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Proc. n" 2iJ i. ·:
Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a BUhli""· a
Universitária em ·n·:b. · '.f)4
Dissertação de Mestrado
ESTUDO DE PARÂMETROS DO PROCESSO CONTÍNUO DE
PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO
HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Ernesto Acosta Martínez
Lorena-SP-Brasil
1999
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
ESTUDO DE PARÂMETROS DO PROCESSO CONTÍNUO DE PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia Industrial '-·
-
Banca examinadora:
Dr. Silvio Silvério da Silva (Presidente) Dr. Francisco Maugeri Filho
Dr. Ismael Maciel de Mancilha Estudante:
Ernesto Acosta Martínez
Lorena-SP-Brasil
1999
ESTUDO DE PARÂMETROS DO PROCESSO CONTÍNUO DE
PRODUÇÃO DEXIUTOLA PARTIR DE HIDROUSADO
HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.
Dr
.
Silvio Silvério da Silva
Orientador e Presidente da Banca Examinadora
·
Lorena-SP-Brasil
momentos de distanciamento.
Aos meus pais Crist6bal
e
Dolores,e
meustrmso«
Taniae
Rodolfo, pelo carinhoe
grande incentivo.
Ao meu irmêo Alexei ("in memoriam"), por sempre me acompanhar.
Aos meus sogros Mirita
e
Mano/o.A todos eles por me darem forças para terminar meus estudos.
Estudo de Parâmetros do Processo Contínuo de Produção de Xilitol a partir
de Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-Açúcar. Ernesto
Acosta Martínez. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de
Engenharia Química de Lorena. Orientador Dr. Sílvio Silvério da Silva
(Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP,
Brasil).
O xilitol, um poliol que possui propriedades anticariogênicas, pode ser empregado como substituto do açúcar por pacientes diabéticos e no tratamento de pessoas deficientes da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase. )A produção de xilitol a partir da xilose presente em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar por Candida guilliermondii FTI 20037 foi avaliada em sistema
contínuo, utilizando-se um reator de bancada (BIOFLO Ili) com volume útil de
1,25 L de hidrolisado tratado e suplementado com nutrientes, a 30 ºC e agitação
300 rpm. Foram testadas diferentes condições de fermentação, determinadas por
três valores de pH (4,0, 5,5 e 7,0), de coeficiente volumétrico de transferência de
oxigênio (10, 20 e 30 h-1) e de vazão específica de alimentação (0,01, 0,03 e
b,05 h-1), de acordo com um planejamento fatorial completo 23 com face centrada.
Em seguida foi feita a quantificação dos níveis das variáveis significativas estudadas neste processo, mediante o uso da metodologia de superfície de resposta.
Constatou-se que o pH, a vazão específica de alimentação (D), a interação
entre estes dois fatores, assim como o termo quadrático de D, tiveram efeito
significativo sobre a produtividade volumétrica em xilitol (Op), ao nível de 5 % de
probabilidade. Também o termo quadrático do pH foi significativo ao nível de
1 O % de probabilidade. Entretanto, o efeito do kLa não se mostrou significativo
sobre Qp. A partir da análise estatística dos dados obteve-se um modelo
matemático para a produtividade volumétrica em xilitol, representado pela seguinte equação:
Qp
=
0,684 + 0,089 pH + O, 149 D - O, 119 pH2 - 0,299 02 + O, 104 pH.DR2
=
0.895Na condição de fermentação correspondente a pH
=
6,7 e D=
0,038 h-1,este modelo prevê um valor de produtividade igual a 0,72 g/L.h. A confirmação da
validade deste modelo foi realizada através de um experimento nesta condição e
empregando-se um kLa igual 20 h". Obteve-se uma produtividade de 0,68 g/L.h,
Study of Parameters of the Continuous Process of Xylitol Production from Sugarcane Bagasse Hemicellulosic Hydrolysate. Ernesto Acosta Martínez. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de
Lorena. Orientador Dr. Silvio Silvério da Silva (Departamento de Biotecnologia,
FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil).
Xylitol, a naturally occurring five-carbon polyalcohol with anticariogenic properties, can be used as a sugar substituta by diabetics and by glucose 6-phosfate dehydtogenase deficient individual. Xylitol production from xylose
present in sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate by Candida
guílliermondii FTI 20037 using the fermentation continuous system was evaluated.
The experiments were carried out in a bench reactor (BIOFLO Ili ) with 1.5 L of
treated hydrolysate supplyed with nutrients, at 30 ºC and 300 rpm. lt was evaluated different fermentation conditions defined by three values of pH (4.0, 5.5
and 7.0), oxygen coefficient transfer (10, 20 and 30 h"1) and dilution rate (0.01,
0.03 and 0.05 h·\ according to a central composite 23 factorial design.
Subsequently, the levels of these variables were quantified by the response surface methodology.
A statistical analysis of the results showed that the effect of pH and D, the interactions between these factors and the second-order effect of D, were statiscally significant on the xylitol volumetric productivity (Qp) at 95 % confidence level. Besides, the second-order effect of pH was also significant at 90 % confidence level. On the other hand, the effect of kLa on the response variable Qp was not significant. From the statistical analysis of the data, the following model
equation was obtained for the xylitol volumetric productivity:
Qp = 0,684 + 0.089 pH + 0.149 D -0.119 pH2 -0.299 02 + 0.104 pH.D
R2 = 0.895
The maximum value for Qp (0.72 g/L.h) was predicted by the model for
fermentations at pH = 6.7 and D= 0.038 h-1. The validity of the model was
confirmed through an experiment employing these values of pH and D, anda kLa
value of 20 h". A volumetric productivity of 0.68 g/L.h, which represents 95.8 % of
À Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL) através do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) pela oportunidade de realização deste estudo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pelo apoio financeiro.
Ao meu orientador, Dr. Sílvio Silvério da Silva, pelas sugestões fornecidas para a realização deste trabalho, pelo respeito e pela confiança depositada em mim.
Aos pesquisadores e amigos Maria das Graças, Inês e Adalberto pelas sugestões e apoio recebido.
Aos professores Dr. João Batista e Dr. Arnaldo Márcio pela amizade, companheirismo e incentivo recebido.
Aos amigos Tihany, Rita, Lourdes, Paulinho, Andersen, Carla, Ana Maria, Márcia, Mauro, Andrea, Eliana, Robertinho, Luciano, 81 e 82, Francislene, Ely, Silgia, Zea, Denise, Angela, Marcelo, Yovanka e Mabel, pelos ensinamentos de vida e pelos momentos de alegria e de tristeza compartilhados.
Aos amigos do ICIDCA, Irene, Mercedes, Manganelly, Tania, Pi!ar, Bell,
Pepe, Maria Elena e Nancy pela constante preocupação.
Ao Ministério dei Azúcar (MINAZ) e ao ICIDCA pelo respeito e pela confiança depositada em mim, assim como pelo apoio financeiro.
À lrani, Valkíria, Ana Márcia, Jussara, Lucinha, Eunice, Cristina, Ludmila e Terezinha, por seu apoio e amizade incondicional.
A todos os funcionários do DEBIQ e "companheiros" da FAENQUIL que não foram citados, mas que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
LISTA DE
SIMBOLOS
, VLISTA DE FIGURAS
vi
LISTA DE TABELAS
viii
1.
