Novas Técnicas Citogenéticas de interesse em Endocrinologia.

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zuocarmoxoarâ

Luís càpnranxomx. , _{_} ' _ - - .'!'úI.-*E . .\-` > .-'I -I - ‹ .

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'ÂHGVAS TÉCN.IOàS› CITOGÊÍ;¡ÉTICAS_DE :INTERESSE

W.

ERDOCRINOLOG-_IA~ - _{REVÍSÃO BBLÍOGRÁFÍICÀ} “

. - . / ‹ ` ` / l 1 \ U š.¡J'z'|`¬/ Ii* _{\_} \

AUTOR; Eliana Ternbs Pereira - _{méâiça Ã._¡} U

suPERvIsoRz~R»âa Rita _{âõz santas H¿rtiàs 5} méâ1¢â*+

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I i Í ‹ I I í ._ ‹ _ I ' i V

Rzsuno

W

¡ › .\' ; . » _ r _. - . › \ ›

,ms anomalias cfamossômieas que mesfirem perturbações eg

peeíficas

da

hemeostase endãcrina relacipnam - se elássicamente aos

eremossomas sexuais. Res últimas ends têm sido descritos muitos eg sos de associação entres _{anomalias dos antossomas} e _{ãoenças endéer¿}

nas sem que,no entento,esta _{relação seje} eonsidefada inzerdepenäeg

te.

,

'

_ e campo

da

infertilidade masculina e feminina ñevas

perspectivas díagnásticas se abrem com o reconhecimento de alterä ções cromossômícas estruturais, antes não

identificáas,

como reg

- ›

s .

paüsáve1s'§ef ábeftõs äe Pepeäíção eü esteriíiäãâe. '

”

Í . 1

'

_ _ É gretifieente o surgimento cada vez mais› frequente

nesta área de trabalhos elucidativos em relação ao tipo de aàemäiía e-sheefrequêneiez Em teàes-os casos de eboräemeñte âe -repeäíçãe a determinação do _{eariotípo dos côníeges} 6 fundamental pera. e aeensg

lhamento genético e _medicine preventiva, de vez que aÍe€1ábí1iáade

fetal pode eeorrer,- levando a perpetuação das eltereçäes na ässeeg äêneiaé ` ` . 'I ' _ _ _ ~ 4

_ eAs neves perspectivas abertas, desde os tzabalhes 1e¿

eiaís de Casperson e _{cole., nos} trazem a mãe úais um instrumente _vg lieso na diagnose médica. '

Q -* -

-

O presente trabalhe propõeêse_a rever as técnicas eítg genéfiicas-utilizadas para diagnóstico das aberrações *eremessômíees

e referir sue-importância em endecrinologia. Í _

\ - , \ . ' V -»› Í _ /

' \ ×'a .!'_ / / Í 1 | . A

_ Este trabalho de revisão .

bibliográfica, realizado .sob g supe:y¿

¿ são da Drfi Rosa Rita dos Santoš-Martins,l

_ _ faz parte da ex1gênc;a`dd Curso de Espg

~í eializaçäo em _{Endocrinulogia minísärêäó}

-

pelo Instituto Estadual Ide *Diabetes_a

Endocrinologia Luis Capfigliohe, éomé~

parte õos requisitos para a habílítaçãø-'

aq _{títula âeVEspec1ê1is€a.} V I

Rm

de aámiz-‹›, 31 âé' _{kàúàubfz aê 1977,*}

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x~

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n 1 o RESUMO 1. - Imrnonnçflo r ' ' z . s A

Z

~ _'

1.1 Estrutura dos cromossomas

.1.2 Anormal idades cromossômieas

` 1.2.1 Isocromossomas -' . 1.2.2 Deleção 1.2.3 Duplicação I' V 1.2.h Inversão 10205 .T1'anS10caçã.Ó ' 1.2.6 Dieêntrico ' " - 1.2.7 Cromossoma em anel › ' ii' 2. - rácmxcàs crroosmfirxcàs ~ - ' ' . `

2.1 Métodos para estudo cromossômíco

. I

.

-.

.2.1.1 Metodo convencional ~,cu1tnra.do toeiãosfi

2.1.1.1 Preparação do medula Õssoa

- 2.1.1.2 Cultura de tecidos

V 2.1.1.3 Cultura de leucócitos periféricos

“_ _{2.1.2 Autorradíografia} ' f ' ~'1 <sub>2.1.3`Bandeamento</sub> cromossômíco '. 1 2.1.3.1 método 2.1.5.2 názoõo 1 2.1.3.3 Método 2 2.1.5.1 Método - 2.1.5.5 método. - 2.1.3.6 Mëtodo 2.1.3.7 Métoâo 1 "2.1.3.8 Método -2.1.h Outras 2.1.1.1 Método .2.1.h.2 Mëúzâo 2.1.h.5 Métoâc 2 2.1.u.u.Méfizâo> 1 2.1.u.5cMázoâú de coloração QL" de coloração-G ¿' de coloração R de coloração C de coloração T 2 de banóeamzntu Bràv . de banáeamento de replicação do coloração N _ ' técnicas ' ' de coloração Giemsa 11 às coloração C 9 _ de coloracao A 1 ` '_- - ão coíoração C ä A ão eo1oraçäo'fioochst_332582 -2.1.5zNomenc1atura~ A ', __`w `____`_ _ ., . _- -_ ._ ._. . , ..._.. . ._....- .¬. ..-_..».-.-...._...~ , ...._.... ..._¬.¬...~»...__...,.._-...-....z...-›‹-.,«..«¬f...-.Q-v-...« . »-- - ¶ah 'wo co-4 10 10 10 10 10 11 11

13

13 äëëãä 19 2o 21 25 25 26 27 28 29 29 29 29

29

29 29 ‹@~"š”›' 1 'â

J

_ .

1

2.2 Métodos especiais para os ciomossomas sexuais 2.2.1 Corpúsculo de Barr * ` » 2.2.2 Drumstick 2.2.3 Cromatina de

Y

3. - ANOMALIAS>CROMOSSOMICAS Cromossomas sexuais - 3-1, 3.1.1 Cromossoma X_ ` xx ‹ 3.1.2 Cromossoma

Y

"-

-_ J j ' '_ 5.2 Desenvolvimento sexual - ¬{

3.3 Anomalias dos cromossomas sexuais 3.3.1 Síndrome

XXY

e variantes'

V3.3.2 Polissomias de

Y

e variantes

`

3.3.3 Polissomias de

X

e variantes _ _

3.3.ü Monossomías äe;X e variantes '

W |

2 3.3.5 Translooações envolvendo o'çromossoma

X

- W

5.3.6 Anomalias estruturais de.Y

É 0

_

«*. 3.3.7 Disgenesias e hermafroditismo '

3.h Outras doenças endôcrinas associadas

a

É

A aberrações cromossômicas í

-

~

3.5

Infertilidae

e anomalias cèomossêmicas

u. - eoncznsão « f Ê ' ¶ 1 1

5. - REFEnENcIàs BIBLIOGRÁFICAS ~' f «A

1 FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA FIGURA 6 FIGURA 7 QUADRO 1 Qusnno 2 QUADRQ 3 QUADRo

_n

I .*2 í ~ 5 FIGURA

_h

'FIGURA ₅

Tipos de eromossomas, segundo a posição do

centrômere

"

2.

Caríotipo ãe mulher norñal *

“

Cariotipo de homem normal *

Cromossomas após coloração G V

Representação ãiagramátíca ãas bandas cromog`

sômicas com métodos de co1oração~Q¿ G e R Exemplo de numeração das _{subdivisões dos eng} mossomas_

Vias morfogênícas do desenvolvimento gonadai Classificação aos cromossomas pelo sisfiama Denver '

z V

- ~.

Símbolos

da

nomenclatura de partes dos cro- mossomas e_seus rearranjos recomendados pela Conferência de Chicago e _Conferência de Paris Cariotípos observados na Síndrome ãe Turner_

Cariotípos _ . › . \ . _ 51 51 36 57 às

no

no hl

HZ

bh bh h5 h5 h6 b8 h8 h9 51 55 59 61 15 17 »18 23 32 55

ha

15 30 à7 50 ~w‹-E--W-,.7. 2 ... _ _ ..._....- _ __..__....`.. ...-.¬ ›« _.,_..¬._._..__._.-.-_-¬...._-..-..., ¬._.¬...__....,.._.._..._.,...-«. ...~ _..

