Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para padronização dos extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e Schinus terebinthifolius Raddi

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para padronização dos extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e Schinus terebinthifolius Raddi.. Dissertação de Mestrado. Leonardo Gouveia Lima. Recife, 2009.

(2) i. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para padronização dos extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e Schinus terebinthifolius Raddi.. Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêutica na Área de Concentração: Produção e Controle de Qualidade de Medicamentos. Orientador: Prof. Dr. Rui Oliveira Macedo. Leonardo Gouveia Lima. Recife, 2009.

(3) Lima, Leonardo Gouveia Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para padronização dos extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e Schinus terebinthifolius Raddi / Leonardo Gouveia Lima. – Recife : O Autor, 2009. xvi, 69 folhas : il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2009.. Inclui bibliografia e anexos. 1. Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. 2. Schinus terebinthifolius Raddi. 3. Fitoterápicos. I. Título.. 615.322 615.32. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE CCS2009-117.

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(5) iii. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Dalci José Brondani VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Profª. Drª. Beate Saegesser Santos.

(6) iv. DEDICATÓRIA. Quando o coração parece que vai explodir de tanta saudade, quando não se tem mais lágrimas para derramar, nem remédio para curar a dor... Quando os passos estão perdidos e as duvidas sem respostas... Quando a ausência do calor de uma palavra, de um olhar, de um sorriso, de um espanto, de um abraço, congela e paralisa... Quando nestes dias tão escuros, tão nostálgicos, tão saudosos... Somente esse sorriso dentro de um mundo de tantas lembranças bem vividas, de tantos sábios conselhos, acompanhado do som de uma voz tão tranquila... Somente alguns instantes... E tudo é suficiente pra esquentar o sangue congelado, relaxar o coração comprimido, estampar um sorriso e lavar o rosto com lágrimas de uma saudade boa... Mãe, quero amar como conheci o teu amor, sempre vivo em cada pedacinho de vida que cruzou o teu caminho....

(7) v. EPÍGRAFE. Jamais perca o seu equilíbrio. Por mais forte que seja o vento da tempestade, busque no interior o abrigo....

(8) vi. AGRADECIMENTOS. Ao Prof. Dr. Rui Oliveira Macedo pela orientação e oportunidade; A Coordenação, professores e funcionários do programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UFPE. Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos (LCQPF) da UFPB pelo espaço e suporte técnico cedido; Aos amigos do LCQPF: Irinaldo, Valdilâneo, Márcia Ferraz, Elisana, Valmir, Wemerson e Fabíola; Em especial aos amigos Rodrigo, Tânia Bôer, Albéris, Arimatéia e Flaviano pela força concedida sem medir esforços no dia a dia do laboratório; Em especial ao amigo Prof. Dr. Fábio Santos Souza, pela amizade construída, pelos incentivos, orientações e conselhos indispensáveis na construção dessa dissertação e de projetos de qualificação pessoal; Aos colegas com quem convivi durante as disciplinas do programa; À minha noiva Rafaella, sempre uma força ao meu lado, me transmitindo paz e amor; À minha família, em especial ao meu grandioso pai e irmãos pelo apoio, força e incentivo; Aos grandes amigos da vida; E àquelas pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho ou estiveram presentes ao meu lado nesta jornada..

(9) vii. SUMÁRIO. 1. Introdução ........................................................................................................................... 01 2. Objetivos.............................................................................................................................. 04 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 04 2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 04 3. Revisão Bibliográfica.......................................................................................................... 05 3.1 Controle de qualidade de matérias-primas vegetais ........................................................... 05 3.2 Cromatografia..................................................................................................................... 06 3.3 Validação de métodos analíticos ........................................................................................ 09 3.4 Schinus terebinthifolius Raddi............................................................................................ 11 3.5 Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng ............................................................................ 13 4. Artigo I - Submetido à revista Journal of Chromatography A. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em cromatografia gasosa para quantificação do α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi. 1. Introdução............................................................................................................................. 17 2. Materiais e métodos.............................................................................................................. 18 3. Resultados e discussão ......................................................................................................... 21 4. Conclusão ............................................................................................................................. 25 5. Agradecimentos ................................................................................................................... 25 6. Referências ........................................................................................................................... 25 5. Artigo II – A ser submetido Avaliação de processos tecnológicos na obtenção de extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi em diferentes condições de extração. 1. Introdução............................................................................................................................. 29 2. Materiais e métodos.............................................................................................................. 30 3. Resultados e discussão ......................................................................................................... 31 4. Conclusão ............................................................................................................................. 36 5. Agradecimentos .................................................................................................................... 37 6. Referências ........................................................................................................................... 37.

(10) viii. 6. Artigo III – A ser submetido Aplicação de método de cromatografia gasosa em estudo de monitoramento quantitativo de marcador químico em extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. 1. Introdução............................................................................................................................. 40 2. Materiais e métodos.............................................................................................................. 41 3. Resultados e discussão ......................................................................................................... 43 4. Conclusão ............................................................................................................................. 51 5. Referências ........................................................................................................................... 51 7. Conclusões ........................................................................................................................... 53 8. Referências bibliográficas.................................................................................................. 54 9. Anexos.................................................................................................................................. 59.

(11) ix. LISTA DE FIGURAS. Revisão bibliográfica: Figura 1. Esquema de um cromatógrafo a gás. 1: fonte do gás de arraste;. 08. 2: controlador da vazão e pressão; 3: sistema de injeção; 4: coluna cromatográfica; 5: sistema de detecção; 6: sistema de registro e tratamento dos dados.. Artigo I: Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em cromatografia gasosa para quantificação do α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi. Figura 1. Cromatogramas para seletividade: (a) solvente de extração (n-hexano),. 22. (b) amostra de padrão do α-pineno e (c) fase hexânica de extrato de Schinus terebinthifolius Raddi.. Figura 2. Curva de calibração do α-pineno em cinco níveis de concentração.. 23. Artigo II: Avaliação de processos tecnológicos na obtenção de extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi em diferentes condições de extração. Figura 1. Perfil cromatográfico do extrato hidroalcoólico em fase hexânica. 34. de Schinus terebinthifolius Raddi. Figura 2. Variação quantitativa dos principais terpenos da amostra frente o tempo de extração e graduação alcoólica dos extratos.. 35.

