Análise in silico da HSP83 de Leishmania chagasi : implicações para antigenicidade e evolução

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA. Análise in silico da HSP83 de Leishmania chagasi: implicações para antigenicidade e evolução 8210 nt. 2103 nt. 1 2. G.1. 1. 60. 120. 3. 4 5 6 7. 8. 9. G.3. G.2. 180. 6639 nt. 10. 240. 300. 360. 420. 480. 540. 600. 660. 720. A B. G.1. 1. 60. 120. C. D. G.3. G.2. 180. 240. 300. 360. 420. 480. 540. 600. 660. 720. Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. 90 99. L.major L.chagasi. 99. L.inf antum. 100. L.amazonens is. 98. L.braziliensis T.brucei 99. T.cruzi. 84. B.saliens. 100. D.trypanif ormis 100. 58. B.uncinatus B.saltans. 95. C.helicis 97. T.borreli. 92. C.tropicalis C.bacillisporus. 100 75. A.thaliana O.sativ a. 100. D.aurar ia. 100. D.rerio. 93. A.albimanus 100. S.salar G.gallus. 10 0. H.sapiens. 100 99. R.norvegicus M.leprae E.coli. 100 100. X.f astidiosa. Recife – PE Fevereiro, 2005.

(2) Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. Análise in sílico da HSP83 de Leishmania chagasi: implicações para antigenicidade e evolução. Dissertação apresentada como pré-requisito para obtenção de título de Mestre junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética, área de concentração em Genética do Departamento de Genética da Universidade Federal de Pernambuco.. Orientador: Paulo Paes de Andrade Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.. Recife – PE Fevereiro, 2005.

(3) Barbosa, Pedranne Kelle de Araújo Análise in silico da HSP83 de Leishmania chagasi : implicações para antigenicidade e evolução / Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. – Recife : O Autor, 2005. 97 folhas : il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2005. Inclui bibliografia e anexos. 1. Ciências biológicas – Genética. 2. Leishmania chagasi – Ciclo biológico – Patogenia e antigenecidade. 3. HSP83 (Proteína de choque térmico) – Regiões divergentes – Análise antigênica. 4. Parasito – Questão evolutiva – Perda de introns na HSP83. I. Título. 575 579.4. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE BC2005-291.

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(5) Alice: Poder-me-ias dizer, por favor, que caminho devo tomar a partir daqui? Gato: Isso depende muito de para onde queres ir. Alice: Não me importo muito de para onde vou. Gato: Nesse caso não importa que caminho tomas. (Aventuras de Alice no País das Maravilhas). Quando o homem não sabe para que porto está rumando, não importa para que lado sopra o vento, pois nenhum deles lhe será favorável. Lúcio Sêneca.

(6) AGRADECIMENTOS À minha mãe, Maria Araújo G. Barbosa, mulher vencedora, que me apoiou e me incentivou investindo no meu potencial profissional e pessoal e que hoje, sem sombra de dúvidas é meu braço forte e minha fonte de inspiração. Mãe, obrigada pelo apoio! Às minhas irmãs Anne D. Barbosa e Arianne G. Barbosa, ao meu pai Edmar Barbosa, que puderam me mostrar que a distância física jamais será suficiente pra nos separarmos e mesmo longe me forneceram forças e incentivos pra que nos momentos de angústia ou solidão eu não especulasse a desistência. Ao André Alves, pelo apoio incondicional e por sua compreensão, quanto a minha falta de humor e às minhas decisões inexplicáveis. À tia Enaura Araújo e ao tio Bixoca (Oscar Velozo, In memorian), guerreiros, que acreditaram no meu desenvolvimento profissional e me ensinaram o quanto vale a pena ser perseverante. Ao meu orientador, Paulo Paes de Andrade, que me recebeu de braços abertos no laboratório e em sua casa, e que me mostrou, que quando achamos que tudo está perdido, na realidade esse é momento pra continuar e terminar e que mesmo sob muitas diversidades conseguiu manter e transmitir calma pra seus orientados estressados. À família GENTROP (Celuza, Tia Lili, Tia Leila, Cynthia, Dona Zizi, Tio Iliano, Frida, Paula, Dani Lóssio, Geórgia, Antônio, Arimatéia, Luciano e Rodrigo), por me receberem como integrante desta família e por todos os momentos de descontração e socorros ofertados pra que esse trabalho chegasse ao fim. À companheira Tia Mércia, por sua amizade, pelos momentos de descontração, apoio profissional e pessoal. Isso será noticiado no Plantão do Jornal Nacional? Ao companheiro estressado, Rafa Queiroz, por sua amizade, pelo conforto nas horas aflitas e até pelos estresses que proporcionamos um ao outro, mas que acabávamos nos divertindo com isso. E agora chapeuzinho, chegamos ao final? À minha eterna orientadora, Ana Brito, uma incentivadora da busca ao conhecimento e que me ensinou que além da persistência, a paciência é fundamental..

(7) À Mariana Eufrázio, pela ajuda inestimável na bancada, que nos momentos de desespero, mesmo achando que tudo poderia dar errado, no final do túnel sempre havia uma Luz. À Marmelo, pelo apoio profissional e por me receber tão bem no puxadinho de Dona Márcia. Ao colega Sonoda e Valdir Queiroz, pelo apoio quanto ao direcionamento final do trabalho. À profª Aline Alexandrino, que mesmo sem saber, se fez constante em minha vida, repassando seus conhecimentos e experiência de vida. Aos amigos, Lúcio Pimentel, Patrese Winter, Luiz Fabiano, Mara Guimarães, Ewerton Leandro e Willis Bispo que mesmo à distância, sempre puderam me apoiar, incentivar e proporcionar momentos agradáveis. Aos familiares e amigos que entenderam minha ausência, mesmo nas principais reuniões familiares, mas que ainda sim, acreditaram que era por uma causa nobre. Ao meu objeto de trabalho: as Leishmanias, causadoras de elevadas taxas de mortalidades, dúvidas e especulações e por isso, o desafio ao conhecimento. Ao cão, fiel companheiro do homem, fonte de meu interesse neste trabalho, na tentativa de proporcionar-lhe melhores condições de saúde. Ao CNPq pela bolsa concedida, viabilizando a realização deste trabalho. A todos que de uma forma ou outra, contribuíram pra realização e término deste trabalho e que por esquecimento, não tenha sido citado. Lembrem-se que são dois neurônios pra fazerem tudo. Agradeço em especial, aos que não puderam fazer nada por mim, estes me deram subsídios, forças e coragem pra jamais desistir, e ainda mais, ir além. A Deus, por reformular meus conceitos a respeito da vida..

(8) Sumário LISTA DE TABELAS .......................................................................................................... IX LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ X RESUMO ............................................................................................................................... XI 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................12 2. OBJETIVOS ...........................................................................................................................13 2.1. Geral .................................................................................................................................13 2.2. Específicos .......................................................................................................................12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................14 2.1. Leishmanioses ...................................................................................................................14 3.2. Leishmaniose Visceral ......................................................................................................15 3.2.1. Agente etiológico e taxonomia ................................................................................15 3.2.3. Epidemiologia .........................................................................................................16 2.2.3. Ciclo biológico ........................................................................................................18 3.2.4. Sinais clínicos .........................................................................................................19 3.2.5. Patologia ..................................................................................................................21 3.2.6. Aspectos imunológicos ...........................................................................................22 3.2.7. Diagnóstico .............................................................................................................23 3.2.8. Tratamento e Controle .............................................................................................25 3.2.9. Vacinas ....................................................................................................................25 3.3. Proteínas de Choque térmico e o sistema imune ...............................................................27 3.3.1. Proteína de Choque Térmico de 83KDa .................................................................28 3.4. Organização dos genes de Leishmania .............................................................................32 3.5. Bancos públicos para análise de seqüências .....................................................................32 3.6. Ferramentas computacionais para análise de seqüências ..................................................33 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................37 5. MANUSCRITO ......................................................................................................................52 5.1. Abstract .............................................................................................................................53 5.2. Introduction .......................................................................................................................54 5.3. Results ...............................................................................................................................57 5.4. Discussion .........................................................................................................................59 5.5. Materials and methods .......................................................................................................63 5.6. Figures ...............................................................................................................................65 5.7. References .........................................................................................................................71.

