Interação da L-arginina com o exercício físico durante o desenvolvimento do sistema nervoso: análise da depressão alastrante cortical em ratos jovens e adultos

Texto

(1)1. HELOÍSA MIRELLE COSTA MONTEIRO. Interação da L-arginina com o exercício físico durante o desenvolvimento do sistema nervoso: análise da depressão alastrante cortical em ratos jovens e adultos. Recife 2011.

(2) 2. HELOÍSA MIRELLE COSTA MONTEIRO. Interação da L-arginina com o exercício físico durante o desenvolvimento do sistema nervoso: análise da depressão alastrante cortical em ratos jovens e adultos Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco para a obtenção do título de Mestre em Nutrição. Orientadora: Dra. Ângela Amâncio dos Santos Profa Adjunto do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco Co-orientador: Dr. Rubem Carlos Araújo Guedes Profº Titular do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Recife 2011.

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(5) 3. Dedico este trabalho à minha família, em especial, aos meus pais, pelo amor incondicional e apoio irrestrito em todos os momentos da minha vida..

(6) 4. Agradecimentos. À Deus, por não me desamparar nos momentos de dúvidas, cansaço e solidão. Ele SEMPRE me mostrou uma forma iluminada de ver as situações. Obrigada por todas as bênçãos. À meus pais, Benedito da C. Guimarães e Maria Madalena M. Costa, por se constituírem estímulos que me impulsionam a correr atrás dos meus sonhos. Meus agradecimentos por terem aceito se privar de minha companhia pelos estudos, concedendo a mim a oportunidade de me realizar ainda mais. Ao meu irmão, tias, primos e avó por estarem sempre na torcida. Obrigada. Às amigas da turma de Mestrado em Nutrição 2009, em especial Amanda, Gisélia, Thays, Rebecca e Michele, com as quais compartilhei momentos de estudos, risos, choros e afetos. Com muita saudade e emoção, obrigada. À minha amiga Thays (tinha que agradecer você a parte), que desde que cheguei a Recife vem se mostrando cada vez mais amiga. Obrigada pela disponibilidade, apoio, estímulos e até mesmo puxões de orelha. Às minhas amigas de apartamento, Nayra, Débora e Paula. Obrigada pela confiança. Aos meus amigos de Teresina e vizinhos em Recife, Lázaro, Igo, Samuel e Jussiê. A amizade de vocês foi imprescindível durante esses anos. Foram irmãos de verdade. Com muita saudade, obrigada. Às amigas do LAFFINT, Manuela, Noranege, Cássia, Cinthia e a mais nova integrante, Geórgia, pelos esclarecimentos quanto às técnicas de cirurgia de DAC. Obrigada. Ao veterinário, Edeones França, pelos ensinamentos das técnicas de manuseio com os animais, além do fornecimento dos mesmos. Meus sinceros agradecimentos..

(7) 5. Aos estagiários, Débora, Mariana, Luciana, João Paulo, Fabiano e Yleana, pela grande colaboração nos experimentos e cuidados dos animais. Obrigada. A todos os professores que ministram as disciplinas do curso de mestrado, porque sem eles não haveria enriquecimento de idéias. Meus sinceros agradecimentos. À professora Luciana Maia, pela disponibilidade, esclarecimentos quanto a metodologia do trabalho e fornecimentos de alguns animais. Sou bastante grata. À minha orientadora, prof.ª Ângela, que se portou como só o fazem os mestres. Acreditando no meu trabalho, deu-me a liberdade necessária. Dividiu comigo as expectativas, conduziu-me a maiores reflexões e desta forma enriqueceu-as.. Minha. especial admiração e gratidão. Ao meu co-orientador, prof.º Rubem, pela paciência, disponibilidade, ensinamentos repassados e contribuição do inicio ao final do estudo, perceptível e enunciável por trás de tantas idéias. Meu respeito, admiração e carinho. É com emoção que lhe agradeço. A todos que, de uma forma ou de outra, me ajudaram a chegar até aqui. Muito obrigada..

(8) 6. “A alegria não chega apenas no encontro do achado, mas faz parte do processo da busca. E ensinar e aprender não pode dar-se fora da procura, fora da boniteza e da alegria.” Paulo Freire.

(9) 7. Resumo. O exercício físico e a suplementação de aminoácidos durante o desenvolvimento são fatores que podem promover mudanças em longo prazo na eletrofisiologia do cérebro. Esta dissertação originou o artigo intitulado como Differential effects of physical exercise and L-arginine on cortical spreading depression in developing rats, atualmente submetido para a publicação, e que está apresentado às páginas 25 - 45. O objetivo foi verificar o efeito da administração de L-arginina e do exercício físico durante o período crítico de desenvolvimento do cérebro sobre a depressão alastrante cortical (DAC). Ratos machos Wistar receberam por gavagem 300mg/kg/dia de L-arginina (grupo Ar, n = 40) ou 300mg/kg/dia de L-Histidina (grupo Histidina, n = 07) ou água destilada (veículo, grupo Ag, n = 40) durante 7-35 dias pós-natal. A partir do 15º ao 35º dia de vida, metade dos animais na condição supracitada realizaram exercício físico em esteira durante 20 minutos, em 5 seções semanais (grupos ArE e AgE). A outra metade foi colocada na esteira por igual período, no entanto com a mesma desligada (animais não exercitados, grupos ArnE e AgnE) para comparação. Quando os animais atingiram 35-45 dias (grupos jovens) ou 90120 dias de idade (adultos), a DAC foi registrada durante 4 horas em dois pontos corticais parietais do hemisfério direito. A velocidade de propagação (mm/min) foi calculada medindo-se o tempo gasto para uma onda de DAC atravessar a distância entre os eletrodos. Os ratos ArE tiveram aumento do peso corporal, mas não no peso do cérebro, na idade adulta em comparação com ArnE (P <0,05). Nas duas faixas de idades, jovens e adultos, a L-arginina aumentou, enquanto que o exercício diminuiu as velocidades de propagação da DAC. Os animais L-Histidina apresentaram valores de propagação de DAC (3.54+ 0.14mm/min) semelhantes aos animais AgnE . A média±d.p. das velocidades foram: nos grupos de jovens, 3,80±0,45 e 4,47±0,47, respectivamente, para ArE e ArnE, e 3,57±0,34 e 3,86±0,32, para AgE eAgnE; nos grupos de adultos, 3,85±0,38 e 4,59±0,36 para a ArE e ArnE, respectivamente, e 3,03±0,20 e 3,40±0,16 para a AgE eAgnE. Conclui-se que as ações da suplementação com L-arginina e o do exercício físico sobre a DAC são diferentes e que não interagem entre si na dose usada neste trabalho. Provavelmente, eles dependem de mudanças de plasticidade associada aos tratamentos durante o desenvolvimento cerebral.. Palavras chave: Desenvolvimento cerebral, Depressão alastrante cortical, L-arginina, Óxido nítrico, Exercício físico..

(10) 8. Abstract. Physical exercise and amino acid supplementation during development are factors that can promote long-term changes in brain electrophysiology. This MS-work originated an article entitled Differential effects of physical exercise and L-Arginine on cortical spreading depression in developing rats, currently submitted for publication, presented at pages 25 45. The aim was to investigate the effect of L-Arginine administration and physical activity during the critical period of brain development on cortical spreading depression (CSD). Male Wistar pups received by gavage 300mg/kg/day of L-Arginine (A group, n = 40) or 300mg/kg/day of L-Histidine (H group, n = 07) or distilled water (vehicle, W group, n = 40) during postnatal days 7-35. From the 15th to the 35th day of life, half of the animals in the above condition run on a treadmill for 20 minutes, 5 sessions per week (AE and WE groups). The other half was placed on the treadmill for the same period, however with the treadmill off (non-exercised animals, A and W groups) for comparison. When the animals reached 35-45 days (young group) or 90-120 days of age (adults), CSD was recorded during four hours on two parietal cortex points of the right hemisphere. The propagation speed (mm/min) was calculated by measuring the time that a wave of CSD crosses the distance between the electrodes. AE rats had increased body weight, but not brain weight in adulthood compared with A (P <0.05). In both age groups, young and adults, L-Arginine increased, whereas exercise decreased the speed of propagation of the CSD. L-Histidine animals had values of propagation of CSD (3.54 + 0.14mm/min) similar W group.The mean±s.d. speeds were in youth groups, 3.80±0.45 and 4.47±0.47 for AE and A, respectively, and 3.57±0.34 and 3.86±0.32, for WE e W; adult groups, 3.85±0.38 and 4.59±0.36 for AE and A, respectively, and 3.03±0.20 and 3.40±0.16 for WE e W. We conclude that the actions of L-Arginine supplementation and of physical exercise on CSD are different and do not interact in the amount administered. They probably depend on changes associated with treatment on plasticity during brain development.. Key words: Brain development, Cortical spreading depression, L-Arginine, Nitric oxide, Exercise..