(12) x. Artigo III: Aplicação de método de cromatografia gasosa em estudo de monitoramento quantitativo de marcador químico em extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Figura 1. Cromatogramas para seletividade: (a) solvente de extração (n-. 44. hexano); (b) solução padrão de β-cariofileno (TR: 12,16 min.); (c) amostra dos extratos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng.. Figura 2. Curva de calibração do β-cariofileno em cinco níveis de. 44. concentração. Figura 3. Perfil cromatográfico do extrato hidroalcoólico em fase hexânica. 48. de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Figura 4. Variação quantitativa dos principais terpenos da amostra frente o tempo de extração e graduação alcoólica dos extratos.. 50.

(13) xi. LISTA DE TABELAS. Artigo I: Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em cromatografia gasosa para quantificação do α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi Tabela 1. Resultados da linearidade para a SQR (α-pineno).. 22. Tabela 2. Resultados dos ensaios de precisão (repetibilidade). 23. Tabela 3. Resultados dos ensaios de precisão (precisão intermediária). 23. Tabela 4. Recuperação do α-pineno em três níveis de concentração pelo ensaio. 24. de ELL. Tabela 5. Avaliação da robustez através de variações na temperatura do detector. 24. Tabela 6. Avaliação da robustez através de variações na temperatura do injetor. 24. Tabela 7. Avaliação da robustez através de variações na razão de aquecimento. 25. da coluna. Tabela 8. Avaliação da estabilidade através da variação das condições de. 25. armazenamento. Artigo II: Avaliação de processos tecnológicos na obtenção de extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi em diferentes condições de extração. Tabela 1. Resultados da quantificação do α-pineno obtidos por destilação. 31.

(14) xii. Tabela 2. Resultados da quantificação do α-pineno obtidos por ELL. 32. Tabela 3. Rendimento e porcentagem relativa dos terpenos presentes em. 33. fase. hexanica. dos. extratos. hidroalcoolicos. de. Schinus. terebinthifolius Raddi obtidos por diferentes condições de graduação alcoólica (70 e 80%) e tempo. Tabela 4. Rendimento e porcentagem relativa dos terpenos presentes em fase. hexanica. dos. extratos. hidroalcoolicos. de. 33. Schinus. terebinthifolius Raddi obtidos por diferentes condições de graduação alcoólica (90 e 98%) e tempo.. Artigo III: Aplicação de método de cromatografia gasosa em estudo de monitoramento quantitativo de marcador químico em extratos hidroalcoólicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Tabela 1. Resultados obtidos da linearidade para a SQR (β-cariofileno). 45. Tabela 2. Repetibilidade (precisão intra-corrida) das soluções amostra. 45. Tabela 3. Precisão intermediária (inter-corridas) das soluções amostra.. 45. Tabela 4. Ensaio de recuperação do β-cariofileno em três níveis de. 46. concentração. Tabela 5. Ensaio da robustez variando a temperatura do detector.. 46. Tabela 6. Ensaio da robustez variando a temperatura do injetor. 46. Tabela 7. Ensaio da robustez variando a razão de aquecimento da coluna. 47.

(15) xiii. Tabela 8. Avaliação da estabilidade de amostras armazenadas em. 47. condições diferentes de temperatura Tabela 9. Resultados da quantificação do β-cariofileno obtidos por ELL. Tabela 10 Rendimento e porcentagem relativa dos terpenos presentes em. 47 49. fase hexanica dos extratos hidroalcoolicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng obtidos por diferentes condições de graduação alcoólica (70 e 80%) e tempo. Tabela 11 Rendimento e porcentagem relativa dos terpenos presentes em fase hexanica dos extratos hidroalcoolicos de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng obtidos por diferentes condições de graduação alcoólica (90 e 98%) e tempo.. 49.

(16) xiv. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ANOVA: Analise de variância; ANVISA: Agência Nacional de vigilância Sanitária; CG ou GC: Cromatografia gasosa; CG/EM ou GC/MS: Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas; CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico; CV%: Coeficiente de variação; DIC ou FID: Detector por Ionização em Chama; DP ou SD: Desvio padrão; DPR: Desvio padrão relativo; EM ou MS: Espectrometria de massa; FEBRAFARMA : Federação Brasileira da Indústria Farmacêutica; ICH: Conferência Internacional em Harmonização; INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial; ISO: Organização Internacional de Padronização; IUPAC: União Internacional de Química Pura e Aplicada; LD: Limite de detecção; LQ: Limite de quantificação; RDC: Resolução da Diretoria Colegiada;.

(17) xv. RESUMO. O crescente mercado mundial de fitoterápicos traz consigo o desafio de se garantir medicamentos com qualidade cientificamente comprovada, apresentando reprodutibilidade lote a lote de sua ação terapêutica de forma segura e eficaz. A qualidade da matéria-prima vegetal tem um papel central na obtenção desses produtos, já que esta apresenta como características a complexidade e a variabilidade da sua composição química. Dessa forma, o controle de qualidade, através da padronização das matérias-primas vegetais é o ponto inicial para a produção de fitoterápicos com qualidade. Neste trabalho foi desenvolvido e validado um método analítico para a quantificação e identificação, através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas, dos marcadores químicos α-pineno e β-cariofileno em extratos de Schinus terebinthifolius Raddi e Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, respectivamente. Este método foi aplicado em um estudo de monitorização quantitativa dos marcadores citados nos extratos hidroalcoólicos obtidos por processos de maceração com variações nas graduações alcoólicas (70, 80, 90 e 98 %) e tempo de extração (5, 10, 15 e 20 dias), visando dessa forma, a avaliação do processo tecnológico extrativo para padronização da produção dos extratos das folhas da Aroeira da praia e Hortelã da folha grossa. Os extratos foram submetidos a um processo de extração líquido-líquido com n-hexano antes de serem analisados no cromatógrafo a gás. De acordo com os resultados obtidos, tanto a graduação alcoólica quanto o tempo de extração são fatores que influenciam no perfil quantitativo dos extratos analisados. Alguns terpenos, principalmente mono e sesquiterpenos, foram observados como principais constituintes dos extratos das plantas estudadas. O melhor rendimento dos marcadores escolhidos, para ambas as plantas, foi observado nos extratos obtidos em processos de maceração com graduação alcoólica de 80 % e coleta aos 5 dias. O método desenvolvido para o estudo de monitoramento proposto, demonstrou-se seletivo, preciso, exato, reprodutível e robusto para a identificação e quantificação dos marcadores em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi e Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Palavras-chave: Schinus terebinthifolius Raddi, Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, extratos, validação, cromatografia gasosa..

