CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU
Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 – UFU 30 anos
POLIMORFISMO RSA I DO GENE PIT1 EM SUÍNOS PIETRAIN E
LARGE WHITE APÓS SELEÇÃO DIVERGENTE
Thiago Felipe Braga1
Faculdade de Medicina Veterinária (FAMEV) da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Av. Mato Grosso, 3289 - bloco 2S. Campus Umuarama. Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
e-mail: thiagobraga86@gmail.com Robson Carlos Antunes2 robson@famev.ufu.br
Resumo: Este trabalho buscou identificar a existência de polimorfismo pela técnica de PCR-RFLP no gene PIT-1 e compará-lo nas linhagens materna e paterna em suínos da raça Pietrain e na linhagem paterna de Large White, que sofreram seleção genética divergente por mais de 30 anos. Foram utilizados 103 suínos, sendo 34 da linhagem paterna de Pietrain (oito machos e 26 fêmeas); 27 da linhagem materna de Pietrain (nove machos e 18 fêmeas) e 42 da linhagem paterna de Large White (11 machos e 31 fêmeas).As amostras de DNA foram extraídas do sangue destes animais e foram e foram amplificadas por PCR e genotipadas por RFLPusando a enzima de restrição RSA I. Observou-se 81,55% de animais com o genótipo AB, sendo; 40,80% da linhagem paterna de Large White; 33,00% da linhagem paterna de Pietrain e 26,20% da linhagem materna de Pietrain. 18,45% eram do genótipo AA, no qual 6,80% eram Large White; 3,90% da linhagem paterna de Pietrain e 7,75% da linhagem materna da mesma raça. Quanto
às freqüências alélicas encontrou-se 59,20% de alelos A e 40,80% de B. A seleção divergente
entre as linhagens paterna e materna de suínos Pietrain alterou a freqüência genotípica de PIT1 nesses animais, tendo o alelo B se fixado melhor na linhagem paterna levando a um maior desenvolvimento muscular e baixos índices de gordura que a materna. Já entre as linhagens paternas de Pietrain e Large White a freqüência não se alterou, e na primeira o gene expressa-se por meio do desenvolvimento muscular e na segunda pela velocidade de crescimento, considerada rápida nesta raça.
Palavras-chave: POU1F; gene candidato; PCR-RFLP; genotipagem.
1. INTRODUÇÃO:
A carne de suínos é a mais produzida no mundo, atingindo, segundo Roppa (2007), 104 milhões de toneladas, ou seja, 39% de toda a produção de carnes no ano de 2007. O Brasil ocupa o quarto lugar no ranking mundial, tendo produzido neste mesmo ano, de acordo com dados da ABIPECS (2008), mais de três milhões de toneladas, ficando atrás apenas da China, União Européia e Estados Unidos. Os números de consumo e comercialização de carne suína no Brasil, em 2007, confirmam uma tendência de fortalecimento e da
versatilidade do uso da carne suína na alimentação humana seja no preparo de cortes “in natura” ou na fabricação de um grande número de embutidos, salgados e defumados, que deverá garantir ao longo dos próximos anos a sua liderança mundial de consumo em relação às carnes de outras espécies.
De acordo com Roppa (1998), desde 1980 o suíno perdeu 31% de seu nível de gordura, 14% de calorias e 10% de colesterol. O percentual de carne magra na carcaça que era de 50% subiu para 56% a 58%, e espera-se que até a virada do milênio chegue aos 62%. No suíno atual, apenas 30% da gordura se encontra localizada fora de sua pele (toucinho), sendo que no interior dos músculos há apenas 1,1 a 2,4% de gordura; o que é o mesmo que no frango e ainda menor que nas carnes bovina (2,5%) e ovina (6,5%). O mesmo autor cita que a porcentagem de gorduras insaturadas (65%) é maior que a de saturadas (35%) no suíno atual, assim como o nível de colesterol contido na carne de um suíno moderno é semelhante ao de outras carnes (bovinos e aves). Mesmo quanto ao nível de calorias, as carnes suínas atualmente disponíveis ao consumidor atendem a demanda de um mercado consumidor cada vez mais exigente: ao consumir 150 gramas de lombo cozido, ingere-se cerca de 270 kcal, o que equivale a menos de meio hambúrguer (300Kcal); 150 gramas de batatas-fritas (400Kcal) ou uma fatia de 120g de pizza de calabresa (345Kcal).