(9) 6. INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES ...........................................................................77 7. ABSTRACT .............................................................................................................................83 8. CONCLUSÕES .......................................................................................................................84 9. ANEXOS ..................................................................................................................................85 9.1. Instruções para autores da revista Genetics and Molecular Biology .................................85 9.2. Instruções para autores da revista Genome Research ........................................................89.

(10) LISTA DE TABELAS. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tabela. 1.. Sinais. e. lesões. mais. comuns. descritos. em. cães. com. Leishmaniose. visceral.......................................................................................................................................... 19 Tabela 2. Alguns Indutores fisiológicos e estados patológicos que aumentam a expressão da HSP90 .......................................................................................................................................... 29. MANUSCRITO Tabela 1. Identificação das seqüências utilizadas de cinetoplastídeos e organismos pertencentes a reinos diferentes a partir do resultado do programa BLASTX utilizando a seqüência da HSP83 de Leishmania chagasi ................................................................................................................ 64. IX.

(11) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1. Paciente apresentando aspecto clínico de leishmaniose visceral ................................ 13 Figura 2. Paciente apresentando leishmaniose cutânea .............................................................. 13 Figura 3. Paciente apresentando leishmaniose cutânea difusa ................................................... 13 Figura 4. Paciente apresentando leishmaniose mucocutânea ..................................................... 13 Figura 5. Formas promastigotas de Leishmania sp. ................................................................... 14 Figura 6. Formas amastigotas de Leishmania infantum ............................................................. 14 Figura 7. Número de casos notificados de leishmaniose visceral no Brasil entre 1985 e 2002.. 16 Figura 8. Mapa com distribuição de casos autóctones de leishmaniose visceral segundo município, Brasil 2002 ................................................................................................................. 17 Figura 9. Fêmea de Lutzomyia sp. engurgitada .......................................................................... 17 Figura 10. Representação esquemática do ciclo biológico de leishmania chagasi ................... 18 Figura 11. Cão com leishmaniose apresentando lesões no corpo, apatia, etc ............................ 19 Figura 12. Cão apresentando emagrecimento acentuado, ceratoconjuntivite, etc ...................... 19 Figura 13. Estrutura tridimensional da região N terminal da HSP90 ......................................... 29 Figura 14. Representação da estrutura primária da HSP90 ........................................................ 29. MANUSCRITO Figura 1. Distribuição dos clones reativos no cluster da HSP83 de L. chagasi ......................... 63 Figura 2. Representação gráfica do alinhamento entre os genes da HSP90 de rato e humano e sua ortóloga a HSP83 de L. chagasi ............................................................................................ 65 Figura 3. Representação gráfica dos domínios da HSP90 mapeados na seqüência da HSP83 leishmanial ................................................................................................................................... 66 Figura 4. Histograma comparativo mostrando a conservação/ divergência entre a HSP83 de L.chagasi e a HSP90 de outros organismos ................................................................................. 67 Figura 5. Dendograma filogenético construído a partir do alinhamento das seqüências da HSP83 com a HSP90 de organismos pertencentes a outros reinos .......................................................... 68. X.

(12) RESUMO Protozoários flagelados do gênero Leishmania são transmitidos para mamíferos através da picada de insetos flebotomíneos e são os agentes etiológicos das quatro formas clínicas de leishmanioses: leishmaniose visceral que é fatal quando não tratada, leishmaniose mucocutânea, leishmaniose cutânea e a leishmaniose cutânea difusa. A leishmaniose visceral é comum em países em desenvolvimento, com uma estimativa de 500.000 novos casos a cada ano. A Leishmania chagasi é o agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas e outras espécies são responsáveis pela forma visceral da doença no Velho Mundo. Devido sua importância, o desenvolvimento de drogas e vacinas usando antígenos do parasito têm sido o alvo de muitos estudos. Entre os maiores antígenos do parasito estão as proteínas de choque térmico (HSP), a maior classe de proteínas conservadas, classificadas como chaperonas. Elas são essenciais no controle do ciclo celular e estão envolvidas na assistência ao dobramento e prevenção de reações irreversíveis tais como agregações inespecificas de proteíans celulares. As HSP possuem um papel importante com agente imunoregulatório com potente uso terapeutico; ademais elas foram identificadas como os maiores imunógenos em várias doenças infecciosas e que estimulam uma resposta específica protetora. A HSP83, ortóloga a HSP90 de mamíferos, é uma das proteínas de Leishmania mais abundantes e é reconhecida pela resposta imune humoral e celular em humanos e em cães com leishmaniose visceral. Neste estudo, baseado em alinhamentos, a estrutura primária da HSP83 de Leishmania chagasi foi comparada a HSP90 de outros organismos, para investigação de suas relações filogenéticas. Quando a seqüência de aminoácidos foi alinhada às seqüências depositadas no banco de genes públicos, ficou evidente que a proteína é extremamente conservada mesmo em organismos pertencentes a diferentes reinos. Quando a seqüência codificante foi comparada, foi possível mapear rigorosamente os exons do gene humano, exceto pela presença de três gaps. O primeiro gap corresponde a uma alça flexível entre duas folhas beta, o segundo tem 57aa (o maior gap), compreende o domínio N-terminal correspondendo ao sítio de ligação de ATP e o último gap, que corresponde também a uma alça flexível entre o domínio central e o domínio carboxi. O aumento da divergência na seqüência é coincidente com as regiões equivalentes as junções dos exons na proteína ortóloga de mamíferos. Nossos resultados sugerem que o gene da HSP83 dos organismos ancestrais aos Kinetoplastida tinha introns, e que foram perdidos durante a evolução.. Palavras chave: Leishmania chagasi, leishmaniose visceral, antigenicidade, HSP83, análise filogenética.. XI.

(13) 1. INTRODUÇÃO A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania e que se apresenta sob duas formas clínicas principais: dermotrópica (podendo se manifestar em três formas clínicas: cutânea, cutânea difusa e mucocutânea) e viscerotrópica. As leishmanioses são endêmicas em 88 países e estão distribuídas em quatro continentes: África, Ásia, Europa e América. Um total de 350 milhões de pessoas encontra-se sob o risco da doença (Desjeux, 1996; Desjeux, 2004). A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como calazar, é a forma mais severa (Desjeux, 2004), sendo fatal quando não tratada. É caracterizada por febre irregular, tosse seca, aumento de baço e fígado e anemia (WHO, 2000). Os cães infectados constituem o principal reservatório doméstico do parasito e têm um papel fundamental na transmissão da leishmaniose para o homem (Alvar et al., 2004); uma das medidas de controle inclui o diagnóstico tanto canino quanto humano no curso inicial da doença (Berman, 1997). A maior parte dos casos de calazar é diagnosticada apenas através da clínica. Os testes sorológicos são os mais utilizados para o diagnóstico laboratorial da LV e, em adição a imunofluorescência indireta (IFI), o ensaio enzimático imunoadsorvente (ELISA) é o ensaio de escolha devido à sua sensibilidade e especificidade no diagnóstico (Guimarães et al., 1989). Entretanto, devido ao fato do antígeno de escolha ser o promastigota intacto ou um extrato dele, implicando em elevada complexidade antigênica, os resultados podem apresentar reação falso positiva para a doença de Chagas (Kalter, 1994). Muitos antígenos de Leishmania foram identificados como membros de famílias de proteínas conservadas, tais como proteínas ribossomais, histonas e proteínas de choque térmico (HSP). Alguns destes antígenos estão sendo caracterizados, conduzindo ao entendimento da resposta imune no hospedeiro e sua utilização em diagnósticos sorológicos (Requena et al., 2000). As HSP das famílias 60, 70 e 90 mostraram-se efetivas na geração da resposta imune contra agentes infecciosos e no câncer (Srivastava et al., 1998), apresentando propriedades imunoestimulatórias e que podem atuar como adjuvantes valiosos, sendo relevantes na estratégia de defesa do organismo contra parasitos, assim como outras doenças (Echeverria et al., 2001) e no desenvolvimento de diagnósticos e vacinas, inclusive para a leishmaniose (Rey-Ladino et al., 1997). Membros da família da HSP90 foram descritas como antígenos imunodominantes durante a infecção causada por L. donovani (Andrade et al., 1992), L. braziliensis (Skeiky et al., 1995) e L. Infantum (Angel et al., 1996). A antigenicidade e imunogenicidade descritas para HSP83, 12.