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;7. 1. INTRODUÇÃO . ' ' ~ '

A

cítogenetica humana tem se t1rmado_como

um

meio de alto valor no

diagnetico

de muitas patologias e como recurso em meãicína preventiva, através de aconselhamento genético.

f «__ Embora e capítulo da genética tenha sido .aberto por Mendel, em 1865,

demonstrano

a transmissão de caracteres 'na _dog

cendêncla, somente em 1879 Arnold-descreveu pela primeira vez e-

cromoesema. Em 1912, winiwarker estimou e número dos‹ cromossomos em H8, sendo 23 pares de antossomos e 2 cromossomas sexuais na

_mg

1her e b? cromosscmas no homem, com

um

único cromossomo X;

A

exig tëneía do cromossoma

Y

no homem só_fb1 descrito em 1921, por Pain

ter(5).

. _ ._' _/ . . ._ ' J u _' ` 0

0 marco historico

da

citogenétíca foi o an de 1956, quando Tjlo e

Lovan.demnstraram

a presença de há cromossomos na célula somática humana (75), achado incontestável até~ho;e@ A pr¿ meire anornaiiäaëe cromossômíea numérica reconhecida foi

a

Sinãro me de Down, apresentando _h7 cromossomos _675), descrita por Lojeg ne, no ano de 1959. _._ Í

_

_ .

_ _

Í -Em 1960, com a Conferência de Denver_(3Ê3, os

cromos somas foram classificados através de_seu comprimento e posição do centromêro. - -«. ~ ~ ~ - ~<

W I

_'

›

-*Em _{1963; a Conferência de Lonfires (~5) estabeleceu}

que para a caracterização dos cromossomos devem ser consideradas

as constricçöes secundárias e _{carecterísyicas autorrañlogrâtícas.}

V

A

Conferência de Chicago, em 1956 C75),~ classificou e estabeleceu

um

sistema de _{nomenclatura para asanormalidadee crg}

mecânicas.

1 - ^ - 1 - › ~

O advento de método äe bandeamento cromossômíco revg lneionon a citcgenétice a partir de 1968, adicionando nn novo _er¿ teria para identificação dos cromossomos, que leva em _cons1eerg ção Va presença do bandas e sub-ba,_n:1as,__ eetabelecidanaflonferêncía

ea Paris, em ₁₉₇₁ (82), % ` 1 1 ~V , 1 A V 7 V - .

› Coming: reforça a importância dos nécnieas

äe'bade§

mento ercmoaeômico,

ealientano

qne antes äeías era impossível o

reconhecimento de tríesomíae e _{aonossoniaa paea'eegmentoa eromog}

sâmicos (22)¿

Í ' z Aí . .8.~: _ ~

A

eromatina de Y, descrioa por Pearson .e Bobrow em

1970 (8ü), veio trazer, associada ä cromatioa do Barr,noves meios

diagnósticos para as alterações sexuais. _

-_

Í

'

O nosso trabalho se propõe a rever as técnicas citg

genticas,

focalizando especialmente as de bandeamento cremossôm;

co) Para isso basearemos nossas obseryaçöes, preferentemente, nas citações originais, de vez que uma revisão mais minuciosa das tég nicas modificadas, são de interesse particular para o citogenefii

cista. @ ' . .Í ' ' `\ 1.1 - f o _ se _ ¡ _ _ ,

`~0 _{cromossomo Õ}

_formao

_{por uma.macromo1ëcu1a de DNA}

que se estende de teiômero a ñelômero, formando complexo com prg teinas histona e não histona (ZZ), e apresenta 2 hastes de polar; dades diferentes, com estrutura he1icoida1(i19);.

_ › H - 1 ` H I › A _-

_ O-DNA e formado por nooieotíâeos,ooasfiituidos.por

na

se nitrogeoada, desoxirribose e gropamenmo fosfato. Estruturelmeg te-apresenta«se como sequência de nneleotideosç-unidos entre -si

por'pontes-de~hidrogênio9 através das~bases _{nitrogenadas, nas coä} binações_de adenina timiaa e-guaninehcitosioa.__A

-varias

seqnêg cia e posições dessas uniões, permitem uma diversificação extreoz dinária do DNA (9h). Podemos reconhecer

DNA

repetitivos em que _ag

quência similares são repetidas mais de um milhão de vezes,ou,DNm moderadamente repetitivo,

emqoe

as sequências foram reproduzidas centenas ou milhares de_veses_(22).; _ z

'

_ H

- As duas hastes de DNA são bases para síntese de duas

novas moléculas,

quandose

duplicar:

m

periodo S; Através de auto; radiografia, observou»-se que nem todos cromossomos complei-,ama sig tese do DNA simultaneamente e mesmo entre alguns cromossomos homg logos, pode haver assinoronia (ü0,h1). _ _ , _

Toda informação genética está contida na sequência

de bases do DEA no cromossomo (9ü). _

As proteínas

cromssômicasg

histonas e¿oäofihíetonas@ encontram-se em proporções diferentes para cada cromossomo. A~rg lação da histona/DNA š 1,9 e entre nã histooa/DNA 6 _{0,2 a 3,0,}

I

i .

I

.9;

pessimo,

esta última,

mam»

enviasse

genética ‹za); setores s

elas função de manutenção

da

estrutura da cromstina e possível _ig tor do repressão gênica (95). .

W-_

'

«

Os cromossomos apresentam-se

dosespiralizaos

duran to a interfose _c condonsados durante a divisão ce1u1ar(I15).

“ . ` `*z . ' `

. Existem diferentes tipos do cromatina nos gononas,

sono

os mais importantes a oncromatina o e hotorocromatina (22).

A hoterooromatina 6 definido como regiões inortos `8oneticomonto, de replicação tardia no _{período S c condonsedos} na interfoso(18)§ Podo ser de dois tipos: _z V

A

“

~ `

. ',

_! a)- Hetcrocromatina constitutiva, localizada na região

bg

mšloga do cromossomo homôlogo; ~ 'V-

b)- Hoteroeromatina facultativa, presente em apenas

um

crg mossoma homãlogo, sendo o cromossomo

X

inativado ao acaso,um oxsg plo desse último tipo. .

~ _ _ -' _ _ se _ j . _/ -

›

Soguno

a localização, a heterocromatina constitoti

va

pode ser centromãrico ou intercalar. Nas tëcnicas citogonéti cas, os métodos do bondes distinguem basicamente os diferentes og taáos do cromatinsz

A

encrometins sprosenta¬so,~useo1moots,disps; sa

na

interfaso, replica precocemente no porioão S o á usualmootc "ativo" _(22). A

*

. V

~

1 `

À

“atividade” de no cromossomo é

expressado

docs

fo; mass Atividade genético sxpressa_ns codificação de RNA. e síntese

ao

om

0.11); ~ _

`"

V 1-2 - ¢ _{ss__s__} A no t. ; ~ f '

As

aormaliõdes

cromossômioas forem revistas e _olsssificg

dos em 1966, no Congresso Sobre Gesético'Humans, em Chicago _f75)§

W

Bá, dois tipos básicos do aberrações:

A s)~ A1toração_do número cos cromossomos

,b)- Alterações ostrutureisà ~ ~ ' ' ' _ ' z V -

As oitoroçëos numéricos são ãooomiooäas eneoploiãie ou poliploiäis o decorrem da ão disiunção äos eromossomess Podem ooorror durante o divisão mitõtice ou meiótics, ou por poräo‹fino§ to

o

snãfose. Das células filhas rosultontes,_omo'sooobo o sromoä

mçym _ _f _¬_¬___ -¬ ~~ --‹ -. - ~-- ›‹-›---~-~-»--›‹-W-»~-‹›--v-‹ -‹---›‹~›› ~ *~ _ap-p

E 1 | ' É ¡ . . _ r - 0100' í ll ' Á . _ ¡ .

soma extra que :alta na entra. A deneminaçäe peliesomia ê utilizg

da

para expressar a presença äe cromossomas adicienaisfie, o termn mennssomia, indica a ausência de

um

cremossoma. Quando- a não _dia junção ecorre apšs

a

fertilização, o embrião pode apresentar duas linhagens celulares, caracterizando›nm mesaieisme.Quanto mais _png cecemenze ocorrer a não disjnnção, maior

c

número de células

eng.

mais que serão encentredas e mais grave será a repercussão feno» típíea (5, Mt, 73: 75.). ' W t Í . à Q

'. _{As anomalias esnruturaia resultam}

_da

_{qnebradb cromeg}

soma durante a divisão celular mitótica on.mei6tiea,_ com a perca ou fusão

inadeqnaa

dos segmentos (5, bh, h8, 73,75). _

~

Sãe eles: `

`fl› '.

