Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação de
rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Iara Maíra de Oliveira Viana1 Paula Rocha Chellini2
1Farmacêutica Industrial. Aluna da Pós-Graduação em Biociências Forenses, pela Universidade Católica de Goiás/IFAR
2Mestre em Estatística pela Universidade Federal de Minas Gerais. Farmacêutica Bioquímica pela Universidade Federal de Juiz de Fora.
Resumo
A tuberculose é um problema de saúde prioritário no Brasil, que juntamente com outros 21 países em desenvolvimento, concentram 80% dos casos da doença no mundo. Devido a frequentes recidivas e a multirresistência a fármacos, seu tratamento representa uma grande preocupação mundial. No intuito de aumentar a adesão do paciente ao tratamento e reduzir a resistência bacteriana, têm sido propostas formas farmacêuticas contendo associações de fármacos. Entretanto, ainda não existem métodos analíticos descritos em compêndios oficiais para análise de algumas dessas associações. Dessa forma, foi desenvolvido método analítico para determinação concomitante dos tuberculostáticos rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada. As análises foram realizadas em cromatógrafo Agilent® 1200 provido de detector ultravioleta (DAD) a 238 nm e coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm; 5 µm), mantida a 30 ºC; eluição em gradiente, sendo que na primeira etapa utilizou-se tampão fosfato pH 6,8: acetonitrila (95:5 v/v), e na segunda fase do gradiente utilizou-se a proporção de (1:1 v/v); fluxo de 1,2 mL/min e volume de injeção de 20 µL. O método desenvolvido foi validado em relação à linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez, conforme procedimentos recomendados pela Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA. A linearidade do método foi confirmada para rifampicina e para isoniazida na faixa de 80 a 120%, resultando em coeficiente de correlação superiores a 0,99. Além disso, os valores obtidos com os testes de precisão e exatidão foram satisfatórios.
Palavras-chaves: Tuberculostáticos. Rifampicina. Isoniazida. Cromatografia a líquido de alta eficiência.
Validação.
Abstract
Tuberculosis is a priority health problem in Brazil, which along with 21 other developing countries concentrate 80% of cases of the disease worldwide. Due to frequent relapses and multidrug resistance, its treatment is a major global concern. In order to increase patient adherence to treatment and reduce bacterial resistance, have been proposed dosage forms containing drug associations. However, there are no analytical methods described in official compendia for the analysis of some of these associations. Thus, was developed an analytical method for simultaneous determination of rifampicin and isoniazid in antituberculosis combined fixed dose tablets. Analyses were performed in chromatograph Agilent® 1200 equipped with an ultraviolet detector (DAD) at 238 nm and column Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm, 5 mm), maintained at 30 °C; gradient elution, where in the first step was used phosphate buffer pH 6.8: acetonitrile (95:5 v/v), and in the second step was used the ratio of (1:1 v/v); flow of 1.2 mL/min and injection volume of 20 µL. The method was validated with respect to linearity, precision, accuracy, selectivity and robustness according to procedures recommended by Resolution RE Nº 899 of May 29, 2003 of ANVISA. The linearity of the method was confirmed to isoniazid and rifampicin in the range of 80 to 120%, resulting in a correlation coefficient greater than 0.99. Furthermore, the values obtained with the precision and accuracy tests were satisfactory.
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose é uma doença infecciosa evitável e curável, causada pela bactéria
Mycobacterium tuberculosis. É transmitida de pessoa a pessoa através de perdigotos de
pacientes com doença respiratória ativa e sua forma mais comum é a pulmonar, podendo também ocorrer em outros órgãos ou tecidos [1].
Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de um terço da população mundial é infectado pela bactéria causadora da doença, entretanto, somente uma parcela desenvolve a tuberculose. Em 2010, a estimativa para a incidência global da doença foi de 128 casos por 100.000 habitantes. No Brasil, a incidência de tuberculose no mesmo ano foi de cerca de 43 casos por 100.000 habitantes. Pessoas com deficiência no sistema imunológico possuem maior risco de desenvolvê-la, o que explica sua alta incidência em portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV, do inglês Human Immunodeficiency Virus). A tuberculose é a principal causa de morte nesse grupo, correspondendo a aproximadamente um em cada quatro mortes de pessoas HIV positivas [1].