(14) foram associadas em sua maioria, às regiões fortemente divergentes distribuídas na sequência de aminoácidos (Rico et al., 1999). Desta forma, a HSP83 de Leishmania chagasi, pertencente ao banco de dados da rede ProGeNE, foi escolhida para análise imunológica e para averiguação in sílico da conservação da proteína e de regiões divergentes candidatas a apresentarem epitopos.. 2. OBJETIVOS 2.1. GERAL Analisar in silico a conservação da proteína de choque térmico de 83 KDa de Leishmania chagasi, comparando à HSP90 de cinetoplastídeos e organismos pertencentes a outros reinos correlacionando as regiões divergentes com as regiões candidatas a antigenicidade. 2.2. ESPECIFICOS - Comparar a conservação da seqüência de aminoácido da HSP83 de Leishmania chagasi com a HSP90 de cinetoplastídeos e de organismos pertencentes a outros reinos; - Estabelecer uma correlação das regiões divergentes da HSP90 humana com a HSP83 de Leishmania chagasi; - Mapear regiões antigênicas descritas na literatura sobre a seqüência da HSP83 de L. chagasi; - Mapear domínios existentes presentes na HSP90 humana na seqüência da HSP83 de L. chagasi; - Analisar a relação evolucionária da seqüência da HSP83 de L. chagasi com a HSP90 de outros organismos.. 13.

(15) 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Leishmanioses As leishmanioses são infecções causadas por protozoários do gênero Leishmania que, do ponto de vista epidemiológico podem ser consideradas uma zoonose quando animais servem de reservatório para o parasito ou uma antroponose quando o homem faz esse papel. A transmissão é rural e periurbana para o ciclo zoonótico e urbana para o ciclo antroponótico, entretanto, este último é mantido apenas por duas espécies do parasito, a Leishmania tropica e a Leishmania donovani (Alvar et al, 1997). Atualmente, as leishmanioses encontram-se entre as 10 principais doenças tropicais (TDR/WHO, 2003). Quanto ao aspecto clínico, há duas formas de apresentação: a) lesões de pele e membranas mucosas (figs.2 a 4.) e a disseminação viscerotrópica (fig.1.)(Stiles et al., 1999). A doença dermotrópica pode se manifestar como lesões cutâneas (fig.2.) (lesões únicas ou múltiplas com ulcerações), cutânea difusa (fig.3.) (lesões disseminadas) e muco-cutânea (fig.4.) (destruição da cavidade oronasal, faringeal ou do pavilhão auditivo). Uma forma mais rara é a leishmaniose dérmica pós-calazar, causada em geral pela L. donovani, após cura da leishmaniose visceral (Ashford, 2000). Estima-se que ocorra entre 1,0 e 1,5 milhões de novos casos de leishmaniose cutânea (Desjeux e UNAIDS, 1998) e 500.000 novos casos de leishmaniose visceral por ano (Handman, 2000).. Fig.1. Paciente em estágio avançado de Leishmaniose visceral.. Fig.3. Aspecto clínico de Leishmaniose cutânea difusa, com lesões nodulares. Fig.2. Paciente com Leishmaniose Cutânea, apresentando lesões ulceradas e bordas infiltradas.. Fig.4. Paciente apresentando a forma mucocutânea, com infiltração e edema no nariz.. Fontes: http://www.dbbm.fiocruz.br/tropical/leishman/leishext/html/leishmaniose_cut_nea.htm Ministério da Saúde, 2004. 14.

(16) 3.2. Leishmaniose Visceral 3.2.1. Agente etiológico e taxonomia Os protozoários do gênero Leishmania são tripanosomatídeos parasitas intracelulares obrigatórios das células do sistema fagocítico mononuclear, com uma forma flagelada ou promastigota (fig.4), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e outra aflagelada ou amastigota (fig.5), encontrada nos tecidos dos vertebrados.. Fig. 5. Formas promastigotas ou flageladas de Leishmania sp.. Fig.6. Aspirado de medula óssea contendo formas amastigotas de Leishmania infantum.. Fonte: http://www.kit.nl/biomedical_research/html/fast.asp. Segundo Levine et al.(1980) a posição taxonômica do agente etiológico da leishmaniose visceral (LV), é a seguinte: Reino: Protista (Haeckel, 1866) Sub-reino: Protozoa (Goldfuss, 1817) Filo: Sarcomastigophora (Honigberg & Balamuth, 1963) Sub-filo: Mastigophora (Deising, 1866) Classe: Zoomastigophorea (Calkins, 1909) Ordem: Kinetoplastida (Honogberg, 1963 emend: Vickerman, 1976) Sub-ordem: Trypanosomatina (Kent, 1880) Família: Trypanosomatidae (Doflein, 1901 emend: Grobben 1905) Gênero: Leishmania (Ross, 1903) Sub-gênero: Leishmania (Ross, 1903) Espécie: Leishmania (Leishmania) chagasi (Cunha & Chagas, 1937). O sub-gênero Leishmania está dividido em cinco complexos: complexo Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania tropica e Leishmania mexicana. Os agentes etiológicos da leishmaniose visceral, a saber, L. donovani, L. infantum e L. chagasi, estão incluídos no complexo Leishmania donovani (Momen e Cupolillo 2000). No Velho Mundo, a leishmaniose visceral é o resultado da infecção por Leishmania infantum a qual é considerada uma espécie distinta da L. donovani (Rioux et al., 1990; Shaw, 15.

(17) 1994). Guessous-Idrissi et al (1997) verificaram que L. tropica é o agente etiológico da leishmaniose visceral em Marrocos. No Novo Mundo, a Leishmania chagasi é o agente etiológico da leishmaniose visceral; entretanto, há divergências sobre a nomenclatura chagasi. O seqüenciamento parcial do gene mspC (major surface protease single gene) e a análise por RAPD (random amplification of polymorphic DNA), mostraram que a Leishmania chagasi e a Leishmania infantum são praticamente indistinguíveis entre si (Mauricio et al., 1999). A baixa variabilidade genética vista em L. chagasi é consistente com sua recente importação para o Novo Mundo, como resultado da introdução de cães europeus infectados com L. infantum, que vieram com a colonização (Ozbel et al., 1995). Estes resultados sugerem que a introdução da Leishmania chagasi no Novo Mundo é uma história recente (Mauricio et al., 1999) e que a L. chagasi seria sinônimo de L. infantum (Mauricio et al., 2000).. 3.2.2. Epidemiologia A leishmaniose visceral é endêmica em 88 países, com um total de 200 milhões de pessoas em risco (Desjeux, 1996) e aproximadamente 12 milhões de casos em todo o mundo distribuídos na África, Índia, Oriente Médio, Europa Mediterrânea, América Central e do Sul (Handman, 2001). Os surtos são decorrentes da resposta imune precária por parte dos hospedeiros, comum em áreas endêmicas, (Grimaldi e Tesh, 1993) ou de situações eco – epidemiológicas que favoreçam o aumento da quantidade de vetores infectados (Tesh e Papaevangelou, 1977). Os casos de LV também estão associados com a desnutrição; Cerf et al., (1987), após estudo prospectivo, demonstraram que o risco em desenvolver a doença era 8,7 vezes maior em crianças com desnutrição grave a severa do que entre aquelas que apresentavam um estado nutricional considerado normal. Segundo Alencar et al., (1991), o registro do primeiro caso da doença no Brasil ocorreu em 1913, quando Migone, no Paraguai, descreveu a presença de Leishmania em material de necrópsia de paciente oriundo de Boa Esperança, Mato Grosso. A partir de um estudo realizado para o diagnóstico e distribuição da febre amarela no Brasil, encontraram-se 41 casos positivos para Leishmania, sendo identificados em lâminas de viscerotomias praticadas post-mortem, em indivíduos oriundos das regiões Norte e Nordeste (Penna et al., 1934). Posteriormente, a Lutzomyia longipalpis foi incriminada como a espécie vetora e foram descobertos os primeiros casos da infecção em cães (Grimaldi et al., 1989). No continente americano, o Brasil é responsável por mais de 90% dos casos registrados de calazar, entre os quais 10% dos pacientes morrem, principalmente devido à demora de encaminhamento ao hospital e à dificuldade de estabelecer um diagnóstico precoce para o início 16.