1-Z~1 - ¬ '

_l A

v,l Divisão transversal próxima a centrômere.0 segmento

cem deficiência de centrômere ê

eliminao

e o segmento remaneaeeg

te forma um cromessoma metacêntrice, podendo

ser

de braço curte eu longo, eom duplicação dos gens; -

¡ _ - Q Q ~ I ' cèiec 2 _/ if 'ml₀ N)_o

N

I C

Lëí=~

. z e

_l Quebra e perda de um segmento terminal ou intercalar

do cremeseoma, n braga curte ou longo. Representa uma menessemia de eegmenzc, áeeae que e hemálego permaneça íntegra;

H

1.2.5 ~ _{zgz;¿gggëg:} a~- " A

_ .

i

'

O aegmentc perdido pela deleçãn de

um

cromossoma á

incorpo-raäo ao homólege, na mesma posiçãn em relação ao eentrömere

«(tandem) eu em pesiçãe invertida (tendem

inertido);

'

1z2zk_- znversãgs ' . - ` . _

f Há quebra em âois pentes _{e o} segmento livre une»se ng vamente ae cromessomafi em posição inwertida.Se ae ãuas quebras ocorrem em

um

mesmo braçeg 5 chamada inversão paracêntrica; ~se

ecerre quebra nas deieebraçes, envolvendo e eentrômerenainvereãeg

6 chamada pericêntriea. ` ^ <

~

1‹›2~*3°:

W

l'

e

. Íreea ee segmentos enzreàcremessamae nãe hom5logeeÇ

na trenslceaçãee pedem eee recípreeae eu nãe recípreeae; A erang leeaçãe reeípreca resulta de quebra lecalizaâa em

qnalqer

pente

i

I .v-

É

'Í 011o

de dois

orooesomas,

exceto na região_eentroméríoa, com troea

_má

tua ãe segmentos. A_üreusíocaçäo não recíproca ocorre quando

há

simples urauslocação äe um segmento _para outro não hom61ogo‹muque não houve quebra. Há um tipo especial de transloceção denominada fusão cêntrice ou Roberteoníena, em que a quebra ocorre perto ou no centrômero dos eromossoues aerocêutrieos (h2). 'O mecanismo eu

volvião na fusão oântrica tem sido eousiãeredo como* translocação recíproca entre dois cromossomee eoroeêutr1cos,.ãanflo origem e um grande cromossomo e

um

pequeno fragmento eêntrieo (20); -

^ '- 1.2.6 - Qbíoêntrggos f. _É H '¡ _ ~. . 1 z ‹ - _ '

Perda de segmento de um dos braços com fusão das org mâtides irmãs e quebre do-ceutrômero,§formendo _{um eromossoma dig} eântrico; se uma transloeaçäo envolve dois oromossomas em que a quebra envolve o eentrôuero e

há

uuiäo das duas porções oom o _eeg

trômero, teremos um cromossoma dicêntrico e

um

fragmento _eeêutr¿

co, que pode ser perdido;

Í _ « Á J o 1.2¿7_- Cromossomgg em anegs '

"

_ ' '

à Beleçao de segmentos terininais de um

oromossomaereg

nião-áos~proçães distaie, formanão umganei '

~ ' _ ' ' . Í . _” - _ ' € . ' _ â ' oe ` _ ~ V

f Ge rearranjos oromossomijeoe tem um

grama

espectro âe

expressões feuotípíoas;

A

grande maioria _é 1ete1,_tanto entes

ua

implantação do embrião como ãurante os primeiros meses'

da

embrig gênese (U2). Í- __' » L _ ' _ ~ * _ #-\ \ I / ' _

I I I . .'§f.›'=l`=3 ƒ\'~;_

.Í-

' I z z É I II z §Écm:càs¶%c1Tn@EmÉ@zëàs I s I I I E \ 1

5 l š \ . _ _ _ , 1 ' -1 0 P4 UI_o 2. rficnucâs cxwoesuáwicâs -1 ~

. ¬As técnicas c1togenéticas_objetivem a contagem e ideg

tificação dos cromossomos e suas aberfações, baseaäos nos critérios estabelecidos nos Congressos de Genética Humana. .

_ _ v É

`

V » ~

Existem métodos que analisam todos_oe cromossomas, eg tabelecendo o _{cariotipo‹amétodos especiais de identificação dos crg}

mossomas sexuais: z; ze _\ '¬í j -iz * - _ . ¡ _ _ 3 _ _ _ I o 4; ` I

2.1 ggtodos para_ESÊUdoWcromošsooicg: «_ 'ici

.g _

-

" _I

2.1.1 - _{Metodo convencional} - _{cultura de tecidos}

_ 2.1.2 ~ Autorradiografia _`¶ " H ~ 2.1.3 -

_Baneamento

_{cromossõmico} 2 e ' I `

'2.2 - _{§§Ío§o3“especi§is para os cromossomgg sexuais:} \ V 2.2.1 - Corpúsculo de Barr 5 _ _ \ 2.2.2 ~_Drumstick_¶¿ A _ 2.2.3 ~ cromatínâ âe '11 _{z_} // »' _{2.1 â} §§todoä_e3a'Estudo_Cromoee$@i§g: _ _ _ 2.1.1 - gštodo cogyencione1'h cultura de tecidos

›

._ Gs cromossomas eviâenciam-se mais facilmente na metáfg

.se

(5)

e prótese tardia (75). '

À

1

'

'

São descritos 3 métodos principais de obtenção de célg

las em divisão para estudo cromossômico(5,75,115)S I -

¬ 1

_

2.1.1.1 - _{Preparação de medula šssea}

2.1.1.2 - _{Cultura âe tecidos ,} \

2.1.1.3 ~ Culture de leucöcitos periféricos

_ ~

~ -

A preparação citogenética inclui: e)» Com T0 _{horas ad;}

ção de eolchicina ou colcemiâ _eo material colhião, pàeäuzinão _íáibi ção do fuso celular e interrupção da mitose,

eneurtano

e äísperseg ão os eromossomes no citoplásmag b)@Exposiçä e soluçãesohipotàmcae

I 1 \ 1 I I

É I » ' in _‹ A 1 _ _ _ _1h¿ que promovem aumento do volume celular por embebição osmótica e eg paração dos cromossomos; c)=Socagem ao ar ou f1ambagem‹amontagem

da

lâmina com lamínula. A

_`

_ _

Glcífí

. 2.1.1.1 - zregaraçãg de medula óssea _

. ~ › . _ : _ 2

_ O material

da

medula ossec-ëobtido por púnção' esternal.