(11) 9. LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1. Reações de síntese da L-Arginina e óxido nítrico --------------------------------13 Figura 2. Esquema da Depressão Alastrante cortical ----------------------------------------19 Figura 3. Representação esquemática dos grupos estudados eletrofisiologicamente---23. FIGURAS DO ARTIGO. Figura 1. Pesos corporais e encefálicos ---------------------------------------------------------39 Figura 2. Registros eletrofisiológicos ------------------------------------------------------------40 Figura 3. Velocidades de propagação da Depressão Alastrante Cortical --------------------41.

(12) 10. LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS A – Arginine AE – arginine – exercise Ag – Água AgE - Água exercício AgnE – Água não-exercício ANOVA – Análise de variância Ar – Arginina ArE - Arginina exercício ArnE – Arginina não-exercício BDNF – Brain-derived neurotrophic factor CSD – Cortical spreading depression DAC – Depressão Alastrante Cortical ECoG - Eletrocortigograma eNOS - Sintase do óxido nítrico produzido no endotélio iNOS e NOS II - Sintase do óxido nítrico produzido pelos macrófagos L-Arg – L-Arginina nE – não-exercício NMDA – N-Methyl-D-aspartic acid nNOS - Sintase do óxido nítrico produzido no cérebro NO – Óxido Nítrico NOS – Sintase do óxido nítrico SNC – Sistema Nervoso Central UFPE – Universidade Federal de Pernambuco VLV – Variação lenta de voltagem W – Water WE – Water-exercise.

(13) 11. SUMÁRIO. 1. APRESENTAÇÃO ----------------------------------------------------------------------- 12 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 L-Arginina e sistema nervoso---------------------------------------------------------- 13 2.2 Exercício físico e sistema nervoso ---------------------------------------------------- 15 2.3 Interação Arginina-Exercício físico no sistema nervoso --------------------------- 16 2.4 Depressão Alastrante Cortical --------------------------------------------------------- 18 3. MÉTODOS 3.1 Animais----------------------------------------------------------------------------------- 20 3.2 Suplementação com L-Arginina------------------------------------------------------- 21 3.3 Exercício físico em esteira ------------------------------------------------------------- 21 3.4 Determinações ponderais--------------------------------------------------------------- 22 3.5 Registro da Depressão Alastrante Cortical------------------------------------------- 22 3.6 Análise estatística ----------------------------------------------------------------------- 25 4. RESULTADOS- Artigo original-------------------------------------------------------- 26 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS------------------------------------------------------------ 47 6. REFERÊNCIAS BILBLIOGRÁFICAS ----------------------------------------------- 48 7. ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------- 54.

(14) 12. 1. APRESENTAÇÃO Tem sido mostrado que o exercício físico está relacionado a processos adaptativos, trazendo benefícios ao sistema nervoso em seres humanos, bem como em animais experimentais (ZOLADZ e PILC, 2010). Sua prática traz benefícios à manutenção da integridade cerebrovascular, produz angiogênese e aumenta a densidade das conexões dendríticas (PYSH e WEISS, 1979), dentre outros efeitos benéficos. O aminoácido L-Arginina, por sua vez, é substrato para diferentes e importantes enzimas. Dentre elas, destaca-se a sintase do óxido nítrico (NOS), responsável por catalisar a formação de óxido nítrico (NO) (SALES et al., 2005). O NO funciona como neurotransmissor. gasoso. implicado. com. a. plasticidade. sináptica. durante. o. desenvolvimento cerebral, refinamento dos circuitos neurais do adulto, além de ter importante papel na regulação do fluxo sanguíneo (MONCADA et al., 1989; SCHUMAN e MADISON, 1991; MAIA et al., 2006). A ação benéfica da L-Arginina sobre o organismo em associação com a execução do exercício físico tem sido evidenciada em alguns trabalhos (PENTTINEN et al., 1998; MAXUELL et al., 2001). Além disso, essas duas manipulações isoladamente são capazes de produzir alterações na excitabilidade neuronal (ARAÚJO, 2003; FRAZÃO et al., 2008; MAIA et al., 2006). Por isso, é razoável considerar a hipótese de que, caso interajam, essas duas manipulações em conjunto poderiam causar modificações sobre a eletrofisiologia cerebral. Para testar essa hipótese, foi utilizado o modelo da Depressão Alastrante Cortical (DAC), um fenômeno relacionado à excitabilidade cerebral. Os resultados da presente dissertação estão contidos em artigo original intitulado Differential effects of physical exercise and L-Arginine on cortical spreading depression in developing rats, o qual foi submetido à publicação (ANEXO A). O presente trabalho teve como objetivo analisar em ratos os efeitos imediatos e persistentes do exercício físico e da suplementação enteral com L-Arginina durante o desenvolvimento sobre a atividade elétrica cortical..

(15) 13. 2. REVISÃO DE LITERATURA. 2.1 L-Arginina e sistema nervoso A L-Arginina (L-Arg) é um aminoácido do tipo condicionalmente essencial em crianças e animais recém-nascidos, pois estes não têm condições de sintetizá-lo. Assim, ele tem de ser fornecido através de alimentos ricos em proteínas (MAHAN e ESCOTTSTUMP, 2005). Em adultos, a síntese endógena de L-Arg envolve o eixo intestinal-renal, ou seja, a citrulina, sintetizada a partir da glutamina, do glutamato e da prolina nas mitocôndrias dos enterócitos, é lançada aos rins, a partir do intestino delgado, para a produção de L-Arg. Além desse mecanismo, a citrulina é facilmente convertida em L-Arg em quase todos os tipos de célula, incluindo as células adiposas, endoteliais, os enterócitos, macrófagos, neurônios, e miócitos (WU et al., 2009) – Figura 1. Uma vez formada, a L-Arg funciona como precursor de importantes moléculas biológicas, exibindo versatilidade metabólica e regulatória (NIEVES JR. e LANGKAMPHENKEN, 2002). Ela é substrato para diferentes e importantes enzimas, tais como a arginase, a arginina-descarboxilase e a sintase do óxido nítrico. A arginase é a enzima clássica catabolizante da arginina no ciclo da uréia. A arginina-descarboxilase catalisa a transformação da L-Arg à agmatina, um agonista endógeno do α2- adrenorreceptor que pode ter um papel no efeito anti-hipertensivo da L-Arg (SALES et al., 2005).. Figura 1: Reações de síntese da L-Arg e do óxido nítrico (LI et al., 2009)..

(16) 14. A sintase do óxido nítrico (NOS) é a enzima que forma o óxido nítrico (NO), um importante sinalizador gasoso produzido no cérebro, no endotélio e nos macrófagos através de suas diferentes isoformas, a saber: nNOS, eNOS e iNOS ou NOS II, respectivamente (LI et al., 2009). No endotélio, a eNOS está presente na membrana plasmática e no complexo de Golgi, funcionando como vasodilatador e co-transmissor com a acetilcolina. A nNOS é encontrada tanto no sistema nervoso central, como no periférico (OLSON e DONALD, 2009). No sistema nervoso, o NO, seus neurônios liberadores e os mecanismos de transmissão que os envolvem constituem o sistema nitrérgico (MONCADA et al., 1997). As propriedades físicas do NO impedem seu armazenamento em vesículas sinápticas e sua degradação por enzimas hidrolíticas. A formação do NO através da L-Arg no sistema nervoso central parece ser regulada predominantemente pela estimulação pós-sináptica de receptores do tipo NMDA (ácido N-metil-D-aspártico) através do glutamato, seguida do influxo de cálcio. Além de ser sintetizado sob demanda, o NO é liberado por difusão em terminações nervosas. Sua ação é consequência da interação com alvos intracelulares, que seriam considerados mensageiros secundários e, a reação com o substrato, caracteriza a finalização de sua atividade (ESPLUGUES, 2002). O NO está implicado com a plasticidade sináptica durante o desenvolvimento cerebral, com o refinamento dos circuitos neurais do adulto, além de ter importante papel na regulação do fluxo sanguíneo (MONCADA et al., 1989; BOHME et al., 1991; SCHUMAN e MADISON, 1991; PATEL et al, 2010). A administração exógena de L-Arg está implicada com o aumento da produção de NO, mas a extensão desse efeito varia dependendo da região cerebral (HARA et al, 2004). Dados têm demonstrado que o possível aumento do NO cérebro acentua significativamente a excitabilidade neural (FRAZÃO et al., 2008). Por outro lado, caso a sua produção seja inibida, isto pode gerar modificações no fluxo sanguíneo e induzir à isquemia no cérebro (PETZOLD et al., 2008). No bulbo olfatório, pode ocorrer diminuição da capacidade de associação olfativa (SAMAMA e BOEHM, 1999). No entanto, no hipocampo e no prosencéfalo, níveis reduzidos de NO podem reforçar a neurogênese tardia (PACKER et al., 2003). Percebe-se que são várias as consequências do desbalanço desse neurotransmissor no cérebro. Ainda assim, muitos questionamentos ainda precisam ser esclarecidos, especificamente acerca da suplementação do seu precursor nas fases iniciais de desenvolvimento neuronal..

