PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
JOSÉ VENÂNCIO CHAVES JÚNIOR
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA SOLUBILIDADE AQUOSA DE COCRISTAIS DE ÁCIDO FERÚLICO
NATAL / RN 2019
DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA SOLUBILIDADE AQUOSA DE COCRISTAIS DE ÁCIDO FERÚLICO
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Cícero Flávio Soares Aragão Coorientador: Fábio Santos de Souza
NATAL / RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474 Chaves Júnior, José Venâncio.
Desenvolvimento, caracterização físico-química e avaliação da solubilidade aquosa de cocristais de ácido ferúlico / José Venâncio Chaves Júnior. - 2019.
150f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão. Coorientador: Prof. Dr. Fábio Santos de Souza.
1. Cocristais - Dissertação. 2. Ácido ferúlico - Dissertação. 3. Solubilidade - Dissertação. 4. Perfil de dissolução -
Dissertação. I. Aragão, Cícero Flávio Soares. II. Souza, Fábio Santos de. III. Título.
A minha família, a minha base, pelo apoio em todas as decisões.
Aos meus orientadores, Cícero Flávio Soares Aragão e Fábio Santos de Souza, pela confiança em mim depositada.
Ao meu parceiro de laboratório Jonh Anderson e a minha namorada Samara Vitória por essa caminhada de pós-graduação que passamos juntos.
Aos colegas da UFPB: Rayanne Sales, Taynara Batista, Fabrício Havy, Pedro Figueiredo e Severino Antônio pela ajuda científica.
Aos colegas do Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos da UFRN, George, Dayanne, Thereza e Nilma pelo auxílio nas execuções dos trabalhos.
Ao Núcleo de Pesquisa e Extensão de Combustíveis e de Materiais (LACOM) da UFPB e ao laboratório multiusuário (PPGCEM) da UFRN pela realização de análises por DRXP e FTIR.
Nada é mais contagioso que o exemplo, e nunca fazemos grande bem nem grande mal sem produzir outros semelhantes. Imitamos boas ações por emulação e as más pela malignidade da nossa natureza que a vergonha aprisiona, mas que o exemplo põe em liberdade.
Os cocristais são estruturas cristalinas geradas a partir da interação de duas ou mais substâncias em uma mesma fase cristalina, os quais demonstram o potencial de melhorar parâmetros tecnológicos e físico-químicos ligados a fármacos, por exemplo a solubilidade aquosa que representa um fator limitante na absorção dos fármacos administrados por via oral. O ácido ferúlico (AFE) é uma molécula muito estudada pelo seu potencial antioxidante, em que se destacam suas atividades antitumorais, no entanto a baixa solubilidade aquosa dessa molécula aparece como um obstáculo para o seu estudo clínico. O objetivo desse trabalho é desenvolver e caracterizar físico-quimicamente cocristais de AFE visando a melhoria de sua solubilidade aquosa. Os cocristais foram preparados pela técnica de secagem por pressão reduzida, utilizando etanol como solvente, e caracterizados por diferentes técnicas analíticas: calorimetria exploratória diferencial (DSC), difração de raios-X do pó (DRXP), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), termogravimetria (TG), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN-¹H) e microscopia eletrônica de varredura ambiental (MEV), bem como foi utilizado um planejamento experimental e avaliada a dissolução in vitro. A nicotinamida (NIC) apresentou ser o melhor coformador para o AFE. O cocristal de AFE e NIC (CC) apresentou um aumento na solubilidade aquosa do AFE em 70% (1,33 mg/mL) quando comparado ao AFE isolado (0,78 mg/mL). Um método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e um por cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) para quantificação do AFE e NIC foram desenvolvidos e validados. O processo de obtenção do CC apresentou bom rendimento (98,3 ± 1,3%) e reprodutibilidade. As técnicas analíticas forneceram fortes indícios de formação do cocristal entre o AFE e a NIC. As técnicas analíticas mostraram a formação de CC na proporção molar 1:1, dentre as condições utilizadas no planejamento experimental. O CC apresentou melhor eficiência de dissolução que o AFE isolado nos meios de pH 4,5 e 6,8. Sabendo da necessidade do aumento da biodisponibilidade do AFE, o CC desenvolvido surge como uma alternativa tecnológica para um produto farmacêutico de maior eficiência para o AFE.
The cocrystals are crystalline structures generated from the interaction of two or more substances in the same crystalline phase, which demonstrate the potential to improve technological and physicochemical parameters related to the pharmaceutical area, for example aqueous solubility which is a limiting factor on absorption of the drugs administered orally. The ferulic acid (FEA) is a molecule very studied for its antioxidant potential, in which its antitumor activities are highlighted, however the low aqueous solubility of this molecule appears as an obstacle to its clinical study. The objective of this work is to develop and characterize physicochemically cocrystals of FEA aiming to improve its aqueous solubility. The cocrystals were prepared by the drying technique under reduced pressure, using ethanol as solvent, and characterized by different analytical techniques: differential scanning calorimetry (DSC), X-ray powder diffraction (XRPD), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), thermogravimetry (TG), nuclear magnetic resonance of hydrogen (NMR-¹H) and scanning electron microscopy (SEM), as well as an experimental planning was used and the in vitro dissolution evaluated. Among the coformers used, the nicotinamide (NIC) showed the best solubility results. The FEA and NIC cocrystal (CC) increase the solubility of FEA in 70% (1,33 mg/mL) compared to the FEA isolated (0,78 mg/mL). The methods for quantification of the FEA and NIC were developed and validated by high performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). The process of obtaining CC showed good yield (98.3 ± 1.3%) and reproducibility. Analytical techniques provided strong evidence of cocrystal formation between the FEA and the NIC. The analytical techniques showed the formation of CC in the 1: 1 molar ratio, among the conditions used in the experimental planning. The CC showed better dissolution efficiency than the FEA alone in the media of pH 4.5 and 6.8. Considering the need for increasing the bioavailability of the FEA, the developed CC appears as a technological alternative for a more efficient pharmaceutical product for the FEA.