INTRODUÇAO
-
1
2. REVISÃO
BIBLIOGRAFICA
,3
2.1. Biomassa Lignocelulósica 3
2.2. Xilitol 6
2.2.1. Propriedades
e
aplicações 62.2.2. Métodos de Obtenção do Xilitol ...•....••..•.•.••••..•.•.•..•... 8 2.2.2.1. Obtenção de Xilitol por Via Química 8 2.2.2.2. Obtenção de Xilitol por Via Microbiológica ..•...•...•..•..•... 1 O
2.3. Processo de Fermentação Contínua ...•..•.•..•...•.•...•... 18
,
3.
MA TE RIAIS E METODOS
23
3.1. Preparo do Bagaço de Cana-de-Açúcar para a Hidrólise .•... 23 3.2. Obtenção do Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-
Açúcar 23
3.3. Tratamento do Hidrolisado para Fermentação .•...•...•... 24
3.4. Microrganismo 24
3.5. Preparo do lnóculo 24
3.8. Elaboração e Confirmação do Modelo 30
3. 9. Métodos Analíticos 30
3.9.1. Determinação de Concentrações de Carboidratos e Ácido
Acético 31
3.9.2. Determinação de Concentração Celular 31
3.9.3. Determinação das Concentrações de Furfural e Hidroximetil-
furf'ural 32
3.9.4. Determinação do Coeficiente Volumétrico de Transferência de
Oxigênio 32
3.1 O. Determinação de Parâmetros Fermentativos 33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...•... 34
4.1. Caracterização parcial e tratamento do hidrolisadohemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar 34
4.2. Ensaios em regime descontínuo 36
4.3. Efeito do pH, kLa e D sobre a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar para a produção de
xilitol pela levedura Candida guilliermondii ...•... 39
5.
CONCLUSOES
··=···ª···li···
67
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
69
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
Símbolo Definição Unidade
kLa Coeficiente volumétrico de transferência de h-1
oxigênio
YP,s Fator de rendimento em xilitol formado em g/g
relação a xilose consumida
YXJs Fator de rendimento de células produzidas g/g
em relação a xilose consumida
Qp Produtividade volumétrica em xilitol g/L.h
Qe Produtividade específica g/g.h
E Eficiência de fermentação %
D
Vazão específica de alimentação h-1tr Tempo de residência h
C* Concentração de oxigênio dissolvido na %
saturação
Co Concentração de oxigênio no tempo
to
%e
Concentração de oxigênio no meio de %cultura CV Causa de variação GL Graus de liberdade SQ Soma de quadrados QM Quadrado médio p Nível de significância
FIGURA 1- Possíveis tecnologias para a produção de xilitol (PARAJÓ
et
ai.,
1998a) 9FIGURA 2- Esquema proposto para a fermentação de xilose por
leveduras (HAHN-HÃGERDAL
et ai.,
1994) 12FIGURA 3- Esquema simplificado do sistema fermentativo empregado
para fermentação contínua 27
FIGURA 4- Sistema experimental empregado para fermentação contínua ... 28 FIGURA 5- Concentração de glicose (g)(•), xilose (S)(•), arabinose (a)(•),
xilitol (XOH)(.,), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular(X) (+), durante fermentação descontínua do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida
guil/iermondii FTI 20037, em kLa
=
30 h" 37 FIGURA 6- Concentrações xilose (S)(•), arabinose (a)(•), xilitol (XOH)("),ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+) durante fermentação contínua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-a~úcar _por Candida guil/iermondii FTI
20037 em pH 4,0 e kLa - 10 h 41
FIGURA 7- Concentrações xilose (S)(•), arabinose (a)(•), xilitol (XOH)(.,), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+) durante fermentação contínua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-a~úcar _por Candida guilliermondii FTI
20037 em pH 4,0 e kLa - 30 h 42
FIGURA 8- Concentrações de xilose (S)(•), arabinose (a)(•), xilitol (XOH)("), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+) durante fermentação contínua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida guilliermondii FTI
20037, em pH 7,0 e kLa
=
10 hº1 43FIGURA 9- Concentrações de xilose (S)(•), arabinose (a)(•), xilitol (XOH)(.,), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+) durante fermentação contínua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida guilliermondii FTI
20037, em pH 7,0 e kLa = 30 hº1 44
FIGURA 10-Gráfico de probabilidade normal para o parâmetro produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, segundo o planejamento fatorial
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida
guilliermondii FTI 20037 em pH 5,5, kLa 20 hº1 e D
=
0,03 h-1(Repetições do ponto central: A, 8 e C) 53
FIGURA 12-Concentrações de xilose (S)(•), arabinose (a)(A), xilitol (XOH)("'), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+)
durante fermentação continua de hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por C.
guil/iermondii FTI 20037 nas condições de kLa
=
20 h-1 e D=
0,03 h" ··· 56 FIGURA 13- Concentrações de xilose (S)(•), arabinose (a)(A), xilitol(XOH)("'), ácido acético (aa)(•) e crescimento celular (X)(+)
durante fermentação continua de hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por C.
guil/iermondii nas condições de kLa 20 hº1 e pH 5,5 57
FIGURA 14- Distribuição de resíduos do modelo proposto (Y) que representa a produtividade volumétrica (Qp) em xilitol na fermentação continua de hidrolisado hemicelulósico de
bagaço de cana-de-açúcar por C. guilliermondii FTI 20037 62
FIGURA 15- Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo modelo proposto (Y), que representa a produtividade volumétrica em xilitol em fermentação continua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por
e.
guilliermondii FTI 20037 63 FIGURA 16- Concentrações de xilose (S)(•), arabinose (a)(A), xilitol(XOH)("'), ácido acético (aa)(•), e crescimento celular (X)(+) em função do tempo, durante fermentação contínua de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por Candida guilliermondii FTI 20037 empregando-se pH 6, 7,
TABELA 1- Fatores e níveis utilizados no planejamento fatorial 29 TABELA 2- Matriz de planejamento fatorial completo 23 com face
centrada e três repetições no ponto central. 29
TA BELA 3- Cálculo dos parâmetros fermentativos 33
TABELA 4- Caracterização parcial do hidrolisado original e concentrado 3 e 6 vezes, e da fração destilada quando o hidrolisado foi
concentrado 6 vezes 34
TABELA 5- Parâmetros cinéticos das fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar por
C. guilliermondii, em sistema descontínuo, com kLa
=
30 h"1 epH controlado em 5,5 e 7 ,O 39
TABELA 6- Parâmetros fermentativos obtidos durante fermentação contínua do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii FTI 20037, em diferentes valores de pH, kLa e D, segundo o planejamento fatorial 23 completo 46 TABELA 7- Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para
o parâmetro produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. gui/liermondii, segundo o
planejamento fatorial 23 completo 49
TABELA 8- Análise de vanancia dos efeitos para o parâmetro produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, segundo o planejamento
fatorial 23 completo 49
TABELA 9- Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para o parâmetro produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, segundo o
planejamento fatorial 22 completo 51
TABELA 1 O- Análise de variância dos efeitos para o parâmetro produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, segundo o planejamento
fatorial 22 completo 51
TABELA 11- Parâmetros fermentativos obtidos durante fermentação contínua do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii, nos valores de pH, kla e D correspondentes ao ponto central do planejamento
experimentos realizados no ponto central 55 TABELA 13- Concentrações de arabinose (a), xilitol (XOH), ácido acético
(aa), células (x) e consumo de xilose (AS), Yp/s,Yx/s, Qp e s
obtidas por fermentação contínua do hidrolisado
hemicelulósico por C. guilliermondii no planejamento com
face centrada 59
TABELA 14- Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância para o modelo representativo da produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii, segundo o planejamento com
face centrada 60
TABELA 15-Análise de variância . dos efeitos, para o modelo
representativo da produtividade volumétrica (Qp) da bioconversão de xilose em xilitol por C. guil/iermondii,
segundo o planejamento com face centrada 61
TABELA 16- Análise de variância de regressão para o modelo representativo da produtividade volumétrica (Qp) da
bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii 61
TABELA 17- Parâmetros das fermentações de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar a xilitol utilizando diferentes
O presente trabalho é parte de um convênio de Cooperação técnico-
científica entre o Instituto Cubano de lnvestigaciones de los Derivados de la
Cana de Azúcar (ICIDCA), de Habana-Cuba, e o Departamento de
Biotecnologia - DEBIQ, da Faculdade de Engenharia Química de Lorena
(FAENQUIL). Um dos objetivos principais desta cooperação científica, além da formação de recursos humanos, é o desenvolvimento de uma tecnologia econômica de produção de xilitol por via fermentativa.