(18) xvi. ABSTRACT. The growing world market of phitoterapics brings the challenge of ensuring quality products with scientifically proven, showing reproducibility of their therapeutic action in a safe and effective forme. The quality of raw plant has a central role in obtaining these products, since it presents characteristics as the complexity and variability of chemical composition. Thus, the quality control through standardization of raw vegetables is the starting point for the production of phitoterapics with quality. This work was developed and validated an analytical method for the quantification and identification, by gas chromatography and mass spectrometry, the chemical markers like β-caryophyllene and α-pinene in extracts of Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng and Schinus terebinthifolius Raddi, respectively. This method was applied in a study of monitoring quantitative of the markers listed in hydroalcoholic extracts obtained by maceration processes of varying degrees in alcohol (70, 80, 90 and 98%) and time of extraction (5, 10, 15 and 20 days), aiming this way, the avaliation of technological extraction process for the production of standardized extracts of leaves of the species studied. The extracts were subjected to a process of liquid-liquid extraction with n-hexane before being analyzed in the gas chromatograph. According to the results, both the alcohol and the time of extraction are factors that influence the quantitative profile of the extracts analyzed. Some terpenes, mostly mono- and sesquiterpenes, were seen as major constituents of the extracts of the plants studied. The best performance of the selected markers for both plants, was observed in extracts obtained in cases of maceration with alcohol at 80% and collection to 5 days. The method developed for the study of monitoring proposed, it was shown selective, precise, accurate, reproducible and robust for the identification and quantification of markers in hydroalcoholic extracts of Schinus terebinthifolius Raddi and Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Keywords: Schinus terebinthifolius Raddi, Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, extracts, validation, gas chromatography. ..

(19) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 1. 1. Introdução O uso das propriedades da natureza vem sendo desde a antiguidade um recurso ao alcance do homem, a fim de suprir suas necessidades básicas de sobrevivência como nutrição, reprodução, adaptação e proteção. Historicamente, os primeiros registros do uso de plantas como agentes terapêuticos para a cura e alívio de doenças são atribuídos às civilizações anteriores à era cristã, como os babilônios e sumerianos (2.600 a.C.), os chineses (2.000~2.500 a.C.), egípcios (1.500 a.C.) e gregos (400 a.C.) (Devienne et al., 2004; Pinto et al., 2002). Devido aos avanços da ciência ao longo dos séculos, as descobertas de várias substâncias de origem vegetal, baseadas em seus usos populares, elucidaram as atividades farmacológicas de forma cientificamente comprovada. Estima-se que aproximadamente 25 % dos medicamentos disponíveis na medicina moderna foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de fontes vegetais (Calixto, 2000). Estima-se ainda que apenas cerca de 20.000 espécies de plantas são utilizadas com fins medicinais em diferentes partes do mundo. Só a diversidade vegetal brasileira conta com um número de 55.000 espécies de plantas catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 espécies (Simões et al., 2003). Neste contexto, fica claro que grande parte das plantas frequentemente utilizadas ainda são passíveis de estudos para o conhecimento científico das suas propriedades farmacológicas e toxicológicas (Calixto, 2003). O mercado mundial de medicamentos fitoterápicos movimenta cerca de 22 bilhões de dólares. Em 2000, o setor faturou 6,6 bilhões de dólares nos EUA e 8,5 bilhões na Europa, sendo a Alemanha o maior mercado mundial de fitoterápicos (Pinto et al., 2002). Segundo a Federação Brasileira da Indústria Farmacêutica, FEBRAFARMA, no Brasil as vendas de fitoterápicos crescem em torno de 15 % anuais, movimentando em toda a cadeia produtiva, cerca de 1 bilhão de reais por ano (Carvalho, 2008). Nos últimos anos, não só no Brasil, mas também em países desenvolvidos, o mercado de fitoterápicos vem experimentando um acentuado crescimento. A razão para o crescimento da busca por terapias alternativas passa por fatores sociais, econômicos e culturais (Barnes, 2004). Porém, esse crescente mercado traz consigo o desafio de se garantir fitomedicamentos com qualidade comprovada, que devem apresentar reprodutibilidade lote a lote de sua ação terapêutica de forma segura e eficaz. No Brasil, a Agência Nacional de vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução da Diretoria Colegiada número 48 (RDC 48) de 16 de Março de 2004 (Brasil,.

(20) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 2. 2004), que normatiza o registro de medicamentos fitoterápicos no país, estabelece exigências para a comprovação da segurança e eficácia do produto a ser registrado, bem como normas de produção e controle de qualidade. A matéria-prima vegetal é um recurso primário para a obtenção do produto final e o seu controle de qualidade é etapa fundamental no desenvolvimento e produção de fitoterápicos com qualidade. Dessa forma, a padronização da matéria-prima e dos processos tecnológicos envolvidos é ferramenta indispensável na busca pela preservação da integridade química e farmacológica da planta, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de sua utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico (Oliveira, 2006). A determinação quantitativa de substâncias ativas em preparados vegetais é um parâmetro importante a ser considerado no controle de qualidade. Porém, o rendimento e a composição dos constituintes químicos das plantas são extremamente variáveis e complexos. Para propor critérios de padronização desses produtos é imprescindível monitorar a variabilidade química da espécie vegetal utilizada como matéria-prima. Efeitos de sazonalidade, procedimentos de fertilização, idade da planta, entre outros fatores que podem influenciar na variabilidade química da espécie devem ser estudados. Além disso, os tratamentos a que as plantas, após coletadas, são submetidas, também podem influenciar na composição química do preparado vegetal. Dessa forma, os processos tecnológicos, como as técnicas de extração e seus parâmetros (grau de divisão do material vegetal, sistema solvente escolhido, tempo do processo) devem ser considerados como fatores importantes e indispensáveis para o estabelecimento de critérios de qualidade no desenvolvimento de tecnologias envolvidas na obtenção de matérias-primas vegetais padronizadas e produtos fitoterápicos (Yariwake et al., 2005; Simões et al., 2003). Não menos importantes que todos os processos envolvidos na obtenção de produtos com qualidade satisfatória, encontram-se o desenvolvimento e a validação de metodologias analíticas. A validação garante que o método analítico gera informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, oferecendo evidências objetivas de que o método é adequado para o uso desejado (Ribani et al., 2004; Brasil, 2003), podendo assim, ser aplicado ao controle de qualidade e padronização de produtos acabados e matérias-primas vegetais. Ferramenta indispensável ao processo de padronização e controle de qualidade dos fitoterápicos e matérias-primas vegetais, a cromatografia é uma técnica muito utilizada no controle de qualidade dos fitoterápicos, apresentando poderosa habilidade na separação de componentes presentes em matrizes complexas, como nos produtos vegetais. Através desta técnica, que pode estar acoplada às técnicas espectrométricas, como a cromatografia gasosa.