Figura 1 ‒ Representação dos tipos de síntons supramoleculares dos
cocristais. A: homosínton; B e C: heterosíntons... 23
Figura 2 – Representação de diferentes estruturas cristalinas... 23
Figura 3 ‒ Estrutura química do ácido ferúlico... 36
Figura 4 ‒ Linearidade obtida para o doseamento... 48
Figura 5 ‒ Curvas DSC do BEN e AFE e respectivas amostras MF e CC... 49
Figura 6 ‒ Curvas DSC do CIT e AFE e respectivas amostras MF e CC... 50
Figura 7 ‒ Curvas DSC e derivadas das amostras MF (A) e CC (B) do AFE e CIT... 50
Figura 8 ‒ Curvas DSC do TAR e AFE e respectivas amostras MF e CC... 51
Figura 9 ‒ Curvas DSC do MAL e AFE e respectivas amostras MF e CC... 51
Figura 10 ‒ Curvas DSC do SAL e AFE e respectivas amostras MF e CC... 52
Figura 11 ‒ Curvas DSC da HID e AFE e respectivas amostras MF e CC... 53
Figura 12 ‒ Curvas DSC do PAB e AFE e respectivas amostras MF e CC... 53
Figura 13 ‒ Curvas DSC da NIC e AFE e respectivas amostras MF e CC... 54
Figura 14 ‒ Curvas DSC e derivadas das amostras MF e CC do AFE e NIC... 54
Figura 15 ‒ Difratogramas do CIT e AFE e respectivas amostras MF e CC.... 55
Figura 16 ‒ Difratogramas do MAL e AFE e respectivas amostras MF e CC... 56
Figura 17 ‒ Difratogramas da HID e AFE e respectivas amostras MF e CC.... 56
Figura 18 ‒ Difratogramas do SAL e AFE e respectivas amostras MF e CC... 57
Figura 19 ‒ Difratogramas do PAB e AFE e respectivas amostras MF e CC... 57
Figura 20 ‒ Difratogramas da NIC e AFE e respectivas amostras MF e CC.... 58
Figura 21 ‒ Difratogramas do PAB e AFE e respectivas amostras MF e CC... 58
Figura 22 ‒ Difratogramas do PAB e AFE e respectivas amostras MF e CC... 59
Figura 23 ‒ Espectros FTIR do CIT e AFE e respectivas amostras MF e CC.. 60
Figura 24 ‒ Espectros FTIR do MAL e AFE e respectivas amostras MF e CC 60 Figura 25 ‒ Espectros FTIR da HID e AFE e respectivas amostras MF e CC.. 61
Figura 26 ‒ Espectros FTIR do SAL e AFE e respectivas amostras MF e CC. 61 Figura 27 ‒ Espectros FTIR da NIC e AFE e respectivas amostras MF e CC.. 62
Figura 28 ‒ Espectros FTIR do PAB e AFE e respectivas amostras MF e CC 62 Figura 29 ‒ Espectros FTIR das amostras da NIC e AFE e respectivas amostras MF e CC nas regiões de 4000-2000 (A), 2000-1500 (B), 1500-1000 (C) e 1000-500 cm-1... 63
(B), 1500-1000 (C) e 1000-500 cm-1... 64
Figura 31 ‒ Linearidade para o teste de solubilidade de 24h... 66 Figura 32 ‒ Espectros UV do AFE (A) e da NIC (B) obtidos por CLAE DAD.... 76 Figura 33 ‒ Cromatograma do método por CLAE... 78 Figura 34 ‒ Cromatogramas, em diferentes comprimentos de onda, do AFE
e NIC por CLUE na região da banda primária... 79 Figura 35 ‒ Cromatogramas do AFE e NIC por CLUE para as colunas 1 a 6. 79 Figura 36 ‒ Cromatogramas para o AFE, NIC e produtos de degradação do
meio básico e na presença de luz em diferentes fluxos. A: produto da degradação básica, B: nicotinamida, C: produto da degradação fotolítica, D: ácido ferúlico... 82 Figura 37 ‒ Representação gráfica dos parâmetros cromatográficos para o
AFE e a NIC em função do fluxo... 84 Figura 38 ‒ Cromatograma do método por CLUE... 86 Figura 39 ‒ Espectros UV do AFE (A) e da NIC (B) obtidos por CLUE DAD.... 86 Figura 40 ‒ Cromatograma do método por CLUE com água pH 6,7... 88 Figura 41 ‒ Cromatogramas por CLAE da seletividade: AFE (A); NIC (B);
24h (C); Ácido (D); Básico (E); Oxidativo (F); Luz (G); Calor (H); AFE, NIC e produtos da degradação básica e fotolítica (I)... 90 Figura 42 ‒ Cromatogramas por CLUE da seletividade: AFE (A); NIC (B);
24h (C); Ácido (D); Básico (E); Oxidativo (F); Luz (G); Calor (H); AFE, NIC e produtos da degradação básica e fotolítica (I)... 91 Figura 43 ‒ Estruturas químicas do ácido nicotínico e vanilina... 93 Figura 44 ‒ Cromatograma do ácido nicotínico por CLUE... 93 Figura 45 ‒ Espectros UV do produto da degradação básica da NIC (A) e do
ácido nicotínico (B) obtidos por CLUE DAD... 93 Figura 46 ‒ Cromotograma da vanilina por CLUE... 94 Figura 47 ‒ Espectros UV do produto da degradação fotolítica do AFE (A) e
da vanilina (B) obtidos por CLUE DAD... 94 Figura 48 ‒ Representação gráfica da resposta em função da concentração,
equações das retas e valores de R e R² do AFE (A) e NIC (B) obtida por CLAE e do AFE (C) e NIC (D) por CLUE... 96 Figura 49 ‒ Gráfico de dispersão dos resíduos para o AFE (A) e NIC (B)
Figura 52 ‒ Curvas DSC do cocristal 1:1 com 40 mL de etanol (A) e com 20
mL de etanol (B)... 108
Figura 53 ‒ Curvas DSC do cocristal 1:1 (A), AFE:NIC 1:2 (B) e AFE:NIC 2:1 (C)... 109
Figura 54 ‒ Curvas DSC das amostras dos pontos 1 a 4 (P1-P4) e da mistura física na proporção molar 4:3 (AFE:NIC)... 111
Figura 55 ‒ Curvas DSC das amostras dos pontos 5 a 8 (P5-P8) e da mistura física na proporção molar 3:4 (AFE:NIC)... 112
Figura 56 ‒ Curvas DSC do AFE e NIC isolados, PC e mistura física na proporção molar 1:1... 113
Figura 57 ‒ Difratogramas das substâncias isoladas, PC e mistura física na proporção molar 1:1... 114
Figura 58 ‒ Difratogramas das substâncias isoladas e misturas físicas na proporção molar 1:1 e 3:4... 115
Figura 59 ‒ Difratogramas das amostras dos pontos 1 a 4 (P1-P4) e do PC... 116
Figura 60 ‒ Difratogramas das amostras dos pontos 5 a 8 (P5-P8) e do PC... 116
Figura 61 ‒ Curvas DSC de diferentes lotes das amostras obtidas na condição do PC... 117
Figura 62 ‒ Aspecto visual da MF (A) e do CC (B) de AF:NIC na proporção molar 1:1... 124
Figura 63 ‒ Difratogramas das amostras de AFE e NIC recristalizadas... 125
Figura 64 ‒ Espectros FTIR-ATR do AFE, NIC e CC... 126
Figura 65 ‒ Espectros RMN-¹H da MF e CC... 128
Figura 66 ‒ Estruturas químicas do AFE (A) e NIC (B)... 129
Figura 67 ‒ Micrografias do AFE (a) e CC (d) no aumento de 1000x e da NIC (b) e MF (c) no aumento de 500x... 130
Figura 68 ‒ Micrografia da amostra CC no aumento de 5000x... 131
Figura 69 ‒ Curvas termogravimétricas do AFE, NIC, MF e TG... 132
Figura 70 ‒ Perfis de dissolução do AFE isolado, na MF e no CC nos meios de dissolução de pH 4,5 (A), 1,2 (B) e 6,8 (C)... 135
Figura 71 ‒ Perfis de dissolução do AFE e NIC nas amostras MF e CC nos meios de dissolução de pH 1,2 (A), 4,5 (B) e 6,8 (C)... 138
Tabela 1 ‒ Solubilidade das substâncias em água a 25 ºC... 45 Tabela 2 ‒ Solubilidade das substâncias em etanol a 25 ºC... 46 Tabela 3 ‒ Teor de AFE nas amostras MF e CC... 47 Tabela 4 – Valores de temperatura de início de fusão (Tonset) e entalpia
(∆Hfus) para as substâncias isoladas e nas respectivas
amostras MF e CC... 48 Tabela 5 ‒ Solubilidade do AFE nas amostras MF e CC... 65 Tabela 6 ‒ Parâmetros das colunas utilizadas na transferência do método
de CLAE para CLUE... 71 Tabela 7 ‒ Parâmetros variados na robustez para a CLAE e para a CLUE. 75 Tabela 8 ‒ Parâmetros cromatográficos para o AFE e para NIC no método
por CLAE... 78 Tabela 9 ‒ Parâmetros calculados para as diferentes colunas... 80 Tabela 10 ‒ Parâmetros cromatográficos para AFE e NIC com as colunas
1 a 6... 80 Tabela 11 ‒ Parâmetros cromatográficos para o AFE e a NIC em função do
fluxo... 83 Tabela 12 ‒ Parâmetros cromatográficos para o AFE e a NIC em função da
concentração... 85 Tabela 13 ‒ Parâmetros cromatográficos para o AFE e para NIC no método
por CLUE... 87 Tabela 14 ‒ Teor de AFE e NIC na seletividade para CLAE e CLUE... 92 Tabela 15 ‒ Testes estatísticos para avaliação da linearidade... 98 Tabela 16 ‒ Valores de repetibilidade e precisão intermediária para o AFE
e NIC por CLAE e CLUE... 99 Tabela 17 ‒ Valores de recuperação para o AFE e NIC por CLAE e CLUE... 100 Tabela 18 ‒ Valores de recuperação para os parâmetros de robustez do
AFE e NIC por CLAE e CLUE... 101 Tabela 19 ‒ LOD e LOQ para AFE e NIC por CLAE e CLUE... 102 Tabela 20 ‒ Planejamento 2³ para o cocristal de ácido ferúlico e
nicotinamida... 105 Tabela 21 ‒ Respostas do planejamento 2³ (tempo, rendimento e
de AFE e NIC na condição do PC... 118
Tabela 24 ‒ Doseamento do AFE e da NIC na MF e CC... 124
Tabela 25 ‒ Doseamento do AFE e da NIC na MF e CC... 126