Por muito tempo, o tratamento da tuberculose no Brasil consistiu na associação de rifampicina, isoniazida e pirazinamida. Porém, após o segundo Inquérito Nacional, que aconteceu em 2009, notou-se um aumento da resistência à isoniazida. O Ministério da Saúde então propôs um novo sistema de tratamento da doença. As dosagens de pirazinamida e isoniazida foram reduzidas, introduziu-se um quarto fármaco (o cloridrato de etambutol) na etapa inicial do tratamento e formulou-se um comprimido com quatro fármacos de dose fixa combinada [2,3].
Atualmente o esquema básico para adultos e adolescentes consiste em dois meses de tratamento com rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol, seguidos de quatro meses de tratamento com rifampicina e isoniazida [2]. O tratamento preconizado para crianças (menores de dez anos) continua sendo com três fármacos [3].
A mudança no esquema de tratamento contra a tuberculose agregou benefícios como redução do número de comprimidos a ser ingerido pelo paciente, impossibilidade da utilização isolada dos fármacos e simplificação da gestão farmacêutica em todos os níveis [2]. O acréscimo de um fármaco aumenta a proteção contra a expressão fenotípica de possíveis mutações genéticas da bactéria Mycobacterium tuberculosis [3]. Além disso, a administração conjunta de medicamentos nos pacientes sensíveis, por meio de medicamentos dose fixa combinada ou formulação conjunta, assegura melhores picos séricos e facilita a sua supervisão [4].
A execução de ensaios analíticos garante que os medicamentos tenham qualidade assegurada [5]. Sem essa avaliação da qualidade, todo o tratamento pode ser comprometido. Entretanto, não existem métodos analíticos descritos na literatura para quantificação simultânea de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada. A Farmacopeia Brasileira 5ª edição e a Farmacopeia Britânica 2011 descrevem métodos analíticos para determinação da qualidade de comprimidos contendo apenas um dos fármacos, rifampicina ou isoniazida [6,7]. Já a Farmacopeia Americana 2012 descreve método para análise simultânea dos fármacos, porém para a forma farmacêutica cápsula [8].
Conforme Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA, o método analítico para quantificação do princípio ativo em produtos farmacêuticos, não descrito em farmacopeias ou formulários oficiais, deve ser validado [9]. Esse processo comprova, pelo fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos para a aplicação ou uso específico pretendido do método analítico foram atendidos [10]. É importante que todo método analítico tenha seu desempenho confirmado por meio de procedimentos de validação intralaboratoriais. Considerando que a validação por procedimentos interlaboratorias tem limitações, já que envolvem um alto custo e determinam principalmente a exatidão e a precisão dos métodos, a validação intralaboratorial é essencial para determinação de parâmetros de desempenho como linearidade, faixa de trabalho, seletividade, limite de detecção e limite de quantificação [11].
Segundo Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA devem ser avaliados os parâmetros especificidade, linearidade, intervalo, repetibilidade, precisão intermediária, exatidão e robustez durante a validação de método analítico para quantificação do princípio ativo em produtos farmacêuticos [9].
Considerando o exposto, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento e validação de método analítico para a quantificação simultânea de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde.
2 METODOLOGIA
2.1 Amostra
Foram utilizados comprimidos de dose fixa combinada de rifampicina e isoniazida (contendo 150 mg e 75 mg por comprimido de fármaco respectivamente) produzidos pela Lupin LTD e doados pela Secretaria de Estado da Saúde de Minas Gerais/Brasil.
2.2 Soluções
2.2.1 Solução tampão fosfato pH 6,8
No preparo da solução tampão pH 6,8 dissolveu-se de 1,4019 g de fosfato de sódio dibásico anidro em aproximadamente 600 mL de água ultrapura e em seguida transferiu-se para balão volumétrico de 1 L. Adicionou-se 1 mL de trietilamina e completou-se volume com água ultrapura. Ajustou-se o pH para 6,8 utilizando solução de ácido fosfórico diluído. Obteve-se, portanto, tampão fosfato de sódio dibásico 10 mM com trietilamina 0,1%.
2.2.2 Solução diluente
A solução diluente foi preparada pela mistura de solução tampão pH 6,8 e acetonitrila na proporção (95:5 v/v).
2.2.3 Solução amostra
Inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo rifampicina e isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se quantitativamente o equivalente a 1/10 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL. Adicionou-se cerca de 10 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução diluente.
