ESTABILIDADE DA α QUIMOTRIPSINA A ph ALCALINO POR ABSORÇÃO NO UV

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ESTABILIDADE DA α–QUIMOTRIPSINA A pH ALCALINO POR

ABSORÇÃO NO UV

Ana Rita Gafaniz*, Nuno Santos** e Rúben Pereira***

* Nº55763

Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Instituto Superior Técnico – Departamento de Física

e-mail: rita_gafaniz@hotmail.com

** Nº55746

e-mail: dodgeps@hotmail.com

*** Nº55754

e-mail: rubens_dmap@hotmail.com

Palavras-chave: α-Quimotripsina, Espectrofotometria de Absorção no UV, Desnaturação, Estabilidade Térmica a pH Alcalino

Resumo Com este trabalho experimental pretendeu-se estudar a estabilidade

térmica da α-quimotripsina a pH alcalino. Para tal, recorreu-se à medição de absorvância de várias amostras da proteína, a várias temperaturas (no intervalo entre 25ºC e 60ºC), aos comprimentos de onda de 250nm e 278nm. Esta técnica permitiu seguir o grau de desnaturação da proteína pela observação da alteração do espectro de absorção do tirosinato (resultante da ionização dos resíduos de tirosina por exposição ao solvente) no UV.

Após o registo dos valores de absorvância das várias amostras representaram-se graficamente as fracções de α-quimotripsina desnaturada e a variação de energia livre em função da temperatura. Calculou-se também a temperatura de transição e os valores das variações de entalpia e de entropia.

A experiência foi realizada por cada um dos grupos para diferentes valores de pH. Os resultados obtidos apontam para uma desestabilização térmica da proteína com o aumento do pH, tendo-se obtido os valores de temperatura de transição de 42,25ºC, 40,81ºC, 40,50ºC e 39,87ºC para os valores de pH de 9,8, 10,2, 10,6 e 11, respectivamente.

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2 1. INTRODUÇÃO TEÓRICA

Este trabalho teve como objectivo, o estudo da estabilidade da α-quimotripsina com o aumento da temperatura num meio de pH alcalino, com base nas alterações no espectro de absorção da proteína.

1.1. Determinação da temperatura de transição da proteína

A experiência realizada é feita num meio alcalino, uma vez que a reacção em causa requer uma ionização do grupo fenol da Tyr, que apenas é mensurável para valores de pH superiores a 9,0. O NH₂ O -O NH₂ OH pK ~ 10.1

Figura 1. Ionização do grupo fenol da tirosina.

Quando a proteína está na sua forma nativa, as Tyr encontram-se “escondidas” no interior da sua estrutura terciária e não são afectadas por variações de pH [1]. Contudo, à medida que se aumenta a temperatura, dá-se a desnaturação (desenrolamento) da proteína e o número de resíduos de Tyr em contacto com o meio aumenta. Como é possível observar na reacção esquematizada na figura 1, ao entrar em contacto com o meio, o grupo fenol sofre perda do hidrogénio, ocorrendo ionização do grupo OH (pK≈10,1) formando assim o ião tirosinato.

Em consequência, ocorre o aumento da absorvância entre os 280nm e 310nm. Este aumento sobrepõe-se à variação observada no espectro quando ocorre desenrolamento da proteína sem ionização da Tyr (diminuição da absorvância entre os 285nm e 295nm devido ao deslocamento do espectro de absorção da tirosina para a zona do vermelho), sendo assim necessárias quantidades menores de proteína nas amostras para se observarem resultados, daí se monitorizar a desnaturação da proteína através dos resíduos ionizados [1].

Para efectuar este estudo assumiu-se que a absorvância da proteína resulta da soma das absorvâncias dos resíduos aromáticos que a constituem.

Traçando o gráfico de absorção para cada um dos comprimentos de onda (250nm e 278nm), em função da temperatura no intervalo estudado, verifica-se que a 278nm não ocorrem grandes variações no espectro de absorvância (porque o fenol e o fenolato possuem igual coeficiente de absortividade molar para este comprimento de onda, ou seja, absorvem de forma semelhante [1]). Portanto, este comprimento de onda vai ser usado como referência para calcular a razão αprot/α. Esta razão corresponde ao grau de

exposição das Tyr na superfície da proteína, com o aumento da temperatura, em que α_proté o grau de ionização das Tyr (experimental).