A comunidade científica está cada vez mais interessada nos problemas relacionados com a poluição ambiental. O desenvolvimento da agroindústria é
um fator relevante em relação a este problema, devido
à
grande quantidade deresíduos gerados anualmente. O uso destes resíduos como matéria-prima é de grande interesse para a obtenção de produtos de alto valor agregado. Dentre estes resíduos encontram-se o bagaço de cana-de-açúcar, uma fonte de açúcares de grande importância, destacando-se a xilose, a qual pode ser empregada como substrato para a obtenção biotecnológica de xilitol.
O xilitol é um adoçante com características importantes como a não formação de cáries e a capacidade de inibir o desenvolvimento das cáries já formadas, em indivíduos que o utilizam em sua dieta. O xilitol pode também ser utilizado em vários alimentos destinados a pacientes diabéticos, àqueles que apresentam problemas no metabolismo de gorduras e a pessoas obesas. Pode
também ser empregado como adjunto pós-operatório, dentre outras aplicações.
Atualmente, o xilitol
é
produzido por processo químico, mediante ahidrogenação catalítica da xilose extraída de plantas tais como "abedul" e
outros vegetais classificados como madeira dura e vegetação fibrosa. É sabido
que os custos deste processo são elevados, pois são requeridas várias etapas de purificação da xilose, altas temperaturas e pressões de trabalho, assim
A bioconversão da xilose em xilitol apresenta-se como uma tecnologia alternativa e promissora em relação ao processo químico, pois a bioconversão
ocorre no próprio hidrolisado, diminuindo assim os custos relacionados com a
purificação do substrato. Além disto, este processo opera em condições mais brandas de temperatura e pressão.
Os processos fermentativos em regime de operação contínua apresentam vantagens em relação ao sistema fermentativo convencional, tais como alta produtividade, maior facilidade de instrumentação e automação, e operação em condições de regime estacionário, onde as células encontram-se em um mesmo estado fisiológico. Assim, a fermentação contínua é muito útil em estudos de otimização de meios, de mecanismos de regulação e de efeitos de parâmetros fermentativos sobre a formação de um produto desejado.
Desta forma, com o objetivo de contribuir para o desenvolvimento de
uma tecnologia que visa a utilização de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar para a produção biotecnológica de xilitol, o presente · trabalho teve como objetivo avaliar o desempenho do sistema contínuo para esta fermentação. Neste caso, procurou-se determinar o efeito da vazão específica de alimentação, do pH e da aeração sobre o consumo de xilose, sobre a produção de xilitol e sobre os parâmetros fermentativos: produtividade volumétrica em xilitol e fator de conversão de xilose em xilitol. Além disso, teve como objetivo também obter um modelo matemático representativo para a resposta produtividade volumétrica em xilitol.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biomassa Lignocelulósica
Grandes quantidades de resíduos vegetais e agro-industriais são gerados e acumulados anualmente na natureza, ocasionando sérios problemas de poluição ambiental e perdas de fontes potenciais de alto valor (BISARIA, GHOSE, 1981, MOLWITZ et ai., 1996). As atividades florestais podem causar uma variedade de impactos sobre o meio ambiente. Entre estas, a monocultura florestal tem um peso considerável, visto que simplifica o ecossistema e o deixa vulnerável a doenças e outros fatores ambientais (U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENGY, 1995).
Os materiais lignocelulósicos são os compostos orgânicos de maior . abundância na biosfera, tendo uma produção anual estimada de 1 O a
50 x 109 t, o que corresponde a aproximadamente 50 % da biomassa no mundo
(KUHAD, SINGH, 1993). O aproveitamento dos resíduos vegetais e agro- industriais como substratos em processos biotecnológicos é uma alternativa atrativa e promissora, uma vez que esses materiais são abundantes e de baixo custo. Dentro deste contexto, diversos pesquisadores têm buscado desenvolver formas de utilização destes materiais e diminuir a contaminação ambiental (CHEN, ANDERSON, 1980, BISARIA, GHOSE, 1981; ROBERTO et
ai., 1994; ROBERTO et ai., 1996).
A biomassa lignocelulósica é composta basicamente por celulose, hemicelulose, lignina e pequenas quantidades de extrativos e sais minerais (D'ALMEIDA, 1988; FENGEL, WEGENER, 1989; HON, SHIRAISHI, 1991; KHUAD, SINGH, 1993; HON, 1996).
A celulose, o material orgânico mais abundante da terra, é um polímero linear de unidades de glicose, unidas através de ligações glicosídicas f3(1-+4), com regiões altamente ordenadas ou cristalinas na sua estrutura. Esta fração é composta por unidades monoméricas de celobiose, a qual é formada pela
junção de duas moléculas de glicose com a eliminação de água, através das hidroxilas ligadas aos carbonos 1 e 4. Este dímero se repete constantemente, apresentando o oxigênio que liga os anéis, na posição equatorial (FENGEL, WEGENER, 1989, KUHAD; SINGH, 1993).
A hemicelulose pode representar até 40 % do material da parede celular dos vegetais (BISARIA, GHOSE, 1981; GONG et ai., 1983; FERRARI et ai.,
1992). É um polímero de baixo peso molecular em relação à celulose e está
composto principalmente por pentases (xilose e arabinose) e hexoses (galactose, manose e glicose), além de apresentar pequenas quantidades dos ácidos acético e urânico (BISARIA, GHOSE, 1981; FENGEL, WEGENER, 1989; KHUAD, SINGH, 1993). A decomposição da fração hemicelulósica da
madeira resulta na produção de furfural e ácido acético, devido à degradação
da molécula de hemicelulose e dos grupos acetil, respectivamente (FRAZER, McCASKEY, 1989). Em geral as plantas e as madeiras duras são mais ricas em pentasanas, enquanto que as hexases predominam nas madeiras moles · (JEFFRIES, 1983; FENGEL, WENEGER, 1989).
A lignina é o terceiro maior componente na parede celular dos vegetais, e possui uma estrutura polifenólica complexa constituída basicamente dos álcoois cumarílico, coniferílico e sinapílico, e não é fermentescível (LADISCH,
1979; BISARIA, GHOSE, 1981 ). A lignina dificulta a degradação microbiana da
celulose e da hemicelulose, e atua como suporte para as fibras de celulose (FENGER, WEGENER, 1989; KUHAD, SINGH, 1993).
Existe ainda uma fração menor formada basicamente por compostos fenólicos e resinas que comumente são chamados de extrativos, pois podem ser extraídos com solventes orgânicos e água, e compreendem cerca de 2-4 % do material lignocelulósico (D'ALMEIDA, 1988; FENGER, WEGENER, 1989).