Apresenta a vantagem de necessitar curto tempo de incubação e _dis

pensar os agentes mitogênicos (75), sendo um procedimento` rápido e

simp1es(115). No entanto, pelas características

da

coleta, não pode ser usada para grande número de individuos

_(S);

H ' 2 2' ' _- 2.1.1.2 - Çcltgra de tecido§_ V -2 _ ' ~

_ As técnicas de cultura de tecidos variam de acordo com

o tipo ce1u1ar(115) e são obtidos por biópsia; `Hecessitam de perig dos longos para cultura (uma <sub>semana ou mais),</sub> mas` _{apresentam a}

_vag

tagem de serem mantidas muito tempo para utilização (5`fi. _{O tecido}

mais utilizado é a _pelo e 6 _util na confirmação dos cariotipos eg centrados em cultura de lcucšcitcs e_ao diagcšc ~ * l

_ _ ~ _ _* › 2 '_ ₀₇₅₎ . 2.1.1.3 ~ geltura de ieucácitoswperiíéricos ' mosaieismo. tz; ‹+ ¡,_›. cêO ChQ

.e_ É a _técnica mais _{ütilizada, desde que foi_desc?ita por}

Moorhea e cole. CYO) em 1960, por apresentar maior~ facilidade na obtenção do material, adequado padrão mitátice e alta qualidade das células em metáfase. Diíere das técnicas anteriores pois n início

da

cultura 6 adicionada _{uma substância mitogênica para} os _íeucóci

tos, a _{fitohemaglutinina, objetivando um maior número de células em}

~metáfase. O tempo de incubação varia de b8 a.72 horas, tempo neceš

sário.para que ocorram duas divisões celulares. `

'»

_

» -

As células colhidas por esses meios são _{fixadas, montš}

das em

Iâinas,

coradas e _{depois examinadas ao microscópico ético.}

A contagem-e classificação dos cromossomas 5 realizada apés fotogrg fia ampliada da lâmina, quando são recortados e dispostos em grupos

e- pares _(115), formando _o

cariotipm

Í

_

-

'

I '-

'

- O cariotipe aormal para

a espécie humana é de 23 pares de cromossomaes sendo 1 par sexualg XX para a mulher-e

X2

para o há*

mem, nas células semáticas. _Ee óvulo e eepermatozríide aszcéiiƒíes são hapléides, constituídas por 23 cromossomas, seado 1 sexuaí,

X

para

o óvulo o

X

ou

Y

para e espermatozóide» '_ ~

r

I

I

I

'

Q

.15-

-~~- -~ Os-critérios mais utilizados para identificaçãodos org

Ímossomas, são: _{comprimento, Índico centromérico, caraoterístícas ag}

torrádiográficas, localização das constrieções secundáríaseapaäräo äas bandas (82). .

›z

_

'

Í

_ O centrômero š um ponto de constricçäo primšríados org

mošsomas-que o ãívíde em dois ramos,f chamados braço curto e braço longo quando desiguaís(115). De acordo com a posição do oentrômero,

os cromossomos podem sor: motacêntéicos,_quando os dois braços têm

o mesmo comprimento; submetacêntríco, quando o_eontrômefo divide o

oromossoma em dois braços_dosiguais e acrocêntrico, quando o centrâ

mero está quase n final do cromossoma(FIG. _1)¿ Alguns dos cromossg mas acrooântrioos ainda possuem pequonos corpos arredondados, chamg ãos satë1ítes,Íno braço ¢urto›(75);_ ___ 3 ___ __._ ___ o. 'o

___~*:':' :'_;1 _ Jar _ :':v=n¢.__ _ __:›sar---aos-r-_~"* __' _. _' 'f'~í"'"'* '~_ _{1nuv¡__} _-_:1:_;_ _{__Jnu1_^';›auaf-u-|__' -1an__ __=_} '

H

~

H

,H

Metacêntríoos Submetaéântrícos_ _Aorooêntricos

_ _ _~:__ ~:_ _ «_ _ _ __ 'Í-A vu* '

__-¬nn&_'___ _' '__ _' -re ___:' _{Tn\c__n‹_} :_ IT_'_»:":_rf_ :;__

V FIG. 1

~ _{TIPOS DE CROMOSSOMAS, SEGUNDO A PGSIÇÃO DO CENTRÔMERO›}

_

~

Os eromosâomas nas oêíuíás somátícas, constítuem~3â ão

22 _{pares homólogos, namorados de 1 a 22I_Íemoi5äemz_š*cTeorescento de eofg} primonto o 1 _{par sexual deoígnado pe1as.1etras}

_X

e Y; Foram_c1asa; fioados em 7 grupos5do acordo com o comprimento o _{posição ão oentrâ}

mero, pelo Congresso de _{Denver (8ED,_domoâstrado no Quadro 1;}

Ç _"; _›\nr'^":¬ _ __ _›<=n›x "' ;z_: _ -:1~_ ' 'í : ' 1=n=** _f__ '*'_~_'___ _; __ __ __'_z-:|nzznr_:':"»f7 _ ';_ f--rânnt' ':_ _ _ *f:';:':_' _ "f_ _;____._ç ¿GRU?os % ._~.zoRoMossoHAs '_« _~ _Posição oo CENTRÓMERQ _ _¬___¿ _ . } 'ig :Í ' " Í É A

A

_P=W

1»

2 ° 5% _

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ÊzzšzzzÊfʧʚãʧʰʧ°S _ . ^ _

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. . paras 3 . __ _ _ V: toâas s_ub'£'!1$t30snÍ'r3-698 _ '\~'~'~""f";"f 'f'¬"'íf if 'Tí-Í z l¢'l“'"* ' z ' ' Til f” _{zz z¬='} 'f 'I rf; __:':¬'_=I-canâfi ; __ _ "t _ Ínunqnpuus-¬| _ C §Ê§;šsg¿mš'X8°

9' ;O* 11° 12'e _{ztodos submotaoêntricos}

LÊ 1--‹.~__ :~: ~ ___-«zz_¬z‹z~ __f__ ; __ ff ___,-ff; _.r;â_ ~~ _ _~z z z-_:; _{,E____-~} _

_

;:___;___VzzÍ~

_'-D; opareã 13,'1ü-8~15~-1o-››~~›--.~1Htodos~aorocêntrícos o 1 üu;~;:<ø-nr ~_ __ 'r f_'-_ _ fi* ; :í '3¢-_i›_-_ _ 11" ' ' ^:-'f--fbtánam-'-P:

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""

' ¬' ' " ' , ~_ G -

,pares 21 o _{22-o«cromossoma-Y-z «§toäo§›aorocêntfíoos} z»

Qua:-É 'í::'^_' __ '1-291:* 'Íunz ';J-au|u|.__ _{_"-'z>-:'~¬'-~f_}

-zfzzzõmran ‹_›_-'_-L-_-_ff~ ~f-‹~~_ _ ~ -...zz zz

_

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\ I . . ` I í ! ;16;

~~ -~ -~ _{'09 metodos}

_{covenciona1sQ}

_{descritos acima, para estude}

cromossômico, são _mais úteis-para precisar rapiäamente as anomalias

äehámmgwparticulermente os

mseicos

e para apreciar a.-importância de certas variantes cremossômieas, comb por exemple, grandes saté1¿

tes (HÊ). Apresentam a desvantagem

de

não identificar claramente tg

dos os cromessomas e _{pareá~1es utilizando somente dois parâmetros}

que têm came medida apenas a ecuiâaäe do ebservador,(22). '

. ~ - s › 9 . ¡ V _ ~ '

Pequenas anomalias estruturais nãø podem ser recenhec; das e, um eromossomaeaâmalo, pode ser classificado em um grupo a

qne.nãe pertence _(15,16). ' n V W ~

,zflas Figures 2 e _3, exemplífícemos earíetípos normeís;_

Qutres métodos desenvolviàos permitem 1ãen£1ficar_ eg -recterísticas próprias e eafia cromesšeme, faeilitandô seu reeonhee¿

'mente e _{detecção das anemelias. Toãee} utilizam a preparçãe-eramossá

míea da forma conyencienal, variahdo o tratamento, após a obtençãn âas _{células m, 9, 159 27, no, 55, 65, 1o1);,} '

. › 2 Zzlzë - _{Auterreâiografie} f,¡ ` I -Í 1 Históricgz e "V-. _. e -› ~

Descrita por Íay1er,em 1957,

utilizâne

timidina marcada com tr¿`

'tio _{(äšf) para identificação âos eremossomas(111);}

2§SÇIigãQfdo metades' ~

'

- .