(18) da terapia específica. Por outro lado, observam-se infecções sub-clínicas ou assintomáticas no homem, que ocorrem com prevalência estimada entre 5 a 10% nas áreas endêmicas (Badaró et al., 1986; Sacks et al., 1987; Meller-Melloul et al., 1991; Mary et al., 1992; Seaman et al., 1992). No Brasil a LV está registrada em 19 das 27 Unidades da Federação, com aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão autóctone (Ministério da Saúde, 2003). A figura 7 revela o número de casos de leishmaniose visceral humana que foram notificadas no Brasil entre 1985 e 2002. 5000 4000 3000 2000 1000 0 1985. 1988. 1991. 1994. 1995. 1996. 1997. 1998. 1999. 2000. 2001. 2002. 2224. 816. 1510. 3426. 3885. 3246. 2570. 1977. 3624. 4858. 3646. 3102. Fig. 7. Prevalência da leishmaniose visceral, Brasil – 1985 a 2002 . Fonte: Adaptado do Manual do Ministério da Saúde, 2003.. Na década de 90, aproximadamente 90% dos casos notificados de LV ocorreram na Região Nordeste, semi-árida e com vegetação xerofílica (Palatnik-de-Souza, et al., 2001). À medida que a doença se expande para as outras regiões e atinge áreas urbanas e periurbanas, esta situação vem se modificando. No período de 2000 a 2002, a Região Nordeste apresentou uma redução para 77% dos casos do País. Segundo o Ministério da Saúde (2003), os dados epidemiológicos dos últimos dez anos revelam a periurbanização e a urbanização da leishmaniose visceral, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e mais recentemente as epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO).. 17.

(19) As áreas de transmissão da doença no Brasil estão representadas na figura 8.. Fig.8. Distribuição de casos autóctones de Leishmaniose Visceral segundo município, Brasil 2002. Fonte: SINAN- COVEV/ CGDT/DEVEP/SVS/MS (Ministério da Saúde, 2003).. 3.2.3. Ciclo biológico A leishmaniose visceral tem como vetor um inseto hematófago pertencente à sub-família Phlebotominae (Diptera, Psychodidae) (Sacks e Perkins, 1984) (fig.9).. Fig.9. Fêmea adulta de flebotomíneo, engurgitada. Fonte: Ministério da Saúde, 2003.. No Velho Mundo as espécies transmissoras pertencem ao gênero Phlebotomus e no Novo Mundo ao gênero Lutzomyia (Alexander e Russel, 1992). Mais de 95% dos casos existentes de leishmaniose visceral nas Américas são transmitidos pela espécie Lutzomyia longipalpis (Forattini, 1974). Geralmente a fêmea realiza o repasto sangüíneo durante a noite, com atividade mais intensa no crepúsculo (Strauss-Ayali e Baneth, 2000). Em função do seu tamanho, são 18.

(20) pouco observados pela população, exceto quando as densidades intradomiciliares são muito elevadas fazendo com que as picadas se tornem um incômodo para os moradores. O flebotomíneo, ao picar a pele do hospedeiro infectado, ingere os macrófagos da derme contendo as formas amastigotas em seu citoplasma. No intestino médio do flebótomo, as formas amastigotas se transformam em promastigotas e aderem ao epitélio do tubo digestivo, onde se multiplicam por divisão binária (Ashford, 2000). Os promastigotas imaturos transformam-se na forma metacíclica infectante que se desprende do intestino e migram para a probóscida. No próximo repasto sanguíneo, as promastigotas metacíclicas serão transferidas com a saliva para um novo hospedeiro. As metacíclicas, por serem resistentes aos mecanismos de imunidade do hospedeiro, são fagocitadas pelos macrófagos, se transformam em amastigotas e, após sucessiva multiplicação, rompem a célula (Awasthi et al, 2004).. Fig. 10. Ciclo biológico do agente etiológico Leishmania. Formas amastigotas(1) ingeridas pelo flebotomíneo após repasto sangüíneo (2) e se transformam em formas promastigotas metacíclicas infectantes(3) no intestino médio e migram para faringe do vetor. Ao realizar um novo repasto sangüíneo no hospedeiro, as formas promastigotas são fagocitadas por células do sistema fagocítico mononuclear (4), se transformam em amastigotas (5), se multiplicam e rompem os macrófagos (6), infectando novas células. Fonte: http://www.leishmania.org/pagine/leishmaniosi_canina/eziologia-ciclo_biologico.asp. 3.2.4. Sinais clínicos No homem Algumas vezes, a LV é precedida de lesões secas ou ulceradas no local da lesão ocasionadas pelo flebotomíneo. Dentre os sinais mais característicos no homem, estão: anemia, esplenomegalia, hepatomegalia e progressiva caquexia desenvolvida em taxas variáveis, de semanas a anos após a infecção. Entre os sinais menos constantes estão: linfoadenopatia e diarréia persistente (Ali e Ashford, 1994). 19.

(21) No cão No cão, a doença se manifesta por lesões na pele e em órgãos linfóides, de modo que, o período de incubação não pode ser determinado com rigor (Genaro, 1993), mas geralmente são reportados entre 3 meses e 7 anos após a infecção (Slappendel e Ferrer, 1998). Após a infecção, alguns cães controlam o crescimento do parasita permanecendo em um estágio assintomático por anos, podendo chegar à cura espontânea, enquanto outros desenvolvem os estágios progressivos da doença, levando-os à morte. Os sinais mais comuns de leishmaniose visceral reportados em cães encontram-se na tabela abaixo: Tabela 1. Sinais e lesões mais comuns descritos em cães com LV. Adaptado de Strauss-Ayali e Baneth, 2001.. Sinais e lesões clínicos presentes em cães com LVC. Porcentagem de cães com LVC. Linfodenomegalia Envolvimento da pele Dermatite esfoliativa Membrana mucosa pálida Esplenomegalia Emaciação / Caquexia Ulcerações Onicogrifose Hiperqueratose nasal Sinais oculares. 65,2-90% 81-89% 56-64,1% 58% 9,5-53,3% 10,1-47,5% 34,4-40% 20-30,5% 18,8% 18%. Com base em exames clínicos de cães infectados por L. infantum na Ilha de Elba, Itália, Mancianti et al (1988) classificaram clinicamente estes animais em: a) assintomáticos, caracterizados pela ausência de sinais sugestivos de infecção por Leishmania; b) oligossintomáticos, caracterizados pela existência de adenopatia linfóide e pequena perda de peso e c) sintomáticos, caracterizados pela existência de todos ou alguns dos sinais severos da doença (figs. 10 e 11).. Fig.11. Cão com leishmaniose visceral apresentando apatia, alopecia e lesões no corpo. Fonte: Ministério da Saúde, 2003.. Fig.12. Cão com emagrecimento, ceratoconjuntivi vite, lesões de face e orelha.. 20.