2.2.4 Solução padrão 100%
Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina substância química de referência (SQR) e 15 mg de isoniazida SQR e transferiu-se para balão volumétrico de 200 mL. Adicionou-se cerca de 20 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução diluente. Obteve-se solução contendo 150 µg/mL de rifampicina e 75 µg/mL de isoniazida.
2.2.5 Solução padrão 200%
Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina SQR e 15 mg de isoniazida SQR e transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL. Adicionou-se, utilizando pipeta volumétrica, 5 mL de acetonitrila e cerca de 10 mL de solução tampão fosfato pH 6,8 e manteve-se a solução em banho ultrassom por 10 minutos. Completou-se o volume do balão volumétrico
com solução tampão fosfato pH 6,8. Obteve-se solução contendo 300 µg/mL de rifampicina e 150 µg/mL de isoniazida. Essa solução padrão 200% foi utilizada na construção da curva analítica.
2.3 Método de ensaio
No desenvolvimento e otimização do método analítico foram testados diversos tampões e proporções dos solventes da fase móvel, e a melhor condição de análise (Tabela 1) foi definida com base nos valores de fator de retenção, da resolução e do fator de cauda dos picos [12]. Os parâmetros cromatográficos otimizados foram: eficiência (número de pratos teóricos), tempo de corrida, composição e vazão de fase móvel, temperatura, volume de injeção e condições de detecção por espectrofotometria no ultravioleta (comprimento de onda). As análises foram realizadas em cromatógrafo a líquido Agilent® 1200 provido de detector de arranjos diodos (DAD).
Tabela 1 – Condições cromatográficas do método analítico para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Parâmetro Condições Cromatográficas
Comprimento de onda 238 nm
Volume de injeção 20 µL
Coluna Zorbax Eclipse XDB – C18 (150 x 4,6 mm; 5µm)
Temperatura 30 °C
Fluxo 1,2 mL/min
Fase móvel Tampão Na2HPO4 10 mM e 0,1% trietilamina (pH 6,8)
Acetonitrila
A eluição foi realizada em gradiente de acordo com as informações contidas na tabela 2, sendo o solvente A uma mistura de tampão e acetonitrila (95:5 v/v) e o solvente B acetonitrila.
Tabela 2 – Gradiente utilizado para possibilitar determinação simultânea de rifampicina e
isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Tempo (min) Solvente A Solvente B Eluição
0 – 2 100% 0% Isocrática
2 – 4 100% → 52% 0% → 48% Gradiente linear
4 – 7 52% 48% Isocrática
7 – 8 52% → 100% 48% → 0% Gradiente linear
2.4 Validação
Os parâmetros linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez foram estabelecidos em ensaios com soluções padrão e amostra. A adequação do método foi avaliada em função dos parâmetros de desempenho estabelecidos na Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA e respectivos critérios de aceitabilidade [9].
2.4.1 Linearidade
Preparou-se uma curva de calibração a partir de três soluções padrão 200% (contendo 300 µg/mL de rifampicina e 150 µg/mL de isoniazida), cujos níveis de concentração foram 80, 90, 100, 110 e 120%. Foram preparadas triplicatas independentes de cada nível por meio da transferência quantitativa de alíquotas dessas soluções padrão 200%, utilizando bureta de 10 mL, para balões volumétricos de 10 mL. Foram transferidos 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0 mL da solução padrão 200% para o preparo dos níveis de concentração 80, 90, 100, 110 e 120% respectivamente. Completaram-se os balões volumétricos com solução diluente. As soluções foram preparadas e analisadas em ordem aleatória.
A linearidade foi avaliada conforme descrito por SOUZA e JUNQUEIRA. Primeiro avaliou-se se o método dos mínimos quadrados ordinários era adequado. Foram testadas as premissas da regressão linear simples pelos testes de distribuição normal dos resíduos (teste de Ryan & Joiner), de homocedasticidade dos resíduos (teste de Brown & Forsythe) e independência dos resíduos (teste de Durbin-Watson). O gráfico dos resíduos da regressão foram construídos e examinados para investigação de perfis que indicassem heterocedasticidade ou desvio da linearidade [13, 14]. Os outliers foram verificados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife. O teste de Jacknife foi aplicado sucessivamente até que novos outliers não fossem encontrados ou até exclusão de, no máximo, 22,2% dos resultados em relação ao original [15]. Em seguida, a análise da variância (ANOVA) foi aplicada para avaliar o desvio da linearidade e significância da regressão. Quando não há desvio da linearidade e a regressão é significativa, conclui-se que o modelo linear é adequado [13, 14].