Í

-

Cultura de _{leücõeitos periféricos; ;âíluíçãe com meio 199(g1áxe),} 57QC, 3 dias; adição de timídina tritíada, 0 a 52 horas antes _{öa_£;} xação; eolcemídg preparação da lâmina eum-eecagem ae ar; Giemse; _fg tografia das células seleeíenaäasg ahálíse de caríotipoconxcentagem

e _{anotações da posiçãe das grães-sobre os eremossomas individuais e}

separação dos hom51eges_(hQ,à1)¬ ' A

~ _ Eüfideme .os_te§zíeo@s ' Wrr,W fei,_e_vflW,,_, _ . r

-Aedup1íeegäø'6ee eremessomes_âe«períe6a Sâäâãívisãe eeiüíâr, vei liza bases nitrogenedes. _{A.eâíçäo‹üatímíâína marcada sem trítío per} míte ê observação âe-síntese de DNA em relaçãe an temps âe incorpg raçãa Ga tímídine e ãietríbuíçäe äa mesma ee lenge âe caäa eromeesg ma (1-ÍAo¶h,1)ø' u z _ > ` u / /

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W

(

; I ao -‹ š I › ¡ ~ ' 019; Qerecterístícas de goloregãoe '¡ . _ -

-'A _{timídina trítiada aparece na fotografia cemo grães distribui}

'dos _{eo 1ongo_dos cromossomas, com variações entre os cremossomas ig}

dívidueís, que permitem sua identificação e detecção de aberrações.

A0 número de cromessomas envolvidos na reprodução do DNA, ~varia

.com _{og tempo de exposição} àe _{lfd, sugerindo* que nem todos org}

mossomaš completam e síntese símultáheamente.

H

d~ '

'

'

_Embora a síntese do DNA-nos cromošeomas homólogos pareça síncrg nizada, alguns apresentam assineronie. O exemplo mais importante é o do par de cromossoma X, em-que un_rep11ce mais tardiamente que og

tro. Este é o menor do par,encontra»se em posição periférica no n

cleo, é

heteropicntíee

e _{dá origem} ao corpúsculo de Berr (à0,h1),

Outros cromossomas podem apresenta; essineronia de síntese para segmentos, como É o caso dos pares números loe 3 (h0)§ ,

. 1 _ ; . V V _ 1 . . Í _ › . \ . _ Obeervagõeg ' '. j 5 z ^

Nem todos os cremossomas hemãlogosš pedem ser pareados ~por _esse

eécníea (75). Hoje, praticamente não está

seno

mais utí1izeda(h3).

_: l

--ex

V Z.1¿3 - gendeementoíerggoggêmíggz

dd

. .' Uma banda é definida-Óbmo uma parte do eromossoma que é nitidamente distinta do segmente adjacente, por aparecer clara ou

nescura,_com os métodos de coloraçãe _Q, -G, B on* C. Esta definíçãe

foi dede no Congresso de París, em 1971.(56). Depois dessa data, og tros métodos de _{bendeemento cromossômíco foram descritos, os quais}

serão _{referidos posteriormente neste trabalho.}

'

de métodos de bendeamento,

sã:

2.1.3.1 ~ _{Método de coloreçãe Q}

z.i.3.z'» Métúõe ae zolqreçäe e

\

2.1.3;3 ~ _{Método de coloração R;}

2¿1.Ê.h « _{Método de co1oração.C'}

2.1.3«Ê e _{Método de coloração T}

e

z.1.3,6e» Métúâe ea banàeameneooefâe

2;1;3À7 » _{Método de bendeamento de replicação} z'

' u

›

I . 1 _ _ , 2§1Ç3;8 » _{Método de}

_colotaço

_N ' " â Í t _ ` . I 4 . ¡ } _

São mais utilizados os mštodçs _Q, R e G. É ~

-_

'V .Os métodos C, T e BrdU, ¿säo utilizados em casos part;

'culares (ä3)° * - - Í - A ' _ _ __ _. _ _ _ 1 . _ - _ 2.1.5.1

° _{fiétofiq õe catçfagãg Q}

Í ._

Hístzšzúcgâ _

. Desenvolvido por Casperson, Fofbçsj Foley, Krídínawsk, Hbêest,

Simonsen, wagh: e Zechs em _{1968, baseado na interação de agentes ag}

.quilantes com regiões do DNA.

Utílizano

quináêrina e quinacrína -

mustarâa em çoloraçãa de cromossomasâ de plantas e Hamster, evideg ciaram um padrão às estríações transversais fluurescentes ao løngg

âas eromátides (lb) . t * * ' * 1 ¬| ` _ l ' _ O O ._'_\ \V.__ Deggtíçgg ao metaqq. ¿

Etanal 95%, 70%, 50%, 5 minutos, respectivamente; Buffer öe Mc Ilavaine 7,0; salução dihídfoc1oride_quinacrína, 20 minutes; VZGQC;

› - f

agua dest11afia,`3 X; exame sob fonte de luz ultravioleta (75).A prg

I '

“3 ₁ "'r _A

_

paração das leuçocítos perifericos e reaíizada na tecníea conveneíg

pal, com duas msdífícáções: a)-A colchicina permanece na meío‹íêcu¿

tura apenas 1 hora, para que as cromossomas não fiquem muita contrai

~âos; b)~As lâminas sãs seeadas ao ar (75); A V

`

Também pode _ser utilizada a prepafaçäø direta de meõula ésseaííš)

Em

am¢M~°s_.t¢6;=;1.¢°ê_ft t

~

_

t

Samente certas regiões äos crømossomas Íigam a quínacrina mustag âa eg _{esses lscaís, parecem-estar locaíizafios nas regiões heterõcrs}

máticas (1h,18,75,lZ2 ) que íncorpõram tardiamente a timídína mareg

äa

(230). '

'

_; _ _ _

-

Os trabalhas iniciais de Caspersøn e co1s;, šugeríam qu@ a quina

`crína _mvstarâa se _{lígasseg prafereneíalmenteg}

aâ

_{segmentaszficos em}

guanínamcítasína (íàšü Estudog posterioréss antretantú, sugerem _qua

o corante lígawse _{aøs sâgmentes ricos em aäenínaztimínag nrefârente}

mënte <59Ê2g299¿l¿Ú‹›_, 4 _

"

H ' H ' I 1 /

É , _ § V ;2J.; i i .Ç.aé1'áeÍÍÇe;:íe*1=`í'<¿.e§, de §¢=>1'911a‹¿'ãQ¢' ' ' - V `

_› A fotografia da lâmina corada

inica

clafamente a presença de rg

gioes com alta capacidade de liga; a qainacrina mustaräa nos cromos somas de plantas e_mam{feros durante z a metáfase (1U)s A técnic§_á ¡ 'ä _ l›.=

reproâutível e pode.ser usada para identificação dos cromossomos e

estudo de aberrações cromossômicas

_QT);

Todos os pares podem ser

_identificados com êsse método. A maior desvantagem 6 _{que os segmeg}

tos distaís das eromátides não são coradas, não sendo possíveläeteg tar alterações estruturais, as vezes encontradas nessa

rogio

(29);

s O cromossomo

Y

é facilmente reconhecido por uma-especial fluoreg

cência brilhante na _{porção distal do braço longo (29,75,1Z2). Por}

isso, a técnica está indicada em todos os casos suspeitos de anomê

lia estrutural e numérica de Y; '

"

.

.Em ₁₉₇₀₅ Pearson e _{Bobrow baseados nesse fato; .identificaram a}

,cromatina de

Y

através da coloração com-quinacrina_ dihiärocloriõe,

.nos núcleos em ínterfase (ÊU). c

“¿. L ' ou ' Y ' Observacoes: V -› s_ j -» ~ - -

"Quinacrina mostarda inâuz a quebras cromossômicas em 50% ¬das _cá

lulas coradas (ih). '~Í ,, _

' e

.

* ›

. z

As lâminas devem ser examinadas logo ap6s.a feitura pois, cerca de 5 minutos-após a exposição ä lus-ultravioleta,-perdem-a _cor(75);

Deve; então, ser realizada microfotografia ( 18,75). . _ . s . ' I ' I Ã . . I ‹ I ' - - | ' ` -. _ `

2;i.3.2 - _{äetodo Çe coloração}

_Q

1 _ _ -. , . . Hístorico._ . _ _ e A _ . ._ _

'As _{bandas G são produzidas apos coloração com Gíemsa, através de}

älferentes técnicas

QE).