Sabendo que ao comprimento de onda de 278nm a Phe possui espectro de absorção nulo podemos então aproximar a lei de Lambert-Beer

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3 ! _"# ! _{1 % &} " ! ' & ! ! (2) em que ε_NATyr₍_OH₎_A, A O NATyr( −)

ε

, NATrpA ε e NAPhe

ε

são os coeficientes de absorção molar de

NATyrA tirosinamida) a pH 7,7, NATyrA a pH 12,4, NATrpA (N-acetil-L-triptofanamida) e NAPhe (N-acetil-L-fenilalanina) respectivamente [1].

No entanto esta formulação é muito afectada pelo erro associado à concentração da proteína (note-se que, a absorvância é proporcional à concentração de proteína – Lei de Beer1). Assim, ao se realizarem os cálculos a dois comprimentos de onda, recorrendo-se à razão A250/A278 para a obtenção do valor de αprot (sendo que um é o de referência),

pretendeu-se eliminar o efeito da concentração de proteína nos resultados (elimina-se a dependência do factor de concentração). Deste modo [1]

& ()*)+,-,_(,. (3) onde / "# ! 0 ! 1 ! 2 ! 3 ! 4 " ! ' (4)

Cada termo da equação é expresso em função da absorvância das diferentes espécies aos dois comprimentos de onda. É então necessário conhecer a priori os valores experimentais da Abs250 e de Abs278, bem como o número de cada tipo de aminoácidos aromáticos da proteína e a absortividade molar, ε, de cada uma das espécies.

Quando a proteína se encontra num estado desnaturado ideal com os resíduos isolados pelo solvente espera-se que os resíduos de Tyr se comportem como NATyrA e assim o grau de ionização é dado pela equação de Henderson-Hasselbalch, que relaciona o pH com o pK de uma determinada espécie [1]

& _5)5!5!67'68_67'68 (5) Assim, a razão entre o grau da ionização do fenol na proteína (αprot) e o previsto pela

relação de Henderson-Hasselbalch (α) descreve o grau de exposição dos resíduos de tirosina ao meio. Na figura 2 apresenta-se uma curva típica da variação desta razão com a temperatura.

1_{Princípio de Beer (1852): a absorvância é directamente proporcional à concentração da substância em} solução.

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Figura 2. Curva de desnaturação térmica(linha contínua) para a α-quimotripsina [1].

A forma sigmóide da curva, permite-nos afirmar que o processo de desenrolamento (ou desnaturação) da proteína é um processo cooperativo. Com o aumento da temperatura há interacções intramoleculares responsáveis pela manutenção da estrutura tridimensional da proteína que vão enfraquecendo progressivamente. Contudo, a estrutura mantém-se até certo instante, instante esse em que se desfaz uma ligação que é determinante neste processo de desnaturação. A partir daí, quebram-se todas as outras ligações e rapidamente se atinge a desnaturação da proteína, perdendo esta a sua actividade biológica.

Neste processo, há uma temperatura para a qual existem 50% de moléculas na forma nativa e 50% na forma desnaturada, designada de temperatura de ponto médio (temperature at the midpoint – Tm), assim como temperatura de desnaturação ou de

transição.

Exprime-se então a razão de absorvância, αprot/α (assumindo que o processo de

desnaturação é reversível) apenas em função da fracção desnaturada deste processo, fD, 96:;< 9 = 96:;< 9 >. 4 = 96:;< 9 >_@. 4@ .DEEEEEF 4AB5,.C @ G6:;< G ,=G6:;<G >A =G6:;<_G >_C,=G6:;<_G >_A (6)

onde (αprot/α)N e (αprot/α)D representam a variação da absorvância com a temperatura

nos estados nativo e desnaturado respectivamente (expressão resultante da aproximação linear feita a cada um dos “patamares” observáveis na representação gráfica de αprot/α

em função da temperatura, correspondentes a cada um dos estados da proteína – patamar inferior: estado nativo; patamar superior: estado desnaturado) e fN e fD

representam as fracções de proteína nativa e desnaturada, respectivamente, para cada temperatura.

Obteve-se em seguida a constante de equilíbrio, Keq, do processo de desnaturação da

proteína

HI _5,..C_C (7)

A partir da relação da termodinâmica calculou-se a variação de energia livre de Gibbs, ∆G, associado a este processo

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onde R é a constante dos gases perfeitos (1.98720 cal.mol-1.K-1) e T a temperatura (em K).