(17) 15. 2.2 Exercício físico e sistema nervoso Tem sido mostrado que o exercício físico regular contribui para manter a saúde, melhorar a qualidade de vida e diminuir a incidência de diversas doenças relacionadas ao estilo da vida moderno (RADAK et al., 2005a,b). A prática sistemática de exercícios físicos promove benefícios orgânicos, além daqueles relacionados diretamente com os sistemas corporais que o executam (ROSA e VAISBERG, 2002). Por exemplo, tanto em seres humanos como em animais experimentais tem sido relatado que a realização de exercício físico resulta em importante impacto positivo para o sistema nervoso (Van PRAAG et al., 1999; AMANN e KAYSER, 2009; ZOLAC e PILC, 2010; VEGA et al, 2010). Em crianças e adolescentes, o exercício físico atua melhorando o aprendizado e o rendimento escolar (CASTELLI et al., 2007; ORTEGA et al., 2008); em adultos, estimula a neurogênese, o que pode ter influência na fase mais tardia da vida, em diminuir os efeitos da perda física e cognitiva associada com a idade (FABEL e KEMPERMANN, 2008). Em animais experimentais, o exercício físico pode aumentar a expressão de RNAm para o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) no hipocampo (LEE et al., 2006). Adicionalmente, tem sido registrado que a prática de exercícios físicos traz benefícios à manutenção da integridade cerebrovascular, produz angiogênese e aumenta a densidade das conexões dendríticas (PYSH e WEISS, 1979; ZHANG et al, 2011). Igualmente, o exercício físico tem sido relacionado com o aprimoramento da aprendizagem e memória, processos cognitivos associados à neurogênese cerebral (RADAK et al., 2001). Várias hipóteses têm sido sugeridas para explicar os mecanismos fisiológicos decorrentes da prática de exercícios físicos. Dentre elas, destacam-se alterações nos níveis de neurotransmissores, como a serotonina (STRÜDER et al., 1999); ativação da ação de neurotrofinas; aumento da vascularização, dos níveis das proteínas sinápticas sinapsinas e sinaptofisinas (VAYNMAN et al., 2006), do número de receptores glutamatérgicos (FARMER, et al., 2004); e, estimulação da neurogênese hipocampal (Van PRAAG, 2008). No entanto, o mecanismo de ação subjacente ao exercício físico ainda requer estudos adicionais. Por exemplo, foi mostrado que camundongos submetidos a 6,5 semanas de exercício voluntário em “roda de corrida” apresentaram benefícios sobre a transmissão sináptica (Van PRAAG et al., 2005). Vaynman et al. (2006) observaram esses achados com apenas três dias da realização dessa atividade. O treinamento aeróbico de corrida em.

(18) 16. esteira realizado por ratos durante o desenvolvimento (21 a 60 dias de idade) foi capaz de estimular a neurogênese hipocampal (SILVA et al., 2010), mas não influenciou o processo epileptogênico (kindling) na amígdala dos animais adultos (ARIDA et al., 2007). Assim, ainda há muito que ser esclarecido quanto à extensão, intensidade e à duração dos benefícios da atividade física sobre as funções cerebrais.. 2.3 Interação Arginina-Exercício físico no sistema nervoso Uma das condições fundamentais para o cérebro funcionar eficientemente na vida adulta é que ele tenha se desenvolvido de forma adequada no início da vida. Nos mamíferos, o desenvolvimento do cérebro começa na embriogênese e continua durante uma fase relativamente curta da vida pós-natal. Essa fase, em seres humanos, termina ao final dos primeiros dois a quatro anos de vida. No rato albino, o mamífero mais usado para estudos experimentais sobre o tema, tal fase compreende as três primeiras semanas da vida pós-natal, ou seja, o período do aleitamento (GUEDES et al., 2004). Nessa fase, o cérebro é mais vulnerável às agressões do ambiente devido ao fato de que os processos implicados com o seu desenvolvimento ocorrem com muita rapidez (GUEDES et al., 2004). Eles compreen dem, sobretudo, a hiperplasia, a hipertrofia, a mielinização, a organização das sinapses (DOBBING, 1968; BERARDI et al., 2000) e a plasticidade neural (HENSCH, 2005). Essa etapa é conhecida como período crítico de desenvolvimento e corresponde ao momento em que o sistema nervoso é mais susceptível a alterações genéticas e ambientais (SERFATY et al., 2008). As experiências vividas nessa etapa do desenvolvimento poderão modificar de forma persistente o sistema nervoso, tanto positiva quanto negativamente, a depender do tipo e da intensidade da intervenção (MORGAINE et al., 1993). O exercício físico constitui um dos fatores não genéticos que pode influenciar o desenvolvimento cerebral. Foi observado que ratos cujas mães foram expostas a prática de exercícios aeróbicos (natação), no período da gestação apresentavam expressão aumentada de RNAm para o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) em seus hipocampos – região relacionada ao aprendizado e à memória (LEE et al., 2006; LOU et al., 2008). O BNDF é uma proteína envolvida com o desenvolvimento, a sobrevivência e a diferenciação neuronal. Ele é encontrado no sistema nervoso central e periférico e é sintetizado e liberado pelo músculo esquelético, exercendo função trófica nos neurônios.

(19) 17. motores. Dessa forma, a atividade muscular pode regular a sua expressão (COTMAN e BERCHTOLD, 2002). Além do exercício físico, outro fator capaz de afetar persistentemente o desenvolvimento do sistema nervoso é o estado de nutrição do animal durante o período crítico (MORGANE et al., 1993). Tanto a desnutrição, como a suplementação nutricional nessa etapa da vida podem influenciar a eletrofisiologia do cérebro (ROCHA-DE-MELO e GUEDES, 1997; MAIA et al., 2006; FRAZÃO et al., 2008). No que se refere à suplementação, tem sido mostrado que alguns aminoácidos, como a L-Arg e a Lglutamina, quando administrados nas fases iniciais do desenvolvimento, podem alterar persistentemente a excitabilidade cerebral (FRAZÃO et al., 2008; LIMA et al, 2009). Em humanos, a relação entre exercício físico e a administração suplementar de LArg tem sido relatada em favor de esta última beneficiar a execução daquela (PENTTINEN et al., 1998; MAXWELL et al., 2001). A L-Arg poderia exercer seus efeitos como precursora do óxido nítrico um reconhecido vasodilatador e hipotensor (HAMBRECHT et al., 2000; ZAGO e ZANESCO, 2006). Ela também poderia atuar através do ciclo da uréia estimulando a formação de compostos de alta energia como a creatina e o fosfato de creatina, o que poderia minimizar a proteólise muscular esquelética (MATSUMOTO et al., 2007). A suplementação de L-Arg melhorou o desempenho em atividades de resistência e a geração de força muscular em humanos (FRICKE et al., 2008). Quando administrada 30 minutos antes de treinamento com bicicleta ocasionou redução da fadiga fisiológica (ETO et al., 1994). No entanto, quando fornecida de forma aguda, imediatamente antes ao exercício, não mostrou eficiência em aumentar à tolerância a fadiga muscular (SALES et al, 2005). Com relação ao sistema nervoso, investigações relacionando o exercício físico e o sistema nitrérgico mostraram que a inibição da síntese de NO pode aumentar o custo metabólico e diminuir o desempenho de ratos na corrida em esteira (LACERDA et al., 2006a), bem como alterar os mecanismos neurais que regulam a glicemia e a mobilização de ácidos graxos livres durante o exercício (LACERDA et al. 2006b). É digno de nota ressaltar que a presente investigação objetiva estimular a produção do óxido nítrico através da suplementação dietética da L-Arg. À luz do nosso conhecimento não há relatos sobre essa interação (suplementação dietética de L-Arg versus exercício físico) no período de desenvolvimento do cérebro. Para estudar os efeitos neurofisiológicos dessa interação, será utilizado como modelo experimental o fenômeno eletrofisiológico da depressão alastrante..