(22) 3.2.5. Patologia No homem Após a inoculação do parasito na superfície da pele pelo flebótomo, as formas promastigotas são fagocitadas pelas células locais do SMF (Sistema Monocítico Fagocitário) onde se multiplicam e disseminam-se até as vísceras por via hematogênica. Os órgãos mais afetados são os mais ricos em células do SMF, como fígado (células de Küppfer), baço (células reticulares e macrófagos), medula óssea e linfonodos. Sherlock et al.(1984) revelam que o aumento de volume do baço deve-se a hiperplasia e hipertrofia das células do SMF com alto grau de parasitismo e que o aumento do fígado é devido à intensa proliferação das células de Küppfer. Na medula óssea observam-se bloqueio da maturação da série granulocítica, inibição de plaquetogênese e intenso parasitismo das células do sistema macrofágico. No cão As alterações histopatológicas mais freqüentes são vistas no tegumento, baço, medula óssea, linfonodos, fígado, rins, pulmões e intestinos (Genaro, 1993). Observa-se dermatite crônica e infiltrado histiocitário com grau variável de parasitismo (Genaro, 1993). A medula óssea apresenta-se hiperplásica, podendo ou não conter parasitas (Keenan et al.,1984). A esplenomegalia pode ocorrer de forma moderada ou o baço pode apresentar-se com tamanho normal, porém com decréscimo do número de linfócitos e proliferação de macrófagos na bainha linfóide periarteriolar (Genaro, 1993). O fígado, geralmente aumentado, apresenta um infiltrado plasmo-linfocitário e hiperplasia das células de Küppfer. Freqüentemente ocorre hepatite difusa e reação inflamatória exsudativa com infiltrado linfo-plasmocitário nos espaços portais e interlobulares (Genaro, 1993). Os linfonodos encontram-se freqüentemente aumentados com perilinfoadenite, hipertrofia dos cordões e dos folículos, intensa fibrose, seios dilatados e hiperplasia de macrófagos (Alencar, 1959). Apresentam ainda redução na população de linfócitos nas áreas paracorticais, extensiva hiperplasia folicular e aumento do número de células plasmáticas (Keenan et al 1984). Nos rins, geralmente ocorrem nefrite intersticial crônica e glomerulonefrite mesangioploriferativa (Genaro, 1993).. 21.

(23) 3.2.6. Aspectos Imunológicos A resposta imune compreende os mecanismos que desencadeiam a imunidade humoral e a imunidade mediada por células. Embora a imunidade humoral possa ter um papel importante na resposta imune protetora, a imunidade mediada por célula é central para obtenção da eficácia protetora contra a maior parte das doenças (Audibert, 2003). A população de linfócitos T pode ser caracterizada em função do padrão de citocinas em T helper 1 (Th1), com produção de Interferon-γ (IFN-γ) e associada à imunidade mediada por célula; T helper 2 (Th2), com produção de Interleucina-4 (IL-4) e associada à imunidade humoral, ambas contribuindo para a suscetibilidade ou resistência às diferentes infecções (Hunter e Reiner, 2000). A infecção por Leishmania pode resultar em imunidade protetora ou em doença em roedores, humanos e cães (Solbach e Laskay, 2000). Quando o hospedeiro fracassa na geração de uma resposta imune protetora efetiva, os parasitas se disseminam da pele e se difundem através dos fagócitos mononucleares para a medula óssea, o baço e o fígado, causando uma doença crônica e possivelmente fatal. A resposta imune do tipo Th1 demonstra ser o maior mecanismo de defesa contra infecção por Leishmania (Scott et al., 1988). A indução de uma resposta do tipo Th1 funcional é crucialmente dependente da citocina IL-12, a qual é produzida pelas APCs (Células Apresentadoras de Antígeno), especialmente células dentríticas. Assim, a IL-12 é considerada uma citocina que induz a célula do tipo Th1 ao passo que o IFN-γ é a citocina mediadora efetiva desta eficácia (Audibert, 2003). Os primeiros estudos de resistência e suscetibilidade nas leishmanioses foram desenvolvidos em modelo murino de L. major, no qual a resistência é determinada por uma adequada resposta Th1, com produção de IFN-γ, enquanto que a suscetibilidade é mediada por linfócitos Th2, com altos níveis de IL-4 e marcada hipergamaglobulinemia decorrente da ativação policlonal de linfócitos B (Alvar et al, 1997). As citocinas IL-12 e IFN-γ, produzidas pela célula Th1, ativam os macrófagos para matar os parasitos, entretanto citocinas produzidas por células do tipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) exacerbam a doença (Borja-Cabrera et al, 2002). Em L. major, a produção de citocinas do tipo Th-1 (IL-2 e IFN-γ) e citocinas do tipo Th-2 (IL-4, IL-5 e IL-10) são mutuamente exclusivas. Porém, foram reportadas respostas do tipo Th-1 e Th-2, em leishmaniose visceral humana e murina, com uma dominância de imunidade protetora do tipo Th-1 (Miralles et al., 1994; Fargeas et al., 1996; Anam et al., 1999). Segundo Coelho et al (2003), os mecanismos determinantes da susceptibilidade a diferentes espécies de Leishmania são de fato, extremamente distintos. A susceptibilidade para 22.

(24) infecção de Leishmania major está ligada à resposta Th2 caracterizada através da produção de IL-4 e expressão diferencial do receptor de IL-12. Em contraste, IL-4 ou IL-10 não têm papel crítico na susceptibilidade para infecção de Leishmania amazonensis. A importância da resposta Th1 parasito-específica na proteção contra L. donovani foi demonstrada tanto em homem como em camundongos (Carvalho et al., 1985; Murray et al., 1992), mas uma vacina que induz uma resposta exclusivamente do tipo Th1 pode não ser suficiente para proteção contra esta forma de leishmaniose (Melby et al, 2001). No cão, semelhante aos humanos, a susceptibilidade para infecções está associada à incapacidade dos linfócitos T responderem aos antígenos parasitários, mesmo na presença de uma forte resposta humoral não protetora. Por outro lado, uma reposta imune protetora nestes animais é caracterizada por uma proliferação linfocitária em resposta aos antígenos de Leishmania (Pinelli et al., 1994; Andrade e Andrade, 1995). Na leishmaniose experimental em camundongos (Sacks e Noben-Trauth, 2002) e em humanos a imunidade é predominantemente mediada por linfócitos T e é manifestada através de uma forte resposta proliferativa de linfócitos do sangue periférico para antígenos leishmaniais, e mediado por citocinas, tais como IFN-γ e TNF-α (fator de necrose tumoral-α), os quais são necessários para ativação dos macrófagos e morte dos parasitas intracelulares (Liew et al., 1993; Kemp et al., 1994; Bogdan et al., 1996; Murray, 1997). De fato, Andrade et al. (1999) demonstraram que em infecções naturais, a proliferação de linfócitos induzida por antígenos ocorre em animais com calazar assintomático ou oligossintomático, porém esta proliferação é completamente suprimida nos animais com comprometimento clínico severo. Segundo Ribeiro-de-Jesus et al (1998), nos indivíduos que desenvolvem leishmaniose visceral existe, logo após a infecção, uma grande produção de IL-10 e de IL-4. Enquanto a IL-4 tem participação na derivação das células Th2, a IL-10 deprime as células Th1 através de sua ação supressora na ativação macrofágica e na função dos linfócitos T, tendo como conseqüência uma resposta negativa na hipersensibilidade retardada, traduzida pela negativação da reação intradérmica de Montenegro (Sacks et al., 1987) com uma marcada diminuição na resposta linfoproliferativa e ausência de produção de IL-2 e IFN-γ (Agudelo e Robledo, 2000). Este quadro é, portanto, semelhante ao observado em cães e comentado acima.. 3.2.7. Diagnóstico A forma mais tradicional no diagnóstico de LV é a identificação das formas amastigotas por aposição em lâmina (método direto) de tecido cutâneo, mucoso e linfóide ou a cultura destes tecidos (método indireto) para detecção de formas promastigotas (Howard et al., 1991). Os métodos diretos incluem preparação, coloração e observação de fragmentos de lesões 23.