Foi depois possível obter a temperatura de desnaturação, Tm, que corresponde ao

ponto em que ∆G=0 no gráfico da variação da energia livre do processo em função da temperatura. Desta forma foi possível obter também os valores da variação de entalpia, ∆H, e de entropia, ∆S, na temperatura de desnaturação através da expressão

∆K ∆N % M. ∆O (9)

1.2. Método Experimental

Relativamente à sua componente prática, este trabalho é bastante simples e ao mesmo tempo útil de utilizar.

Basicamente, ele consiste em solubilizar a α-quimotripsina num tampão carbonato-bicarbonato (pré termostatizado a 25ºC) e colocar no reactor. Depois, medindo a temperatura, a cada elevação térmica de 1ºC retira-se uma amostra de 1ml da solução, até aos 60ºC.

Este procedimento terá de ser repetido para os vários valores de pH da solução tampão.

No final obtêm-se os valores das absorvâncias provenientes da espectroscopia de UV nos 250 e 278nm.

2. TRATAMENTO DE RESULTADOS

A partir dos resultados obtidos da espectrofotometria de UV foi possível calcular o αprot através da equação 3. A equação foi aplicada aos vários valores de absorvâncias,

medidos através dos dois comprimentos de onda, às várias temperaturas. Através da equação 5 calculou-se, também, o valor de α.

Com estes valores foi possível obter um gráfico que relaciona o quociente αprot/α

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Figura 3. Gráficos de relação entre o quociente αprot/α e a temperatura (K) aos pH’s de 9,8 (ο), 10,2 (*), 10,6 (×) e 11 (É).

De forma a obter os quocientes entre os graus de ionização do fenol quando a proteína está na forma naturada, (αprot/α)N, e desnaturada, (αprot/α)D, analisaram-se os

gráficos da figura 3. Através dos patamares inferior e superior é possível obter rectas de ajuste aos pontos. Estas rectas são obtidas por regressão linear em software apropriado.

Assim obtêm-se as várias equações que são representadas graficamente na figura 4, 5, 6 e 7. A valores inferiores de temperatura (verde) estão representadas as equações correspondentes ao estado de proteína naturada enquanto que, a valores mais elevados (azul) corresponde o estado de proteína desnaturada.

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Figura 4. Gráfico representativo da relação entre αprot/α e a temperatura (K) (ο) e das rectas

de ajuste, por regressão linear, de (αprot/α)N (verde) e (αprot/α)D (azul) em função da temperatura (K), a pH 9,8. As equações das

rectas de ajuste são, respectivamente, =PQRST

P >_N 0,0072966 M % 2,0285 e =PQRST

P >_D 0,011296 M % 2,7879

P >_N 0,0006266 M % 0,011156 e =PQRST

P >_D 0,015324 M % 4,2585.

P >_N 0,00018084 M % 0,40581 e =PQRST

P >_D 0,0093924 M % 2,0682.

P >_N 0,0013926 M % 0,025663 e =PQRST

P >_D 0,006068 M % 0,97215.

Por forma a obter a constante de equilíbrio, Ku/f, é necessário calcular previamente a

fracção de α–quimotripsina desnaturada, fD. Recorrendo à expressão (6), calculam-se as

fD para cada valor de temperatura, em cada pH. Estes valores estão representados nos

gráficos da figura 8.

Aplicando a equação (7) obtém-se o valor da Ku/f, também para cada instante

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Figura 8. Representação dos pontos da fracção de α–quimotripsina desnaturada, fD, em função da temperatura. Mais uma vez estes valores são apresentados relativos aos pH’s 9,8 (ο), 10,2 (*), 10,6 (×) e

11 (Ñ).

Recorrendo à termodinâmica, obtém-se facilmente a variação da energia de Gibbs, ΔG, através da sua relação directa com a constante de equilíbrio e a temperatura, dada pela equação (8).

Figura 9. Representação dos pontos da ΔG (kcal.mol-1_{) em função da temperatura, a) em toda a gama} de temperatura considerada na experiência (25 a 60ºC) e b) apenas numa zona considerada linear. Foram

considerados os valores para os 4 pH’s: 9,8 (ο), 10,2 (*), 10,6 (×) e 11 (_Ñ).