(20) 18. 2.4 Depressão Alastrante Cortical O fenômeno da depressão alastrante cortical (DAC) foi descoberto por um pesquisador brasileiro, Aristides Azevedo Pacheco Leão. Ele observou que quando o córtex cerebral era estimulado por agentes químicos, físicos ou mecânicos, surgia uma diminuição (“depressão”) da atividade elétrica do tecido cerebral, que se propagava (“alastrante”) de forma concêntrica e reversível (com velocidade da ordem de 2 a 5 mm/min), do ponto onde se iniciou, para todo o restante da população de neurônios (LEÃO, 1944). Ou seja, quando uma região do cérebro é invadida pela DAC ocorre uma depressão na amplitude do eletroencefalograma, de forma que esse registro gráfico da atividade neuronal se torna praticamente isoelétrico (LEÃO 1944, 1947). A DAC é acompanhada pelo aparecimento de uma variação lenta de voltagem (VLV), a qual também se propaga de forma concêntrica e é igualmente reversível. A VLV se apresenta como uma forma de onda bem definida, com característica do tipo tudo-ou- nada; ela expressa com clareza o início e o final do fenômeno. Por essa razão, é muito utilizada para calcular a velocidade com que a DAC se propaga pelo tecido nervoso (GUEDES ET AL, 2004; GUEDES, 2005) – Figura 2. A DAC tem sido registrada em inúmeras regiões cerebrais (bulbo olfatório, teto óptico, tubérculo quadrigêmio, núcleo caudado, córtex cerebelar). Além disso, o fenômeno foi demonstrado em diversas espécies de vertebrados, inclusive no homem, bem como em aves, répteis e anfíbios (LEÃO e MARTINS FERREIRA, 1958; 1961; FIFKOVA et al., 1961; BURES et al., 1974; MAYEVSKY et al., 1996; GUEDES et al., 2005)..

(21) 19. Figura 2: À esquerda, esquema ilustrando a seqüência de eventos (numerados de 1 a 6) que ocorrem durante a depressão alastrante cortical (DAC) da atividade elétrica, no córtex cerebral de um coelho anestesiado (esquema adaptado de uma ilustração original do professor Hiss Martins-Ferreira). No momento 1, um ponto cortical (X) foi estimulado, iniciando a DAC. A sua propagação, concêntrica, está ilustrada nas etapas de 2 a 4, nas quais as área escuras representam porções do tecido cortical invadidas pela DAC e as áreas quadriculadas indicam regiões que já sofreram a DAC e agora estão se recuperando do fenômeno (áreas refratárias a uma nova estimulação). Nas etapas 5 e 6 observa-se que a recuperação também se dá de forma concêntrica, sendo o ponto onde a DAC se originou o primeiro a se recuperar totalmente (áreas claras) Finalmente, todo o tecido se recupera, retornando à condição inicial (etapa 1). À direita, mostram-se o eletrocorticograma (ECoG) e a variação lenta de voltagem (VLV), registrados simultaneamente em um ponto cortical, durante a DAC (registro obtido em nosso laboratório). Esta foi deflagrada pela estimulação química (KCl a 2%), aplicada, durante 1 min, a um ponto cortical situado a cerca de 8 mm do local do registro, no período assinalado pelas setas (Estim). Nota-se, no ECoG, a redução da amplitude das ondas eletrográficas, no momento em que ocorre a VLV, característica da DAC. A depressão do ECoG recupera-se totalmente após cerca de 3 minutos (Adaptado de GUEDES, 2005).. Vários fatores podem afetar a deflagração e a propagação do fenômeno da DAC (GUEDES et al., 2002; AMANCIO-DOS-SANTOS et al., 2006). No caso da L-Arg, foi verificado que a sua suplementação durante o período crítico de desenvolvimento aumenta de forma persistente a velocidade de propagação da DAC em ratos Wistar. Isto indica que a administração de L-Arg parece exercer um efeito facilitador sobre a excitabilidade neural (FRAZÃO et al., 2008; MAIA et al., 2009). Em relação ao exercício físico, foi visto que quando ratos são submetidos à natação precoce (dos 8 aos 22 dias de vida), ou tardia (dos 50 aos 120 dias), ocorre. um efeito modulador antagônico à propagação da DAC,. independentemente da fase de vida em que o exercício físico é realizado (ARAÚJO, 2003). Assim, pode-se perceber que tanto o exercício físico, como a L-Arg isoladamente exercem efeitos sobre a excitabilidade cerebral. Entretanto, o efeito da associação dessas duas variáveis sobre a DAC ainda não havia sido analisado. Considerou-se, portanto, pertinente.

(22) 20. investigar uma possível interação dessas duas relevantes variáveis em modular a atividade elétrica do cérebro.. HIPÓTESE Nós hipotetizamos que: ⇒. A interação L-arginina-exercício físico durante o período crítico de. desenvolvimento do sistema nervoso altera a eletrofisiologia cerebral de ratos jovens, avaliada pela DAC e esta mudança persistirá até a idade adulta.. 3. MÉTODOS. 3.1 Animais Foram estudados 83 ratos machos albinos, da linhagem Wistar, provenientes da colônia do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). Esses foram mantidos em gaiolas de polipropileno e sob condições padrão do biotério, à temperatura de 22±2 ºC e a um ciclo artificial claro-escuro de 12/12 horas (o escuro iniciando-se às dezenove horas). Os procedimentos experimentais foram iniciados após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Centro de Ciências Biológicas/UFPE (Processo nº 23076.005924 / 2008 - 80, ANEXO B). O manejo e o cuidado dos animais cumpriram as normas internacionais do National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (U.S.A.). Para as determinações experimentais, utilizou-se ninhadas de seis filhotes por mãe e de acordo com a administração de L-Arg e a realização de exercícios físicos, os animais foram distribuídos, no 7º dia de vida, em 4 grupos: água + não exercício (AgnE), água + exercício (AgE), L-Arg + não exercício (ArnE) e L-Arg + exercício (ArE). As mães e os filhotes após o desmame (21º dia de vida) tiveram livre acesso à água e comida (dieta comercial “Labina”; Agribrands Purina do Brasil, LTDA) (ANEXO C)..

(23) 21. 3.2 Suplementação com L-Arginina Do 7º ao 35º dia de vida pós-natal os filhotes receberam diariamente, por gavagem, solução contendo 300 mg/kg/dia de L-Arg (grupo Ar; adaptação de MAIA et al., 2009) ou volume equivalente do veículo – água destilada (grupo controle – Ag). A gavagem foi realizada sempre no mesmo horário, entre 6:00 e 8:00 horas da manhã, e consistiu em contenção do animal, introdução da cânula de gavagem e injeção lenta do líquido na cavidade gástrica. Inicialmente, nos primeiros 10 dias de gavagem, este processo foi feito por meio de cânulas de polietileno, de pequeno calibre e flexíveis conectadas a seringas de vidro de 1,0 mL. No primeiro dia, antes de sua introdução na cavidade oral, as cânulas foram marcadas ao nível em que atingiriam a porção inferior do estômago do animal. Após o 10º dia de gavagem, a administração das soluções foi realizada através de cânulas de metal. A L-Arg, obtida através do laboratório Sigma, foi pesada em balança analítica Bosh (Modelo S-2000, capacidade de 200g e sensibilidade de 0,1mg), diluída em água destilada e imediatamente administrada aos animais. O volume de água ou da solução de L-Arg foi de 0,5 mL na 1ª semana (7º ao 14º dias de vida) e 1,0 mL nas 2ª, 3ª e 4ª semanas (15º ao 35º dias de vida). Além do grupo tratado com água, outro grupo controle (n=7) recebeu, por gavagem, do7º ao 14º dias de vida, 300 mg/kg/dia de aminoácido (L-histidina), o qual não tem qualquer relação com a via de síntese do óxido nítrico. O objetivo desse grupo foi investigar se eventuais efeitos da L-arginina seriam produzidos também por outro aminoácido, caracterizando um efeito inespecífico.. 3.3 Exercício físico em esteira Aos 15 dias de idade, animais de ambos os grupos água e arginina foram subdivididos, de acordo com a condição de exercício físico a que foram submetidos (exercitados ou não-exercitados). Para o exercício físico foi utilizado esteira motorizada (Insight EP-131, 0º inclinação), e o protocolo de experimento seguiu uma adaptação do modelo utilizado por SILVA et al. (2010). Os animais foram exercitados (grupo E) no horário das 6:30 às 8:00 horas, em 5 sessões semanais, durante 3 semanas. Entre as sessões de exercício houve dois dias de descanso, em que nenhum exercício era realizado na.