É interessante ressaltar que todos os constituintes da biomassa estão íntimamente associados e/ou ligados químicamente, construindo todo o complexo celular (FENGER, WEGENER, 1989).
O bagaço de cana-de-açúcar é um típico resíduo lignocelulósico muito abundante em países como Brasil, Cuba, Índia, Barbados e Irlanda, uma vez que nestes países a indústria açucareira é de grande significância comercial.
De acordo com MACEDO (1998), a produção de cana-de-açúcar no Brasil, na
safra 1996/97, foi de 273 x 106 ton. Para cada tonelada de cana processada,
obtém-se de 180 a 280 Kg de bagaço (SANTANA, SOUZA, 1984), o qual contém aproximadamente 33 % de celulose, 30 % de hemicelulose e 29 % de lignina (KUHAD, SINGH, 1993). Apesar deste resíduo ser utilizado como combustível nas indústrias sucro-alcooleiras, alimentícias, papeleiras e químicas (MACEDO, 1998), grandes quantidades são acumuladas anualmente na natureza, aumentando os problemas ambientais, além de significar uma perda de potenciais fontes de valor energético (BISARIA, GHOSE, 1981 ).
Segundo FUNK (1975) e JEFFRIES (1985), a hidrólise ácida dos materiais lignocelulósicos permite extrair até 80 % das pentases presentes na fração hemicelulósica em forma de xilose, o que torna vantajosa a utilização
destes materiais como matéria-prima para processos de bioconversão.
Um aproveitamento integral e mais eficiente dos materiais
lignocelulósicos pode ser conseguido mediante a separação das principais · frações lignocelulósicas em moléculas mais simples (PARAJÓ, et a/.,1998b). Processos tais como hidrólise ácida (FUNK, 1975; LADISCH, 1979), enzimática
(BISARIA, GHOSE, 1981; PARAJÓ et ai., 1997), explosão à vapor (SCHULTZ
et ai., 1984) e extração com soluções alcalinas (du TOIT, 1984), são métodos
que permitem a hidrólise da fração hemicelulósica em monossacarídeos. Esta fração é mais fácil de hidrolisar que os componentes celulósicos cristalinos da biomassa, devido a sua estrutura heterogênea e ao seu baixo grau de polimerização (WINKELHAUSEN, KUZMANOVA, 1998).
Segundo FUNK (1975) o processo de hidrólise ácida pode ser conduzido mediante o uso de altas concentrações de ácido mineral, a temperatura ambiente ou a baixas temperaturas, ou pelo emprego de ácido mineral diluído e altas temperaturas e pressões. Entretanto, para a utilização da hemicelulose, uma hidrólise a baixa temperatura é mais conveniente, pois impede a degradação da xilose, formando produtos que podem ser fortes inibidores do metabolismo microbiano (Kim, Lee, 1987 citados por DOMINGUEZ et ai., 1997; WINKELHAUSEN, KUZMANOVA, 1998)
2.2. Xilitol
2.2.1. Propriedades e aplicações
O uso de adoçantes de baixo valor calórico vem aumentando a cada dia. Estes produtos oferecem benefícios psicológicos e fisiológicos, pois ajudam na redução e manutenção do peso, redução de cáries, de riscos associados com a obesidade e controle de diabetes. Dentre os adoçantes de baixo valor calórico encontra-se o xilitol (CCC, 1999).
O xilitol, um álcool pentahidroxilado de xilose, é um produto intermediário
do metabolismo de carboidratos nos seres humanos e em animais (MANZ et
ai., 1973; YLIKAHRI, 1979). Este pentiol é encontrado em frutas e vegetais em
concentrações muito baixas em comparação
à
concentração de sacarose emcana-de-açúcar, sendo antieconômica a sua extração a partir dessas fontes . (EMOOI, 1978).
Dentre as propriedades físico-químicas do xilitol encontram-se o poder adoçante equivalente ao da sacarose e um conteúdo calórico de 2,4 cal/g, equivalente a um terço do conteúdo calórico da sacarose e metade das calorias do sorbitol. Quando consumido em forma sólida ou cristalina, produz um frescor devido a seu calor de solução altamente negativo (-34,8 cal/g). Por
outro lado, o xilitol, devido à sua relativa baixa velocidade de absorção no
intestino, apresenta propriedades laxantes e, se consumido em grandes quantidades, pode causar diarréia osmótica (EMODI, 1978; CURTAYRES,
1980; GRENBY, COLLEY, 1983). Este efeito varia entre indivíduos e com a
forma em que o xilitol é consumido, sendo comparado ao sorbitol e a outros carboidratos de baixa absorção. O nível de tolerância é de 20 a 30 g/dose ou 50 g/dia, podendo ser aumentado se for ingerido em várias refeições diárias
(AMINOFF etal., 1978; EMODI, 1978; SANROMÁN etal., 1991).
Devido
à
ausência de grupos aldeídices ou cetônicos na molécula, oxilitol não participa de reação de escurecimento do tipo Maillard (MANZ et ai.,
1973; EMODI, 1978). Esta propriedade é desejada no processamento de
alimentos a temperaturas elevadas, onde essa reação é indesejável. O xilitol pode também substituir a lactose em alguns alimentos, podendo ser aplicado em casos de indivíduos intolerantes à este açúcar (MANZ et ai., 1973).
O xilitol é metabolisado independentemente da insulina, além de não
causar flutuações súbitas nos níveis de glicose no sangue. É não cariogênico,
pois não é metabolisado por microrganismos presentes na flora bucal, como por exemplo, Streptococcus mutans. Além disso, também é capaz de inibir o desenvolvimento de cáries já existentes (cariostático) (EMODI, 1978; MÃKINEN, 1979; AGUIRRE-ZERO et ai., 1993; NOTHENBERG, 1994). Por outro lado, segundo MÃKINEN (1979), o consumo deste poliol está associado a um ligeiro incremento nos níveis de atividade das glicosidases salivares, enzimas que produzem uma película fina que protege o esmalte dos dentes. Estas propriedades o tomam um produto de grande valor para as indústrias alimentícia, farmacêutica e odontológica, podendo ser utilizado em programas
de prevenção de cáries. Além disto, pode ser também empregado como
· substituto do açúcar na dieta de pacientes portadores de diabetes mellitus, bem como ser utilizado por pessoas com doenças biliares e renais, e também por pacientes obesos, uma vez que exerce um efeito normalizante sobre o metabolismo das gorduras (MANZ et ai., 1973). Segundo WANG e van EYS (1981) o xilitol pode ser utilizado também no tratamento de portadores de insuficiência de glicose 6-fosfato desidrogenase, a qual pode ocasionar anemia hemolítica. Este poliol é usado como componente nas transfusões de sangue para evitar choques após cirurgias. Como não reage com aminoácidos, pode ser utilizado na alimentação parenteral (FUNK, 1975).
O xilitol, em combinação com glicóis, é utilizado no campo da traumatologia para preparar poliésteres ramificados, como por exemplo, o hidroxipropil-xilitol, cujas propriedades mecânicas e termofísicas são semelhantes às das espumas de poliuretano, usadas para a imobilização de lesões traumatológicas (SANROMÁN et ai., 1991).
