PREDIÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA TtsI DE
Bradyrhizobium
elkanii
587
POR
HOMOLOGIA
MOLECULAR
F.B.S. de SOUZA1, B.A.S. de SOUZA1, N.A.N ALENCAR2, C.N. ALVES2 e D. do
S.B. BRASIL1
1 Universidade Federal do Pará, Laboratório de Informática
2 Universidade Federal do Pará, Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de
Fármacos
E-mail para contato: davibb@ufpa.br
RESUMO – Bactérias Rhizobia são fixadoras de nitrogênio, responsáveis por formar nódulos nas raízes de plantas leguminosas. A maior parte destas espécies bacterianas estão na família Rhizobiaceae em alfa-protebactérias e pertencem a um dos gêneros: Rhizobium, Mesorhibium, Ensifer ou Bradhyrhizobium. Estudo recente apresentou a sequência do genoma de Bradyrhizobium elkanii e outro revelou a presença de genes envolvidos na fixação biológica de nitrogênio tais como genes do grupo NIF, NOD e genes para o sistema de secreção de proteínas do tipo III (T3SS). A importância comercial da compreensão dos mecanismos de reação envolvidos em bactérias Rhizobia está na redução do uso de fertilizantes nitrogenados que apresentam um custo elevado. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi obter a estrutura tridimensional da proteína TtsI, obtida do projeto genoma de Bradyrhizobium elkanii 587. A seleção dos modelos foi feita no BLAST (PDB) e apresentou identidade de 33% com a proteína RegX3 (pdb: 2OQR). O modelo obtido pelo programa SWISS MODEL pode ser utilizado para estudos dos mecanismos de reação envolvidos na fixação de nitrogênio por este tipo de bactéria.
1. INTRODUÇÃO
Segundo o relatório do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) divulgado em fevereiro de 2015, a produção agrícola da América do Sul representa 52,14% da soja mundial, enquanto os EUA 35% (GRANOSUL, 2015).
Em um mercado de elevada competitividade dentro do contexto de uma economia globalizada é necessário maior eficiência na produção, por meio da redução dos custos de produção e o aumento da produtividade, em especial, no setor primário do Brasil (Hungria et al., 2001).
Bactérias do gênero Bradyrhizobium associam-se ao sistema radicular da soja e fornecem, em uma relação simbiótica, o nitrogênio necessário para o desenvolvimento da planta (Hungria et al., 2001).
O mercado global exige cada vez mais um paradigma de desenvolvimento pautado na sustentabilidade, o que exige o emprego de novas tecnologias, neste aspecto a biotecnologia tem muito a contribuir em especial nos campos de produção de alimentos, geração de energia, prevenção da poluição ambiental e biorremediação (Schenberg, 2010).
Entre as técnicas à serviço da biotecnologia encontra-se a modelagem molecular que consiste em um conjunto de ferramentas para a construção, edição e visualização, análise e armazenamento de sistemas moleculares complexos (Barreiro et al., 1997).
A estratégia de modelagem molecular por homologia baseia-se no conhecimento de que a conformação estrutural de uma proteína é mais conservada que sua sequência de aminoácidos durante o processo evolutivo, onde pequenas mudanças na sequência derivam em sutis modificações na estrutura tridimensional, logo se ao menos uma sequência homologa para a qual a estrutura tridimensional resolvida esteja disponível é encontrada, é possível a aplicação do método de predição de estrutura tridimensional de uma proteína-alvo denominado modelagem por homologia (Silva e Silva, 2007).
1.1 BACTÉRIA BRADYRHIZOBIUM ELKANII 587
A bactéria Bradyrhizobium elkanii pertence à Ordem Rhizobiales, caracterizada por bactérias aeróbias, diazotróficas (JORDAN, 1982 apud TIEPPO, 2011), quimiorganotróficas, possuindo um formato de bastonetes não formadores de esporos, gram-negativas de tamanho que varia de 0,5-0,9 micrometro x 1,2-3,0 micrometro. Sua mobilidade ocorre através de um flagelo polar único ou dois a seis flagelos peritríqueos (SOMASEGARAM e HOBEN, 1994)
Geralmente é encontrado no solo realizando a fixação biológica de nitrogênio, este processo ocorre através da simbiose com as plantas, sua maior afinidade encontra-se com plantas da Família Fabacea (SPRENT, 1995; apud TIEPPO, 2011). Este gênero fixa o nitrogênio atmosférico em nódulos presentes nas raízes das plantas (FREIRE, 1992). À associação planta-bactéria é de grande interesse para o mercado, pois oferece benefícios econômicos e ecológicos já que estas bactérias associam-se simbioticamente às plantas fixando o nitrogênio em condições limitantes desse composto (GEURTS e BISSELING, 2002 apud CAMPOS, 2009).
Os organismos diazotróficos efetuam o processo de fixação biológica de nitrogênio, por meio da redução de nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3), à
amônia produzida pode ser utilizada pelo metabolismo do organismo. Os Rhizobiales fixam o nitrogênio nas plantas em estruturas diferenciadas denominada de nódulos (GIONGO, 2007).
A amônia produzida pelo rizóbio será exportada para a planta que não dependerá mais da disponibilidade deste nutriente no ambiente (GIONGO, 2007 apud TIEPPO, 2011).
1.1.1 CARACTERIZAÇÃO DO T3SS e TtsI
O T3SS permite que bactérias gram- negativas injetem proteínas de virulência diretamente no citosol das células eucarióticas hospedeiras, as proteínas injetadas podem interagir com fatores eucarióticos com função de transdução de sinal, de modo a se tornarem capazes de interferir com a sinalização celular (HUECK, 1998 apud CAMPOS, 2009).
