabilidade genética e, consequentemente, uma baixa taxa de especiação (SMITH e READ, 2008).
Em contrapartida, o fato dos glomerosporos apresentarem células multinucleadas confere elevada variabilidade genética a um único esporo (KUHN, HIJRI e SANDERS, 2001; MARLEAU et al., 2011), gerando maior plasticidade a um único genoma destes fungos, resultando em uma grande capacidade adaptativa (ANGELARD et al., 2014). Isso permite que várias espécies de FMA se desenvolvam a partir de uma única raiz vegetal ou que uma única espécie de FMA possa se associar a diversas espécies vegetais, aparentemente não havendo pressões seletivas que direcionassem a relação planta-fungo a um nível espécie-específico (DEACON, 2006; SMITH e READ, 2008).
Porém, é provável que a diversidade descrita para os FMA não reflita a real riqueza do grupo. Tal hipótese pode ser sustentada quando se consideram algumas evidências moleculares e de interações ecológicas tais como: (i) a sua origem ancestral: 600 milhões de anos atrás, segundo estimativas moleculares (REDECKER et al., 2000), e aproximadamente 400 milhões de anos atrás, segundo registros fósseis (DOZTLER et al., 2006; 2009; KRINGS et al., 2007); (ii) o longo período de coevolução da simbiose micorrízica, sendo esta considerada essencial para o sucesso evolutivo das plantas terrestres (KARANDASHOV e BUCHER, 2005; BUSCOT, 2015); (iii) a ampla distribuição dos FMA nos ecossistemas terrestres (SMITH e READ, 2008), incluindo plantas epífitas (ROWE e PRINGLE, 2005) e biomas aquáticos (NIELSEN et al., 2004; KAI e ZHIWEI, 2006); (iv) o fato de que microssimbiontes tendem a desenvolver especificidade em simbioses complexas, como a micorriza arbuscular (SOUZA, SILVA e BERBARA, 2008); e (v) a diversidade atual das espécies vegetais que estes fungos se associam, sendo a micorriza arbuscular o tipo de associação entre microrganismos e raízes vegetais mais difundido na natureza (FITTER e
MOYERSOEN, 1996; BEVER et al., 2001; QUILAMBO, 2003; KERNAGHAN, 2005; DEACON 2006; SMITH e READ, 2008; SOUZA, SILVA e BERBARA, 2008).
Embora o consenso científico seja que os FMA sejam assexuados, a presença de “genes de meiose” sugere que há possibilidade de reprodução sexuada, ou parassexual, nesses organismos (CORRADI e LILDHAR, 2012), alguns estudos relatam a observação de que a troca de núcleos ocorre entre membros de uma espécie de FMA após anastomoses (fusão citoplasmática e troca entre hifas) (GIOVANNETTI, AZZOLINI e CITERNESI, 1999; CROLL et al., 2009; COLARD, ANGELARD e SANDERS, 2011), entretanto as fusões nucleares ainda não foram detalhadamente observadas nesses organismos.
Souza et al. (2007) sugerem que, na verdade, a aparente baixa diversidade pode indicar que os critérios utilizados para definição de táxons nos FMA sejam insuficientes para diferenciar espécies, alertando para uma necessidade de se conduzirem inventários de longa duração, a fim de acessar com maior precisão a biodiversidade destes organismos.
Segundo Bever et al. (2001), uma das razões da suposta baixa riqueza de espécies de FMA é que enquanto as plantas “se apresentam para serem contadas e identificadas”, o mesmo não se pode considerar dos FMA, que são muito mais difíceis de serem acessados. Assim, investigações de sua diversidade têm sido dificultadas por limitações na “habilidade de pesquisa” para monitorar e identificar a diversidade das comunidades de FMA. Ainda nesse mesmo experimento, os autores demonstraram que cada variação na metodologia de amostragem como as condições da casa de vegetação, das culturas armadilhas (tratamento usado no solo e espécies vegetais utilizadas), estação do ano em que o solo foi coletado, podem responder pela diversidade de espécies fúngicas. E que a diversidade de FMA pode ser bem próxima à diversidade de plantas.
Com base no trabalho de Bever et al. (2001), Souza, Silva e Berbara (2008) estimam que a diversidade de FMA possa estar entre 37.000 e 78.000 espécies. Se estas estimativas estiverem corretas e se for levado em consideração o trabalho de Zangaro e Moreira (2010) no qual, na época, o registro de FMA era de 220 espécies para o mundo, 106 para o Brasil e 72 espécies para a Mata Atlântica, tem-se que este domínio contém aproximadamente 1/3 da diversidade mundial para esse grupo. Como a diversidade de espécies descritas reflete apenas 0,5% a 0,2% da diversidade estimada para este grupo, a diversidade potencial da Mata Atlântica seria de 12.109 a 25.527 espécies.
Outro fator que deve ser levando em consideração, e que recentemente vem ganhando relevância, é que aproximadamente 60% das sequências ambientais de FMA não coincidem com a de fungos cultivados, que possuem distribuição global e hábitos generalistas (ÖPIK et