2.2.2. Métodos de Obtenção do Xilitol
O xilitol pode ser obtido pela extração sólido-líquido de frutas e vegetais, e a partir da 0-xilose obtida por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos (MELAJA e HÃMÃLAINEN, 1977). No segundo caso pode-se empregar dois métodos: síntese química, através da hidrogenação catalítica, e biosíntese, empregando-se leveduras e bactérias fermentadoras de pentases. Também pode ser obtido a partir da 0-xilose, utilizando microrganismos e/ou enzimas como catalisadores do processo de redução (OJAMO et ai., 1988; HEIKKILA et
ai., 1990; HEIKKILAeta/., 1991; HEIKKILAeta/., 1992; PARAJÔ eta/., 1998a).
A FIGURA 1 apresenta as possíveis tecnologias para a produção de xilitol, segundo PARAJÓ et ai. (1998a).
2.2.2.1. Obtenção de Xilitol por Via Química
O xilitol é atualmente preparado quimicamente através da hidrogenação catalítica da xilose, obtida por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos
(JAFFE et ai., 1974; HYVÔNEN et ai., 1982; DOMINGUEZ et ai., 1997; SILVA
et ai., 1998). Este processo envolve a etapa de obtenção da xilose, que pode ser feita através da hidrólise ácida do material lignocelulósico rico em xilana, ou por hidrólise enzimática, empregando enzimas com alta atividade xilanolítica e
celulolítica (BISARIA, GHOSE, 1981 ). Posteriormente, realiza-se a purificação
do hidrolisado para se obter uma solução de xilose pura. Este procedimento inclui operações com resinas de troca iônica, descoloração e fracionamento cromatográfico (PARAJÓ et ai., 1998b). As etapas seguintes compreendem a hidrogenação catalítica da xilose purificada na presença do catalisador níquel- Raney, que requer altas temperaturas ( 100-140 ºC) e pressões elevadas
(50 atm) (WISNIAK et ai., 1974). Em seguida, o material hidrogenado é
separado mediante filtração mecânica e separação cromatográfica e, posteriormente, é realizada a cristalização do xilitol obtido (MELAJA,
HÃMÃLÃINEN, 1977; HEIKKILA
et
ai., 1990; HEIKKILAet
ai., 1991; HEIKKILAXilose comercial Lignocelulósicos contendo xilana Frutos e vegetais agente de extração
l
Extração sólido-líquido catalisador (ácido)l ,...:..-.-...:.--Solução contendo xiloss
H2
produtos de reação enzimas e/ou
microrganismos
Separação/
puriflcaçâo Conversão Biotecnolégica
FIGURA 1- Possíveis tecnologias para a produção de xilitol (PARAJÓ et ai.,
Durante este processo ocorre a formação de diversos compostos indesejáveis, o que demanda a necessidade de várias etapas de purificação do produto, incluindo o uso de colunas de troca iônica com passos sucessivos e/ou uso de ácidos para precipitar a lignina. Estes procedimentos acarretam um elevado custo no produto final (HEIKKILA et ai., 1990; HEIKKILA et ai., 1992;
SILVA et ai., 1998). Estas características do processo abrem caminhos para o
estudo de novas tecnologias para a obtenção de xilitol.
2.2.2.2. Obtenção de Xilitol por Via Microbiológica
A via microbiológica de obtenção de xilitol se apresenta como alternativa à via química pois, como a bioconversão ocorre diretamente no hidrolisado, os custos de purificação dos hidrolisados hemicelulósicos ricos em xilose são inferiores (FELIPE et ai., 1993). Além disto, o processo microbiológico opera em condições mais brandas de pressão e temperatura, e seu emprego poderia reduzir os altos níveis de poluição ambiental e os gastos relacionados com tratamento de resíduos produzidos pela via química (MOLWITZ et ai., 1996,
WINKEHAULSEN, KUZMANOVA, 1998).
Existem bactérias, leveduras e fungos capazes de assimilar e fermentar a xilose, produzindo xilito!, etanol e outros compostos (WINKEHAULSEN, KUZMANOVA, 1998). Dentre estes microrganismos, destacam-se as leveduras, especialmente as do genêro Candída (BARBOSA et ai., 1988;
SILVA, AFSCHAR, 1994; VANDESKA et ai., 1995). Dentre estas, Candida
guilliermondii tem-se mostrado como uma levedura promissora para produzir
xilitol, tanto em meio sintético (SILVA et ai., 1996) quanto em hidrolisado de
materiais lignocelulósicos (ROBERTO et ai. 1996; FELIPE et ai., 1996a).
A bioconversão xilose-xilitol ocorre devido à ação das enzimas
intracelulares xilose redutase e xilitol desidrogenase, presentes nos microrganismos eucarióticos fermentadores de xilose, conforme demonstrado na FIGURA 2.
O primeiro passo do metabolismo de xilose é o transporte deste açúcar através da membrana celular. O fornecimento de oxigênio tem, aparentemente, um papel importante sobre a ativação ou indução do sistema de transporte de xilose (Skoog, Hahn-Hãgerdal, 1990 citados por HAHN-HÂGERDAL et ai.,
1994 ). Uma vez dentro da célula, a xilose é reduzida a xilitol pela enzima xilose
redutase (EC 1.1.1.21) dependente de NADPH (CHIANG, KNIGTH, 1960). O
xilitol é então excretado da célula ou oxidado a xilulose pela ação da enzima xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) dependente de NAD+ (JEFFRIES, 1985; VANDESKA et ai., 1995). A xilulose é fosforilada a xilulose 5-fosfato pela
xilulose quinase (EC 2.7.1.17) (LEE et ai., 1996), e, desta forma, entra na via
das fosfopentoses (NOLLEAU et ai., 1993) que, em conexão com a via glicolítica, gera as coenzimas necessárias para as etapas iniciais do
metabolismo da xilose. Na via das pentases fosfato, a D-xilulose-5-fosfato é
convertida em gliceraldeído 3-fosfato e frutose 6-fosfato, através de rearranjos não oxidativos. Estes são transformados em piruvato pela via Embden · Mayerhof Parnas (EMP). O piruvato é um composto intermediário entre a via fermentativa e a via oxidativa das células. Na presença de oxigênio, o piruvato é oxidado através do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e a cadeia respiratória, onde ocorre a fosforilação oxidativa (HAHN-HÂGERDAL et ai., 1994 ).
A bioconversão de xilose em xilitol a partir de hidrolisados
hemicelulósicos ricos em xilose apresenta algumas limitações devido
à
presença de inibidores do metabolismo microbiano. Entre tais inibidores encontram-se o furfural, o hidroximetilfurfural e o ácido acético, provenientes da decomposição dos açúcares e dos compostos fenólicos de baixo peso molecular derivados da lignina. São também inibidores os íons metálicos: ferro, níquel, cobre e cromo, assim como alguns minerais, provenientes dos materiais lignocelulósicos, do solo ou da corrosão dos equipamentos de hidrólise ( JAFFE
et ai., 1974; LEE, McKASKEY, 1983; HEIKKILA et ai., 1992; PARAJÓ et ai.,
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u..O efeito destes compostos sobre a formação de xilitol por leveduras está
relacionado à sua concentração no meio e aos parâmetros fermentativos
associados à produção de xilitol, principalmente o pH e a aeração. A fim de
minimizar o problema de toxicidade dos hidrolisados sobre a fermentação, vários métodos têm sido utilizados para o tratamento dos hidrolisados, como por exemplo, a adsorção com resinas de troca iônica (MADDOX, MURRAY, 1983), a precipitação por alteração do pH com ácidos e bases (ROBERTO et
ai., 1991) e a adsorção com carvão ativo (ALVES, 1997).