(25) cutâneas, ou no caso da LV, de aspirados de medula óssea ou baço. Estes procedimentos geralmente são vantajosos pela sua simplicidade, porém são invasivos (Reed, 1996). Algumas vezes, o aspirado de medula é negativa na observação microscópica direta em função da baixa sensibilidade da técnica, além das dificuldades inerentes na identificação das formas amastigotas por inexperiência do observador. Aspirados de baço geralmente apresentam melhor resultado do que de medula, mas requerem uma prática apurada para o procedimento da biópsia. A sensibilidade do diagnóstico melhora quando o material da biópsia de baço e medula é submetido à cultura, entretanto, existe o risco de contaminação e a possibilidade de baixo crescimento (Reed, 1996). A dificuldade em obter e examinar tecidos tem levado a um uso mais freqüente dos métodos sorológicos (Davies et al., 2003). Dentre os métodos de sorodiagnósticos mais utilizados estão a imunofluorescência indireta (IFI) e o teste de aglutinação direta (DAT), ambos utilizando formas promastigotas como antígeno (Badaró et al., 1986). A IFI é considerada positiva em títulos iguais ou superiores a 1:32, entretanto, a reatividade cruzada é freqüentemente observada com soros de pacientes chagásicos, com tuberculose, malária e hanseníase (Badaró, 1983; Da Costa et al., 1991; Malchiodi et al., 1994; Kohanteb e Ardehali, 2005), o que tem direcionado as pesquisas para a identificação e isolamento de antígenos específicos de leishmanias com objetivo de melhorar a sensibilidade e especificidade das técnicas de diagnósticos sorológicos (Qu et al., 1994; Tebourski et al., 1994, Ferreira et al., 2003; Rosati et al., 2003). Vários antígenos estão sendo propostos para diagnóstico de Leishmania utilizando imunoensaios, como ELISA e Western blotting. Entre eles estão a HSP70, GP63, rK39, rK26, e FML (Rachamim et al., 1991; Badaró et al.,1996; Cabrera et al.,1999; Brito et al., 2000; Zurita et al., 2003). O uso destes novos antígenos traz consigo um esperado aumento da especificidade dos testes, já que a complexidade antigênica é muito inferior àquela dos testes IFI e ELISA convencionais. Segundo Brito et al. (2000) a técnica de imunoblotting com lisado de Leishmania braziliensis mostrou-se mais sensível e específica do que o ELISA, o que se deve à separação física dos diversos componentes antigênicos na membrana, após a eletroforese em SDSpoliacrilamida. Com o advento da biologia molecular, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e suas variantes têm sido empregadas com maior especificidade e sensibilidade. A PCR tem sido usado com sucesso no diagnóstico de humanos (Piarroux et al., 1994; Salotra et al., 2001) e cães (Mathis e Deplazes, 1995; Strauss-Ayali et al., 2004) com LV, sendo eficiente em distinguir espécies de Leishmanias por amplificação de seqüências de minicírculo e de outros alvos nos DNA nuclear e de cinetoplasto (Brujin e Barker, 1992; Rodrizues et al., 1994; Singh et al., 1999; Cortes et al., 2004; Mortarino et al., 2004). 24.

(26) 3.2.8. Tratamento e Controle Entre as drogas leishmanicidas usadas no tratamento da leishmaniose visceral humana, incluem-se os antimoniais pentavalentes, aminosidina, pentamidina, anfotericina B, alopurinol e miltefosina (Slappendel e Ferrer, 1998; Singh e Dube, 2004). Evidências indicam que a quimioterapia para cães infectados usando antimonial pentavalente tem se mostrado ineficaz, podendo causar a exarcebação da doença (Marzochi et al., 1985; Alvar et al., 1994; Oliva et al., 1998). A eliminação dos cães sintomáticos e o tratamento dos cães assintomáticos e oligossintomáticos com anfotericina B lipossomal levaram a uma redução de 67% na freqüência da doença canina em dois anos de estudos (Gradoni et al., 1995). Entretanto, o tratamento de cães e humanos com a mesma droga não é recomendado pela Organização Mundial da Saúde, visto que essa terapia pode levar a resistência do parasito (OMS, 1990). Ademais, muitas recaídas foram descritas depois do tratamento. Clinicamente, os maiores focos da doença desaparecem após o tratamento do cão, mas isso não indica a ausência completa do parasito no ambiente (Gradoni et al., 1987; Alvar et al., 1994; Baneth e Shaw, 2002). A presença de infecções latentes em cães é comum e é importante na manutenção do parasito em regiões endêmicas (Palatnik-de-Souza et al., 2001). No Brasil, até recentemente, aproximadamente 200.000 casas eram borrifadas e 20.000 cães eliminados a cada ano para prevenção da LV (Ashford et al., 1998). Na ausência de uma segura e rápida ferramenta para detecção de cães infectados, alternativas de estratégias de controle são necessárias. A aplicação tópica de inseticidas em cães ou o uso de coleiras com inseticidas podem substancialmente reduzir a picada do vetor em cães e protegê-los da infecção, porém esta estratégia requer re-tratamento regular, pois o efeito do inseticida é curto (Reithinger et al., 2001).. 3.2.9. Vacinas Várias estratégias de vacina contra a leishmaniose estão sendo adotadas, entretanto, o foco é contra a forma cutânea da doença causada pela Leishmania major. Comparativamente poucas estratégias de vacinação foram formuladas contra a Leishmaniose visceral (Follador et al., 2002; Reed e Campos-Neto, 2003; Daneshvar et al., 2003). Afrin e Ali (1997) verificaram que o antígeno de membrana de Leishmania (LAg), quando encapsulados em lipossomas, pode induzir altos níveis significativos de proteção contra a infecção por L. donovani tanto em hamsters como em camundongos BALB/c. A proteína recombinante A2 (proteína abundante em formas amastigotas de L. infantum, 25.

(27) L. chagasi, L. mexicana, L. amazonensis e L. donovani), quando empregada como antígeno vacinal, mostrou um nível de proteção significativo contra o desafio por L. donovani, em camundongos BALB/c (Ghosh et al., 2001). Coelho et al. (2003) verificaram que esta proteína induz uma resposta Th1, com aumento da produção de IFN-γ, sem concomitante aumento dos níveis de IL-4. Adicionalmente verificaram que houve uma grande redução da carga parasitária no baço. Estes resultados sugerem que A2 é uma forte candidata para o desenvolvimento de novas vacinas para o calazar. O uso de lipossomas sólidos para veicular o antígeno LAg em ensaios de vacinação experimental de camundongos BALB/c induziu uma proteção significativa (81 – 87%) contra um desafio de L. donovani. O uso de antígeno não encapsulado também induziu proteção, embora menor, mostrando assim a importância do lipossoma de DSPC (disteariol fosfatidil colina) como adjuvante e veículo vacinal na leishmaniose experimental murina (Mazumdar et al., 2004). Afrin et al (2002) investigaram a eficácia protetora da proteína Gp63 (Glicoproteína de 63 kDa) livre e encapsulada em lipossomas. As moléculas carregadas positivamente foram selecionadas devido ao nível máximo de proteção observada contra LV experimental nestes lipossomas (Afrin e Ali, 1997). Camundongos BALB/c foram imunizados com Gp63 e 10 dias depois infectados com promastigotas de L. donovani transformadas. Depois de 2 e 4 meses após infecção demonstrou-se proteção de 22,8 e 40% respectivamente, nos 2 meses, e 41 e 57% respectivamente após os 4 meses. O nível de proteção da Gp63 lipossomal foi maior que a Gp63 livre induzindo uma resposta DTH antes e depois da imunização. Entretanto, a diferença não foi estatisticamente significativa. Testes realizados com o antígeno ligante de fucose e manose (FML) de Leishmania donovani em combinação com saponinas, alumina (Al (OH)3) e adjuvante de Freund como forma vacinal em modelos murinos de leishmaniose visceral, mostraram que havia uma resposta humoral significativamente mais alta nos grupos vacinados com FML + saponinas ou FML + Al (OH)3 do que nos controles não vacinados. Houve uma redução da carga parasitária nos animais vacinados com FML + saponina em relação ao grupo vacinado apenas com salina e com saponina (Santos et al., 1999). Em 2001, Silva e colaboradores avaliaram a eficácia de uma vacina contra o calazar canino em área endêmica do Brasil, utilizando FML purificada de L. donovani. Houve uma proteção de 92% após 2 anos, com soroconversão contra FML em 97% e DTH positiva em 100% dos animais vacinados. Empregando um antígeno de L. major precipitado com alumina e adicionado de BCG, Mohebali e cols. (2004) obtiveram uma proteção de 69,3% em cães no Irã, com base na soroconversão avaliado pelo teste de aglutinação direta. 26.