Tabela 26 ‒ Valores de δ e J para a MF e CC... 129
Tabela 27 ‒ Etapas de degradação e perda de massa do AFE, NIC, MF e CC... 132
Tabela 28 ‒ Avaliação da solubidade e da condição sink para o AFE nos três meios de dissolução... 133
Tabela 29 ‒ Valores do perfil de dissolução do AFE e na MF e CC... 136
Tabela 30 ‒ Valores do perfil de dissolução da NIC na MF e CC... 139
Tabela 31 ‒ Valores de ED para o AFE isolado e nas amostras MF e CC em pH 1,2; 4,5 e 6,8... 140
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AFE Ácido Ferúlico
BEN Ácido Benzoico
CC Cocristal
CIT Ácido Cítrico
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência
DP Desvio Padrão
DPR Desvio Padrão Relativo
DSC Calorimetria Exploratória Diferencial
FDA Food and Drug Administration
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
HID Hidroquinona
MAL Ácido Málico
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MF Mistura Física
NIC Nicotinamida
PAB Ácido Para-aminobenzoico
PDRX Difração de Raios-X do Pó
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN-¹H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMNs Ressonância Magnética Nuclear de Sólidos
SAL Ácido Salicílico
SE Solução Estoque
TAR Ácido Tartárico
TG Termogravimetria
δ Deslocamento químico
∆Hfus Entalpia de Fusão
d Dubleto
dd Duplo Dubleto
HETP Altura Equivalente a um Prato Teórico
J Constante de Acoplamento
m Multipleto
N Número de Pratos Teóricos
R Resolução
s Singleto
T Fator de cauda
Tendset Temperatura do final do evento térmico
Tonset Temperatura do início do evento térmico
1 INTRODUÇÃO... 19 2 OBJETIVOS... 20 2.1 Objetivo geral... 20 2.2 Objetivo específicos... 20 3 REVISÃO DE LITERATURA... 21 3.1 COCRISTAIS... 21
3.1.1 Técnicas analíticas aplicadas na caracterização dos cocristais.. 26
3.1.2 Métodos de obtenção dos cocristais... 28
3.1.2.1 Métodos por moagem... 29
3.1.2.2 Métodos por solução... 30
3.1.3 Melhorias e pontos negativos dos cocristais... 31
3.1.3.1 Solubilidade e dissolução... 31 3.1.3.2 Compressibilidade e fluxibilidade... 33 3.1.3.3 Estudos in vivo... 33 3.1.3.4 Estabilidade... 34 3.2 ÁCIDO FERÚLICO... 35 3.2.1 Atividades farmacológicas... 37
3.2.2 Abordagens tecnológicas com o AFE... 39
4 TRIAGEM DO MELHOR COCRISTAL DE ÁCIDO FERÚLICO... 41
4.1 MATERIAL E MÉTODOS... 41
4.1.1 Preparo das misturas físicas (MF)... 41
4.1.2 Obtenção dos cocristais (CC)... 42
4.1.3 Doseamento das misturas físicas e cocristais... 42
4.1.4 Calorimetria Exploratório Diferencial (DSC)... 42
4.1.5 Difração de Raios-X do pó (DRXP)... 42
4.1.6 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)... 43 4.1.7 Solubilidade Farmacopeica... 43 4.1.8 Solubilidade de 24 horas... 43 4.1.9 Análise estatística... 43 4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 45 4.2.1 Solubilidade Farmacopeica... 45
4.2.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)... 48
4.2.4 Difração de raios-X (DRXP) ... 55
4.2.5 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)... 60
4.2.6 Solubilidade de 24 horas... 65
4.2.6.1 Linearidade do teste de solubilidade de 24 horas... 67
5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS, POR CLAE E CLUE, PARA O ÁCIDO FERÚLICO E NICOTINAMIDA... 67
5.1 MATERIAL E MÉTODOS... 69
5.1.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 69
5.1.1.1 Condições cromatográficas... 69
5.1.1.2 Preparo da fase móvel... 69
5.1.1.3 Preparo das amostras... 70
5.1.2 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) ... 70
5.1.2.1 Transferência do método CLAE para CLUE... 70
5.1.2.2 Condições cromatográficas... 72
5.1.2.3 Preparo do NaH2PO4... 72
5.1.2.4 Preparo das amostras... 72
5.1.3 Validação dos métodos por CLAE e CLUE... 73
5.1.3.1 Seletividade... 73
5.1.3.2 Linearidade... 73
5.1.3.3 Precisão... 74
5.1.3.4 Exatidão... 74
5.1.3.5 Robustez... 74
5.1.3.6 Limites de detecção e quantificação... 75
5.1.4 Análise estatística... 75
5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 76
5.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 76
5.2.2 Transferência do método CLAE para CLUE... 79
5.2.3 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE)... 81
5.2.4.3 Precisão... 98
5.2.4.4 Exatidão... 99
5.2.4.5 Robustez... 100
5.2.4.6 Limites de detecção e quantificação... 101
6 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA O COCRISTAL DE ÁCIDO FERÚLICO E NICOTINAMIDA... 103
6.1 MATERIAL E MÉTODOS... 104
6.1.1 Preparo das misturas físicas (MF) ... 104
6.1.2 Obtenção dos cocristais (CC)... 104
6.1.3 Planejamento experimental... 104
6.1.3.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)... 105
6.1.3.2 Difração de raios-X (DRXP)... 105
6.1.4 Doseamento... 105
6.1.5 Reprodutibilidade do processo de obtenção dos cocristais... 105
6.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 106
6.2.1 Planejamento experimental... 107
6.2.1.1 Escolha dos níveis... 108
6.2.1.2 Planejamento 2³... 109
6.2.1.3 Calorimetria exploratório Diferencial (DSC)... 111
6.2.1.4 Difração de raios-X... 113
6.2.2 Reprodutibilidade do cocristal com nicotinamida... 117
7 CARACTERIZAÇÃO E ESTUDOS DE DISSOLUÇÃO DO COCRISTAL DE ÁCIDO FERÚLICO E NICOTINAMIDA... 119
7.1 MATERIAL E MÉTODOS... 119
7.1.1 Preparo da mistura física... 119
7.1.2 Obtenção do cocristal... 120
7.1.3 Doseamento da mistura física e cocristal... 120
7.1.4 Avaliação de polimorfismos... 120
7.1.5 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR)... 120
7.1.6 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN-1H)... 120
7.1.10 Dissolução in vitro... 121
7.1.10.1 Preparo dos meios... 122
7.1.10.2 Eficiência de dissolução (ED) ... 122
7.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 123
7.2.1 Características físicas da mistura física e cocristal... 124
7.2.2 Doseamento da mistura física e cocristal e rendimento... 124
7.2.3 Avaliação de polimorfismos... 125
7.2.4 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e Reflectância Total Atenuada (FTIR-ATR) ... 125
7.2.5 Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-1H)... 127
7.2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)... 130
7.2.7 Termogravimetria (TG) ... 131
7.2.8 Solubilidade e dissolução in vitro... 133
7.2.8.1 Dissolução do AFE isolado nos diferentes meios... 134
7.2.8.2 Avaliação da dissolução da NIC... 138
7.2.8.3 Eficiência de dissolução (ED)... 140
8 CONCLUSÕES... 141
1 INTRODUÇÃO
A busca por novos fármacos ou alterações em suas propriedades físico-químicas, a partir do uso de diferentes tecnologias, para que possam apresentar melhor eficácia ou diminuição nos efeitos adversos é uma constante na área farmacêutica (KINCH, 2016). Todavia, exigências rigorosas de qualidade têm de ser cumpridas para que só assim possa ocorrer a comercialização (FDA, 2016).
Dentre as propriedades dos fármacos a serem aprimoradas para que possam apresentar melhor eficácia podem ser citadas a estabilidade e a solubilidade aquosa, cabendo destaque a essa última porque é um dos parâmetros que limitam diretamente a biodisponibilidade dos fármacos administrados por via oral e consequentemente a atividade farmacológica, além de possibilitar uma redução na dose para diminuição de efeitos adversos. O aprimoramento dessas propriedades pode ser realizado por diversas tecnologias, sendo as mais comuns: dispersões sólidas, microencapsulações e mais recentemente os cocristais (KHADKA et al., 2014).
Entende-se o aumento dos estudos com cocristais por possuírem a capacidade de alterar as características físico-químicas em estado sólido dos fármacos, podendo propiciar ainda, além do aumento da sua solubilidade aquosa, a melhoria de outros parâmetros biofarmacêuticos como propriedades mecânicas do pó e estabilidade (ROCHA et al., 2016). Os cocristais são formados com auxílio de coformadores, substâncias inertes capazes de interagir por ligações não covalentes com o fármaco, e são obtidos por metodologias que utilizem ou não solventes, por exemplo moinhos e rotaevaporação, respectivamente (SHAIKH et al., 2018).