O genoma suíno é composto por 19 pares cromossômicos, com comprimento de cerca de três bilhões de pares de bases de DNA, o que gera, tal como em humanos, um mapa em torno de 3000 cM (centiMorgans). A biotecnologia, por meio da identificação de genes associados às características de interesse econômico, principalmente aquelas de difícil mensuração ou de baixa herdabilidade, têm permitido avanços nos programas de melhoramento, por meio de uma seleção mais efetiva. As diversas técnicas de biotecnologia têm contribuído para o desenvolvimento de mapas genéticos saturados e a identificação de locos controladores de características quantitativas (QTL´s) (NINOV, 2006).
Para o desenvolvimento de marcadores moleculares, duas estratégias vêm sendo utilizadas, uma de certa forma aleatória e a outra dirigida. A primeira tem como objetivo inicial o desenvolvimento de um mapa genético para a espécie em questão. Nessa estratégia, marcadores são desenvolvidos para cobrir todo o genoma, para que, em uma segunda fase, sejam conduzidos estudos de correlação entre esses marcadores e as características desejáveis. Nos animais domésticos, o mapa está baseado principalmente em marcadores micros-satélites. A segunda estratégia baseia-se na detecção de polimorfismos associados a genes sabidamente importantes para as características que se pretende estudar (COUTINHO; REGITANO, 2001).
No caso do melhoramento animal, uma estratégia para identificação de genes que controlem características de interesse é feita por meio de estudos utilizando-se genes candidatos; que são genes de seqüência e ação biológica conhecida e que estão envolvidos com o desenvolvimento ou a fisiologia de uma determinada característica de interesse (BRYNE; MCMULLEN, 1996); cujas mutações possam ser associadas a uma determinada característica.
O gene PIT1, como exemplo de um gene candidato, se caracteriza por ser uma proteína de 291 aminoácidos e faz parte da família de domínio POU (PIT1, Oct1, Oct2, Unc86) que codificam proteínas envolvidas no desenvolvimento, entre elas um fator de transcrição restrito à porção anterior da glândula hipófise denominado Pit-1. Há fortes evidências da participação desse gene na ativação de outros genes hipofisários relacionados ao crescimento dos animais, como os genes do hormônio do crescimento (GH), da prolactina (PRL), da subunidade β do hormônio que estimula a tireóide (TSHβ) (TUGGLE; TRENKLE,
1996; YU et al., 1995; COGAN; PHILIPS, 1998), além de sua ação na ativação do próprio gene PIT1 (PARMENTIER et al., 1999).
A expressão do gene PIT1 tem relação com a expressão idade dependente, na qual os animais neonatos tiveram maior expressão em relação a quinze dias de idade e esta não foi diferente de trinta dias (SUN et al., 2002).
O fator transcricional PIT1 está envolvido na expressão do gene GHRHR e diferentes formas da proteína GHRHR são geradas por um mecanismo de processamento alternativo do RNA (MILLER et al., 1999). O DNA de PIT1, complementar ao RNA mensageiro de Pit-1 (PIT1cDNA) e/ou sequências genômicas foram clonadas em diversas espécies animais, inclusive em suínos. Em todas as espécies testadas, o gene PIT1 mostrou seis “exons” e cinco “introns”, medindo em torno de 1,6 a 2,0 kb e comportou-se como um loco único no genoma de vertebrados (INGRAHAM et al., 1988; OHTA et al., 1992). Conforme Andersson e outros (1994), o gene PIT1 está localizado no cromossomo 13 de suínos.
Estudos de associação entre características de desempenho e qualidade de carcaça em suínos e polimorfismos do gene PIT1 mostram que este pode ser considerado um gene candidato para QTLs nesta espécie (YU et al., 1995; YU et al., 1999; STANCEKOVA et al., 1999; BRUNNSCH et al., 2002).
O controle da expressão dos hormônios da hipófise é pouco entendido em suínos e a raça afeta os modelos de expressão dos hormônios especialmente entre raças comerciais e chinesas (SUN et al., 2002).
Existem várias teorias sobre sua origem da raça Pietrain, sendo todas baseadas em raças de constituição larga, forte e musculosa (PORTER, 1993). Os suínos Pietrain possuem pelagem cinza e branca com manchas pretas largas e irregulares, circuladas por um anel de pêlos brancos na pele pigmentada. As orelhas são eretas e voltadas para frente.
A raça caracteriza-se por alta porcentagem de carne magra, baixos índices de gordura, grande área de olho de lombo e maior conformação de carcaça nos pernis (ROTHSCHILD; RUVINSKY, 1998).
Já a raça Large White caracteriza-se por sua robustez, fácil adaptação ao sistema intensivo de produção, prolificidade, excelentes rendimento de carcaça, produção de presunto e bacon e rápido crescimento são muito usados em cruzamentos com Landrace. Os varrões são fortes e as matrizes possuem boa habilidade materna e vitalidade de leitões (PORTER, 1993).