(21) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 3. acoplada à espectrometria de massa (CG-EM), é possível realizar análises de quantificação e identificação de constituintes químicos voláteis obtendo-se resultados altamente eficazes, seguros e rápidos (Demeestere et al., 2008; Gong et al., 2003)..

(22) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 4. 2. Objetivos. 2.1. Objetivo geral Aplicação de metodologia analítica para padronização de extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi e Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e avaliação do processo extrativo envolvido.. 2.2. Objetivos específicos - Desenvolver e validar metodologia analítica para a quantificação do marcador αpineno em extratos hidroalcoólicos da espécie Schinus terebinthifolius Raddi. - Desenvolver e validar metodologia analítica para a quantificação do marcador βcariofileno em extratos hidroalcoólicos da espécie Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. - Avaliação dos parâmetros (graduação alcoólica e tempo) do processo extrativo através do monitoramento quantitativo dos marcadores das espécies estudadas. - Avaliação da composição química dos extratos hidroalcoólicos das espécies Schinus terebinthifolius Raddi e Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, obtidos por processo extrativo sob condições variadas de graduação alcoólica e tempo..

(23) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 5. 3. Revisão bibliográfica. 3.1. Controle de qualidade de matérias-primas vegetais As plantas e os extrativos vegetais são fontes de substâncias ativas utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e fontes de matérias-primas farmacêuticas, tanto para a obtenção de fármacos (substâncias ativas isoladas), como para a obtenção de adjuvantes ou, ainda, de medicamentos tecnologicamente elaborados, os medicamentos fitoterápicos (Simoes & Schenkel, 2002). Numa época em que as exigências de segurança, eficácia e qualidade, estabelecidas pelas agências regulamentadoras de medicamentos, se tornam mais rígidas, a permanência ou entrada no mercado desses produtos estão relacionadas com o desenvolvimento de estudos científicos objetivando a obtenção de matérias-primas controladas e o desenvolvimento de tecnologias apropriadas para a obtenção de extratos vegetais (Oliveira et al., 2006). A transformação de uma matéria-prima vegetal em um medicamento deve visar a preservação da integridade química e farmacológica da planta, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de sua utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico. Para garantir esses objetivos, a pesquisa para o desenvolvimento de fitoterápicos inclui várias etapas envolvendo um processo interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional (Oliveira et al., 2006). O processo de desenvolvimento de um produto fitoterápico envolve uma série de atividades multidisciplinares, reunindo estudos de aspectos botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, microbiológicos e de desenvolvimento de tecnologias analíticas e tecnológicas (Simões et al., 2003; Franco et al, 2005). Considerando as plantas medicinais como fonte de matérias-primas para a preparação de fitoterápicos, observa-se a complexidade da sua constituição química como um fator crítico na busca por produtos seguros e eficazes. Ao contrário dos extrativos vegetais, a utilização de substâncias isoladas é favorável à garantia da constância da composição, ausência de qualquer outra substância ativa e ainda ao controle de qualidade do produto em questão (Simões et al., 2003). Além da complexidade e muitas vezes do desconhecimento da composição química dos vegetais, o controle da variabilidade dos constituintes ativos é fator decisivo na obtenção de produtos de qualidade comprovada. Fatores como sazonalidade, idade e desenvolvimento da planta, condições climáticas, constituição e condições do solo, disponibilidade hídrica, estímulo por patógenos e ainda toda a fase tecnológica envolvida no tratamento do material.

(24) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 6. vegetal pós coleta (secagem, estocagem, métodos e condições de extração, etc) podem influenciar significativamente na não-constância dos ativos presentes na amostra vegetal, interferindo dessa forma, na qualidade e, conseqüentemente, no valor terapêutico dos preparados fitoterápicos (Neto et al., 2007). A qualidade da matéria-prima vegetal tem um papel central na obtenção de produtos reprodutíveis no que diz respeito à composição e propriedades terapêuticas (Neto et al., 2007; Capasso et al., 2000). Neste contexto, se faz necessário a busca pela padronização dos insumos vegetais (planta in natura, extratos, tinturas, extratos secos, etc.) através da caracterização da constituição química e/ou atividade farmacológica (Simões et al., 2003; Capasso et al., 2000). Um método comum utilizado na padronização do material vegetal é através da determinação, identificação e quantificação dos marcadores químicos conhecidos para aquela planta, os quais podem ou não ser o responsável pela atividade farmacológica da mesma (Schaneberg et al., 2003). A padronização das matérias-primas, através do monitoramento da constituição química da planta frente às diversas condições de plantio, cultivo, manejo, coleta e tecnologias de extração, é etapa importante para o desenvolvimento de fitomedicamentos preparados a atender às exigências de qualidade, cada vez mais rígidas, dos órgãos regulamentadores do setor.. 3.2. Cromatografia Os produtos fitoterápicos são caracterizados pela complexidade e variabilidade da sua constituição química, sendo necessário o monitoramento dessa constituição nas matériasprimas vegetais para que se possa garantir a qualidade do produto farmacêutico. Devido a natureza da amostra, que quase invariavelmente apresenta interferentes com características físico-químicas muito próximas das do analito, a análise dessa classe de produtos é considerada complexa. Por isso, a seletividade do método analítico de escolha é parâmetro crítico para a validade dos resultados obtidos. As técnicas cromatográficas são bastante utilizadas para análises de matrizes complexas como produtos vegetais, pois envolvem a separação destes interferentes e permitem a quantificação do analito de forma precisa, exata e sensível (Gong, 2003; Medeiros, 2006). A cromatografia consiste em um método físico-químico de separação dos componentes de uma amostra, que são distribuídos em duas fases em contato íntimo, uma estacionária e outra móvel. A fase móvel carreia o analito pela fase estacionária, e durante essa passagem os componentes da mistura são distribuídos de forma que cada composto é.