O ácido ferúlico (AFE) é um ácido fenólico que está sendo estudado e apresentando bons resultados de eficácia e segurança. Apresenta alto potencial antioxidante e bons resultados como molécula auxiliar a ser utilizada no tratamento de alguns tipos de câncer (MUTHUSAMY et al., 2016). Entretanto, uma das limitações que dificulta a sua aplicação clínica do AFE é sua baixa solubilidade, onde algumas tecnologias para aprimorar essa característica tem sido realizadas, por exemplo sua incorporação em micropartículas e polímeros amorfos a fim de aumentar sua solubilidade aquosa (NADAL, 2016).
Nesse contexto, viabiliza-se o estudo da aplicação da tecnologia dos cocristais com o AFE impulsionando-os para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos que o contenha em suas formulações.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e caracterizar físico-quimicamente cocristais de ácido ferúlico com aprimoramento de sua solubilidade aquosa.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a formação de diferentes cocristais farmacêuticos do ácido ferúlico; Caracterizar a formação dos cocristais por (DSC), termogravimetria (TG),
espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e difratometria de raios-X do pó (PDRX);
Selecionar o cocristal com melhor solubilidade aquosa;
Otimizar o processo de obtenção do cocristal que apresentar melhor solubilidade aquosa com o auxílio de planejamento experimental;
Desenvolver e validar metodologias para doseamento do ácido ferúlico e melhor coformador por cromatografia líquida de alta e ultra eficiência (CLAE e CLUE);
Caracterizar o melhor cocristal por microscopia eletrônica de varredura (MEV), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN-¹H) e termogravimetria (TG);
Avaliar o perfil de dissolução in vitro do melhor cocristal em diferentes meios de dissolução.
3 REVISÃO DE LITERATURA
A procura por novos fármacos, ou alteração nas propriedades biofarmacêuticas dos fármacos já existentes, faz necessário o desenvolvimento de novas tecnologias que permitam o aperfeiçoamento desses produtos farmacêuticos com a finalidade de ampliar as alternativas terapêuticas atuais, por exemplo, com menos efeitos colaterais ou com menores custos ou ainda mais eficazes terapeuticamente (ROBINSON; HOWELL, 2014).
As alterações nas propriedades físico-químicas e biofarmacêuticas dos fármacos leva em conta diversas modificações no estado sólido dessas matérias-primas. As principais propriedades a serem melhoradas são a estabilidade, propriedades mecânicas como compressibilidade, densidade, dureza, fluxibilidade e a solubilidade aquosa, cabendo destaque para esse último por ser um fator determinante na absorção por via oral (WANG et al., 2018). A maioria das formas farmacêuticas hoje são sólidas devido às razões econômicas, facilidade de administração e estabilidade. Os fármacos existem no estado sólido amorfo ou cristalino; no estado cristalino há um arranjo definido dos átomos que dá origem a diferentes estruturas cristalinas, diferentemente do estado amorfo onde não há organização (KARAGIANNI; MALAMATARI; KACHIRIMANIS, 2018).
As modificações no estado sólido podem ser alcançadas através da amorfização ou alterações nas propriedades cristalinas dos fármacos. Quando o fármaco não é amorfo pode se transformar em amorfo por diferentes tecnologias, a exemplo das dispersões sólidas. A matéria-prima amorfa geralmente apresenta melhores resultados de solubilidade que a respectiva forma cristalina, no entanto apresentam geralmente maior instabilidade física e química devido a sua menor estabilidade termodinâmica frequentemente tendendo a recristalização do material (HASER; ZHANG, 2018). Assim são levadas em consideração outras técnicas de alteração na estrutura cristalina como sais, solvatos, polimorfos e os cocristais.
3.1 COCRISTAIS
Os cocristais são estruturas cristalinas formadas pela união de duas ou mais substâncias em uma única fase cristalina, são sólidos a temperatura ambiente e representados em razão estequiométrica (KARAGIANNI; MALAMATARI;
KACHIRIMANIS, 2018). Assim estão classificados dentro dos sistema multicomponentes, junto aos sais, dispersões sólidas, complexos de inclusão entre outros (HEALY et al., 2017). Algumas das aplicações dos cocristais estão na indústria farmacêutica, alimentícia e na fabricação de explosivos (WANG et al., 2018; BENNION; SIDDIQI; MATZGER, 2017).
Nos cocristais farmacêuticos uma das substâncias é o fármaco de interesse e a outra é uma molécula com capacidade de interagir com essa primeira para formar o cocristal, chamada coformador. Devido à diferença na nova estrutura cristalina apresentada pelo cocristal, quando comparada a das substâncias isoladas, surgem diferenças nas propriedades físico-químicas e biofarmacêuticas (ROCHA et al., 2016). Já existem no mercado medicamentos contendo cocristais. O Entresto®, aprovado em 2017 pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e em 2015 pela Food and Drug Administration (FDA), contém o cocristal de sacubitril e valsartana sódica indicado para tratar insuficiência cardíaca (ANVISA, 2018; DUGGIRALA et al., 2016). O Steglatro® também é um recente medicamento contendo o cocristal de ertuglifozina e ácido L-piroglutâmico para o tratamento de diabetes tipo 2 (EMA, 2018). Várias patentes com diversos cocristais também tem sido depositadas (SHAH; PARMAR, 2018), o que ressalta a importância dessa tecnologia na área farmacêutica. As interações mais citadas nos cocristais são ligações de hidrogênio, interações π-π e forças de van der Waals. Devido ao caráter não covalente dessas ligações, os cocristais quando são solubilizados liberam os componentes individuais; assim são mantidas as atividades farmacológicas de cada componente. O empacotamento dessas estruturas pode ser entendido pela repetição de síntons (figura 1), que são arranjos supramoleculares que compreendem o arranjo espacial das moléculas e suas interações a partir dos mesmos grupos funcionais, os homosíntons, e a partir de grupos funcionais diferentes, os heterosíntons. Essa terminologia é bastante utilizada e serve de base para estudos teóricos aprofundados para entender como os cocristais podem ser formados (SHAIKH et al., 2018).
Figura 1 – Representação dos tipos de síntons supramoleculares dos cocristais. A: homosínton; B e C: heterosíntons..
Fonte: autoria própria
Alguns autores subdividem os cocristais em moleculares, iônicos e mais recentemente nos cocristais salinos a depender da natureza ionizante de seus componentes e interações do fármaco com o coformador (figura 2).
Figura 2 – Representação de diferentes estruturas cristalinas.
Os cocristais moleculares apresentam fármaco e coformador de estrutura não ionizada e são ligados ao fármaco na maioria das vezes por interações fracas. Os cocristais iônicos apresentam conformadores com estrutura ionizada, na maioria dos casos sais alcalinos, e são ligados ao fármaco por ligações de hidrogênio assistidas ionicamente (DUGGIRALA et al., 2016). Já os cocristais salinos diferem dos iônicos por apresentarem o fármaco ou coformador na forma de sal, também formados por ligações de hidrogênio (BERRY; STEED, 2017). Porém, independente da classificação, todos os seus componentes estão dentro de uma mesma fase cristalina, que pode ser entendida como o modo que átomos, moléculas e íons se organizam de forma regular e repetitiva (VIOGLIO; CHIEROTTI; GOBETTO, 2017). Esses últimos são menos frequentes mas é possível achar exemplos na literatura. Buist e Kennedy (2014) obtiveram diferentes cocristais iônicos entre a carbamazepina em sua forma molecular e o iodeto de sódio; e um exemplo de cocristal salino foi obtido com o cloridrato de berberina com o ácido cítrico (LU et al., 2019).
Os coformadores estão listados na lista das moléculas reconhecidas como seguras (GRAS) do FDA, sendo considerados atóxicos. Esses apresentam os mais variados grupos funcionais. Exemplos de coformadores são o ácido oxálico, ácido fumárico, ácido glutárico, nicotinamida e sacarina. A seleção dos coformadores pode se basear, por exemplo, nas propriedades químicas do fármaco e coformador, compatibilidades e no método de obtenção (BOLLA; NANGIA, 2016). Ainda existe a “regra dos 3”, em que o ∆pKa entre a base e o ácido é levado em consideração na seleção dos coformadores. Essa avaliação diz que quando ∆pKa < 0 tendencia a formação de cocristais e quando ∆pKa > 3 a formação de um sal é facilitada devido à transferência total de prótons entre as moléculas, quando ∆pKa está no intervalo 0-3 é difícil prever a formação; mas essa avaliação as vezes é questionável por alguns autores pois o pKa é avaliado em estado líquido (KALE; ZODE; BANSAL, 2017; KARIMI-JAFARI et al., 2018; VIOGLIO; CHIEROTTI; GOBETTO, 2017).