2. METODOLOGIA:
Foram utilizados 103 suínos, sendo 34 da linhagem paterna de Pietrain (oito machos e 26 fêmeas); 27 da linhagem materna de Pietrain (nove machos e 18 fêmeas) e 42 da linhagem paterna de Large White (11 machos e 31 fêmeas). Coletaram-se amostras de sangue destes animais, por punção da veia jugular. A extração do DNA sangue foi realizada por meio do protocolo Master Mix.
Em seguida, realizou-se uma reação em cadeia de Polimerase (PCR). Utilizou-se a mesma sequência do par de primers de Yu e outros (1994) (5´AGTGTAGCCAGAGCATCT3´ (forward) e 5´ACCACATCTGCACACTCA3´ (reverse)) que amplificava uma seqüência de 1745 pares de bases (pb) dentro do gene PIT1 no suíno.
Com a conclusão da PCR, o produto amplificado foi visualizado em eletroforese em gel de agarose a 1,5% - TBE 0,5X, corado com brometo de etídio.
Para a verificação de polimorfismo entre os animais, foi realizada uma restrição enzimática com Rsa I, levando à formação de três fragmentos, compostos de 710, 388 e 322 pares de base cada, além dos fragmentos monomórficos de 774, 153 e 108 pares de base. Para tal, o produto da PCR necessitou ficar em overnight a 37ºC.
Em seguida, o produto da restrição enzimática com eletroforese em gel de agarose 3,5% - TBE 0,5X e corado com brometo de etídio foi visualizado. A genotipagem foi realizada pela visualização dos géis corados em um transiluminador de luz ultravioleta. Todos os animais apresentaram os fragmentos monomórficos de 774, 153 e 108 pares de base. Os considerados AA apresentaram a seqüência não-clivada, ou seja, uma banda de 710pb; nos AB havia três bandas, sendo elas de 710, 388 e 322pb e os animais BB possuíam as bandas de 388 e 322pb. Além destes todos os genótipos apresentam os fragmentos monomórficos de 774, 153 e 108pb.
Os genótipos obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste de x2 (Qui-quadrado) a uma significância de 0,05 (SOUNIS, 1985).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Após genotipados os 103 suínos Large White (linhagem paterna) e Pietrain (linhagens materna e paterna), foram encontrados as freqüências genotípicas (Tabela 1) e alélicas (Tabela 2) do gene PIT1. Observou-se 57,30% de animais com o genótipo AB, sendo; 26,20% da linhagem paterna de Large White; 18,50% da linhagem paterna de Pietrain e 12,60% da linhagem materna de Pietrain. 20,40% eram do genótipo AA, no qual 7,80% eram Large White; 4,80% da linhagem paterna de Pietrain e 7,80% da linhagem materna da mesma raça. E do genótipo BB foram relatados 22,30% dos animais, dos quais 6,80% eram Large White, 9,7% eram Pietrain linhagem paterna e 5,80% eram da linhagem materna da mesma raça. Quanto às freqüências alélicas encontrou-se 49,00% de alelos A e 51,00% de B.
Pierzchała, Blicharski e Kurył (2003) ao estudarem cruzamentos que incluíam as raças Pietrain e Large White observeram as seguintes freqüências genotípicas; 42.5% de AA; 48,8% de AB e 8,7% de BB.
Tabela 1: Determinação das freqüências genotípicas do gene PIT1 de 103 suínos das raças Pietrain (linhagens materna e paterna) e Large White (linhagem paterna)
Freqüências genotípicas
Raças AB % AA % BB % Total %
Pietrain (linhagem materna) 13 12,6 8 7,8 6 5,8 27 26,2 Pietrain (linhagem paterna) 19 18,5 5 4,8 10 9,7 34 33,0 Large White (linhagem paterna) 27 26,2 8 7,8 7 6,8 42 40,8
TOTAL 59 57,3 21 20,4 23 22,3 103 100
Tabela 2: Determinação das freqüências alélicas do gene PIT1 de 103 suínos das raças Pietrain (linhagens materna e paterna) e Large White (linhagem paterna)
Freqüências alélicas
Raças A % B % TOTAL %
Pietrain (linhagem materna) 29 14,1 25 12,1 54 26,2 Pietrain (linhagem paterna) 29 14,1 39 19,0 68 33,0 Large White (linhagem paterna) 43 20,8 41 19,9 84 40,8
TOTAL 101 49,0 105 51,0 206 100 Ao comparar as freqüências genotípicas das linhagens de Pietrain paterna e
materna encontrou-se diferença estatisticamente significativa (Tabela 3), na qual a linhagem paterna apresentou maior freqüência do genótipo AB, enquanto que a materna do AA. Estes resultados sugerem que o alelo B esteja associado ao desenvolvimento de massa muscular, pois com a seleção divergente os animais da linhagem paterna tendem a apresentar maiores índices musculares na carcaça e menores taxas de gordura que a linhagem maternas.