(24) 22. esteira. Cada sessão diária de exercício tinha duração de 30 minutos e, as velocidades de treino variavam a cada semana, sendo de 5 m/min, 10 m/min e 15 m/min, nas 1ª, 2ª e 3ª semanas, respectivamente. Para efeito de comparação, parte dos animais dos grupos água e arginina foram submetidos às mesmas condições descritas acima, porém, estando a esteira desligada. Estes formaram o grupo de ratos não-exercitados (grupo nE).. 3.4 Determinações Ponderais. Pesos Corporais Cada animal foi pesado nos dias 7, 14, 21(dia do desmame), 28, 35 e no dia do registro eletrofisiológico em balança Marte, modelo 1001 com capacidade de 1 kg e sensibilidade até 0,1 g.. Pesos Encefálicos Ao final dos registros eletrofisiológicos os ratos, profundamente anestesiados, foram sacrificados e seus encéfalos, retirados. Para isso, o neuro-eixo foi seccionado transversalmente em dois níveis: caudalmente, tangenciando-se a borda inferior do cerebelo, incluindo-o; rostralmente, no limite entre os hemisférios cerebrais e os bulbos olfatórios, excluindo-se esses últimos. Imediatamente após a remoção, os encéfalos foram pesados em balança analítica (marca Bosh, modelo S-2000, capacidade de 200g e sensibilidade até 0,1 mg), obtendo-se o chamado peso do encéfalo úmido. Em seguida foram colocados em uma estufa (FANEM) a 100ºC e pesados a cada 2 dias na mesma balança citada acima, até atingirem peso constante, considerado o peso do encéfalo seco.. 3.5 Registro da Depressão Alastrante Cortical. Procedimento cirúrgico Parte dos animais de cada grupo (AgnE, AgE, ArnE, ArE) e o grupo L-histidina foram submetidos ao registro eletrofisiológico da DAC aos 35-45 dias de idade (animais jovens, n=44). Nos demais animais, o registro foi realizado na idade adulta (90-120 dias de vida; n=39; Figura 4). Para o registro da DAC, cada animal foi anestesiado com uma solução contendo mistura de uretana a 10% + cloralose a 0,4%, à dose de 1000 mg/kg de uretana + 40 mg/kg de cloralose, via intraperitoneal. Foi procedida uma traqueostomia para.

(25) 23. introdução de uma cânula de polietileno com a finalidade de facilitar a respiração. A temperatura retal do rato foi mantida em torno de 37±1 ºC. Em seguida, a cabeça do animal foi fixada em aparelho estereotáxico, de modo a permitir a incisão e remoção da pele e do periósteo para exposição do crânio. Por meio de trepanação, foram feitos três orifícios (anterior, médio e posterior, de cerca de 2 a 4 mm de diâmetro cada), alinhados paralelamente à linha média, ao nível do hemisfério cerebral direito.. Estimulação Cortical e Registro Eletrofisiológico A DAC foi provocada aplicando-se o estímulo (solução de KCl a 2%), a um ponto da superfície cortical frontal, durante um minuto, através do orifício anterior. Os registros eletrofisiológicos foram feitos utilizando-se eletrodos impolarizáveis (tipo “Ag-AgCl”),.

(26) 24. conectados a um polígrafo. Em dois pontos corticais parietais (um em cada orifício) foi registrada a atividade elétrica cortical (eletrocorticograma; EcoG) e/ou a variação lenta de voltagem que acompanha a DAC. As variações corticais de voltagem foram obtidas contra um eletrodo de referência comum, colocado sobre os ossos nasais, nos quais o potencial é invariável. O registro foi feito por um período de 4 horas. A velocidade de propagação da DAC foi então calculada com base na distância entre os dois eletrodos registradores e no tempo gasto pela DAC para percorrer esta distância..

(27) 25. 3.6 Análise estatística A análise de variância (ANOVA) foi empregada para analisar os dados. Nas comparações em que ANOVA apontou diferenças significantes foi aplicado o teste para comparação múltipla de Tukey-Krammer. Em todos os casos, foi considerado como nível de significância para rejeição da hipótese nula, um valor de P < 0,05..

(28) 26. 4.0 Resultados – Artigo Original. Differential effects of physical exercise and L-Arginine on cortical spreading depression in developing rats. Artigo submetido para publicação na Revista Nutritional Neuroscience.

(29) 27. TITLE: Differential effects of physical exercise and L-Arginine on cortical spreading depression in developing rats. AUTHORS: Heloisa Mirelle Costa Monteiro1, Débora de Lima e Silva2, João Paulo Bernardo Dantas de França2, Luciana Maria Silva de Seixas Maia3, Monara Kaélle Cruz Angelim1, Ângela Amâncio dos Santos2, Rubem Carlos Araújo Guedes1* AFFILIATION: 1. Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, 50670-901,. Recife PE, Brazil. 2. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de. Pernambuco, 50670-901, Recife PE, Brazil. 3. Departamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de. Pernambuco, 50670-901, Recife PE, Brazil *Corresponding author. 1. Telephone: + 55-81-2126-8936; Fax: + 55-81-2126-8473;. e-mail: rc.guedes@terra.com.br. Words count: 2.904 Number of figures: 03 Number of tables: 0.

(30) 28. ABSTRACT. Objective - We investigated the effect of early-in-life administration of L-Arginine and physical exercise on cortical spreading depression (CSD) in young and adult rats. Methods - L-Arginine (300mg/kg/day, n=40) or distilled water (vehicle, n= 40) was given to the rats during postnatal days 7-35 by gavage. Physical exercise was carried on a treadmill during postnatal days 15–35 in half of the animals in each condition described above. The other half (non exercised animals) was used for comparison. When the animals reached 35-45 days (young groups) or 90-120 days of age (adult) CSD was recorded on two cortical points and CSD propagation velocity. was. calculated. Results. -. L-Arginine. treated+exercised rats had increased body weight, but not brain weight, in adult age compared to L-Arginine+Non-exercise ones (P< 0.05). In both young and adult animals, LArginine increased, whereas exercise decreased the CSD propagation velocity. The mean±s.d. velocities in mm/min were: in the young groups, 3.80±0.45 and 4.47±0.47 respectively for the L-Arginine exercised and non-exercised condition, and 3.57±0.34 and 3.86±0.32, for water-exercised and non-exercised; in the adult groups, 3.85±0.38 and 4.59±0.36 for the L-Arginine exercised and non-exercised, respectively, and 3.03±0.20 and 3.40±0.16 for the water exercised and non-exercised. Discussion – L-Arginine and exercise affect CSD differentially (L-Arginine accelerated, while exercise decelerated CSD), and both effects did not interact. Probably they depend on plasticity changes associated to the treatments during brain development.. Key words: Brain development, Cortical spreading depression, Developing rat, LArginine, Physical exercise..

(31) 29. Introduction. Physical exercise is associated to adaptive processes in several organs, including the brain.1,2 In children and adolescents, exercise has been postulated to improve learning and school performance.3 In adults, it can stimulate neurogenesis.4 Neurogenesis may decrease the effects of physical and cognitive loss associated with age. 5 In experimental animals it has been shown that physical exercise increase the expression of mRNA for the Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) in hippocampus of the rat offspring whose mothers were submitted to the exercise during pregnancy. Furthermore, physical exercise is involved with angiogenesis,. 6. number of glutamate. receptors7 and increase of serotonin release.8 Therefore, there is so much to be explained about the extent and duration of the neural benefits of exercise. From the evidence above described, a protective effect of physical exercise on the nervous system could be hypothesized. It is well established that the more intense development period of the central nervous system occur in the early stages of life. This phase is often called “growth spurt period” of the brain.9 Depending on the type and intensity of the intervention, insult or stimulus experienced during this period of life can positively or negatively alter the nervous system in a persistent manner.9 Physical exercise, nutritional status and administration of isolated nutrients, like some amino acids such as L-Arginine and glutamine can interfere with brain development.10,11 Intake of protein-rich foods early in life is essential for the organism development, since in that period body is unable to synthesize some amino acids such as arginine. For this reason arginine is considered as a conditionally essential amino acid.12 L-Arginine is the precursor of important biological molecules and it is the substrate for different and.