Os cocristais diferem dos solvatos por não apresentar solvente em sua estrutura e diferem dos sais por sua ionização. Os sais contém ânions e cátions (fármacos e contraíons) que interagem por interações iônicas. Embora existam as subclasses dos cocristais iônicos e salinos, esses ainda diferem dos sais por não interagirem com o coformador por ligações iônicas, não há a transferência de prótons (VIOGLIO; CHIEROTTI; GOBETTO, 2017). Vantagens dos cocristais sobre os sais se baseiam no fato que os cocristais podem ser formados independentemente da
capacidade de ionização dos fármacos e o número de coformadores é maior que os contraíons, as moléculas utilizadas na formação dos sais (KUMINEK et al., 2016; SHAIKH et al., 2018).
Embora a cocristalização possa diminuir a tendência de formação de hidratos, recentemente tem sido relatado na literatura cocristais hidratados, onde moléculas de água fazem interação com o fármaco e coformador por ligações de hidrogênio (HEALY et al., 2017). Masshadi et al. (2016) obtiveram um cocristal de isoniazida e ácido protocatecuico com maior estabilidade que a isoniazida isolada, onde a água utilizada no processo de obtenção foi incorporada a estrutura. Um outro exemplo de cocristal com moléculas de água em sua composição foi obtido por Kerr et al. (2016), nesse cocristal de cafeína e ácido cítrico as moléculas de água podem ter sido incorporadas na estrutura a partir da própria água utilizada no processo ou do próprio ácido cítrico que foi utilizado em sua forma hidratada. Assim, com essas diversas variações que existem nos cocristais, entende-se o porquê dos autores divergirem quanto a subclassificações.
São vários os fatores que influenciam a formação do cocristal. As diferentes estruturas cristalinas formadas são atribuídas às diferentes interações moleculares entre o fármaco e o coformador, geradas, por exemplo, pelas diferenças dos grupos funcionais e pKa, podendo ser alteradas ainda por suas proporções estequiométricas durante a síntese e pela natureza dos solventes. É possível a formação de cocristais com as mesmas moléculas em diferentes proporções molares, em que seus comportamentos diferem frente a estudos de caracterização. Li e Matzger (2016) obtiveram cocristais de carbamazepina e ácido para-aminobenzoico nas proporções molares de 1:1, 2:1 e 4:1 os quais apresentaram características cristalinas e taxas de dissolução diferentes. Samipillai e Rohani (2019) obtiveram cocristais de progesterona e ácido 4-hidroxibenzoico nas proporções molares de 1:1, 1:2 e 2:1, onde foi possível perceber diferenças de solubilidade entre esses.
Os cocristais também podem ser representados pela união de dois fármacos, como observado por Merlos et al. (2018) e Grecu et al. (2017), que obtiveram cocristais de tramadol com celecoxibe e espironolactona com griseofulvina, respectivamente.
Não necessariamente as duas ou mais substâncias a serem trabalhadas no cocristal tem de ser cristalinas. A dapaglifozina, que é um material amorfo, foi trabalhada por Deng et al. (2017), que obtiveram um cocristal com ácido cítrico, um
material cristalino, com maior estabilidade que a dapaglifozina isolada sem comprometer suas características biofarmacêuticas. O dióxido de silício coloidal, muito usado como deslizante e adjuvante de secagem, é um material amorfo que foi utilizado como coformador em cocristais com hidroclorotiazida com melhor dissolução que a hidroclorotiazida isolada (EL-GIZAWY et al., 2015)
É possível encontrar na literatura estudos com cocristais polimórficos. O polimorfismo se refere a capacidade do material de apresentar diferentes formas cristalinas para um mesmo composto (KARAGIANNI; MALAMATARI; KACHIRIMANIS, 2018). A partir de diferentes métodos de obtenção podem ser obtidos cocristais polimórficos. Grossjohann et al. (2015) relataram cocristais polimórficos de sulfadimidina e ácido para-aminosalicílico obtidos por diferentes metodologias com melhores propriedades de dissolução que a sulfadimidina isolada. Sokal et al. (2017) obtiveram cocristais polimórficos de etenzamida e ácido gentísico a partir de diferentes métodos de obtenção, onde uma das formas polimórficas foi mais estável que outra.
3.1.1 Técnicas analíticas aplicadas na caracterização dos cocristais
As técnicas analíticas usadas para evidenciar a formação dos cocristais são as capazes de estudar as características cristalinas de sólidos como a difração de raio-X do pó (DRraio-XP), as capazes de estudar o comportamento térmico como as técnicas de análises térmicas e as técnicas espectroscópicas vibracionais como a espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Técnicas de caracterização no estado líquido não são utilizadas, pois os cocristais quando solubilizados no solvente liberam as substâncias isoladas.
A difração de raios X do pó (DRXP) promove a difração do raio-X através dos diversos planos cristalinos do material. Quando o raio incide no cristal é espalhado entre as diversas distâncias dos planos, nas várias camadas de átomos, onde são gerados ângulos de difração característicos para cada cristal, assim é possível saber quando ocorre alteração na estrutura cristalina (MÜLLERS et al., 2015). Essa técnica é a mais aplicada na caracterização dos cocristais e diferenças nos difratogramas entre o cocristal e as substâncias isoladas permitem verificar sua potencial formação, inclusive a de polimorfos (SOKAL et al., 2017). A formação do cocristal e verificação de sua pureza fundamenta-se no aparecimento ou desaparecimento de novos picos
no difratograma, quando comparados as substâncias isoladas (PATIL et al., 2014; ZHOU et al., 2016a).
As principais técnicas de análise em função da temperatura aplicadas na identificação dos cocristais são a calorimetria exploratória diferencial (DSC) e a termogravimetria (TG). A DSC mede a diferença de energia entre a amostra e um material de referência, medindo características como ponto de fusão. O ponto de fusão pode ser modificado quando há alteração na estrutura cristalina, assim entende-se a aplicação da DSC. Já a TG mede a variação da massa em função da temperatura; como o cocristal apresenta diferentes propriedades físico-químicas dos cristais individuais, pode haver diferença na decomposição dessas moléculas (ZHOU et al., 2016a).
A DSC é uma poderosa ferramenta na triagem de possíveis coformadores, pois é possível a visualização de eventos térmicos característicos dos cocristais (ZHOU et al., 2016a). De modo geral, a fusão é o evento em destaque, pois com a mudança na estrutura cristalina com a formação do cocristal, na maioria dos casos, apenas um ponto de fusão é visualizado (KULKARNI et al., 2015). Quase sempre o cocristal formado tem ponto de fusão intermediário as substâncias isoladas com diferenças nas entalpias de fusão esperadas (SHIMPI et al., 2014; HIENDRAWAN et al., 2016; CUADRA et al., 2016; PATIL et al., 2014), no entanto é relatada a formação de cocristais com temperaturas de fusão mais baixas que das substâncias isoladas (SUGANDHA et al., 2014).
Embora a TG não seja tão aplicada na caracterização como o DSC é possível obter dados interessantes. Embora a TG não informe características cristalinas do material, essa técnica permite identificar a presença de solventes na estrutura cristalina, como observado por Masshadi et al. (2016). No entanto, sua melhor aplicação com cocristais é na avaliação da estabilidade térmica, a partir da análise do início de sua degradação (HUANG et al., 2014; DROZD et al., 2017). Ainda, Masshadi et al. (2016) identificaram que seu cocristal de isoniazida e ácido protocatecuico se tratavam de um cocristal hidratado ao associar os resultado de perda de água verificada no TG aos dados cristalográficos da DRXP.
Na técnica de FTIR são verificadas as vibrações das ligações intra e intermoleculares. Quando o cocristal se forma podem ser geradas ligações intermoleculares específicas com vibração diferente das geradas pelas substâncias individuais, capazes de serem detectadas pelo FTIR (KARAGIANNI; MALAMATARI;
KACHIRIMANIS, 2018). A FTIR permite avaliar o provável mecanismo na formação dos cocristas, principalmente a formação de ligações de hidrogênio, representadas muitas vezes pelo deslocamento dos picos para regiões de menores número de onda. Na maioria das vezes os grupos envolvidos na formação de ligações de hidrogênio são a hidroxila, carbonila, ácido carboxílico, aminas e amidas (SHAIKH et al., 2018). A alteração da estrutura cristalina a nível microscópico é facilmente avaliada pela MEV. É comum a avaliação por MEV com os cocristais (DENG et al., 2017; DUARTE et al., 2016). Além da avaliação da morfologia das partículas, a MEV dá uma noção do tamanho dessas partículas, permitindo relacionar com os estudos de solubilidade por exemplo. A avaliação da morfologia também permite uma noção prévia de como é o comportamento de fluxo dos pós, pois diferentes morfologias podem apresentar diferentes propriedades de fluxo (KAMBLE et al., 2018).