(25) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 7. seletivamente retido pela fase estacionária. As diferentes modalidades de técnicas cromatográficas podem ser classificadas segundo critérios relacionados ao mecanismo de separação envolvido, aos diferentes tipos de fases utilizadas e à técnica empregada. Essa classificação pode ser baseada, na forma do leito cromatográfico: cromatografia em coluna ou planar; no estado físico da fase móvel: cromatografia gasosa, líquida e de fluido supercrítico; no mecanismo de separação: cromatografia de adsorção, de partição, de troca iônica, de exclusão e por afinidade. A cromatografia se destaca dentre os modernos métodos de análise química, devido à facilidade com que efetua a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, muitas vezes hifenadas a outras técnicas instrumentais de análise, como a espectrometria de massas (Collins, 2006).. 3.2.1. Cromatografia Gasosa (CG) Na cromatografia gasosa a separação baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre uma fase estacionária, que pode ser líquida (cromatografia gáslíquido) ou sólida (cromatografia gás-sólido), e uma fase móvel constituída por um gás de arraste inerte. Através deste método, gases ou substâncias volatilizáveis podem ser separados. Os gases de arraste mais utilizados são o hidrogênio, nitrogênio e o hélio (Collins, 2006). A técnica de desenvolvimento usada em CG é a eluição. Uma corrente de gás passa continuamente pela coluna arrastando consigo os constituintes vaporizados da amostra introduzida através de um sistema de injeção sob aquecimento programado. De acordo com as propriedades dos diferentes componentes da amostra em relação às da fase estacionária, tais substâncias vão sendo retidas por tempos determinados, chegando à saída da coluna em tempos diferentes. Após esta separação, as substâncias chegam até um detector adequado, que gera um sinal para um sistema de registro e tratamento dos dados. Durante a análise, a temperatura da coluna pode permanecer constante (CG isotérmica) ou sofrer variações (CG com temperatura programada), sendo a programação de temperatura bastante útil na separação quando a amostra é composta por substâncias com diferenças em seus pontos de ebulição. A figura 1 apresenta um esquema básico de um cromatógrafo a gás..

(26) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 8. Figura1. Esquema de um cromatógrafo a gás. 1: fonte do gás de arraste; 2: controlador da vazão e pressão; 3: sistema de injeção; 4: coluna cromatográfica; 5: sistema de detecção; 6: sistema de registro e tratamento dos dados.. Os sistemas de detecção mais utilizados para análises quantitativas são: Detector por Condutividade Térmica, que se baseia na modulação da condutividade térmica dos gases de arraste pelos analitos e o Detector por Ionização em Chama (DIC), considerado universal já que é capaz de detectar qualquer substância orgânica (Collins, 2006). A cromatografia gasosa é uma técnica que possui alto poder de separação e resolução, o que torna possível a análise de dezenas de compostos de uma mesma amostra. Estas vantagens são extremamente úteis quando combinadas com a espectrometria de massas (EM) para a identificação dos analitos em estudo. Os detectores de ionização em chamas (DIC) e a espectrometria de massas são as técnicas mais comuns empregadas em paralelo para quantificação e identificação, respectivamente (Demeestere et al., 2008). Vários são os estudos que apontam a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas como técnica de escolha nas análises de quantificação e detecção de compostos voláteis envolvidas no controle de qualidade de matérias-primas vegetais e produtos tecnologicamente acabados (Gong, 2003; Demeestere et al., 2008; Tavares et al., 2005; Liang et al., 2009; Negueruela et al., 2006). No entanto, essa técnica apresenta a grande limitação de ser aplicável a amostras necessariamente voláteis e termicamente estáveis..

(27) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 9. 3.3. Validação de métodos analíticos Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis, além de comprometer a confiabilidade na garantia da qualidade de produtos como medicamentos. Atualmente, a necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dessa forma, a validação é etapa fundamental para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra (Ribani et al., 2004). A validação, exigência mundial na tentativa de assegurar a qualidade de produtos farmacêuticos, consiste em processo de avaliação sistemática de um procedimento analítico que garante, por meio de estudos experimentais, que o método atende às exigências analíticas, gerando resultados confiáveis e oferecendo evidências objetivas de que é adequado para o uso a que se propõe (Brasil, 2003; WHO, 1992; Ribani et al., 2004; Shabir, 2003). Para registro de novos produtos, incluindo fitoterápicos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a validação de metodologias analíticas e, para isso, a maioria deles tem estabelecido documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação. IUPAC, ISO, INMETRO e ICH são exemplos de órgãos que fornecem diretrizes e recomendações para o processo de validação. No Brasil, a ANVISA, através da RDC 899 de maio de 2003, estabelece as normas para validação de metodologias analíticas e bioanalíticas determinando os parâmetros de desempenho analítico que devem ser avaliados, tais como seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez (Ribani et al., 2004).. 3.3.1. Seletividade A seletividade de um método instrumental é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, a substância em exame na presença de outros componentes (impurezas, produtos de degradação, compostos da matriz) que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. Em métodos de separação, como cromatografia, a seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. É o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um método instrumental de separação e, no caso de não ser assegurada, a linearidade, exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidos (Ribani et al., 2004; Brasil, 2003)..

(28) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 10. 3.3.2. Linearidade A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou concentração da espécie a ser quantificada pode ser determinada através de relação matemática, que pode ser expressa como uma equação de reta chamada de curva analítica, de no mínimo cinco pontos (Ribani et al., 2004; Brasil, 2003).. 3.3.3. Precisão É um termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas, sendo expressa normalmente, pela estimativa do desvio padrão absoluto (σ) ou desvio padrão relativo (DPR), também conhecido como coeficiente de variação (CV%). A precisão pode ser avaliada em três níveis diferentes: repetibilidade ou precisão intra-corrida, que representa a concordância entre os resultados em um curto período de tempo com o mesmo analista e instrumentação; precisão intermediária, que avalia a concordância dos resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes e com analistas ou instrumentos diferentes; reprodutibilidade, que se refere a estudos colaborativos entre laboratórios, no sentido de reprodução dos resultados da metodologia de análise aplicada.. 3.3.4. Exatidão Representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. O ensaio de recuperação é um dos processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método e é definida como a proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada. A recuperação deve ser avaliada na faixa de concentração esperada para o composto de interesse e ainda em três diferentes concentrações, para evitar o aumento da dispersão dos resultados já que a recuperação pode diferir substancialmente a altas e baixas concentrações (Ribani et al., 2004).. 3.3.5. Limites de detecção e quantificação.