2.4.2 Seletividade
Seletividade foi avaliada em ensaios com soluções padrão 100%, amostra e branco. A solução padrão 100% e a solução amostra foram preparadas conforme item 2.2.4 e item 2.2.3 respectivamente. Já o branco consistiu apenas no preparo da solução diluente, conforme item 2.2.2, pois não foi possível identificar os excipientes presentes nos comprimidos de dose fixa combinada de rifampicina e isoniazida produzidos pela Lupin LTD. Após preparo, as três
soluções foram injetadas em cromatógrafo a líquido conforme descrito no item 2.3. Os perfis cromatográficos obtidos com a solução padrão 100% e solução amostra foram comparados, verificando se os tempos de retenção dos fármacos rifampicina e isoniazida eram semelhantes. O perfil cromatográfico do branco foi utilizado para identificar possíveis interferentes provenientes do diluente utilizado. Para isso o perfil cromatográfico do branco foi comparado com os perfis cromatográficos da solução padrão 100% e da solução amostra. Além disso, avaliou-se a pureza dos picos dos fármacos rifampicina e isoniazida com auxílio de detector de arranjo de diodos.
2.4.3 Exatidão e precisão
A exatidão e precisão do método analítico foram avaliados conforme Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA.
Devido à indisponibilidade dos constituintes da matriz do comprimido doado, optou-se por estudar a exatidão pelo método da adição de padrão. Assim, quantidades conhecidas de rifampicina SQR e isoniazida SQR foram adicionados ao medicamento, sendo preparadas soluções em três níveis de concentração 90, 100 e 110% com três réplicas de cada. Para o preparo dessas soluções, inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo rifampicina e isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se quantitativamente o equivalente a 1/25 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico de 50 mL. Adicionou-se 5, 10 e 15 mL de solução de padrão 100% recém preparada a cada balão volumétrico de 50 mL. Completou-se o volume dos balões volumétricos com solução diluente. Preparou-se também duas soluções amostra 80%. A partir das leituras das soluções amostra 90, 100 e 110%, soluções amostra 80% e da solução padrão 100% foi estimada a recuperação aparente. A recuperação deve ser entre 98 e 102% [16].
A precisão do método foi verificada através da precisão intracorrida e da precisão intercorrida. Em um primeiro dia foram realizadas seis determinações a 100% sob mesmas condições de análise (em um curto período de tempo e com o mesmo analista e equipamentos). Já em um segundo dia foram preparadas outras seis soluções amostra utilizando balança diferente e por outro analista. As precisões sob as duas condições (precisão intracorrida e precisão intercorrida) foram expressas em termos de desvios padrão relativos, sendo o critério de aceitação desvio padrão relativo menor que 5% [9].
2.4.4 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos [9]. Para avaliação da robustez do método variou-se três parâmetros: temperatura, fluxo e coluna cromatográfica. Os ensaios foram realizados de forma univariada conforme tabela 3 e os resultados foram comparados por meio de análise de variância (ANOVA). Foram necessários 3 dias de análise, sendo que em cada dia foram preparadas 3 soluções amostra e 1 solução padrão 100%. No primeiro dia as soluções foram injetadas nas condições dos ensaios de 1 a 3. No segundo dia foram preparadas novas soluções, que foram utilizadas nos ensaios de 4 a 6 e, em um terceiro dia, preparou-se soluções para realizar os ensaios 7 e 8. Os ensaios 2, 5 e 7 correspondem às análises nominais realizadas para servir de comparação para os demais ensaios. Os teores de rifampicina e isoniazida obtidos nos ensaios de 1 a 3 foram comparados entre si, bem como os ensaios 4 a 6, e os ensaios 7 e 8.