Outra técnica que é utilizada mas não necessariamente caracteriza a formação dos cocristais é a ressonância magnética nuclear (RMN) que permite determinar as as estruturas das moléculas através da avaliação do deslocamento químico de átomos como o hidrogênio e carbono (LI et al., 2016b). As ligações não covalentes dos cocristais são quebradas quando solubilizados, liberando as moléculas no meio. Como as amostras foram solubilizadas para ser feita a análise por RMN-1H,
espera-se que o espectro do cocristal espera-seja o mesmo espectro da mistura física (o somatório dos espectros das matérias-primas isoladas), como observado por Li et al. (2016b), Deng et al. (2017) e Lou et al. (2018). Uma observação a mais sobre o RMN-1H foi
avaliada por Deng et al. (2017) ao estudarem um cocristal de dapaglifozina com ácido cítrico, em que foi proposto que a presença de um sinal referente a um hidrogênio ativo não presente nos espectros das matérias-primas isoladas dava indícios de um cocristal.
3.1.2 Métodos de obtenção dos cocristais
O crescente aumento na busca por cocristais farmacêuticos vem promovendo o desenvolvimento de métodos mais atrativos economicamente e ambientalmente para suas produções. Os métodos de obtenção são na maioria das vezes divididos em duas categorias: os métodos por moagem e os por solução. Os métodos por moagem consistem na trituração dos componentes com auxílio ou não de altas temperaturas com o uso mínimo ou sem uso de solventes. Os métodos por solução
formam cocristais a partir da mistura das substâncias em um solvente volátil que é em seguida evaporado (KARIMI-JAFARI et al., 2018; ROSS; LAMPROU; DOUROMIS, 2016).
O mecanismo de cocristalização é afetado tanto pelas características dos materiais quanto dos solventes e do processo de produção, como os diferentes grupos funcionais, pH e temperatura. A probabilidade de formação de cocristais por heteronsíntos é maior, logo a escolha de coformadores com diferentes grupos funcionais é desejável. Nos métodos por moagem a força de atrito gera um calor responsável por quebrar as interações intermoleculares dos materiais e formar novas interações entre esses materiais. Nos métodos por solução os cocristais vão sendo formados por nucleação e crescimento dos cristais a medida que o solvente é evaporado (KARIMI-JAFARI et al., 2018).
3.1.2.1 Métodos por moagem
Os métodos por moagem podem ser classificados como secos, quando não há solventes, ou como assistidos por solução. A vantagem dessas metodologias está no não uso ou no uso mínimo de solventes, mas uma desvantagem relatada na literatura pode estar no fato da obtenção de um material não homogêneo devido à formação incompleta do cocristal. Os métodos de moagem assistidos por solução são mais eficazes devido ao uso de quantidades pequenas de solvente acelerar a reação por umedecer a superfícies dos sólidos. Em menor escala essas metodologias são realizadas em gral e pistilo e em maior escala em moinhos e extrusoras (KARIMI-JAFARI et al., 2018; ROSS; LAMPROU; DOUROMIS, 2016).
A extrusão por fusão a quente é uma técnica de moagem bastante citada na literatura dos cocristais que consiste na passagem forçada do material seco por matrizes que misturam o material em altas temperaturas até a fusão do material com posterior resfriamento. Um exemplo recente de aplicação dessa técnica foi na obtenção de cocristais de carbamazepina e ácido cinâmico por Moradiya et al. (2014). O moinho de bolas também é considerado um método de moagem e foi utilizado, por exemplo, na obtenção de cocristais com espironolactona e griseofulvina (GRECU et al., 2017).
Após a moagem assistida por solução, o material permanece úmido fazendo necessária a secagem por algumas horas ou dias. São inúmeros os estudos com essa
metodologia. El-Gizawy et al. (2015) utilizaram dessa metodologia para a obtenção de cocristais de hidroclorotiazida e dióxido de silício coloidal utilizando acetona como solvente, assim como Putra et al. (2017) que obtiveram cocristais de epalrestate e cafeína utilizando gotas de etanol.
3.1.2.2 Métodos por solução
Os métodos por solução são os mais relatados na literatura. Além da evaporação lenta do solvente em temperatura ambiente, várias técnicas tem sido otimizadas para uma obtenção mais rápida desse material e em larga escala, como a secagem por evaporação sob pressão reduzida e a secagem por aspersão. Uma desvantagem dessa metodologia é que as matérias-primas precisam ser solúveis no solvente de trabalho (KARIMI-JAFARI et al., 2018).
A secagem por aspersão ou atomização (Spray drying) é uma técnica geralmente relacionada com a obtenção de materiais amorfos, porém pode ser utilizada na produção de cocristais. Patil et al. (2014) utilizaram essa técnica e obtiveram cocristais de carbamazepina com nicotinamida e também por moagem assistida por solução utilizando 900 μL de metanol para 5 g de carbamazepina. Também foi possível a obtenção de cocristais de teofilina com ureia utilizando a metodologia de secagem por aspersão utilizando soluções metanólicas aquosas (ALHALAWEH et al., 2013).
A evaporação lenta de solvente junto a moagem assistida por solução são os métodos mais relatados na literatura. Cerca de 700 mg de cocristais de ezetimiba e metilparabeno foram obtidos lentamente após solubilização em 10 mL metanol com secagem a temperatura de 35 ºC por 2 dias (SUGANDHA et al., 2014). Cocristais de ezetimiba e prolina também foram preparados por evaporação lenta de acetato de etila e heptano (SHIMPI et al., 2014). A secagem por evaporação sob pressão reduzida pode ser realizado utilizando o aparelho de rotaevaporação, como utilizado por Zhou et al. (2016b) que obtiveram cocristais de resveratrol com 4-aminobenzamida ao dissolver as matérias primas em etanol. Foi possível a obtenção de cocristais de carbamazepina com sacarina a partir da solubilização das matérias primas em solução de metanol e etanol (62:38) com posterior rotaevaporação (PAGIRE et al., 2017).
Percebe-se que muitas metodologias usam solventes com alta toxicidade o que vai de encontro a química verde. Assim, sempre que possível, procura-se utilizar metodologias livre de solventes ou que usem solventes menos tóxicos como o etanol (ROSS et al., 2016).
3.1.3 Melhorias e pontos negativos dos cocristais
Comparados a outras tecnologias, os cocristais apresentam menos pontos negativos, no geral, pode-se observar para o cocristal resposta inferior ao fármaco isolado, por exemplo menor dissolução ou estabilidade física. Apesar disso, as melhorias que podem ser obtidas com os cocristais são indiscutíveis, quando comparadas com as respostas das moléculas isoladas ou outras tecnologias (SHAIKH et al., 2018).
3.1.3.1 Solubilidade e dissolução
A melhoria de solubilidade aquosa é o parâmetro mais citado na literatura dos cocristais. A dissolução dos fármacos em meio aquoso é uma etapa determinante na absorção dos fármacos por via oral, e para que ocorra essa dissolução as drogas devem apresentar certo grau de solubilidade aquosa. Os testes de dissolução in vitro podem ser usados para estimar uma relação com os resultados que podem ser obtidos in vivo, através da avaliação do perfil de dissolução dos fármacos em diferentes meios fisiologicamente simulados. Esses testes in vitro normalmente correlacionam-se com os resultados obtidos na avaliação da solubilidade aquosa (AULTON; TAYLOR, 2016). Uma estimativa é que 40% das drogas existentes e 90% das novas drogas em estudo apresentem solubilidade aquosa limitada (KALEPU; NEKKANTI, 2015). Nesse contexto se entende o grande número de estudos relacionados à melhoria desses parâmetros.