Dentre as resinas empregadas para a remoção de ânions e cátions presentes nos hidrolisados hemicelulósicos encontram-se as de troca aniônica base débil Amberlite IRA-45 (van Zyl et ai., 1991) e Amberlite IRA-94 (DOMINGUEZ et ai., 1997) e as de troca catiônica fortemente ácida DOWEX 50W-X4 (van ZVL et ai., 1991; GONG et ai., 1993).
A precipitação por alteração do pH com ácidos e bases é outro método
utilizado para remoção de inibidores (ROBERTO et ai., 1991; HEIKKILÃ et ai.,
· 1992). ALVES et ai. (1998) estudaram o efeito do tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com os ácidos sulfúrico e fosfórico, e com as bases óxido e hidróxido de cálcio, sobre o metabolismo de xilose por Candida guil/iermondii, para a produção de xilitol. Os resultados mostraram que o emprego de ácido fosfórico favorece o aumento do fator de
conversão de xilose em xilitol e a produtividade. Por outro lado, o uso das
bases avaliadas não foi significativo, sendo preferido o uso de óxido de cálcio, por razões econômicas. O uso de hidróxido de potássio no tratamento deste hidrolisado diminuiu em 43 % o consumo de xilose por Candida guil/iermondii,
em relação ao uso de hidróxido e óxido de cálcio (ROBERTO et ai., 1991 ).
O emprego de carvão ativo foi relatado por vários autores como adequado para a remoção de compostos fenólicos, assim como para a clarificação de hidrolisados hemicelulósicos (ROBERTO et ai., 1991; GONG et
ai., 1993; WANG et ai., 1997; ALVES et ai., 1998). O tratamento de hidrolisado
hemicelulósico com carvão ativo não é adequado para a remoção de ácido
acético, conforme demostrado por ALVES et ai. (1998).
A toxicidade do ácido acético e do furfural para a levedura Candida
guilliermondii, durante a conversão de xilose em xilitol, foi constatada quando
estes estavam presentes em concentrações maiores que 4,5 g/L de ácido
acético (FELIPE et ai., 1995, FELIPE et ai., 1996a, FELIPE et ai., 1997) e que
1,0 gil de furfural (OJAMO et ai., 1988). O ácido acético, um potente inibidor
do metabolismo da xilose por leveduras (JEFFRIES, 1985; van ZYL et ai.,
1988; FERRARI et ai., 1992; FELIPE et ai., 1997), tem seu efeito relacionado
com a concentração da forma não dissociada e, portanto, dependente do pH do meio de fermentação. No pH ótimo para a fermentação por leveduras (pH 4,0- 5,0), este ácido, que se encontra sob a forma não dissociada, difunde livremente para o interior da célula (citoplasma), onde se dissocia, causando um decréscimo no pH intracelular (NODA et. ai., 1982; HERRERO et. ai., 1985). Como resultado, o gradiente de prótons na membrana citoplasmática não pode ser mantido, a produção de energia é desacoplada e o transporte de
vários nutrientes é prejudicado (KO et. ai., 1975; HERRERO et. ai., 1985). Em
· outros estudos, realizados por SILVA (1994), verificou-se que em pH 4,0 a conversão xilose-xilitol, em meio sintético sem ácido acético, ocorre com uma eficiência de 76,3%. Entretanto, FELIPE (1994) observou que nenhuma
bioconversão ocorre quando a levedura C. guilliermondii cresce em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar contendo ácido acético em concentrações maiores que 5 gil, em pH inferior a 4,5.
O furfural é outro composto que pode inibir a utilização de açúcares presentes nos hidrolisados hemicelulósicos pelos microrganismos. Este
composto é formado pela degradação da xilose durante o processo de
hidrólise, e sua formação depende da intensidade das condições de concentração de ácido e de temperatura de reação. Segundo PARAJÓ et ai. (1997a), o furfural pode ser inibitório para o crescimento da levedura
Debaryomyces hansenii Y-7 426, cultivada em hidrolisado de madeira, em
concentrações entre 1,3 e 3,2 gil. No entanto, concentrações menores que 2 gil foram relatadas como tendo efeito prejudicial mínimo sobre a
fermentação. A enzima álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) é responsável pela
respiratória pois têm efeito sobre a síntese de citocromos e sobre a velocidade de crescimento das células, respectivamente. De acordo com SILVA et ai. (1997), concentrações de furfural de até 0,5 g/L não influenciam o desenvolvimento da levedura C. guilliermondii em meio complexo.
Concentrações de furfural entre 0,2 e 1 g/L favoreceram a conversão de xilose
. em xilitol por C. guil/iermondii (Farmos-Yhtyma, 1988, citado por PREZIOSI-
BELLOY et ai., 1997).
O hidroximetilfurfural, por ser muito reativo, está usualmente presente em hidrolisados hemicelulósicos em baixas concentrações. CHUNG, LEE (1985) relataram que uma concentração de hidroximetilfurfural de O, 11 % e seu efeito interativo com o furfural (0,08 %) e com outras toxinas, podem, além de inibir o crescimento celular, causar a morte das células. Segundo FELIPE et ai.
(1996a), o efeito inibitório destes compostos é mais acentuado quando se emprega baixos níveis de inóculo (2,4x106 cel/mL) durante a fermentação de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guil/iermondii. Nesta condição de inóculo, observou-se uma diminuição de 46 % da viabilidade celular, sendo que houve um incremento de 25 % na quantidade de células quando se empregou maior nível de inóculo (1,2x108 cel/mL). Por outro lado, estudos realizados por PREZIOSI-BELLOY et ai. (1997), mostraram que concentrações de 1,5 g/L de hidroximetilfurfural tiveram um efeito ligeiramente estimulante sobre a produção de xilitol em meio sintético, pela levedura Candída parapsilosis.
O conhecimento do efeito do pH sobre a produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar é importante pois, dependendo do pH de fermentação, o efeito tóxico do ácido acético é acentuado ou a solubilidade de alguns nutrientes no meio pode ser afetada, tornando impossível a sua assimilação (NODA et ai., 1982; SANCHEZ et el., 1997; FELIPE et ai., 1997). Em geral, as leveduras crescem melhor em meio ácido, em valores de pH entre 3,5 e 3,8, sendo que os limites de tolerância para várias espécies variam entre 2,5 e 8,0 (SILVA et ai., 1997a). Estudos realizados por FELIPE (1994) demostraram que o pH inicial para a produção de xilitol por C. guilliermondíi está na faixa de 5,5 a 6,5. Em outros estudos realizados com esta mesma cepa verificou-se que em fermentações de
hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar para produção de xilitol, o pH aumentou constantemente, atingindo valores finais da ordem de pH 8,0
(PFEIFER et ai., 1996). Isto sugere que o microrganismo usa o ácido acético
como fonte de carbono, o que reforça os resultados obtidos por FELIPE et ai.
(1995) e MARTINEZ et ai. (1999). Estudos realizados por FELIPE et ai. (1997),
com C. guil/íermondii crescendo em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de
cana-de-açúcar, constataram que em pH de fermentação inferior a 4,5, o
consumo de glicose, xilose e arabinose, assim como a produção de xilitol e o crescimento celular, foram inibidos. Entretanto, em pH superior a 5,5 o microrganismo produziu xilitol com rendimento e produtividade iguais a O, 75 glg e 0,57 gll.h, respectivamente.