(29) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 11. O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental. Pode ser expresso pelo método baseado em parâmetros da curva analítica de calibração através da equação: LD = 3 x s / S. Onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação e S é a inclinação ou coeficiente angular da curva analítica. O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental. Assim como o LD, também pode ser expresso pelo método baseado em parâmetros da curva analítica de calibração através da equação: LQ = 10 x s / S. O método proposto é o melhor para expressar os limites de detecção e quantificação para métodos de separação como a cromatografia, pois é considerado estatisticamente mais confiável (Ribani et al., 2004).. 3.3.6. Robustez A robustez de um método analítico representa sua habilidade em gerar resultados não afetados por pequenas variações deliberadas em seus parâmetros de análise. Mudanças nas temperaturas do detector, injetor e coluna, velocidade do gás de arraste e natureza da coluna são exemplos de alterações que podem ser levadas em consideração na avaliação da robustez de métodos cromatográficos. As mudanças provocadas refletem as alterações que podem ocorrer quando um método é transferido para outros laboratórios, analistas ou equipamentos. A avaliação das mudanças nas condições de análise permite, não só avaliar a robustez do método, como também ordenar e classificar a influência de cada uma das variações nos resultados finais (Shabir, 2003; Ribani et al., 2004). 3.4. Schinus terebinthifolius Raddi Uma das espécies da família Anacardiaceae, Schinus terebinthifolius Raddi, é conhecida popularmente no Brasil como aroeira-da-praia, aroeira-pimenteira, aroeiravermelha, pimenta-rosa, etc. É uma árvore perene nativa da América do Sul, de porte médio, com altura variando de 5 a 10 metros, dotada de copa arredondada e tronco tortuoso de 30 a.

(30) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 12. 60 cm de diâmetro. É comum em beiras de rios, córregos e várzeas úmidas. É cultivada em vários países da Europa, América Central e sul dos Estados Unidos, ocorrendo no Brasil desde o Nordeste até o Rio Grande do Sul em diversas formações vegetais. Apresenta várias sinonímias botânicas como S. acutifólia Engl., S glazioviana Engl., S. polhiana Engl., S. raddiana Engl., S. aroeira Vell e S. mucronulatus (Pires et al., 2004; Lanzoni, 2007; Arruda, 2008). A aroeira-da-praia é uma espécie considerada versátil, possuindo inúmeras aplicações além de suas potencialidades medicinais e químicas. Seu uso é comumente descrito na arborização de ruas com fins ornamentais, como madeira em construções e reflorestamento de áreas desmatadas e ainda na culinária internacional (Botelho, 2006). Muitos estudos apontam o uso de diferentes partes da planta como as folhas, cascas e frutos, como agentes terapêuticos no combate a diversas enfermidades. As principais atividades farmacológicas atribuídas à aroeira são: ação antiinflamatória e cicatrizante, antioxidante, antimicrobiana, diurética, adstringente, etc. Ribas et al. (2006) e Lanzoni (2007) evidenciaram ação cicatrizante de extratos das folhas de aroeira em lesões induzidas na língua de ratos. Lucena et al. (2006) avaliaram, obtendo resultado positivo, a ação cicatrizante do extrato hidroalcoólico da entrecasca da aroeira em bexigas de rato. Amorim e Santos (2006), em ensaio clínico randomizado, demonstraram atividade segura e eficaz no tratamento de vaginose bacteriana utilizando gel a partir de extrato hidroalcoólico de Schinus terebinthifolius Raddi, obtendo cura de 84% das pacientes submetidas ao tratamento. Guerra et al. (2000) demonstraram atividade de extratos fluidos das folhas da planta contra as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e a levedura Cândida albicans. Extratos aquosos demonstraram atividade antifúngica contra Cândida albicans segundo estudo realizado por Schmourlo et al. (2005). Atividade antioxidante foi evidenciada por Degaspari et al. (2004) em trabalho onde analisou a ação de extratos aquoso e alcoólico obtidos a partir dos frutos da aroeira-vermelha. Já Lima et al. (2002) evidenciaram a mesma atividade utilizando a casca do caule da planta. Algumas outras aplicações medicamentosas da espécie são descritas com frequência na literatura. Seu uso como antisséptico, adstringente e diurético é comum na América do Sul, assim como seu uso em estomatites e infecções do trato respiratório (Clemente, 2006). Além das suas aplicações medicinais, existem vários relatos na literatura sobre a fitoquímica da espécie, identificando substâncias presentes nas plantas e relacionando a composição química com as possíveis indicações farmacológicas. Taninos, flavonóides,.

(31) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 13. alcalóides, saponinas, terpenos e grande quantidade de óleos essenciais são exemplos de substâncias presentes na composição química da espécie (Barbará et al., 2008; Ceruks et al., 2007). Nos primeiros estudos citados da espécie, foram relatadas presenças de inúmeras substâncias, como ácido terebintefólico e α-amirina nas cascas da planta, triterpenos nas folhas e compostos fenólicos como o cardanol nos frutos, indicando a variação da constituição química em partes distintas da espécie (Arruda, 2008). Segundo Queires e Rodrigues (1998), os compostos fenólicos aparecem em maior quantidade nas flores, estando presente em menor quantidade nas folhas e depois no caule. Saponinas e flavonóides são citadas como constituintes da casca da espécie (Lanzoni, 2007). O óleo essencial de Schinus terebinthifolius Raddi apresenta grande quantidade de terpenóides, principalmente mono e sesquiterpenos (Barbosa et al., 2007). Ceruks et al. (2007) isolaram compostos fenólicos de extratos das folhas da planta, como por exemplo, o galato de etila e a quercitrina, relacionando-os com a ação antioxidante da mesma. Barbará et al. (2008) relataram a ocorrência de vários terpenóides no óleo essencial de Schinus terebinthifolius Raddi, indicando a presença do α-pineno e limoneno como compostos majoritários. Devido à variabilidade e complexidade da constituição química das plantas medicinais, estudos sobre os fatores que afetam a constância dos compostos da espécie, como a parte da planta empregada, sazonalidade e métodos e condições de extração, são necessários para a padronização das matérias-primas de produtos fitoterápicos como meio de garantir a qualidade desses produtos. Santos et al. (2007) evidenciaram a presença de sabineno, αpineno, cariofileno, limoneno, germacreno-D entre outros, como constituintes de exemplares da espécie, indicando diferenças nos seus teores. Clemente (2007) identificou variações nas concentrações dos compostos do óleo essencial extraído de partes diferentes da planta e em condições sazonais distintas. O estudo indica a presença tanto de mono como de sesquiterpenos, como α-pineno, α-sabineno, βpineno, α-felandreno, mirceno, limoneno, α-gurjuneno, aromadendreno, elemol, entre outros. 3.5. Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng Espécie da família Lamiaceae, Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, é uma planta herbácea nativa da Ásia Oriental e encontra-se distribuída por toda a América, desde as Antilhas até o Sul do Brasil. É popularmente conhecida no Brasil como hortelã da folha.