(28) É clara a urgência do desenvolvimento de uma vacina contra as leishmanioses e em particular o calazar. A vacina deve induzir uma resposta mediada por linfócitos T e, sempre que possível, altos títulos de anticorpos específicos, ainda que o papel protetor destes seja discutível (Rachamim e Jaffe, 1993; White e McMahon-Pratt, 1990; Dole et al., 2000).. 3.3. Proteínas de Choque Térmico e o sistema imune A primeira citação sobre as Proteínas de Choque Térmico (HSP) surgiu em 1962, depois que células de glândulas salivares de Drosophila foram expostas a 37°C por 30 min e retornaram ao seu estado normal a 25°C; um “puffing” de genes foi observado ocorrendo nos cromossomas das células (Ritossa et al., 1962). Em 1974, Tissieres et al. verificaram um aumento na expressão de proteínas com massa moleculares de 26 e 70 KDa. Estas proteínas foram nomeadas de proteínas de choque térmico. Desde então, um grande número de proteínas em adição a estas, coletivamente referida como HSP, foram descobertas (Kiang e Tsokos, 1998). As HSP são chaperonas moleculares que se ligam a outras proteínas e estabilizam a conformação destas. Embora muitas HSP sejam expressas constitutivamente, sua expressão também é regulada por várias perturbações fisiológicas ou estressantes (ex: temperaturas elevadas, hipóxia, isquemia, metais pesados, aumento de cálcio, falta de glicose, câncer e infecção microbiana) (Csermely et al., 1998; Robert, 2003). As HSP estão presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas, o que sugere que tenham um papel fundamental no processo celular: estão presentes tanto no citosol como na mitocôndria, no retículo endoplasmático e no núcleo (Kiang e Tsokos, 1998). Geralmente as funções atribuídas as HSP são: apresentação e estabilização de proteínas oligoméricas; servir como chaperona molecular em transportes de proteínas entre organelas celulares e contribuir para dobramento inicial de proteínas alteradas (Lindquist e Craig, 1988; Csermeley et al., 1998; Kiang et al., 1998, Pockley, 2003). As HSP tem uma função fisiológica importante no metabolismo celular normal e a importância de muitas HSP está baseada na sua capacidade em se associar à outras proteínas modificando o destino e a função destas proteínas (Rico et al, 1999). Estas proteínas podem ser induzidas não somente quando há aumento de temperatura, mas também através de uma variedade de agentes nocivos, muitos dos quais afetam a conformação e estrutura da proteína (Craig, 1985; Lindquist, 1986; Lindquist e Craig, 1988). A elevação na síntese destas proteínas podem ser o resultado do aumento da tradução do mRNA (McGarry e Lindiquist, 1985; Theodorakis e Morimoto, 1987). ou o aumento na 27.

(29) transcrição dos genes de choque térmico (Biens e Pelham, 1987). Um aumento de temperatura de 25º para 37ºC induz uma significante resposta ao choque térmico em cultura de promastigotas de Leishmania, resultando em um estágio de diferenciação. Esta mudança na temperatura está relacionada com o encontro do parasito quando ele é transmitido para o homem através do inseto (Van Der Ploeg et al., 1985; Shapira et al., 1988). As HSP também são importantes no controle da imunidade protetora. Sua função de chaperona obriga sua participação na apresentação de moléculas de anticorpos estando envolvidas na estabilização das moléculas do MHC de classe I e classe II e podem estimular a síntese de citocinas (More et al., 2001). Trabalhos sugerem que as HSP desenvolvem papéis críticos na geração de resposta imune contra o câncer e agentes infecciosos (Minowada e Welch, 1995; Srivastava et al., 1998) e algumas destas proteínas estão envolvidas no processo de montagem de componentes moleculares do sistema imune (DeNagel e Pierce, 1993). Embora as proteínas de choque térmico sejam abundantes e conservadas na natureza e suas funções em diferentes organismos sejam geralmente similares, assim como suas características estruturais e seus pesos moleculares, elas, surpreendentemente, apresentam uma natureza antigênica, primeiramente observada na malária e na esquistossomose (Bianco et al., 1986; Nene et al., 1986; Hedstrom et al., 1987). A resposta contra HSP foi então descrita para Schistosoma mansoni, que expressa diferencialmente um grupo de proteínas identificadas como homóloga à HSP70 quando é submetido ao estresse (Yuckenberg et al., 1987). Andrade et al. (1990 e 1992) mostraram que o soro de pacientes com calazar tinha anticorpos dirigidos contra antígenos homólogos à família HSP70. Em infecções parasitárias, as HSP70 e 90 representam o maior alvo da resposta imune. Algumas das doenças infecciosas como: tuberculose, leishmaniose, malária, doença de Chagas, etc., tem a HSP70 como antígeno imunodominante nos organismos infectados (Kiang e Tsokos, 1998). As HSP foram descritas como os antígenos mais abundantes durante muitas doenças infecciosas (Shinnick, 1991). 3.3.1. Proteína de choque térmico de 83kDa Em eucariotos, as HSP estão agrupadas em três grandes classes com massas moleculares de 20 a 30, 68 a 73 e 82 a 90 kDa (Neidhardt et al., 1984; Lindquist, 1986). O último grupo é comumente referido como HSP86 ou HSP90 em eucariotos superiores (Welch et al., 1982; Lai et al., 1984) e HSP83 nos protozoários Leishmania spp., Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi (Mottram et al., 1989; Shapira e Pinelli, 1989; Shapira e Pedraza, 1990). As HSP das classes 82 a 90 são proteínas citoplasmáticas, algumas vezes nucleares, ligando-se ao envelope nuclear de células permeabilizadas. (Schlatter et al, 2002) e sendo abundantes mesmo na ausência de estresse (Welch et al., 1982; Lai et al., 1984). 28.

(30) A família da HSP90 incluem membros localizados em diferentes compartimentos celulares. Em vertebrados, dois diferentes membros da HSP90 são expressas no citosol (Lindquist e Craig, 1988; Kiang e Tsokos, 1998). A HSP90α e a HSP90β que são resultados da duplicação de um gene que coincide com a emergência dos vertebrados (Moore et al., 1989; Krone e Sass, 1994; Gupta, 1995). A. caracterização. bioquímica. de. HSP90. purificada. indica. que. a. HSP90α. predominantemente existe como um homodímero e a HSP90β existe como um monômero (Minami et al., 1991). A HSP90α é mais induzível, porém a HSP90β é mais expressa constitutivamente. Algumas pequenas diferenças na dimerização do domínio C-terminal da HSP90 β parecem ser a causa de sua menor estabilidade em relação à HSP90α (Csermely et al., 1998). Estudos mostraram que o choque térmico aumenta a oligomerizaçao e a atividade in vitro da HSP90 como chaperona (Yonehara et al., 1996; Nemoto et al, 1997). Depois da exposição ao choque térmico, a HSP90 exibe uma ligação mais eficiente que outras proteínas, para uma variedade de reações (Lanks et al., 1992). Em células estressadas, a HSP90 pode também funcionar na preservação da integridade estrutural do citoplasma e do núcleo. Esta função requer grandes concentrações celulares de HSP90 (Csermely et al., 1998). Sua expressão e seu papel em algumas doenças tem importância excepcional, tais como doenças cardiovasculares, várias infecções, doenças auto-imune e no câncer. Ela também pode ser induzida devido à utilização de algumas substâncias como o etanol (Miles et al., 1994) e cocaína (Salminem et al., 1997). Alguns dos indutores fisiológicos, assim como alguns estados patológicos também aumentam a expressão da HSP90 e estão listados na tabela abaixo: Tabela 2. Indução da HSP90 (HSP90α e HSP90β) através de vários agentes fisiológicos e condições patológicas. Adaptada de Csermeley et al., 1998. PROTEÍNA INDUZIDA HSP90α. HSP90β. Choque térmico Éster Soro, insulina, Insulina ligada ao fator de crescimento Estradiol Interleucina 4 Depleção glutationa Fator de crescimento epidermal. Interleucina 6 Ativação linfócito Resistência a glicocorticóide. A HSP90 está envolvida em cadeias de transdução de sinal. A interação da HSP90 com 29.