A solubilidade é um processo termodinâmico no qual ocorre o equilíbrio entre soluto e solvente, já a dissolução é um processo cinético que pode ser compreendido em termos de velocidade de taxa de dissolução a qual o soluto chega em equilíbrio (BERRY; STEED, 2017). Como se deseja correlacionar as respostas com resultados in vivo é comum que a avaliação da solubilidade e dissolução sejam realizadas em meios que simulem o pH do estômago, duodeno e intestino. Zhou et al. (2016b)
avaliaram a solubilidade de cocristais de resveratrol em diferentes meios aquosos e obtiveram melhor resposta que o fármaco isolado. Cocristais de hidroclorotiazida com aerosil apresentaram dissolução superior ao fármaco isolado em meio de pH 1,2 (EL-GIZAWY, 2015). Já em pH 4,5, cocristais de dapaglifozina com ácido cítrico apresentaram melhor solubilidade que o fármaco isolado. Em pH 6,8, cocristais de carbamazepina com nicotinamida apresentaram melhor perfil de dissolução que o fármaco isolado (PATIL; MODI; BASAL, 2014).
A solubilidade como um processo termodinâmico pode ser entendida em termos de energia livre (entropia), onde maiores valores de energia livre favorecem a interação entre soluto e solvente e posterior solubilização. Um outro fator ligado a solubilidade é a entalpia de hidratação que está relacionada a liberação de energia quando ocorre interações de hidrogênio entre o soluto e o solvente; os sais apresentam maior entalpia de hidratação e isso os favorecem (BABU; NANGIA, 2011). A solubilidade de materiais amorfos é alta, pois possuem maior energia livre devido à desorganização das moléculas gerando maior superfície de contato que melhora a interação com a água. Em teoria, esses materiais possuem maior solubilidade que os cocristais por não necessitarem de energia para quebra da estrutura cristalina, pois não a possuem (HEALY et al., 2017). Comparado aos solvatos, os cocristais não hidratados normalmente apresentam melhor solubilidade pois a energia livre necessária para liberar as moléculas de água dos solvatos os favorece (BABU; NANGIA, 2011).
A solubilidade do cocristal em teoria é menor que a de um material amorfo, uma vez que possuem menor energia livre, dependendo da quebra da rede cristalina e da solvatação dos componentes do cocristal para uma melhor solubilidade. Quanto menor a força da rede mais fácil ocorre a solvatação (WANG et al., 2018). Os cocristais geralmente possuem a força da rede cristalina menor que as dos componentes individuais e consequentemente maior facilidade de solvatação (KARAGIANNI; MALAMATARI; KACHIRIMANIS, 2018). A solvatação é facilitada pela escolha de coformadores mais solúveis que o fármaco de interesse (ROCHA et al., 2016).
A vantagem de solubilidade de materiais amorfos e sais sobre cocristais também não é regra, depende dos componentes os quais se trabalham em ambas as tecnologias, pois na literatura é possível observar que cocristais de diferentes fármacos possuem melhor solubilidade aquosa que outras tecnologias. Remenar et
al. (2003) obtiveram cocristais de itraconazol com o ácido málico e com o ácido tartárico e compararam com a forma amorfa referência já comercializada e observaram que os cocristais apresentaram perfis de dissolução em meio ácido equivalentes a forma amorfa. Sanphui et al. (2013) observaram que cocristais de ácido pimélico apresentaram maior solubilidade em meio ácido aquoso que o citrato de sildenafila. Cocristais de tenoxicam com resorcionol apresentou ter maior solubilidade que o fármaco na forma de sal (BOLLA, SANPHUI, NANGIA, 2013).
3.1.3.2 Compressibilidade e fluxibilidade
A compressibilidade é a capacidade do pó em diminuir seu volume para um estado mais denso e é comum matérias primas farmacêuticas apresentarem uma pobre capacidade de compressão (BERRY; STEED, 2017). Já a fluxibilidade é a habilidade de fluxo do pó, sendo desejável para que pós não sejam aderidos às superfícies das máquinas durante a produção e para que não ocorra o comprometimento do enchimento das matrizes durante a compressão (DE SIMONE et al., 2017). A melhoria desses parâmetros nos cocristais permite a produção de formas sólidas mais facilmente e com menor quantidade de outros excipientes. Normalmente esses parâmetros são avaliados com o cocristal em uma formulação, porém é fácil encontrar estudos desses parâmetros com os cocristais apenas; por exemplo, cocristais de lamotrigina com diversos coformadores apresentaram melhores propriedades de compressibilidade e fluxibilidade que a lamotrigina isolada (THIPPARABOINA et al., 2015).
3.1.3.3 Estudos in vivo
Os estudos in vivo avaliam a biodisponibilidade e diferentes respostas dos fármacos isolados frente aos cocristais. A biodisponibilidade é definida como a extensão do ativo que é absorvida e se torna disponível no sitio de ação, logo, quanto maior a biodisponibilidade maior será o efeito do fármaco. São poucos os estudos clínicos dos cocritais; a maior parte são com animais (WANG et al., 2018). Os estudos com humanos mostram a eficácia terapêutica dos cocristais sem comparar com o fármaco sozinho em relatórios aprovados pelo órgão responsável, como o do Steglatro® aprovado pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA, 2018).
São menos numerosos os estudos in vivo com os cocristais comparados aos in vitro, porém é fácil achá-los. Merlos et al. (2018) mostraram que o cocristal de celecoxibe e tramadol obtiveram melhores respostas que os fármacos isolados, sem agravar os efeitos tóxicos, quando avaliaram a alodinia mecânica e hiperalgesia térmica em estudos com ratos. Huang et al. (2014) compararam a biodisponibilidade oral de nanocristais de baicaleina e cocristais de baicaleina e nicotinamida administrados oralmente em ratos e concluíram que os cocristais obtiveram maiores concentrações plasmáticas do que a baicaliena isolada e que seus nanocristais.
3.1.3.4 Estabilidade
A estabilidade pode ser entendida pela capacidade do material de manter sua integridade em períodos e condições variadas. A avaliação da estabilidade em estado sólido inclui protocolos já bem definidos que se baseiam em variar condições de umidade e temperatura, estabilidade acelerada e longa duração por exemplo, fotoestabilidade, bem como também estudos menos comuns, sob pressão de compactação por exemplo (SHAIKH et al., 2018).
Uma das possíveis desvantagens dos cocristais está relacionada com a estabilidade física frente a altas umidades que pode acarretar na dissociação do cocristal. Eddleston et al. (2012) observaram alterações cristalinas no material ao submeter cocristais de cafeína com alguns coformadores a umidades relativas superiores a 90% após algumas semanas ou meses, sendo essas alterações consideradas dissociação do cocristal. Essa desvantagem não é uma regra geral. Em alguns casos os cocristais revertem esse ponto negativo ao diminuir a higroscopicidade, quando comparado as substâncias isoladas, como observado por Chow et al. (2012) que obtiveram cocristais de ibuprofeno e nicotinamida com menor higroscospicidade. Ainda, em contraponto, os cocristais podem ser formados em condições de moderada umidade (KUMINEK et al., 2016). Ervasti et al. (2015) observaram a formação de cocristais de nicotinamida com teofilina a partir de misturas físicas armazenadas a 75% de umidade relativa.
Com relação ao processo de fabricação de formas farmacêuticas que venham a conter os cocristais pode ser pensado na inviabilidade de sua produção ao levá-los a processos que entrem em contato com solvente, levando a dissociação, ou a impossibilidade de formá-los ao adicionar excipientes concomitantemente. Porém
estudos mostram que é possível a formação de cocristais nessas condições. Rajbhar et al. (2016) na obtenção de comprimidos adicionaram à formulação cocristais já preparados de claritromicina com ureia e submeteram a granulação por via úmida com alguns excipientes. Walsh et al. (2018) mostraram a formação de cocristais de ibuprofeno com isonicotinamida durante o processo de extrusão por fusão a quente e secagem por aspersão ao adicionar as matérias primas isoladas e excipientes como manitol, xilitol, soluplus e PVP K15.
Apesar da vantagem da solubilidade aquosa a alta energia dos materiais amorfos também faz com que eles sejam termodinamicamente instáveis podendo levar a reversão para a fase cristalina comumente, como relatado por Hu et al. (2014) os quais sintetizaram cocristais, sais e formas amorfas de sulfatiazol e observaram que após 1 mês em condições ambientes o material amorfo já apresentava recristalização enquanto a estabilidade dos cocristais e sais se mantiveram.