(32) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 14. grossa e hortelã da folha graúda, enquanto que em Cuba é mais conhecida como orégano francês (Gurgel, 2007; Oliveira et al., 2007). É uma planta perene com comprimento que varia de 5 cm a 1 m, aromática, com folhas ovais de bordas dentadas, pecíolos grossos e flores violáceas com forte odor característico (Castillo & Gonzallez, 1999; Oliveira et al., 2007). Apresenta algumas sinonímias botânicas como Plectranthus aromaticus Roxb, Coleus amboinicus Lour e Coleus aromaticus Benth. A hortelã da folha grossa é utilizada em ornamentações, na culinária e bastante empregada na medicina popular. Vários estudos são encontrados na literatura evidenciando suas possíveis propriedades farmacológicas, como atividades antioxidante, anticonvulsivante, expectorante, antimicótica, antimicrobiana, antiasmática. Encontram-se citações de usos diversos da planta com fins medicinais, como no tratamento de doenças da pele como micoses superficiais e furunculose, afecções da garganta e boca, cefaléia, febre, tosse, constipação, distúrbios digestivos, distúrbios convulsivos, etc (Oliveira et al., 2007; Alarcón et al., 2006; Gurgel, 2007; Castillo & Gonzallez, 1999). Villate et al. (1999) demonstraram em estudo com ratos que o extrato aquoso preparado a partir de folhas de P. amboinicus apresentou efeito antiepiléptico. Salmán et al (1996) evidenciaram efeito antioxidante da planta, demonstrando que o extrato de flavonóides obteve melhor resposta que o α-tocoferol. Silva et al. (2006) evidenciaram o uso de preparações fitoterápicas das folhas da planta em casos de asma, gripes e resfriados devido à ação farmacológica broncodilatadora e expectorante da mesma. (Gurgel, 2007) evidenciou ação antimicrobiana do extrato hidroalcoólico das folhas da hortelã contra bactérias gram-positivas, principalmente Staphylococcus aureus, ação antiinflamatória e antineoplásica. Estudos demonstram que extratos obtidos de diferentes partes da planta apresentam compostos como ácido oxilacético, ácidos triterpênicos e flavonóides como salvigenina, quercetina, luteolina, apigenina, eriodictiol e taxifolina (Castillo & Gonzallez, 1999). Gurgel (2007) avaliou o perfil fitoquímico do extrato hidroalcoólico das folhas de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng e constatou a presença de flavonóides (quercetina e luteolina, rutina), terpenos, derivados cinâmicos, monoterpenos (carvacrol e timol), triterpenos (sitosterol e amirina) e esteróides. Kaliappan et al. (2008) revelaram a presença de flavonóides, terpenóides, saponinas, esteróides, taninos, proteínas, carboidratos e óleos voláteis nas folhas da espécie. Carriconde et al. (1995) revelaram como principais constituintes químicos o carvacrol, cariofileno, terpineol e timol; flavonóides como a apigenina, quercetina, luteonina e taxifolina; além de ácidos terpênicos e taninos. Castilho e Gonzalez (1999) citam ainda diferenças dos constituintes do óleo essencial da planta quando.

(33) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 15. cultivada em diferentes países: no Paquistão, a espécie apresentava em seu óleo volátil cariofileno, p-cimeno, timol, entre outros; em Cuba, α-terpinoleno, 1,8 cineol e salicilato de etila; na Hungria, eugenol; e no México, limoneno e ainda vitaminas C (ácido ascórbico), B1 (tiamina) e B2 (riboflavina). Devido às variações na constituição dos metabólitos secundários da espécie, Carneiro, (2008) estudou o efeito das condições de cultivo e coleta associados à sazonalidade nos teores do óleo essencial de Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, realizando monitoramento quantitativo do β-cariofileno como marcador químico da espécie..

(34) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 16. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em cromatografia gasosa para quantificação do α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi. Leonardo G. Lima1; Rodrigo A. da Costa2; Fabio S. de Souza3; Rui O. Macedo4 1,2. Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Prof. Artur de Sá, s/n – Cidade Universitária Cep. 50740-521 Recife, PE, Brasil. 3,4. Laboratórios Unificados de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, LUDEM -. Universidade Federal da Paraíba - UFPB, Campus I Cep. 58059-900 João Pessoa, PB, Brasil Resumo Um método analítico utilizando cromatografia gasosa foi desenvolvido para monitoramento quantitativo do marcador α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi. A preparação das amostras envolveu uma fase de extração líquidolíquido utilizando n-hexano como solvente apolar. As separações cromatográficas foram desenvolvidas em coluna capilar DB-5 (30m x 0,25mm; 0,25µm) e nitrogênio como fase móvel numa taxa de fluxo de 1,5 mL/min. O tempo de retenção do α-pineno foi 3,08 minutos. Os limites de quantificação (LQ) e detecção (LD) foram 0,0229 e 0,0068 µg/mL, respectivamente, não sendo detectados interferentes nos cromatogramas obtidos. A seletividade, linearidade, precisão, exatidão, recuperação e estabilidade do método proposto foram validadas. O método descrito demonstrou-se uma ferramenta analítica sensível para a determinação e monitoramento dos níveis de α-pineno em extratos hidroalcoólicos de Schinus terebinthifolius Raddi. Palavras chave: Schinus terebinthifolius Raddi, extratos, validação. Abstract A gas chromatography (GC) method was developed for the monitoring of quantification of α-pinene in hydroalcoholic extracts of Schinus terebinthifolius Raddi. Sample preparation involved one-step liquid/liquid extraction using n-hexane as apolar solvent. Chromatographic separation was carried out using a capillary column DB-5 (30m x 0,25mm; 0,25µm) and nitrogen as mobile phase at a flow-rate of 1,5 mL/min. The retention time of α-pinene was 3,08 min. The limits of quantification (LQ) and detection (LD) was 0,0229 and 0,0068µg/mL, respectively and no interferents were detected in chromatograms..