As mais importantes são as que usam _prá toatamento com ASG (Giemsa salinoacétiço), descritas por Summer, em 1971 (11Ó)e o _{pretratamento com tripsina, descrito por Seabright,}

om 197l(lD1). H » :- n ' V A ' ` .f¿eS;¢r;Lçã° mšíbefiefl o. s

V

c s s c s _ . , ' . _

Ass

-z-»oo,'5»M ms _ici + _{Msoiuçãoc às em-‹s1z‹›}

_{âosáâíoçoéoâc,}

_{1 boss;}

água destilada; giemsa, 10 _{minutos; água destilaâa; secas} »es _ae;

c

5 minutos; montar em Permount§Ç › Í Í l 5 í y 1 ‹ w l 1 r 9.

;22;

Iripsina-Solução tripsina 0,1%, pH 7,0, 3700, 10 a 15 segundos; eta noi 5 e 100%, 10 segundos, respectivamente; secar ao ar; giemsa, 10

a 15 minutos; água destilada; secar ao ar; montar em permount. Ver

diretamente ao_míerosc6p1o e fotografar.

_ › Eondamentos teõricoss ' ' ~ . \ -_ b I ' wa

A maioria _{das tecnicas de coloraçeo} G, utilizam agentes que dos

notaram as proteínas como proteases, sal, calor, detergentes e _urá

ia._Comings sugere que a desnatnração das proteínas comiadestruiçäo das estruturas terciárias, é importante fator no _{padrão' de} colorg

cão (22) e, citando Latt(1973), refere que existe uma precise corre

lação entre DNA de replicação tardia e as

banas

G.. EQ .V "

Qerásieeísfiiees de seleresãef ,

'

~

~.~ 0 10

_ Cora.as regiões de heteromatinas constitutiva intercalar (22), O

padrão de

banas

G corresponde aos resultadoszobtídos com o método

de coloração Q, com excessão da constricçäo secundária tdos braços

longos dos cromossomas 1 e _{16, que} coram no primeiroe são negativos

no segundo método; 0 _{segmento distal} Yq_š brilhante no método Qeavg riável no G (32), Este método é dos mais úteis na detecção de_ano; malidades cromossânicas'(5Ê), porque a distribuiçãode bandas claras

e escuras é característica para cada per cromossömico, permitindo, assim, a perfeita classificação dos mesmos; Identifica com mais ce; teza _{aberrações cromossômicas_como deleções} e transloceções, que se

riam praticamente impossiveis de interpretar pela técnica convencíg

Observegãess `

_

›

4 .

0 método de coloração G apresenta o _{mesmo padrão de bandas que o}

método _Q (29, 58). No entanto, devido a maior facilidade ~e _rapidez

de execução(l01) e por _{úsar microscépio comum;} é mais 'economico e

mais fltílízafie (73). Os cromossomos não perdem a cor e são mais dis tífltes que na_band¿ Q

C5).

La Maze e _{Sanchez, propoem um novo mëtg}

do de coloração em due as bandas G e C são produzidas .simultaneamen

te, claramente identificadas em todos os cromossomas, propondo o né?

me de bandas

W

para esse padrão encontrado (58). _

- Na

Fig. _{ht exenplâficamos cromossomas após coloração G;}

1 ~ _ _ É 0230 i _ I 1 _ ¡ __.. ___ _______._ .¬ - .~.a.~-,_ .›› J M.. z_z,z=. __ _ - . * 'lfiz-,‹.,,›:-^ 1 ' _{/¿;.:. z›,,.} _ »;r- -, .-z_._, .V ' 'W'-'.z,:' I -â ;' ~ - ' ~; Pt

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_coLRàçKo

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2;1.5é3 w äétodo de colõra ãø

~Híst6ríco: -Í

1 -Descrito por Dutrillaux e Lejeune

(28) em 1971, envolvendo àqng

".

_{cimento em_sa1ução pH_predeterm1nado.} -

~ I

~ 2¢âÇ_âLz_ê

_ Cultura de leucócitaà periféricos; fixaçãø e secašem ao ar=1ívr@,

20_mM _Püh, pH 6,5, 879 C, 10 a _{12 minutos; Giemsa} temperatura' _amb;

;Ãg3@UmQ:

_,_ P¬:«& 9__ ä 1' -ãz. äà

W

`0ntG, _{10 minutos (28),} _

É particularmenxe aáeqnada para análise na prametáfase.'

..1?I1y.1_f~?+ê_¶f1‹zê,ê:1;â:z_s_ t_‹â;à›Í1:fé¢;ê›_s;2

¶

_

_ As regiões ãas banñas R, eúrrê1acíonam~se bem cem a crëmâtínâ de

replícaçãa precoce, aucromatina (22) e com as segmentas cnäê- o DNA não particularmente rico em adenina»timina (29).

. ,________W__ ...__ - W. . _ _. ...._.._.. .... W- _, _. ._ . ¬_._... ..._.‹.._ ~-.W...».¬..=_-__ ..¬....zf...›$...,..._»-«¬-.... .» .z-¬¬-«fz---›‹-pq;-xx ‹-..,.-.›...z¬..~...--..-‹.¬.¬« ...¬_,.¬_..-.«..._. _,

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;2h;

.;Q_aérê‹;s;ef_£_sâ1;¢êâ_.@_ê _‹zz‹_z1¿e:;e_â;'=zé@__= -

~

~

Cora as segmentas não enredos nas métâdos G _{e Q,} dando umepaàrão reverso e estes (23$2§Ú. As constricçöes secunáárias ãos breçes leg gos dos cromassomes 1, 9 e 16 são excéssöes, pois não eoram

ns

má toâos R e.Q. 0 šegmento distal do eromoäsama

Y

6 variável (82). A

constância desses estruturas permite separar es pares crnmossômícos

_ _ ›

`

_ eEsta'técníca é útil na detecção das peqúehas áltereções estrutg

reis das extremidades ãas cramátídes, que eão coradas- em üodos os eramessomas (29). Cømpíementa a técnica G e às fluorescência. _

fleeee '_

"

_ V e_' V ¬ Í ` - --O C1' _U5 G) *1 4 . 91 I

'O _{mesmo padrão de bandas 6 observado após coloraçãø com ecrídine}

orange, ãescrito por Bobrew e eels., permitindo; segundo esses eutg res, maior -reso1uç'š.o'das baÃnd.as

R'(9

); »

- - H « _ ` ' V _ _ ; V . V ,I _ I _ 2~1-FJ* - _šëãâée

_de

_{_°2_1_1_f>_1:_‹=_*_íê_ä¿»=>____~'z"} ~ -1 ` I §1stšrícoe› f _›e ' ,' _ ' .«"_

_ Técnica original de Pardne e Geil, em 1970 (81) e aâeptaäa per~

Arríghi e Heu em 1971 _{(h ),} após tratamentó vígereso mmnealuções eg

lines vísua1ízanáa'as-bandas _C, príncipalmeate na metáfase.

Qeeârüáàà

íeé2@fie° ` _äQ_ ___,,_- « _ _ _ ~ .

cultura ea 1eu¢6¢1t0s per1fér1¢óâ;›o,o7 K na on, 1 _{e 2 mânufiõâ;}

2 x SSC, 609€, durante e neíte, curado com Gíemee 15 e 30 mínutese

Eeeâeeeê§eê.te6:¿eaâ= _

W

_

~ ~ ~

As regiões ñas bandas C são es de heterucramatína constitutiva, provevelmente áreas ãe repetitiva DNA (Ê&§; Pafece earresponáere:qg giäo em que as proteínas mão hístenas envolvem e DNÀ Êäi);

§â2ee§â;iâ§1¢êâšiezâeleâêâšefl ¬ _ _¶ _

Gere as _{regiões justeeentfeméríeae, eenetfíeçãee eeeumãšríes e e}

%fgçeLlenge da eremôeseme Y, enquenäe a festa ãae efemátíâeâe pefmë neeem ¡:›'.§z1:í_&a§ (Ê1929 3., Cera ^¡;am`oém ee e2°zmeâeâmas~ _{Ê., É} e 16 que aprg

sentam uma pefçäo justaeentremérÍee_maíef que ee entres cfømessemes;

(ëmz

L

¡ Ê _ -1 i I : _ _ _ _ › Í K lozsoi

_› _{A técnica não permite} a identificação de todosloscremossomas das células `somât.ícas. Tem valor quendo_ usada/ em conjunto comes outras técnicas e é`de particular valor no estudo dos cromossomas meíóti

cos masculinos (55,82)¡ Sua principalãinicação é o estudo do crg

mossoma.Y. 1 . 1 ' servagees; « _ ' _ _ - _ T P I `

_ Como je referido nos comentarios de bandeemento G, ~fo1 descrito

recentemente um método de ce1oração~eimu1tânea C e G (58).