Pierzchała, Blicharski e Kurył (2003) observaram que suínos AA apresentam menor área de olho de lombo e maior quantidade de gordura em relação aos animais BB.
Tabela 3: Relação entre as freqüências genotípicas do gene PIT1 de 61 suínos das linhagens materna e paterna da raça Pietrain
Raças AB % AA % Total %
Pietrain (linhagem materna) 19 31,10 08 13,10 27 44,20 Pietrain (linhagem paterna) 30 49,20 04 6,60 34 55,80
TOTAL 49 80,30 12 19,70 61 100
Entre linhagens paterna de Pietrain e Large White não houve diferença significativa (Tabela 4). Acreditava-se que a expressão do gene PIT1 seria maior na raça Large White, uma vez que esta apresenta crescimento rápido, enquanto que, a Pietrain é de crescimento lento, sugerindo que na primeira este gene se expresse na velocidade de crescimento e na segunda, no desenvolvimento da massa muscular, características destas raças, respectivamente.
Tabela 4: Relação entre as freqüências genotípicas do gene PIT1 de 76 suínos das linhagens materna e paterna da raça Pietrain
Raças AB % AA % Total %
Large White (linhagem paterna) 35 46,00 07 9,20 42 55,20 Pietrain (linhagem paterna) 30 39,50 04 5,30 34 44,80
TOTAL 65 85,50 11 14,50 76 100
Diversos autores associaram o gene PIT1 à velocidade de crescimento e baixa quantidade de gordura em carcaças de suínos (ANDERSSON et al., 1994; WILKIE et al., 1996; MOSER et al., 1998). Sun e outros (2002) mostraram um efeito significante sobre o genótipo de PIT1 e os níveis circulantes de Hormônio do Crescimento (GH), assim como uma correlação positiva entre o mRNA deste gene e a concentração plasmática do GH. Yu e outros (1994) e posteriormente Kuryl e Pierzchała (2001) indicaram correlações entre os polimorfismos de PIT1 e características de gordura e deposição de carne em suínos. Além disso, Pierzchała, Blicharski e Kurył (2003) afirmaram que a importância biológica do PIT1 está associada à velocidade de crescimento e composição de carcaça em suínos.
A seleção divergente entre as linhagens paterna e materna de suínos Pietrain alterou a freqüência genotípica de PIT1 nesses animais, tendo o alelo B se fixado melhor na linhagem paterna levando a um maior desenvolvimento muscular e baixos índices de gordura que a materna. Já entre as linhagens paternas de Pietrain e Large White a freqüência não se alterou, e na primeira o gene expressa-se por meio do desenvolvimento muscular e na segunda pela velocidade de crescimento, considerada rápida nesta raça.
5. REFERÊNCIAS
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PIT1 GENE POLYMORPHISM IN PIETRAIN AND LARGE
WHITE PIGS AFTER DIVERGENT SELECTION
Thiago Felipe Braga1
Faculdade de Medicina Veterinária (FAMEV) da Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Av. Mato Grosso, 3289 - bloco 2S. Campus Umuarama. Bairro Umuarama, Uberlândia – MG.
e-mail: thiagobraga86@gmail.com Robson Carlos Antunes2 robson@famev.ufu.br
Abstract: Identifying polymorphisms in the PIT1 gene of 103 pigs and compare the maternal and paternal lineage of pietrain and large white breeds that suffered a divergent selection was the aim of this study. DNA samples extracted from the blood of these animals were amplified by PCR and genotyped by RFLP using the restriction enzyme Rsa I. Data were statistically analyzed by the qui-square test. 57.3% of genotype AB animals were observed, where 26.2% were of Large White paternal lineage; 18.5% were Pietrain paternal lineage and 12.6% were Pietrain maternal lineage. 20.4% were AA, where 7.8% were Large White, 4.8% were Pietrain paternal lineage and 7.8% were of the same maternal lineage breed, with 22.3% BB (6.8% were Large White paternal lineage; 9.7% were Pietrain paternal lineage and 5.8% maternal lineage). As for the allele frequency, 49.0% of A and 51.0% were B. In Pietrain maternal and paternal lineages, determining that the PIT1 gene had been fixed in the paternal lineage, suggesting that the B allele is associated to low body fat and better muscle development than maternal lineage. However, in the pietrain and large white paternal lineages no significant statistical difference was found.