(35) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 17. The selectivity, linearity, precision, accuracy, recovery, and stability of the developed method were fully validated. The described method provides a sensitive analytical tool for determining and monitoring α-pinene levels in hydroalcoholic extracts of Schinus terebinthifolius Raddi. Keywords: Schinus terebinthifolius Raddi, extracts, validation. 1. Introdução Schinus terebinthifolius Raddi, pertencente à família Anacardiaceae e conhecida popularmente como aroeira da praia, é uma espécie da flora medicinal e aromática da América do Sul e, no Brasil, está presente desde o Nordeste até o Sul do país (Clemente, 2006). É uma árvore perene, de folhas e frutos aromáticos, cujas partes, principalmente folhas, casca e frutos, têm sido bastante utilizadas, baseadas em estudos que demonstram atividades terapêuticas como antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante, anti-séptica, cicatrizante e etc. (Medeiros et al., 2007; Barbosa et al., 2007; Santos et al., 2006; Collins et al., 2006; Schmourlo et al., 2005; Ribas et al., 2006; Guerra et al., 2000) Devido à complexidade e variabilidade dos constituintes químicos das plantas, o crescente mercado de fitoterápicos traz consigo o desafio de se garantir produtos com qualidade, que devem apresentar reprodutibilidade de ação terapêutica de forma segura e eficaz. Um ponto chave na busca por fitoterápicos de qualidade é a quantificação das substâncias ativas ou majoritárias da droga vegetal, os marcadores químicos, que podem ser os responsáveis pela ação farmacológica da planta. Alguns estudos anteriores evidenciam a composição química de partes aéreas da aroeira, alguns terpenos, como o α-pineno, são indicados como compostos majoritários (Clemente, 2006; Barbosa et al., 2007; Santos et al., 2007; Arruda, 2008; Bárbara et al., 2008; Lloyd et al., 1977). Consequentemente, a quantificação desses componentes ativos pode ser de grande importância para a avaliação da qualidade das matérias-primas desta planta. Tradicionalmente, a cromatografia, muitas vezes aliada as outras técnicas de análise, é usada para avaliar a qualidade de produtos vegetais. A cromatografia gasosa (CG) é a técnica de escolha para separação de uma grande quantidade de compostos voláteis. Seu poder de separação é extremamente útil quando combinada à espectrometria de massas (EM), na identificação de inúmeros analitos presentes em misturas complexas, como no caso dos produtos fitoterápicos (Collins et al., 2006; Bara et al., 2006; Aragão, 2002; Demeestere et al., 2008)..

(36) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 18. O desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para o controle de qualidade e padronização de matérias-primas vegetais são ferramentas para a obtenção de fitoterápicos com qualidade cientificamente comprovada. A validação garante que o método analítico gera informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, oferecendo evidências objetivas de que o método é adequado para o uso desejado (Ribani et al., 2004). Dessa forma, o objetivo deste trabalho é desenvolver e validar uma metodologia analítica para a quantificação, via cromatografia gasosa, do marcador químico α-pineno em amostras de extratos de Schinus terebinthifolius Raddi. 2. Materiais e métodos 2.1. Substância de referência e Solventes O padrão α-pineno, obtido junto a Sigma Aldrich (USA), foi utilizado como substância química de referência (SQR). O metanol e o n-hexano, ambos grau HPLC, foram obtidos da Merck (USA).. 2.2. Material vegetal Extratos hidroalcoólicos da planta Schinus terebinthifolius Raddi foram fornecidos pelo Laboratório Rabelo (Cabedelo-PB). Os extratos foram produzidos através de processo pré-determinado de maceração do vegetal, numa graduação alcoólica de 80% durante 5 dias.. 2.3 Extração líquido-líquido (ELL) Antes das análises cromatográficas, os extratos hidroalcoólicos foram submetidos ao processo de limpeza por extração líquido-líquido, utilizando o n-hexano como solvente apolar na proporção de 2:1. O processo de extração foi realizado utilizando funis de separação de 125 mL em agitação durante 15 minutos, em triplicata. 2.4 Preparo das soluções Soluções padrão Foi preparada uma solução estoque de α-pineno diluindo-se a SQR em n-hexano, na concentração de 50µL/mL, correspondendo a 42,96µg/mL, baseando-se na densidade do αpineno de 0,8592 mg/mL. As soluções padrão foram preparadas por diluições consecutivas da solução estoque com n-hexano obtendo-se níveis de concentrações de 0,171, 0,257, 0,343, 0,429 e 0,515 µg/mL. Soluções amostra.

(37) _____________________________________________________________________________ Lima L G. 19. As fases hexânicas dos extratos submetidos ao processo de extração líquido-líquido, eram filtradas em microfiltros Anow® do tipo PTFE e logo em seguida injetados em volumes de 1,0 µL no cromatógrafo.. 2.5 Condições analíticas As análises cromatográficas foram realizadas em um sistema Shimadzu GC17-A equipado com um auto-injetor e detecção por ionização em chamas (FID). A coleta e integração dos dados foram realizadas com o software Class5000. O nitrogênio foi utilizado como fase móvel numa taxa de fluxo de 1,5 mL/min. As análises cromatográficas acopladas à espectrometria de massas (CG/EM) foram realizadas em um sistema Shimadzu GCMSQP5050A operando no modo SCAN com escala de varredura de 45-450 u.m.a e detecção por impacto de elétrons (70 eV). A coleta e integração dos dados foram realizadas com o software Class5000. O hélio foi utilizado como fase móvel e taxa de fluxo de 1,5 mL/min. A comparação dos espectros de massas obtidos foram realizadas utilizando-se o banco de dados da biblioteca Wiley, 6ª Edição do software Class-5000 1999, com 229.119 espectros. As condições cromatográficas foram idênticas para ambas as análises. A separação cromatográfica ocorreu em coluna capilar DB-5 (30m x 0.25mm; 0.25µm). A programação do aquecimento da coluna foi de uma temperatura inicial de 70ºC aquecida até 105ºC numa razão de 5ºC/min e 10ºC/min até a temperatura final de 280ºC. O volume de injeção foi de 1,0 µL. As temperaturas do injetor e detector eram, respectivamente, 250ºC e 280ºC. O tempo da análise foi de 27,5 minutos.. 2.6 Estudo da validação do método analítico Todo o processo de validação do método foi realizado com base nas recomendações do Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Foram avaliados os parâmetros de seletividade, precisão, exatidão, linearidade, robustez e limites de detecção e quantificação.. 2.6.1. Seletividade A seletividade avalia o grau de interferência de outros compostos que possam estar presentes na amostra. Ela garante que o pico de resposta seja do composto de interesse. O solvente puro (n-hexano), soluções amostras e soluções padrão foram analisados e os espectros dos picos obtidos na separação foram comparados para a comprovação da presença do composto puro..