Tabela 3 – Ensaios realizados para análise da robustez do método analítico para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Parâmetro Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 Temperatura (ºC) 25 30 35 30 30 30 30 30 Fluxo (mL/min) 1,2 1,2 1,2 1,1 1,2 1,3 1,2 1,2 Lote da coluna 799511 8-595 799511 8-595 799511 8-595 799511 8-595 799511 8-595 799511 8-595 799511 8-595 993967 -902 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No desenvolvimento do método foram avaliados vários comprimentos de onda, utilizando o modo varredura (200 – 400 nm) do equipamento. Foi observado que o máximo de absorção da rifampicina ocorre no comprimento de onda de 238 nm e 338 nm, e o máximo da isoniazida em 265 nm. Como em 238 nm foram observados valores adequados de sinais para ambos os fármacos, esse foi o comprimento de onda selecionado.
Para escolha do pH foram testados diferentes tampões e avaliados os resultados de tempo de retenção, resolução ente os picos e o fator de cauda.
Os perfis dos gráficos de resíduos (Figura 1) demonstraram que não houve tendências óbvias, indicando que há bom ajuste ao modelo linear escolhido. Os intervalos de confiança dos resíduos sugeriram a presença de outlier apenas no gráfico do analito rifampicina, que foram confirmados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife, portanto não houve indicação de um número maior que 22,2% de outliers para cada curva.
Figura 1 – Gráficos de resíduos obtidos pelas curvas de cada fármaco, rifampicina e isoniazida. -200 -100 0 100 200 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 ei Concentração (%)
Gráfico de resíduos - Rifampicina
-100 -50 0 50 100 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 ei Concentração (%) Gráfico de resíduos - Isoniazida
A tabela 4, a seguir, contem os dados obtidos nos experimentos para avaliação da linearidade. Foi confirmado que os resíduos da regressão seguem a distribuição normal, são homocedásticos e independentes, que são as premissas da regressão linear. Dessa forma, o teste de F pode ser aplicado para avaliação da regressão e do desvio da linearidade. Além disso, obteve-se coeficiente de correlação (r) satisfatório na faixa de linearidade definida,
0,9979 para rifampicina e 0,9957 para isoniazida. Os resultados indicam que há bom ajuste ao modelo linear. A significância da regressão (p < 0,001) e desvios de linearidade não significativos (p > 0,05) determinaram linearidade na faixa de 80 a 120% para ambos os fármacos (Figura 2).
Tabela 4 - Estatísticas para avaliação da linearidade para as curvas da rifampicina e da isoniazida.
Estatística Rifampicina Isoniazida
Faixa de Linearidade
80% a 120% 120 a 180 µg/mL 60 a 90 µg/mL
Número de observações total
ninicial 15 15
Número de observações, após exclusão de
outliers n 14 15 Normalidade R 0,9780 0,9620 p p > 0,10 p > 0,10 Homocedasticidade tL 0,235 - 0,434 p p > 0,05 p > 0,05 Independência d 2,036 2,667 p p>0,01 p>0,01
Coeficiente de correlação da curva final
r 0,9979 0,9957 Regressão F 2843,104 1505,811 p p < 0,001 p < 0,001 Desvio da linearidade F 0,117 0,188 p p > 0,05 p > 0,05
ninicial = número de observações antes da avaliação de outliers; n = número de observações, após exclusão de outliers pelo teste Jacknife; R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner; p = significância; tL = estatística t de Levene; d = estatística de Durbin-Watson; r = coeficiente
de correlação da curva linear final obtida para cada fármaco e F = razão entre as variâncias (teste ANOVA).
Figura 2 – Gráficos finais da linearidade obtidos para cada fármaco, rifampicina e isoniazida. y = 58,989x - 94,613 R² = 0,9958 r = 0,9979 4000 4600 5200 5800 6400 7000 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 R e sp o st a Concentração (%)
Gráfico Final da Linearidade - Rifampicina
y = 18,98x - 5,5163 R² = 0,9914 r = 0,9957 1400 1600 1800 2000 2200 2400 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 R e sp o st a Concentração (%)
Gráfico Final da Linearidade - Isoniazida
O método analítico é seletivo e possui adequada resolução entre os picos (Figura 3). Nenhum pico é observado quando injetada a solução branco, indicando que não existem interferentes provenientes dos solventes utilizados na análise. Além disso, os perfis cromatográficos da solução padrão e da solução amostra, preparadas na mesma concentração, são semelhantes. Os tempos de retenção médios observados foram de 9,838 ± 0,373 minutos para rifampicina e de 3,041 ± 0,461 minutos para isoniazida obtidos pela injeção da solução padrão. Para a solução amostra, os tempos de retenção médios foram 9,810 ± 0,389 de
minutos para rifampicina e de 3,034 ± 0,480 minutos para isoniazida. O ruído observado na linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco é devido ao uso da eluição em gradiente (Figura 4).