Apesar dessa caracterização a distribuição de T3SS não é exclusiva de patógenos, esta distribuição já foi encontrada em bactérias endosimbiontes (GHOSH,2004). O T3SS é composto aproximadamente por 20 proteínas diferentes, deste total pelo menos dez são altamente conservadas, dentro desse grupo existe uma grande semelhança de sequência com proteínas do corpo basal do flagelo bacteriano (HUECK, 1998).
Os genes relacionados com a nodulação apresentam alguns envolvidos na faixa de amplitude de hospedeiro para a simbiose, esse é i caso dos genes nolXWBTUV em
Sinorhizobium fredii USDA257, os quais, quando mutados, alteram a especificidade de
hospedeiros da bactéria (AUSMEES et al., 2004). A transcrição dos genes nolXWBTUV depende da presença de flavonoides e das proteínas reguladoras de transcrição NodD1 e NodD2 (KRISHNAN et al., 1995 apud CAMPOS, 2009).
Em bactérias gram-negativas fitopatogênicas, o T3SS é substancial para a colonização do tecido vegetal hospedeiro, através da secreção e translocação de proteínas efetoras para a célula vegetal (MUDGETT, 2005). Foi sugerido que a função desse sistema em organismos simbiontes seria similar à que ocorre em patógenos, ou seja, a secreção de proteínas efetoras diretamente dentro da célula hospedeira eucariótica (KRISHNAN et al., 2007).
Os responsáveis pela ativação da transcrição dos genes do T3SS em rizóbios são os flavonoides, posteriormente ocorre à ativação de NodD1. Na região promotora do gene ttsI dos diversos rizóbios foi encontrado o motivo nod-box, sequência a qual a proteína NodD1 se liga para a ativação dos genes por ela regulados (LÓPEZ-BAENA et al., 2008).
O gene ttsI é o único que possui características de ativador de transcrição entre todos os genes do lócus do T3SS, o que sugere que essa proteína seja o único regulador da transcrição dos demais genes desse sistema (WASSEM et al., 2008).
2. HOMOLOGIA DA PROTEÍNA Ttsl de Bradyrhizobium elkanii 587
A homologia da proteína TtsI foi realizada utilizando o servidor SWISS MODEL através do qual pôde-se propor a estrutura da proteína-alvo (target) partindo de sua sequência primária obtida por Okazaki et al. (2009) e de estruturas homólogas tridimensionais.
No servidor UNIPROT realizou-se a pesquisa de uma sequência de proteína sem PDB, obtendo-se a seguinte sequência conforme mostra a Figura 1.
Figura 1- Sequência de peptídeos obtida para a proteína Ttsl de Bradyrhizobium elkanii 587 no servidor UNIPROT.
O segundo passo foi determinar os moldes (templates) que estivessem diretamente relacionados ao alvo através de uma maior identidade e similaridade entre eles, esse alinhamento foi realizado no servidor PDB (Protein Data Bank), obteve-se como melhor molde a proteína RegX3 com 33% de identidade conforme a Figura 2.
No servidor SWISS MODEL realizou-se a construção de modelos similares ao alvo (TtsI) a partir do alinhamento entre o target e o template, obteve-se o seguinte modelo proposto pelo servidor, conforme a Figura 3.
Figura 3- Modelo proposto.
3. VALIDAÇÃO
A avaliação estereoquímica do modelo foi feita através do gráfico de Ramachandran (RAMACHANDRAN; RAMAKRISHNAN; SASISEKHARAN, 1963). O número de resíduos localizados em regiões com ângulos favoráveis, dados em porcentagem, para o modelo foi considerado satisfatório, o modelo gerado do domínio catalítico apresentou 85,6% dos resíduos previstos dentro da região favorável. Esse resultado está apresentado na Figura 4. Esta é uma análise estatística dos número de aminoácidos em cada região e permissões, exceto para resíduos de prolina e glicina (triângulo), pois estes devido a suas flexibilidades apresentam permissões diferente em relação aos demais.
Figura 4 - Gráfico de RAMACHANDRAN obtido através do servidor SWISS-MODEL para validar o modelo 3D da proteína Ttsl.
O gráfico de ANOLEA é usado para avaliar a qualidade do modelo, mostra a energia de interação de cada resíduo de uma cadeia de proteína podendo determinar assim zonas com elevada energia, geralmente relacionadas a erros estereoquímicos e choques ou interações indevidas. O gráfico de ANOLEA está em processo de validação.
Valor de RMSD calculado para o modelo foi de 0,048 Å. Esse resultado demonstra que o desvio médio na construção do modelo foi satisfatório, principalmente por ser uma proteína que apresenta muitas regiões de alça, sendo assim, a estrutura tridimensional proposta satisfaz as condições exigidas durante a evolução, considerando a estabilidade da estrutura das proteínas (ARNOLD et al., 2006).
O DFIRE analisa as interações atômicas, provendo pseudo-energias para os modelos as quais indicam a sua qualidade. Este valor para a presente proteína foi de -231,49.
4. CONCLUSÃO
O presente modelo encontra-se em processo final de validação para posteriormente ser depositado no banco de dados PDB (Protein Data Bank).
Através da elaboração do modelo tridimensional da proteína TtsI será possível realizar estudos de ancoragem e dinâmica molecular permitindo o estudo das interações moleculares presentes nesta proteína e com outras substâncias.
5. REFERÊNCIAS
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