(32) 30. important enzymes such as nitric oxide synthase (NOS), which catalyzes the formation of nitric oxide (NO).13 On the other hand, NO is an unconventional neurotransmitter involved with synaptic plasticity during brain development, refinement of neural circuits in adults, as well as having an important role in regulating blood flow.14,15 It has been documented that the administration of 300 mg/kg L-Arginine during the period of fast brain development influences brain electrophysiology in rats.10 Moreover, L-Arginine seems to improve the performance in sport activities through NO.16,17 However, the potential benefits of combined administration of L-arginine and exercise on the brain have been poorly investigated. Additionally, so far we know there are no reports about the existence of interaction between L-Arginine and exercise during development on the electrophysiology of nervous system. So, it motivates this investigation. We used the cortical spreading depression (CSD) phenomenon18 to index brain electrophysiological changes associated with the two treatments presently applied to developing rats: physical exercise and L-Arginine administration. CSD is a reversible phenomenon, which propagates slowly along the cortical tissue and has been recorded in several species of vertebrates,19,20 including humans.21,22 Changes in CSD propagation velocity have been experimentally characterized under conditions of environmental and nutritional manipulations.23,24,25 By recording CSD in the brain of young and adult rats, two questions have been addressed: (1) how does early-in-life physical exercise, combined with L-Arginine treatment, affect CSD propagation, and (2) if confirmed, would this effect persist into adulthood..

(33) 31. Materials and methods. Experiments were approved by the Ethics Committee for Animal Research of the Universidade Federal de Pernambuco, Brazil, whose protocols comply with the “Principles of Laboratory Animal Care” (National Institutes of Health, Bethesda, USA). Male Wistar rats (n = 80) from the colony of our University were suckled in litters formed by 6 pups and after weaning (21 days of life) had free access to water and to the mother’s diet, a rodent laboratory chow diet (PURINA do BRAZIL LTD.) with 23% protein. Animals were housed in 51×35.5×18.5 cm polypropylene cages, in a room with a 12/12 h light-dark cycle (lights on at 6 am) and temperature of 23 ± 1ºC. The pups originated three groups according to the treatment they were submitted by gavage, from the postnatal day 7 to 35. Animals received either 300 mg/kg/day L-Arginine (SIGMA; experimental group, A; n = 40) or equivalent volume of the vehicle, distilled water (control group, W; n = 40). An additional control group was formed by 7 young rats that received per gavage another amino acid (L-histidine; 300mg/kg), which is not involved in the metabolic pathway that uses arginine as substrate to synthesize nitric oxide. The gavage procedure was carried out between 06 and 08 h, daily. The total volume administered in each gavage ranged from 0.5 ml/day (from postnatal days 7 to 14) to 1.0 ml/day (postnatal days 15–35). From the postnatal day 15 to 35, both A- and W pup-groups formed two subgroups, exercised (EW and EA; n= 20 in each subgroup) and no exercised (W and A; n= 20 in each subgroup). Animals in the exercise groups were exercised on a treadmill (model ET 2000, INSIGHT EQUIPAMENTOS CIENTÍFICOS, Ribeirão Preto, Brazil) during 30 minutes per day, between 06 and 08 hours in 5 weekly sessions (one session per day). In the first week of the exercise program, the treadmill velocity was set at 5 m/min; in the.

(34) 32. second and third weeks, the velocity was increased to 10 m/min and 15 m/min, respectively. This approach was adapted from Silva et al26. Animals in the sedentary groups were left on the treadmill for the same duration of time, but were not exercised (treadmill was kept off). The animals were weighed on days 7, 14, 21, 28, 35 and on the day of the CSD recording (35-45 days for the young groups and 90-120 days for the adult groups). For the CSD experiment, the animal was intraperitoneally anesthetized with a mixture of 1 g/kg urethane plus 40mg/kg chloralose (SIGMA). This mixture has been used because in the rat it provides a very stable anesthesia, which lasts for several hours. This condition is very convenient for CSD recording in acute experiments (in which the recovery of the animal from anesthesia is not required). Furthermore, this anesthetic mixture does not block CSD, in contrast to other anesthetics.27 A tracheal cannula was inserted and three trephine holes were made on the right side of the skull. These holes were aligned in the anteroposterior direction and parallel to the midline. One hole was positioned on the frontal bone (2-mm diameter) and was used to apply the stimulus (KCl) to elicit CSD. The other two holes were drilled on the parietal bone (3–4 mm in diameter) and were used to record the propagating CSD wave. Rectal temperature was continuously monitored and maintained at 37±1 ºC by means of a heating pad. CSD was elicited at 20-min intervals by 1 min application of a cotton ball (1–2 mm in diameter) soaked with 2% KCl solution (approximately 270 mM) to the anterior hole drilled at the frontal region. Both, the slow potential change and the reduction of the spontaneous cortical electrical activity (ECoG) accompanying CSD, were recorded for 4 h, by using two Ag/AgCl agar-Ringer electrodes (one in each hole) against a common reference electrode of the same type placed on the nasal bones..

(35) 33. The calculation of the CSD velocity of propagation was based on the time required for a CSD wave to pass the distance between the two cortical electrodes. At the end of the recording session, the animals, while still anesthetized, were killed by lesioning the bulbar region with a sharp needle, inserted through the cistern magna, promptly provoking cardiorespiratory arrest. The brain (including the cerebellum and excluding the olfactory bulb) was immediately removed and weighed. Body and brain weights, as well as CSD-velocity intergroup differences, were compared by using ANOVA followed by a post hoc (Tukey) test, when indicated. Differences were considered significant when P<0.05.. Results The average age on the day of CSD recording was 39±2.47 and 101±6.41 days for the young and adult groups, respectively. Fig 1 shows the body weight at 7, 14, 21, 28 and 35 days of life (upper-left panel). Neither L-Arginine administration nor physical exercise modified body weight. However, on the day of the CSD recording session (upper-right panel), adult rats, but not the young ones, treated with L-Arginine and submitted to physical exercise (group AE) presented higher body weight (353.76±40.64) than their control group (WE; 277.78±52.87). The lower panels of Fig 1 present the wet- and dry-brain weights, measured on the day of the CSD recording, in the young and adult groups. The mean ± SD of wet brain weights for the groups W, A, WE, AE were, respectively (in g): 1.534±0.135, 1.521±0.108,. 1.559±0.201,. 1.531±0.124. (young. groups;. lower-left. panel). and. 1.672±0.183, 1.558±0.165, 1.642±0.199, 1.704±0.095 (adult groups; lower-right panel). The mean ± SD dry brain weights for the young groups were 0.296±0.027, 0.298±0.025, 0.298±0.040, 0.298±0.025 and in adult ones were 0.351±0.039, 0.335±0.040, 0.344±0.045,.

(36) 34. 0.354±0.034 for the groups W, A, WE, AE, respectively. The intergroup differences did not reach statistical significance.. Figure 1 around here. Electrophysiological recordings on the cortical surface of two young and two adult rats in both conditions, exercised and non exercised, are presented on Fig 2. Both, ECoG and DC-potential recordings confirmed the presence of CSD after each KCl stimulation, documenting the typical ECoG depression and the slow potential change accompanying CSD. In line with previous report (Maia et al, 2009) administration of L-Arginine facilitated CSD propagation in both young and adult animals, as they presented higher CSD velocities (P<0.05) than the control animals (treated with water). Physical exercise reduced (P<0.05) CSD velocities in both L-Arginine and water treated animals. The mean ± sd CSD velocities (in mm/min) for the young groups were 3.86 ± 0.32, 3.57 ± 0.34, 4.47 ± 0.47 and 3.80 ± 0.45 (groups W, WE, A, AE, respectively). The mean ± sd CSD velocities (in mm/min) for the adult animals were 3.40 ± 0.16, 3.03 ± 0.20, 4.59 ± 0.36 and 3.85 ± 0.38 (groups W, WE, A, AE, respectively; Fig 3). A group of young rats treated with 300 mg/kg of L-histidine presented mean CSD velocities of 3.54+0.14 mm/min, comparable to the corresponding water-treated controls, suggesting that the CSD acceleration seen in the L-Arginine group was not due to a non-specific amino acid imbalance, but rather was L-Arginine-specific (Fig 3).. Figures 2 and 3 around here.