Figura 3 – Cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco no teste seletividade
0 200 400 600 800 1000 1200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Padrão Amostra Branco Tempo (min) m A u
Figura 4 – Linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco no teste seletividade 0 25 50 75 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Padrão Amostra Branco Tempo (min) m A u
Tabela 5 – Desvios padrões relativos obtidos nas análises de soluções amostras preparados para avaliação do teste precisão
Parâmetro Rifampicina Isoniazida Precisão intracorrida 1º dia 0,56 % 2,01 %
Precisão intracorrida 2º dia 2,29 % 1,61 %
Precisão intercorrida 1,63 % 3,23 %
As concentrações médias esperadas e observadas, bem como as porcentagens de recuperação de cada fármaco, encontram-se na tabela 5. As porcentagens de recuperação dos fármacos rifampicina e isoniazida foram superiores a 98% e inferiores a 102% (Tabela 6) e os valores de DPR foram menores que 5%, portanto o método para análise simultânea dos dois fármacos não é inexato.
Tabela 6 – Concentrações médias esperadas e observadas e porcentagens de recuperação de cada fármaco obtidas no teste exatidão
Fármaco Nível de concentração Concentração esperada (mg/mL) Concentração observada (mg/mL) Recuperação (%) Rifampicina 90 % 0,1417 0,1404 99,1 100 % 0,1563 0,1535 98,2 110 % 0,1713 0,1699 99,1 Isoniazida 90 % 0,0653 0,0656 100,5 100 % 0,0727 0,0731 100,5 110 % 0,0804 0,0815 101,4
Na verificação da robustez do método analítico, constatou-se que pequenas variações de temperatura, no fluxo e no lote da coluna cromatográfica não impactam significativamente o método. Não houve diferenças estatisticamente significativas a 95% de confiança (p > 0,05). A tabela 7 apresenta o teor de cada fármaco obtido em cada ensaio. Além disso, ela apresenta os valores de F obtidos, valor de p e o F crítico correspondente a cada grupo de ensaios. Os ensaios foram realizados conforme descrito no item 2.4.4 e tabela 3: nos ensaios de 1 a 3 variou-se a temperatura, nos ensaios 4 a 6 variou-se o fluxo e no ensaio 8 utilizou-se coluna com lote diferente da coluna da validação. O resultado do ensaio 8 foi comparado com o resultado obtido com o ensaio 7. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que, quando
aplicado o método analítico para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada, a temperatura do método pode variar entre 30 ºC ± 5 ºC, o fluxo entre 1,2 mL/min ± 0,1 mL/min e que pode-se utilizar coluna cromatográfica de outro lote sem causar grandes variações no resultado analítico.
Tabela 7 – Resultados obtidos nos experimentos realizados para análise da robustez do método para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Estatística Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 Teor de Rifampicina 102,4% 102,0% 102,6% 102,6% 102,0% 102,0% 101,4% 101,4% F 6,457 x 10-1 5,272 x 10-2 1,485 x 10-2 p 0,557 0,949 0,909 Fcrítico 5,143 5,143 7,709 Teor de Isoniazida 99,7% 99,6% 99,7% 94,2% 94,2% 94,2% 92,4% 92,1% F 2,506 x 10-3 7,760 x 10-4 1,914 x 10-1 p 0,997 0,999 0,684 Fcrítico 5,143 5,143 7,709 4 CONCLUSÕES
O método analítico desenvolvido para quantificação simultânea de rifampicina e isoniazida em comprimidos dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde, é seletivo e específico e cumpriu com os requisitos de linearidade, precisão, exatidão e robustez. Esse método permitirá a verificação da qualidade dos comprimidos disponibilizados pelo Sistema Único de Saúde. Além disso, o novo método poderá ser útil no trabalho de verificação da qualidade dos produtos farmacêuticos realizado pelos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACENs) juntamente com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos da Faculdade de Farmácia da UFMG e ao Grupo de Revisão da Farmacopeia Brasileira 5ª edição pela colaboração no trabalho.
REFERÊNCIAS
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