São inúmeros os exemplos na literatura de cocristais que mantiveram ou aprimoraram estabilidades quando comparadas aos componentes isolados (SHAIKH et al., 2018). A avaliação da estabilidade acelerada, 40 ºC e 75% de umidade relativa, de cocristais de carbamazepina com ácido cinâmico não mostrou alterações físico-químicas no período de 6 meses (MORADIYA et al., 2014). Lu et al. (2019) avaliaram a estabilidade de cocristais salinos de berberina e ácido cítrico ao submete-lo a diferentes umidades relativas e observou que o cocristal apresentou menor variação de peso se comportando melhor frente a sorção e desorção de água comparado ao fármaco na forma de sal. Deng et al. (2017) avaliaram a estabilidade térmica pela TG e viram que os cocristais de dapaglifozina apresentaram início de degradação aproximadamente 100 ºC após o início de degradação da substância isolada. Cocristais de etravirina com ácido benzenotricarboxilíco apresentou melhor solubilidade e estabilidade que os sais estudados por Rajput et al. (2013).
3.2 ÁCIDO FERÚLICO
O ácido ferúlico (AFE), ou ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico (figura 3), é um ácido fenólico derivado do ácido cinâmico presente em plantas como a Angelica sinensis, Climinicifuga recemosa e Ligusticum chuangxiong, também encontrado em algumas frutas como tomate e laranja e em maior concentração em cereais como trigo e milho (MANCUSO; SANTANGELO, 2014; PAIVA et al., 2013; SILVA; BATISTA, 2017). É
isolado largamente dessas fontes por meios enzimáticos a fim de sua aplicação na indústria farmacêutica e alimentar devido a suas propriedades farmacológicas por um baixo custo (KUMAR; PRUTHI, 2014; WU et al., 2017).
Figura 3 ‒ Estrutura química do ácido ferúlico
Fonte: autoria própria
Embora os estudos, em sua imensa maioria, não abordem a estereoquímica do AFE, esse existe nas formas de isômeros cis e trans, sendo a trans a mais frequente na natureza (SILVA; BATISTA, 2017). Apesar de não citar quais isômeros estão se trabalhando na maioria do estudos, esses se referem ao isômero trans pois esse é sólido a temperatura ambiente, já o cis é líquido (PAIVA et al., 2013). O AFE possui pKa de 4,6 (DUPOIRON et al., 2017) e é convertido em sua forma cis ao ser exposto a luz UV (HORBURY et al., 2016).
Como a solubilidade das moléculas dependem do meio e da temperatura que está se trabalhando, são vários os valores de solubilidade em meios aquosos do ácido ferúlico na literatura. Em água pH 3 e pH 7,2 a 25 ºC foi visto que a solubilidade do AFE foi de 0,71 e 6,63 mg/mL respectivamente, resultado esperado pois em pH maior o AFE estará ionizado (SAIJA et al., 2000). Mota et al. (2008) obtiveram diferentes valores de solubilidade a depender da temperatura da água, com pH próximo a 3, onde foi visto valores de 2,19 mg/mL próximo a 50 ºC e 0,78 mg/mL próximo a 25 ºC. As farmacopeias americana, europeia e brasileira consideram que para ser muito pouco solúvel a substância precisa ter em torno de 1 a 10 mg/mL, abaixo desse valor as substâncias são consideradas praticamente insolúveis ou insolúveis (AULTON; TAYLOR, 2016; ANVISA, 2010a).
O sistema de classificação biofarmacêutica preconiza que moléculas classe 2 possuem alta permeabilidade e baixa solubilidade aquosa (BAGHEL; CATHCART; O’REILLY, 2016). Alguns autores abordam a classificação biofarmacêutica para o AFE, afirmando-o como classe 2 (FRANKE, 2014), mas essa não é a melhor abordagem, já que não são estabelecidas doses já comercializadas. Para confirmar
se possui baixa solubilidade aquosa de acordo com a CBS é necessário confirmar que a maior dose do fármaco, que é administrada oralmente, não é solúvel em 250 mL de soluções aquosas de pH fisiológico (ANVISA, 2010b; ANVISA, 2011).
A farmacocinética pré-clínica do AFE está sendo estudada. Sabe-se que o AFE não é degradado pelo estômago e após ingestão oral a maior parte do AFE é absorvido por difusão passiva no cólon. Foram vistos estudos que a biodisponibilidade após ingestão oral representou 20% na sua forma inalterada, com picos de concentração plasmática em torno de 30 minutos, sendo excretado na urina na forma inalterada e glicosilada. A toxicidade oral é baixa, apresentando toxicidade subcrônica muito baixa e LD50 de 2,1 e 2,4 g/kg em ratos fêmeas e machos, respectivamente
(MANCUSO; SANTANGELO, 2014; PAIVA et al., 2013; ZHAO; MOGHADASIAN, 2008).
3.2.1 Atividades farmacológicas
São várias as atividades farmacológicas do AFE observadas na literatura, dentre essas é destacado seu potencial antioxidante devido ao seu alto poder de sequestrar radicais livres graças aos grupos hidroxilas presentes em sua estrutura que doam elétrons para o radicais livres, estabilizando-os. Essa neutralização dos radicais livres é importante pois esses são instáveis por possuírem um elétron não pareado, o que permite interações com moléculas como lipídeos e proteínas, acelerando a degradação oxidativa e podendo levar a inflamações. Esse potencial antioxidante do AFE se relaciona com outras atividades como protetor de doenças cardiovasculares e neuroprotetoras, pois depende das células as quais estão sendo afetadas pelos radicais livres (SILVA; BATISTA, 2017; MANCUSO; SANTANGELO, 2014).
São várias as atividades citadas na literatura para o AFE e algumas com possíveis mecanismos de ação abordados, principalmente na avaliação da atividade antitumoral, algumas delas são comentadas a seguir.
Um mecanismo geral antioxidante, além do sequestro de radicais livres, é proposto por Ma et al. (2011), em que o AFE aumentou a expressão do gene e da proteína heme-oxigenase 1, uma enzima com propriedades antioxidantes, pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular e do fator nuclear eritroide 2. Em ratos hipertensivos o AFE (50 mg/kg) foi capaz de atenuar a inflamação cardíaca e
renal de ratos ao aumentar os níveis das enzimas superóxido dismutase e catalase, responsáveis pela neutralização de radicais livres (ALAM; SERNIA; BROWN, 2013).
Devido a sua estrutura química apresentar várias insaturações, o AFE é um potencial absorvedor da luz UV que contribui para seu potencial antioxidante contra danos oxidativos às células gerados pela radiação da luz UV (SILVA; BATISTA, 2017; KUMAR; PRUTHI, 2014). Assim, também é aproveitado seu potencial uso em cosméticos na proteção solar, como observado por Lin et al. (2005) que observaram o dobro de fotoproteção ao reduzir eritemas e queimaduras solares em porcos, como isômero trans em uma formulação na concentração de 0,5%. E formulações cosméticas com o AFE já são comercializadas (TEE-NGAM et al., 2013).
Na literatura o relato do efeito sinérgico do AFE com outras moléculas para diversas doenças é bastante promissor. Yogeeta et al. (2006) avaliaram a cardioproteção do AFE (20 mg/kg) junto ao ácido ascórbico (80 mg/kg) administrados oralmente em ratos, onde foi possível reduzir a chance de infartos induzidos por isoproterenol devido a seus mecanismos antioxidantes. Prabhakar et al. (2013) avaliaram o efeito hipoglicemiante do AFE isolado (10 mg/kg) e juntos a metformina e tiazolidinodiana, em que isoladamente o AFE apresentou resultados semelhantes aos outros hipoglicemiantes e sinergicamente reduziram a glicemia a níveis normais em ratos diabéticos. O AFE também apresentou atividade antifúngica in vitro ao induzir apoptose dos fungos Candida albicans e Candida glabrata, tendo resultado mais significativo quando avaliado junto a caspofungina, apresentando efeito sinérgico (CANTURK, 2018). Esse efeito sinérgico é bastante interessante em estudos antitumorais.
No estudo contra o câncer é comum a abordagem de associações de medicamentos tanto para a obtenção de efeitos sinérgicos citotóxicos contra as células cancerígenas quanto para diminuição de efeitos colaterais e reversão da resistência celular aos diferentes fármacos (ZOU et al., 2017).
A problemática das células multidrogas resistentes foi abordada por Muthusamy et al. (2016) ao investigarem a sensibilização de células multidrogas resistentes de adenocarcinoma ao paclitaxel. Foi visto que o AFE diminuiu significativamente a expressão de proteínas de efluxo (ABCB1) de maneira dose dependente e permitiu a permanência do paclitaxel nas células e consequente indução da apoptose. Essas proteínas de efluxo são responsáveis pela resistência ao paclitaxel e a várias outras