(37) 35. Discussion When submitted to L-Arginine, or to treadmill exercise, young and adult rats presented changes in CSD propagation: L-Arginine accelerated, while exercise decelerated CSD. However, when both treatments were presently combined, no interaction between the two factors could be found. Since the treatments were performed during the suckling period, and the CSD-effects were found in both young and adult groups, it is suggested that the effects are permanent, or at least long-lasting. It is first important to detach that our data confirm previous study on the effect of L-Arginine on CSD.10 These authors demonstrated that administration of 300 mg/kg/day of L-Arginine to rats during development resulted in higher CSD velocities of propagation at adulthood. We suggest that this could be due to the participation of the amino acid L-Arginine in the production of nitric oxide (NO).28 L-Arginine is the substrate of NO synthase. 29. and so, when its. availability increases as a consequence of daily additional administration by several administration pathways, it enhances NO production in the brain.28 NO has been related to alteration in the blood vessels reactivity29 and to neuronal excitability.30,31 Once in rat cerebral cortex, NO can induce an increase in the microflow of the capillary vessels.32 Furthermore, the formation of endogenous NO is tightly linked to the changes of cerebrovascular regulation following CSD.33 Those observations may have clinical importance, since CSD is involved with brain vascular alterations34 and the participation of the phenomenon on the pathological mechanisms of some neurological diseases, such as migraine35,36 and brain ischemia37 has been suggested. Concerning to the neuronal excitability, it has been hypothesized that L-Arginine excites nuclei that regulate the excitatory neurotransmitter glutamate,30 increases the excitability of the neurons of medial vestibular nucleus38 and participates on the rapid initiation of the CSD recovery phase.39 Those overall effects were attributed to the.

(38) 36. enhancement of NO synthesis in the brain via L-Arginine. The relationship between neuronal excitability and CSD has been documented by other studies, which strongly suggest a relationship with epilepsy.40,41 It has become clear that dietary supplementation of certain amino acids such as Lglutamine11 and L-Arginine10 can change brain susceptibility to CSD. In this work, although amino acid blood levels have not been monitored, it is reasonable to assume that the long-lasting treatment imposed during brain development increased blood levels of LArginine.42 The CSD effects in the L-Arginine treated group could not be attributed to the gavage stress, since previous study showed no difference in the propagation velocities of the phenomenon between the animals that underwent gavage and a naïve group (these last rats were not submitted to any treatment).11 Moreover, in order to exclude the possibility that the effects were due to a non-specific amino acid imbalance (i.e., L-Arginineindependent action), one additional group was treated in the same manner with equivalent amounts of L-histidine (Fig 3). In contrast with L-Arginine, the group treated with Lhistidine (which does not have participation in NO synthesis) displayed CSD propagation velocities comparable to the water-group. Therefore, it is reasonable to postulate that the probable increase in plasma arginine would lead to an increase in the interstitial brain content of this amino acid, supporting a role of the excessive arginine in modifying brain excitability by modulating the NO synthesis pathway.28 Future studies are needed to confirm this possibility. On the other hand, physical exercise seems also to promote changes on brain function.1 Consistent findings show that exercise produces brain angiogenesis (Isaac et al, 1992),43 increases the density of dendritic connections,6 stimulates hippocampal neurogenesis,44 and increases mRNA for brain-derived neurotrophic factor and for nerve growth factor in rat brain.45 Besides these, it changes neurotransmitter levels, activates the.

(39) 37. action of neurotrophins, increases vascularization, levels of synaptic proteins (synapsin, synaptophysin)46 the number of glutamate receptors,7 and increases serotonin release.8 In this study, it was found that physical exercise per se reduced CSD propagation velocities. By considering the above mentioned possibility of alterations in several brain physiological aspects due to physical exercise, it could be suggested that physical exercise during 20 days may have decreased neuronal excitability. It could be due to an increase in the number of synaptic connections, which might increase the distance to be traveled in communication between cells.6 It could also be possible that the increased activity of the motor cortex (due to the exercise) during development have increased brain myelin thickness between the cells. In fact, it has been demonstrated that cortical myelin content inversely correlates with CSD propagation velocity.47 Since CSD seems to depend on neuronal activity, it is not surprising that the CSD propagation would be influenced by the inter-neuronal distance, which among other factors is influenced by the amount of myelin between the cortical cells. Another possible mechanism that could explain CSD reduced velocities in exercised animals would be represented by enhancement of the serotoninergic activity. It is already demonstrated that physical exercise can stimulate the serotoninergic system by promoting an imbalance in the branched chain amino acids/tryptophan ratio in favor to this last one in the blood stream. This increases the chance for tryptophan to cross blood-brain barrier and produce serotonin in the neurons.48 Indeed, several studies have demonstrated that increased brain serotonin availability exerts an antagonistic effect on CSD propagation.24,49 It has been shown that inhibition of brain NO synthase lead to important metabolic adjustments during exercise, such as an increase in plasma glucose levels.50 Harkin et al. (2004)51 have also reported that NO synthase inhibitors augment the effects of serotonin.

(40) 38. re-uptake inhibitors in the forced swimming test. Both conditions, i.e., high plasma glucose levels52 and stimulation of serotoninergic system24,49 are associated with low CSD velocities. Here we found that L-Arginine administration increased the CSD propagation velocity, which is in line with the above studies. However, L-Arginine was not able to abolish the possible physical exercise effect in reducing CSD propagation. It seems that physical exercise may have a powerful and persistent action in the electrophysiology of the brain. The present data shows that the group that performed physical exercise and receive L-Arginine presented body weight in adulthood higher than the control physically exercised that was treated with water. Gollisch et al (2009)53 showed that young animals that were subjected to exercise on running wheels for 4 weeks did not have significant increase in body weight compared to sedentary group. In their experiments, they observed that despite the highest energy expenditure through exercise training, it was compensated for significant higher caloric intake in the trained groups. Harkin et al (2004)51 showed that swimming exercise in association with inhibition of NO synthase increased the serotonin available in the synaptic gap, which is involved in decreasing food intake.54 However, Luras (2010)55 observed in low weight adult animals that the administration of L-Arginine stimulated food intake without modifying the release of serotonin in the ventromedial hypothalamus. So, it is reasonable to suggest that the administration of L-Arginine and physical exercise during the critical period of brain development may promote a long lasting change in food intake, with significant repercussions on the body weight observed on the adulthood. In conclusion, this work reinforces previous data concerning to L-Arginine action on CSD, and first describes the CSD effects of physical exercise. The combination of both treatments indicated no interaction concerning the CSD effects. The potential relevance of.

(41) 39. the findings for excitability-dependent neurological diseases shall deserve further investigation.. Acknowledgements The authors thank the Brazilian agencies CAPES (Procad/2007), CNPq (No.474126/2010-2), MSSCTIEDECIT (No. 17/2006), Facepe (APQ0975-4.05/08), and IBN-Net/Finep (No. 4191) for financial support. R.C.A. Guedes is Research Fellow from CNPq (No. 301190/2010-0).

(42) 40. Figure legends. Figure 1. Body and brain weights of animals treated, per gavage, during postnatal days 7– 35, with 300mg/kg/day of L-Arginine (A) or equivalent volume of distilled water (W). Half of the animals in each condition ran on a treadmill from the days 15 to 35 (exercised animals; group E). Upper left panel – body weight on days 7, 14, 21, 28 and 35. Upper right panel- Weight of young and adults animals on the day of CSD recording. Lower panels are wet and dry brain weights in young animals (left) and in adult animals (right). The number of animals in each group was n=10. Values are expressed as mean ± SD. The asterisk indicates difference between groups AE and WE (ANOVA plus Tukey test)..

(43) 41. Figure 2. Electrocorticogram (ECoG; E) and slow potential change (P) recorded during cortical spreading depression (CSD) in the right hemisphere of 35–45 days-old (young groups; left traces) and 90-120 days-old rats (adult groups; right traces) treated per gavage with 300 mg/kg/d of L-Arginine (A) or water (W) from postnatal day 7 to 35. In both A and W conditions, half of the animals was exercised (E) on treadmill from day 15 to 35. The horizontal bars (P1-traces) show the period (1 min) of stimulation with 2% KCl on frontal region of the right hemisphere, to elicit CSD. The vertical bars correspond to 10 mV in P and 0.5 mV in ECoG (negative upwards). The inset shows the point of KCl application and the recording positions 1 and 2, from which the traces marked with the same numbers were obtained..