(31) proteínas como receptores de esteróides, caseína kinase II, kinase elF2α e receptor de hidrocarbonetos e em alguns casos, são essenciais para sua função como chaperona (Rose et al., 1987; Miyata e Yahara, 1992). Uma variedade de evidências, isto é, a abundância de HSP90 mesmo na ausência de estresse, a conservação da seqüência de aminoácidos entre procariotos e eucariotos (Miyata e Yahara, 1992), e a indispensabilidade em leveduras (Borkovich et al., 1989), sugerem que HSP90 está envolvida em outras funções fundamentais da célula. A HSP90 contém três grandes domínios: o domínio amino terminal (fig. 13a e 13b), que contém o sítio ligador de ATP (Adenosina trifosfato); o domínio central e o domínio carboxi terminal que é necessário para homodimerizaçao (Nemoto et al., 1995). Os domínios amino e central atuam como sítios ligadores para as cochaperonas p50 e Aha1, respectivamente, onde possivelmente a p50 inibe e a Aha1 estimula a atividade ATPase da HSP90 (Meyer, 2004; Roe et al., 2004).. Fig.13. Estrutura tridimensional da região amino terminal da HSP90 de Homo sapiens (a) e sua homológa HSP83 de Leishmania chagasi (b). A HSP83 de L. chagasi foi modelada a partir de sua homologia com a seqüência de H. sapiens pelo programa Modeller. Fonte: Vasconcelos et al., 2004.. A figura 14 representa a estrutura primária da HSP90 baseada na estrutura da HSP90 alfa de Homo sapiens de 722 aminoácidos. As áreas em cinza indicam as regiões conservadas analisada por comparação de seqüências conhecidas da HSP90. As áreas em branco representam as regiões de baixa homologia e na região carboxi terminal, observa-se à presença de um pentapeptídeo conservado (MEEVD), encontrado em muitos membros da família das HSP90. Região conservada Fig. 14. Estrutura primária da HSP90. Fonte: Scheibel e Buchner, 1998. Região conservada. A função da HSP90 é complexa e envolve a ligação de uma série de chaperonas Alça Flexível Fig. 14. Estrutura primária da HSP90. Fonte: Scheibel e Buchner, 1998.. 30.

(32) A função da HSP90 é complexa e envolve a ligação de uma série de chaperonas para formar um complexo dinâmico multimérico (Maloney e Workman, 2002; Issacs et al., 2003). A inibição da atividade ATPase da HSP90 atua como resposta antitumoral in vitro e in vivo (Schulte e Neckers, 1998). Entre as classes de inibidores da HSP90 destaca-se a geldamicina (Neckers et al., 1999), que se liga competitivamente ao sítio de ligação de ATP e bloqueia a função da HSP90, impedindo sua apresentação às proteínas clientes (Rowlands et al., 2004). A HSP83 é uma das proteínas mais abundantes em Leishmania, constituindo 2,8% das proteínas celulares (Brandau et al, 1995), sendo codificada por múltiplas cópias do gene e é encontrada na fração solúvel do citoplasma (Shapira e Pinelli, 1989; Brandau et al, 1995; Hubel e Clos, 1996). Também é conhecido o seu papel controlador da homeostase nos estágios de diferenciação celular em L. donovani e T. cruzi (Wiesgigl e Clos, 2001; Graefe et al, 2002; Bente et al, 2003). Essa proteína possui alto nível de conservação entre tripanosomatídeos, com 84% entre HSP83 de L. mexicana amazonensis e T. cruzi (Shapira e Pedraza, 1990), bem como entre outros organismos e é abundante em promastigotas e amastigotas quando exposta ao estresse térmico. Em eucariotos superiores e em leveduras, a HSP83 citosólica tem sido conhecida por interagir diretamente com fatores de transcrição, dependente de ligante e reguladores do ciclo celular (Rutherford e Zuker, 1994; Scheibel e Buchner, 1998; Buchner, 1999). Nemoto et al. (1997) desenvolveram uma biblioteca de anticorpos monoclonais e mostraram que estes anticorpos reconhecem especificamente a HSP90 humana e que os maiores domínios imunogênicos estão localizados em 2 regiões restritas. Embora o modelo proposto seja principalmente para análise de estruturas de subdomínios, ele é válido para análise da estrutura e função da HSP90. Skeiky et al, 1997 observaram que a HSP83 é um antígeno imunodominante reconhecido através do soro de pacientes com leishmaniose cutânea difusa (DCL). Foram analisados três antígenos leishmaniais imunodominantes (HSP70, HSP83 e LeIF) e dentre os 3 a HSP83 revelou uma especificidade dominante. Dois indivíduos também demonstraram altos títulos de IgG1 e IgG3, mas não de IgG4. Porém, os que apresentaram boas respostas para HSP83 obtiveram dominância na subclasse de IgG4. Portanto, eles puderam identificar que a HSP83 de leishmania é um antígeno dominante no diagnóstico contribuindo para a resposta de anticorpo IgG4. A HSP83 de L. infantum já foi relatada como antígeno imunodominante no calazar canino (Angel et al., 1996).. 31.

(33) 3.4. Organização dos genes de Leishmania O genoma nuclear de Leishmania infantum estão organizados em 36 cromossomos individuais com um tamanho variando de 0,35 a 3,0 Mb e um tamanho do genoma total de 35,5Mb (Wincker et al., 1996; Ravel et al., 1998). Brito et al. (1998) compararam o número de cromossomos e os grupos de ligação das espécies de Leishmania do Velho Mundo com os das espécies do Novo Mundo; apesar da grande maioria dos grupos de ligação serem conservados (32 cromossomos), os membros do subgênero Viannia e os do subgênero Leishmania provenientes do Novo Mundo apresentam 34 e 35 cromossomos, respectivamente. A organização dos genes de RNA ribossomais (RNAr) em Leishmania é semelhante com os de eucariotos: múltiplos, com repetições em tandem e regiões codificantes separadas por espaçadores não-transcritos (Requena et al., 1997). Por outro lado, investigações em genes nãoribossomais identificaram situações de cópia única e de cópias múltiplas repetidas em tandem (Myler et al., 1999). Os genomas possuem ainda 30% de seqüências repetitivas, sendo cerca da metade provavelmente proveniente das repetições teloméricas e os restantes 15% resultado de microsatélites, transposons e repetições dispersas de algumas famílias de genes (Rodriguez et al., 1997; Ivens e Blackwell, 1999).. 3.5. Bancos públicos para análises de seqüências Entre os bancos que buscam informações acerca de funções protéicas está o Interpro que tem o objetivo de combinar as assinaturas protéicas mais comuns encontradas nos bancos específicos em um mesmo banco, possibilitando a caracterização única e não-redundante de famílias protéicas, domínios ou sítios funcionais (Mulder et al.-The InterPro Consortium, 2001). Os principais bancos de dados integrantes do InterPro são: Pfam que é um banco de famílias de domínios (Studholme et al., 2003); PROSITE é um banco de domínios e famílias protéicas mais sensível na detecção de organismos divergentes (Falquet et al., 2002); PRINTS, banco que abriga uma coleção de assinaturas, motivos e domínios de famílias protéicas (Attwood et al, 2003), entre outros. O Pfam (Protein families database of alignments and HMMs), é uma grande coleção de alinhamentos de seqüências múltiplas e utiliza o modelo de Markov cobrindo muitos domínios e famílias de proteínas. Cada família no Pfam é representado pelo alinhamento de duas seqüências múltiplas (Bateman et al., 2000; Bateman et al., 2002). 32.