;' _

*

l

~

× ₁

2.1.3.5 - 1;' Metodo de colora giz; _ ___1u‹:-='%@=F_ _ _-3 ;__f--._ ão T

, _ i _Historico: «_ â › _

~;a

_ _ Q - _ - - -z , _ `

'bescríto-por Dutrillaux em 1973 (30), obseevado após tratamento

térmico e coloração por aeridine erefiše ou G1emsa§ _

2<â`â¢1;içä°__<1.9;._fê@Ífš_@_fl_ê_.= V o V V Í ` _ _ _ _ ~ _ A Ê _ i/ ._ _

Solução físiologica de Earle pH _5¡1, 879€, 50 minnte§,eereâo eom Giemsa ou aerídine orange (22). *

É " * ` ' ' Eelieevâfltes _tâ=í_r ¢=›ê= ~ ~ e _1 __ _ _ . _ , H

V As bandas T podem ser consideradas como eqoelas frações- äas

bag ñas R, mais resistentes ao _{tratamento com agentes desnaturenteâ(29)}

§êê:ee§e1:_íSt_1¢ê:ê __f1_â____ê9_1ê_1ieeä@; Á A . % V ` A

Cora a região_do telômere, semelhante às bandas R-(22). Difereg cia-se Gee bandas R‹pelo-äesaparecimentoqquase completo- ñas benâae íneefcalares e reforço da coloração de _{certas extremidades- áes erg}

%má1;1õ_es (Zz).

A

técnica é útil _no

âíegnásuee

'ae _{¬zàr›ez~z:;e‹;ães ez-cz=3_}

turais nos segmentos ãisteís das cromâtídes (ãfifiâpríncípaímente

ns

casos de pequenas áeleçõee de extremíäedes. ` ' `

Observageesz 1 _ ' z _‹ ` * _

-A _{eoloração eum aeriâína orange, aumenta o oontragte âag bagäag}

Í-27929?? _ _ _ '_ __

f

'_ ' Í Í ¡ \ ! í 1

1 , . .zó. e z _ , } 241%-5'¿6 ~ _{..cM¿ë°dz°: deWèo@11¢1eeefl@efl§.ê1Jãc1<ëc!1=} ~ Histórico: V M lo * o , of M .“ ,.

._...._.

V . {&â

í` _{Descrita por-Zakherov, Seleznev, Benjoech e Baranovskayá em 1971.}

(29). A 5~bromodéoxyueíd1ne (BräÚ),_é um análogo da tímidine; _Sua

incorporação na cultura de línfõcitoš periféricos na fase S tardia constitui um método simples e eficáz ãe colocar em evidência os seg

mentos cromossômícoe de replicação tardia. É mais

simp1ee¿de

reeul

teo

superior a eutorradiografie _(h3;87)« -` '

' › . _ Í ° 2es¢nÀeäâ_d0 m¿t°de= 1 'c ' e~ = ~ L ao ~ ' I

Cultura de leucócitos periféricos; Brdü _{0,26%, 0,5 ml em meio fi} s1õ16g1co, 2 horas; zolchícína; Koi o,o75 M; álcool metil acéciêo;

.acridíne orange 5 _{Ég/100 m1§.pH 6,7,} 10 minutos; montar e _observar

sob luz ultravioleta (A3). _ _›~ ` Eqggëmentosíoeégícoea ~ ' ~ » ' _'

."

-" `

Brdfl induz a desespiralização dos segmentos de replicação tardia por um-mecanismo ainda não conhecido¢{h3), ~‹_ «

' -4 Qe1íêc§e¿rísctíce_oe_"decoloxjacãos ví ¶ _ . "

Mostra es mercaçõzes de bandas R, ha.b_itua1,- recoi1hecendo_o X. de rg

plícação tardia. Nas polissomias de

X

cbeerva~se mais ãe- _{om cromoâ}

soma ínativaäo. Se houver um X _{estruturalmente aberrente,} este será de replicação _{taedia.cNes_trans1oceç5es X/eutossoma balenceaäes} o› _o

_X

_

' _

normal 6 que _{sera inativado, ocorrendo 0 contrário se houver traog}

locàção âeebelenceeáe. No último caso, a inetivaçäo näo -evite a _eg

pressão fenotípica da aberração (h3).~ ,. A

-'

Qbeervagõess ' c c -~.'

f _f_

'Após dois ciclos celulares em presença de _BrdU, es äuee~cromát¿ dee de um mesmo cromoesoma_ adquirem _{proprieâedee tínücriaíe ëifg} rentes, que _{permitem reconhecer aquele de primeira geração da cromá}

tico de segunda-geração. _{Esta ãietifiëäe} é realizada' _com 'o _emprego

de Hoechst 35258 ou acrídioe orange ou e _{combinação Heecfiet 35258»}

Gíemoe (&ʧ60)z ~ › Q ` _ ¡ . / z I 1 É x 1 i . í i

~;z7;

2.1.5.7 « _{gãtodo oe banoeoogoto de geglicação:}

, z .

Hístórícgs _

c' - ~_'

.

Í oescrizo por Late em 1973~e Perfàxe woíff

em 197u (87), senao og

servado que após dois ciclos de replicação na presença de Brdñ, sg

guião por coloração com Hoechst 33258,as cromátiâee coram díferenci

alniente (50). ~. ` Y * " . - _ _ eesçfieez 1 `

efiëtodo äescrito por Perry e _{Wolff; BräU, 2h horas, eseuro§ Colcg}

mia 2 z 1o-7 m,.z horas; o,o75

M

Kel, 8 minutos; ácââo-âzétizo 3z1;

Hoechst 55258, 12 minutos; água desionizadag 2h horas; 2 x SSC ou

água, 2 horae,.6OQC; Giemsa _3%, 30 minutos (81).

-A

Ehëdemefltvs teáricøaf. V `

V

. W

As células são_cu1tivaãas com BrdU por Zà horas, tempo em que 2 ciclos de replicação ocorrem. z

'

"“

; Latt sugere_que a âíferença entre as 2 cromâtides 6 causada por

um epagemento diferencial da fluorescência do BrdU incorporado em~1 ou 2 filamentos do DNA. cKueh1me e _{Wolff, entretanto, têm oostulaáo}

que diferenças na ligação daoproteÀínaaoB'1~äU _{contido nas} .cr°o-mât-iões

é`a _{causa de coloração diferencial com Giemse~G?7).}

V

.gerecigeris¶;ie§,s__,,s1§_zecolo;:ê§ä9: .

' ` '

_

c '

As células cultivadas por 2 completos ciclos em presença ão Brâfl apos tratamento com um dos métodos de coloração diferencial ãe org mátide irmã, mostra uma cromátide escura e _{outra clara 02%);}

Observagãos ` ` '

0 método descrito inicialmente por Latt, não utiliza a coloração com Gíemsa apos Hoeehst~33258¿ 6 fotoinstâvel e e imagem escurece rapidamente (87).

_A

preparação com Giemsa é permanente  ,¿ V

w _{_} ' É __ ;28.`. 2,1.5.8 â §što§o qo coloração §_ .› ' \ Ê __ _3;; iífí Histšrido: - ~ “_ -¿

Doscrita por Matsni e Sasaki, ém›1973 (65)Ç - _ - .