(44) 42. Figure 3. CSD velocities of young (35-45 days-old; white bars) and adult rats (90-120 days-old; gray bars) treated, per gavage, during postnatal days 7–35, with 300mg/kg/day of L-Arginine (A) or equivalent volume of distilled water (W). Half of the animals in each condition ran on a treadmill from the days 15 to 35 (exercised animals; group E). The number of animals in each group varied between 9 and 11. Another control group (n=7) of young animals, treated with L-histidine, (H) is also shown. Values are expressed as mean ± s.d. The asterisks indicate that the CSD-velocities in the A-treated rats are significantly higher (p<0.05) than those in the corresponding W-groups. The symbol # denotes that the CSD-velocities in the E-rats are significantly lower (p<0.05) than in the respective nonexercised groups (ANOVA plus Tukey test)..

(45) 43. References 1. Zoladz JA, Pilc A. The effect of physical activity on the brain derived neurotrophic factor: from animal to human studies. Journal of physiology and pharmacology 2010; 61(5):533-541. 2. Amann M, Kayse B. Nervous system function during exercise in hypoxia. High altitude medicine & biology, 2009;10(2). 3. Ortega FB, Ruiz JR, Castillo MJ, Sjöström M. Physical fitness in childhood and adolescence: a powerful maker of health. Int J Obes (Lond), 2008; 32:1-11. 4. Vega SR, Kleinert J, Sulprizio M, Hollmann W, Bloch W, Strüder HK. Responses of serum neurotrophic factors to exercisein pregnant and postpartum women. Rojas Vega, Responses of serum neurotrophic factors to exercise in pregnant and postpartum women. Psychoneuroendocrinology ,2010. 5. Fabel K, Kempermann G. Physical Activity and the Regulation of Neurogenesis in the Adult and Aging Brain Neuromol Med. 2008; 10:59–66. 6. Pysh JJ, Weiss GM. Exercise during development induces an increase in Purkinje cell dendritic tree size. Science 1979;206:230-232. 7. Farmer J, Zhao X, Van Praag H, Wodtke K, Gage FH, Christie BR. Effects of voluntary exercise on synaptic plasticity and gene expression in the dentate gyrus of adult male Sprague–Dawley rats in vivo. Neuroscience 2004;124:71–79. 8. Strüder HK, Hollmann W, Platen P, Wöstmann R, Weicker H, Molderings GJ. Effect of acute and chronic exercise on plasma amino acids and prolactin concentrations and on [3H]ketanserin binding to serotonin2A receptors on human platelets. European Journal Appl Physiologyl. 1999; 79(4):318-24. 9. Morgaine PJ.; Austin-Lafrance R.; Bronzino J.; TonkisS J.; Diaz-Cintra S, Kemper T et al. Prenatal malnutrition and development of the brain. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 1993; 91-128. 10. Frazão MF, Maia LMSS, Guedes RCA. Early malnutrition, but not age, modulates in the rat the L-Arginine facilitating effect on cortical spreading depression. Neuroscience Letters 2008; 447: 26–30. 11. Lima DSC, Maia LMSS, Barboza EA, Duarte RA, Souza LS, Guedes RCA. L Glutamine supplementation during the lactation period facilitates cortical spreading depression in well-nourished and early-malnourished rats. Life Sciences, 2009; 85: 241–247. 12. Beaumier L, Castillo L, Yu YM, Ajami AM, Young VR. Arginine: new and exciting developments for an "old" amino acid. Biomed Environ Sci. 1996; 9(2-3):296-315. 13. Sales RP, Miné CEC, Franco AD, Rodrigues EL, Pelógia NCC, Silva RS et al. Efeitos da suplementação aguda de aspartato de arginina na fadiga muscular em voluntários treinados. Revista Brasileira de Medicina do Esporte, 2005; 11:347-351. 14. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Biosynthesis of nitric oxide from L-Arginine: a pathway for the regulation of cell function and communication. Biochemical Pharmacology, 1989; 38:1709-1715. 15. Maia LMSS, Frazão MF, Souza TKM, Silva MB, Rocha-de-Melo AP, Picanço-Diniz CW et al. L-Arginine treatment early in life influences NADPH-diaphorase neurons in visual cortex of normal and early-malnourished adult rats. Brain Research, 2006;1072:19-25. 16. Abel T, Knechtle B, Perret C, Ester P, Von Arx P, Knecht H. Influence of chronic supplementation of arginine aspartate in endurance athletes on performance and substrate metabolism. Int J Sports Med. 2005; 26: 344-349..

(46) 44. 17. Hambrecht R, Hilbrich L, Erbs S, Gielen S, Fiehn E, Schoene N, et al. Correction of Endothelial Dysfunction in Chronic Heart Failure: Additional Effects of Exercise Training and Oral L-Arginine Supplementation. Journal of the American College of Cardiology 2000;35:706-713. 18. Leão AAP. Spreading depression of activity in the cerebral cortex. Journal of Neurophisiology 1944a (7): 359-390. 19. Burés J, Buresova O, Krivanek I. The Mechanisms and Applications of Leao’s Spreading Depression of Eletroencephalografic Activity. 1974, Praga: Academia. 20. Guedes RCA, Tsurudome K, Matsumoto N. Spreading depression in vivo potentiates electrically-driven responses in frog optic tectum. Brain Research 2005;1036: 109-114. 21. Mayevsky A, Doron A, Manor T, Meilin S, Zarchn N, Ouaknine GE. Cortical spreading depression recorded from the human brain using a multiparametric monitoring system. Brain Research, 1996; 740:268-274. 22. Dohmen C, Sakowitz OW, Fabricius M, Bosche B, Reithmeier T, Ernestus RI, Brinker G, Dreier JP, Woitzik J, Strong AJ, Graf R. Co-Operative Study of Brain Injury Depolarisations (COSBID) spreading depolarizations occur in human ischemic stroke with high incidence. Annals of Neurology 2008; 63: 720–728. 23. Fregni F, Liebetanz D, Monte-Silva KK, Batista-de-Oliveira M, Santos AA, Nitsche MA, et al. Effects of transcranial direct current stimulation coupled with repetitive electrical stimulation on cortical spreading depression. Experimental Neurology 2007; 204; 462–466 24. Amâncio-dos-Santos, A, Pinheiro PCF, Lima DSC, Ozias MG, Oliveira MB, Guimarães NX, et al. Fluoxetine inibts cortical spreading depression in weaning and adult rats suckled under favorable and unfavorable lactation conditions. Experimental Neurology. V.200, p.275-282, 2006 25. Costa-Cruz RRG, Amâncio-dos-Santos A, Guedes RCA. Characterization of cortical spreading depression in adult well-nourished and malnourished rats submitted to the association of pilocarpine-induced epilepsy plus streptozotocin-induced hyperglycemia. Neuroscience Letters 2006; 401: 271–275. 26. Silva SG, Dona F, Fernandes MJS, Scorza FA, Cavalheiro EA, Arida RM. Physical exercise during the adolescent period of life increases hippocampal parvalbumin expression. Brain and Development 2010; 32:137–142. 27. Gorelova NA, Krivánek J, Bures J . Functional and metabolic correlates of long series of cortical spreading depression waves in rats. Brain Res 1987; 404: 379–381. 28. Hara S, Mukai T, Kunihiko K, Mizukami H, Kuriiwa F, Endo T. Different response to exogenous L-Arginine in nitric oxide production between hippocampus and striatum of conscious rats: a microdialysis study. Neurosci Lett 2004; 336: 302–307. 29. Böger RH. The Pharmacodynamics of L-Arginine. The Journal of Nutrition 2007; 137: 1650–55S. 30. Torrecilla M, Ruiz-Ortega JÁ, Ugedo L, Pined J. Excitatory regulation of noradrenergic neurons by L-Arginine/nitric oxide pathway in the rat locus coeruleus in vivo. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 2007; 375:337–347. 31. Obrenovitch TP, Urenjak J, Wang M. Nitric Oxide Formation During Cortical Spreading Depression Is Critical for Rapid Subsequent Recovery of Ionic Homeostasis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 2002; 22:680–688. 32. Tomita M, Osada T, Unekawa M, Tomita Y, Toriumi H, and Suzuki N. Exogenous nitric oxide increases microfow but decreases RBC attendance in single capillaries in rat cerebral cortex. Microvascular Reviews and Communications 2009; 1: 11-16..