A aeração é o principal fator que influencia a produção de xilitol por leveduras (MOLWITZ et ai., 1996; SILVA et ai., 1996). O oxigênio fornecido através da aeração é utilizado na respiração, transporte de açúcar, regeneração de coenzimas, produção de ATP durante a fosforilação oxidativa e · no incremento da massa celular. Pequenas alterações na disponibilidade de
oxigênio ocasionam mudanças no metabolismo da levedura e
consequentemente alteram a excreção de xilitol. Segundo JEFFRIES (1983), esta influência parece estar relacionada com a regeneração dos cofatores essenciais para a atividade das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase
e, também, com a produção de ATP durante a fosforilação oxidativa.
Em condições aeróbias ocorre a maior produção de massa celular,
enquanto que em condições limitadas de oxigênio, uma grande parte da xilose
é convertida em xilitol (LIGHTELM et. ai, 1988; GROOTJEN et. ai., 1991;
WINKELHAUSEN, KUZMANOVA, 1998). A dependência do comportamento
fermentativo das leveduras em relação
à
disponibilidade de oxigênio pode serdevido ao fato de que sob condições anaeróbias, ou em taxas de transferência de oxigênio muito baixas, o sistema de transporte de elétrons é incapaz de oxidar completamente o NADH intracelular, ocasionando um aumento de sua concentração. Este aumento provoca uma alteração das concentrações de NADH e NAD+, permitindo a excreção de xilitol. O aumento da taxa de transferência de oxigênio favorece a fermentação de xilose. Este fato pode ser
devido ao papel do oxigênio como aceptor final de elétrons, que alivia a desproporção dos dois passos iniciais do metabolismo anaeróbio de xilose. Esta hipótese está sustentada pela relação inversa entre o grau de aeração e a produção de xilitol observada em algumas leveduras. Por outro lado, quando o oxigênio é fornecido em excesso, ocorre um desvio no fluxo de piruvato,
resultando em uma alta produção de massa celular (Laplace et ai., 1991, citado
porWINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998, PARAJÔ etal., 1998a).
Altos rendimentos em xilitol são observados sob condições de aeração e
agitação apropriadas (SILVA et ai., 1997a). Estudos realizados por SILVA et ai.
( 1996) relatam que a produtividade volumétrica em xilitol por C. guilliermondii
foi favorecida em 288 %, pelo aumento da agitação de 200 (kLa 5,3 h-1) para
300 rpm (kia 10,6 h-1). Entretanto, o aumento para 400 rpm (kLa 41 h-1)
provocou um incremento de 22 % no consumo de xilose e uma diminuição de
71 % na produtividade volumétrica em xilitol. SILVA et ai. (1997b), em
fermentação de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar pela
· levedura C. guilliermondii, obtiveram maiores valores de produtividade
volumétrica (0,87 g/L.h) e conversão de xilose em xilitol (0,67 glg), com coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio igual a 27 h" e agitação de 400 rpm.
O grau de inibição do metabolismo da xilose pelo ácido acético está principalmente relacionado com a concentração do ácido e a disponibilidade de
oxigênio (du PREEZ etal.,1991; SILVA, 1994, FELIPE etal., 1996b). A aeração
afeta significativamente a assimilação de ácido acético pelas leveduras. van
ZYL et ai. (1991), observaram um efeito favorável da aeração sobre o consumo
de ácido acético e xilose pela levedura Pichia stipítís, com diminuição de 56 %
da produtividade volumétrica em etanol, de 17 % da velocidade específica de
crescimento e de 33 % do fator de conversão de xilose em xilitol, sob condições limitadas de oxigênio. Em condições anaeróbias de cultivo não foi verificado consumo de ácido acético e o crescimento celular foi mínimo (140 unidades KLETT). Verificou-se também uma diminuição de 38 % da produtividade volumétrica. Entretanto, o fator de conversão de xilose em etanol (0,47 glg) não foi afetado pela presença de ácido acético.
Resultados encontrados por FELIPE et ai. (1996b) demostraram que, em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, a melhor
produtividade em xilitol (0,65 g/L.h) ocorre a 0,6 wm (volume de ar por volume de meio por minuto), condição em que as células adaptaram-se bem na
presença de concentrações de ácido acético em torno de 4,5 gil. Segundo
SILVA (1994) em condições de aeração de 20 mL de ar/min, em meio contendo
1,0 g/L de ácido acético, a produção de xilitol foi reduzida em 4,36 %. A
fermentação de xilose por Pichia stipitis foi também inibida pelo ácido acético (van ZYL et ai., 1991 ). Segundo estes autores, em concentrações de ácido acético na faixa de 0,8 a 13 g/L, pH 5, 1 e 6,5 respectivamente, em condições
anaeróbias, observou-se uma redução de 50 % na produtividade de xilitol.
A produção de xilitol por C. guilliermondii em sistema descontínuo de fermentação é influenciada significativamente pelo fornecimento de oxigênio, e elevados rendimentos em xilitol podem ser obtidos em condições ajustadas de coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) e de agitação · (OJAMO et ai., 1988).
2.3. Processo de Fermentação Contínua
A modalidade contínua de operação de reatores é muito utilizada na pesquisa e no desenvolvimento de vários processos biotecnológicos cujo objetivo é a obtenção de produtos de alto valor agregado (DAWSON, 1977). O processo contínuo apresenta várias vantagens em relação ao sistema descontínuo tradicional (AIBA, 1973). No processo contínuo em reator de mistura completa, sem reciclo de células, as células estão em um estado fisiológico definido e constante, quando em regime estacionário. Neste caso, a
velocidade específica de crescimento celular é igual à vazão específica de
alimentação. Neste processo obtém-se, também, produtividades volumétricas maiores em relação á fermentação descontínua, uma vez que consegue-se
uma redução nos tempos mortos de operação (AIBA, 1973, WANG et ai., 1979,
Este processo permite também operar em condições automatizadas, o que
possibilita obter produtos com qualidade constante (WANG et ai., 1979,
COONEY, 1986). Estas particularidades tornam a fermentação contínua muito útil para estudos de otimização de meios e determinação de mecanismos de regulação, assim como para o estudo dos efeitos de parâmetros fermentativos
sobre a formação de um produto desejado (AIBA, 1973, ACEVEDO, GENTINA,
1996).
Por outro lado, o emprego desta modalidade de fermentação apresenta desvantagens tais como a necessidade de um equipamento de maior complexidade, maior controle operacional, aproveitamento incompleto do
substrato e a possibilidade de que longos tempos de operação conduzam à
contaminação e mesmo á mutação espontânea da cultura (AIBA, 1973, WANG
et ai., 1979, ACEVEDO, GENTINA, 1996).
A concepção teórica de sistemas contínuos de mistura completa considera perfeita homogeneidade de seu conteúdo, ou seja, concentração de
· substrato, células e produto iguais na saída e dentro do biorreator. O
desenvolvimento deste sistema é expresso em termos da concentração de
células no estado estacionário e da concentração de substrato · como uma
função da vazão específica de alimentação ou do tempo de residência médio (COONEY e HUMPHREY, 1985).