W

_ _ §@â§r1êão-fiojmêt°d9= _ o › ~ _ ~ *z- _ _ Â

5% TCA, 30 minutos 8590; 0,1 N BC1, 50 g~h5 minutos, 60QC;corado

com Gíemsa GEZ). '

_ _ z 5 ' . -'_ - V »7 ' §u¿n§ome_n§9s -§;_e6;ji_co_§z ' ' - _ ` ' . =

A técníoa extrai as proteínas histonas o ácídos_‹nuc1ë1cos (65);

As

banas

N parecem

cofresponer

às regiões de proteínas _não histg

nas.Çz2)§'Coraoespecifíoamente a região organzzaäora dos nuoleolos

‹az‹,;6s›.

_~

v

~

1

Qê:§¢fieríSti§fisW§§_¢°1°âê§ã°= L

_

Nas células humanas em metáfaséä as bandas

N

aparecem como mggo

ohas verme1ho~arroxeadas, restrítas1äs*fegíões äos'saté1ítes às tg dos os _{cromogsomas acrooêntricos (55,65).'Gera1menté aparecem duaâ}

manchas soñíe o segmento mas, muitas vezes, elas se fundem; Nos _né

cloos dos linfšcítos em interfase; aparecem como minúsculas manohas agrupadas ãentro do nucleólo (65). São importantes para äiferencíar

satélites dê _{braço curto nos çromossomas acrocêntricos¿} 1

' 'Ú

.gbservagõesa ›

›

_ _.

.

Ferrara e _{coís., em poblicação recente (55), aoresentaram modífi}

~caçšes da técnica com uso_de AG»AS¿ qúe não altera a _{morfologia dos}

cromossomas e dá melhor coloração _{aos mesmos. A contrário de outros}

autores (22965), encontraram que os sítios corados diferencíalmenäâ com Gíemsa e AG-AS 1oca1ízam~se no braço curto de todos os acroeêg tríeos, bom abaixo _{dos satélites, na constrícção secunãáría, Os si} tios da bandas_N e AGQÀS são as mesmas

one

_{ocoèro roassociaçãolbäg/}

rRNA e, os autores, concluem que os gená são 1oea1íaados.oaoonstríg ção

secunãriâ

ñas aerooêntèicosg _

~ Í A G » I x 1

;29;

L 2.1.h ~ _{Qutras técnicas:}

íí '

Gutias técnicas para idêntífícação dê alguns cromog

somas, são também descritas (22): `

. _ '- ' ‹\ _ 2.1.h.1 é gštqáo de ço19ragão_G1emsa 11: u .' ~

Cora a constricção secundária do cromossoma 9‹§'a1gg *

mas outras heterpcromatinas centroméiicas. É variante da Método C _

(ug): ›

."

'_ '^ H . 1 V A .2.1_;.b,.z - _{;r¿zé1:od.o~de_pó19zgâ;¿äø,;;_;_;z} __ › ' f' .

Cora a constricçäo secundária do cromossoma 9.

1 \ z _ _ . ø . ` ,.. _ ' - 2-1~¿'›~5 -¬f <'‹‹¢~ |..J _QQ

Gera _a constricçäo secundária dos cromossomas 1.e 16.

_¬ 2.1.hzh ~ Método de¿go19ragão"C_ä: _-Q Gore "K1netocherès".~ . 2.1;b.5 - šátøfiõ de co1qração;Høechst ãägãfis _ A *

Cora distintamente _a Gromátíde de replicação taräia§ É variante do Bandeamento BrdU (60,75).` " '

.

'

2.1.5 - Nomegplatugz

-

_

_ Com o surgimanäâ das técnicas

âe}baneamen%u,

a Ceg

ferêneía de'París estabeleceu nârmas para a nomeneíafiura dos crg mossomas. _{(QUADRO 2)} ív. z ' '

QUADRO 2 1 ..~¬.¬.__,,, ...- Gân P Q h `i die âèl dup inw ins ins t rcp reb tan ter ›$ 28 chip: + eentrömero . braço curto ~

Q

braço longo À: eonsfiricçãoísecundária anel . _ , ~ ~ _ 1 isaeromossoma Í ãicêntrico dèleção ãuplieáçäv z , inversão 'Í ' inserçëa 5 ~ Á inserção invertida Âlvqn .,°¡, .-q0\.0.,›~,m m . u¿&HS¿@u¢3âu \ translocaçãu recíproca . ~trans1oca%ãc.rabertsoníaša . -. fusãø eêntriea translocaçãø tendem -

teámína1'(ptef =_fina1 ão braço chris)

9 (qñer = final do braga lango)

quebra sem união F ~

quebra e rauníäø de... paraa.. cramøssoma adicional . Vperäà*ãe'eremassomê , _ _ _ v ` . . . .. z.‹.«..._. ....› .V .. _- ..._. .~. _.: __..,...‹.«.,.. .... f <sub>A.</sub> . . ..¿V..,~.._,. `_._... ._ H .,...,...› ..._,.._ .,..;,v ,.,._._ ._ W.,

Símbaíõs da namaneiâtmñê äa paffies ãos üfümöãäômâš É ääüš Êãäffãfljüä ?®GÔmQ§ ãaâas pela Cânfêrêncía äa Ghieâgø ê

Canfârâncía“de Paríâ (82§«' I '

š ! _ § ! e . ' â ;31; › . › Í _' '

Baseeño nes métodos de cóloração Q, G e R (FIG. 5), cê

I I

É

da cromossoma e considerado consistiršde uma contínua šerie de ben

des, que sãe numeradas em.erdem creseente, a partir ão eentrômere,

em cada braço. .L ^ | -. t ~ '

"Lanfimargu são ae áreas com características moffel6g¿ cas distintas que servem

eoo

pista diagnóstícaruxiãentífieaçãa dos crÓmossomas.Podem ser as regiões terminais dos braçoe,.a centrômero

e outras bandas. â › I' . . e _ _ _ _. . ›l _ V -

Uma_ggg¿šQ é definida como a área entre 2

"lanmarks"

ajacentes,

numeradas em oràem eresceñte. H

,.^`

¿

I

Se uma banda que serve äe»"1andmark"requer snbdivíeäo,

as _{gggzggggâg conservam} o número da_banda _e da regiäo.'

W

,

› .Na designação de uma banda, utilieam-se h criterios:

- Número do cromossoma Í ` `

"

í ' `\ = _{Símbolo do;braço} - Número

da

região

~ _{Rámere_da banda dentèojäa regíãe_(FIG.6).}

,

.;

-

_ `Para uma breve revisão ãas Normas ãeterminedee na Ceg

ferêncía de Paris, para ídentífíeaçãeêaâeseríçäe âae_aberreções erg'

mossômíeas, sugerímes e _trabalho de_S1mpsen (95), a esse respeifie.

xua 2»2 è _{ëšiedes ââe¢¢1êis;ne§e as}

_{qâemeâsemêegâ}

_,;â=e

2ë2»1 - _{§eâ2áê;ulQeáâ:ëꧧ=} Histórica:-A < Q e~ ¬ e ~W _ V × \ _ -

f _{'Descr1ta_pof Bare e Bertren,em`195h, em células nervosas de gate}

(`5). _{Mais taràe_ídeetifícade em tecidos humanas, presente nas eélg}

las femininas e ausentes nas masculinas (69). Cerrespenfie ao eremeg

some X9 ínaúívêae na ééiúleg V

V Ç ~ e ~ W » . e 1 I I ).

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Negauve or pale stainmg O and G bands

- _{Ppsitive R bands}

31 ^ '

\ _ Pusmve O a_nd G bands

Negative R hands . 'variable mas

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REPRESEMAÇÃQ Díàcnmáwzcâ

nÀs.emms

õawossømczàs,

QBSERVÀDAS com os

amamos DE

_{cozomàção Q, G e} Rg,

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(París C_0&fë2I°@n'-26'

(ÍW1)s

_{Àiãtanziwzáäízatíon} 'in _{human cytogenatíes.}

À Birth

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8‹.z 7 1972.

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