As fermentações contínuas, de um modo geral, podem ser conduzidas em fermentadores tipo tanque agitado, tubular, de coluna ou de circulação, e podem operar em diferentes modalidades tais como: quimiostato de simples etapa ou multietapa e com recirculação de células ou de líquido, entre outras (WANG et ai., 1979, COONEY, HUMPHREY, 1985, GROTT et ai., 1993, KRUSE, SCHUGERL, 1996). Outros tipos de fermentadores, por exemplo,
· reator contínuo de leito fluidizado (possibilidade de crescimento microbiano em
películas superficiais), reator de células por microfiltração e fermentador "airlift" (possibilita altas velocidades de transferência de oxigênio) tem sido empregados nos estudos de fermentação contínua (DELGENES et ai., 1988,
NGUYEN, SHIET, 1992, WEUSTER-BOTZ, 1993, SILVA, 1994, ROCA et ai.,
têm sido desenvolvidos para estudar a concentração de coenzimas, a regulação de transporte de nutrientes, a variação da atividade enzimática com fornecimento de oxigênio e a regulação do metabolismo de nitrogênio,
potássio, sulfato, fosfato e magnésio como substratos limitantes, entre outros
(OAWSON, 1977, WANG et ai., 1979, TEMPEST, NEIJSSEL, 1980).
Além do desenvolvimento de novos processos biotecnológicos, a teoria
original de crescimento celular de Monod, referente à cultura contínua,
permanece virtualmente intacta (DAWSON, 1977). Esta teoria não considera mudanças fisiológicas que ocorrem na célula com as mudanças na velocidade de crescimento. Entretanto, existem muitos modelos e equações que poderiam adequar-se a diferentes situações de crescimento, mas estes podem ser
reconhecidos como simples modificações do modelo de Monod. Tais modelos
consideram outros efeitos como manutenção, inibição da velocidade específica de crescimento devido a altas e baixas concentrações de substrato, inibição pelo produto, emprego de vários substratos, metabolismo endógeno, cinética
· enzimática e metabólitos secundários (AIBA et ai., 1973, MOSER, 1985,
BAILEY, OLLIS, 1986).
Na literatura consultada verificou-se alguns estudos sobre a fermentação contínua de xilose para a produção de xilitol. Entretanto, nenhum estudo foi encontrado utilizando-se hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-
açúcar como substrato nesta bioconversão. Alguns destes estudos, realizados
em meio sintético, descrevem o efeito da vazão específica de alimentação (D)
sobre a formação de xilitol. FURLAN et ai. (1991 ), em ensaios com a levedura
Candida parapsilosis, empregando uma taxa constante de aeração de 0,3 wm,
verificaram que o aumento da vazão específica de alimentação de 0,055 para
O, 139 h-1 resultou em um aumento da velocidade específica de formação de
xilitol de 0,018 para 0,032 g/g.h. Entretanto, o fator de rendimento em xilitol foi reduzido de O, 16 para O, 11 g/g. Para um valor de D igual a 0,060 h", um
aumento da taxa de aeração de O, 15 vvm (kLa
=
1 O, 1 h-1) para 0,60 wm(kLa
=
26,6 h-1) resultou numa redução na velocidade específica de formaçãode xilitol de 0,062 para 0,009 g/g.h, assim como no fator de rendimento em xilitol de 0,31 para 0,08 g/g.
Segundo SILVA (1994), em fermentação contínua com C. guilliermondií,
em meio sintético, utilizando-se um . reator de leito fluidizado, a máxima
produtividade volumétrica de xilitol (1, 12 g/L.h) e o maior fator de rendimento (0,60 g/g) observados, ocorreram em uma vazão específica de alimentação
igual a 0,027 h-1.
WINKELHAUSEN et ai. (1996), em cultivo de Candida boídínii em xilose,
com uma vazão específica de alimentação de 0,05 h-1, observaram que
concentrações de oxigênio dissolvido de 2, 1 a 3, 1 % provocaram uma
significativa diminuição do fator de rendimento em xilitol (de 0,20 para O g/g).
Estudos sobre a produção contínua de xilitol, em reator tipo leito
fluidizado, usando duas leveduras recombinantes imobilizadas
( Saccharomyces cereviseae H475, com alta atividade da enzima xilose
redutase e S. cerevíseae 8641, com baixa atividade desta enzima) em meio sintético, foram realizados por ROCA et ai. (1996). Em condições anaeróbias,
pH 5,5 tamponado e vazão específica de alimentação O, 11 h-1, foram
· produzidos 15 g/L de xilitol com a cepa H475. Entretanto, com a cepa 8641 foram obtidas concentrações de até 21, 5 g/L de xilitol. As maiores produtividades volumétricas de xilitol foram 3,44 e 5,8 g/L.h, para as leveduras
de baixa e alta atividade de xilose redutase, respectivamente. Em condições
limitantes de oxigênio (O, 1 vvm), com ambas leveduras, empregando-se uma
vazão específica de alimentação igual a 0,088 h-1, foram obtidas concentrações
de xilitol de 11 g/L.
Em outros estudos, ALEXANDER et ai. (1989), estudaram a
fermentação contínua em meio sintético ( 1 O g/L de xilose) com sistema de células por microfiltração. Neste sistema, empregando-se a levedura Candida
shehatae, nas condições de pH 4,5, 30 ºC e vazão específica de alimentação
de 0,05 n", foram produzidos 7 g/L de xilitol.
DELGENES et ai. (1988) realizaram estudos de produção contínua de
etanol, usando a levedura floculante P. stípítis em meio sintético, num fermentador tipo torre "gas lift'' de simples etapa. Estes autores observaram que trabalhando-se a pH 5,0 controlado e 30 ºC, o aumento da vazão
níveis de xilitol produzidos de 3,75 até 1,25 g/L. Entretanto, com maiores
valores de D, o nível de xilitol produzido se manteve aproximadamente
constante. Utilizando uma vazão específica de alimentação igual a 0,818 h-1
estes autores observaram um arraste ("wash-out") das células.
MÜTZE e WANDREY (1983), também realizaram estudos fermentativos de meio sintético contendo xilose, em operação contínua, utilizando a levedura
Pachysolen tannophilus. Os experimentos foram realizados em pH mantido em 5,2, temperatura de 30 ºC e vazão específica de alimentação entre 0,0022 e
0,0166 h ', A diminuição da aeração a uma vazão específica de alimentação
igual a 0,0083 h-1 provocou uma diminuição na produção de biomassa e um
aumento na produção de etanol e de xilitol. Esta levedura produziu quantidades similares de etanol e xilitol.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados nos Laboratórios de Fermentação do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL).
3. 1. Preparo do Bagaço de Cana-de-Açúcar para a Hidrólise
O bagaço de cana-de-açúcar, proveniente da Usina Santa Bárbara, Santa Bárbara d'Oeste-SP, foi submetido a secagem a temperatura ambiente, ao ar livre, com o objetivo de diminuir o seu teor de umidade. Após esta etapa, determinou-se seu teor de umidade, através de secagem em estufa à 105 ºC, até peso constante.
3.2. Obtenção do Hidro/isado Hemice/ulósico de Bagaço de Cana-de-
Açúcar
As operações de hidrólise para obter o hidrolisado hemicelulósico foram realizadas em um reator de aço inoxidável AISI 316, com volume de 250 L, operando em sistema descontínuo, a 120 ºC por 1 O min, relação sólido-líquido 1: 1 O, empregando-se 100 mg de ácido sulfúrico P .A. por g de bagaço de cana- de-açúcar (matéria seca). O hidrolisado obtido foi centrifugado em centrífuga industrial de porcelana e, posteriormente, concentrado a vácuo, a uma temperatura de 66 ± 4 ºC, em evaporador de vidro vertical de 4 L, com o objetivo de aumentar em 3 vezes a concentração de xilose presente no mesmo. Todo o volume do hidrolisado concentrado foi armazenado em bombonas plásticas em câmara fria a 8 ºC.