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Por análise dos gráficos da figura 9 a) é possível reconhecer uma gama de temperaturas em que os valores da energia de Gibbs aproximam uma recta linear. Esta zona (figura 9 b)) é chamada de zona linear e é através desses pontos que se irá traçar uma recta de ajuste, obtida por regressão linear (figura 10, 11, 12 e 13). Estas rectas são definidas pelas equações (9).

Figura 10. Variação da energia de Gibbs em função da temperatura, como recta de ajuste aos

pontos experimentais. O intervalo de temperatura considerado para a regressão foi

entre 310,15 e 323,15. pH = 9,8.

entre 313,15 e 321,15. pH = 10,2.

entre 314,15 e 320,15. pH = 10,6.

entre 307,15 e 321,15. pH = 11.

A temperatura de transição é facilmente obtida por simples intersecção das rectas de ajuste com o eixo dos xx (temperatura). Desta forma, obtêm-se os valores apresentados na tabela 1.

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10 pH Tm (ºC) 9,8 42,2519 10,2 40,8069 10,6 40,4968 11 39,8676

Tabela 1. Temperaturas de transição nos vários pH’s.

Pela equação (9), os valores da variação de entalpia e entropia no ponto da temperatura de transição estão automaticamente determinados, como sendo o declive e a ordenada na origem, das equações das rectas de ajuste determinadas anteriormente. Assim, obtêm-se os valores da tabela 2.

pH ΔHm (kcal.mol-1) ΔSm (kcal.mol-1.deg-1)

9,8 114,88 -0,36181

10,2 118,05 -0,37310

10,6 126,04 -0,39755

11 117,47 -0,37319

Tabela 2. Variação da entalpia e entropia no ponto médio, nos vários pH’s.

3. DISCUSSÃO DE RESULTADOS

Em todos os gráficos da variação do grau de exposição das Tyr (αprot/α) com a

temperatura (figura 3) é visível uma curva sigmóide (numa visão aproximada) que traduz o efeito cooperativo do processo de desnaturação, já referido. Há inicialmente uma variação muito pouco significativa, correspondente ao momento em que a proteína ainda se encontra na forma nativa. Nesta altura os efeitos do aumento de temperatura são quase imperceptíveis, ou seja, a exposição dos resíduos de tirosina ao solvente é ainda reduzida e não varia consideravelmente. Isto deve-se ao facto da estrutura da proteína não estar significativamente alterada. A partir de certa temperatura o grau de exposição das Tyr aumenta bruscamente (principalmente para os valores de pH mais elevados). Passada esta grande variação, tem-se novamente uma variação pouco perceptível do grau de exposição das Tyr com o aumento da temperatura. Desta vez, deve-se ao facto de praticamente todos os resíduos de tirosina estarem expostos ao solvente.

Observa-se então, que à medida que o pH se torna mais alcalino as oscilações nas curvas diminuem, bem como a transição para o estado mais próximo do desnaturado se revela mais rápida. De facto, sendo o pH óptimo desta enzima 8,0 [2] (menor que os estudados), é de esperar que, para valores de pH maiores e, com o aumento da temperatura, a proteína perca a estabilidade mais rapidamente.

Para os valores de pH de 9,8 notam-se oscilações em praticamente toda a curva e a passagem para um estado totalmente desenrolado pode-se considerar lenta, quando comparada com os outros gráficos. Nestes, as oscilações continuam a ser perceptíveis, contudo com o aumento do pH, elas acontecem mais para zonas de temperaturas mais baixas, quando a proteína ainda está na forma nativa. Verifica-se então que, com o aumento do pH as curvas se vão identificando cada vez mais com a curva apresentada na figura 2, obtendo-se portanto, uma avaliação da desnaturação mais exacta, devido à maior percentagem de ionização das Tyr expostas.

Atendendo agora à variação das curvas de variação de fracção desnaturada, fD, com a

temperatura, verificamos que à medida que o pH aumenta, as curvas se deslocam para a esquerda, tal como era esperado. Isto ocorre como consequência da temperatura de transição ser cada vez menor, confirmando novamente que, à medida que o pH aumenta

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mais fácil é provocar a desnaturação da proteína por temperatura, isto é, menor é a sua estabilidade térmica.

Quanto à representação gráfica das energias livres de Gibbs é importante salientar o facto de os declives serem negativos em todos eles, como seria de esperar. Isto porque, para que a proteína se desnature é necessário que o processo se torne favorável (ΔG negativos).

Quanto aos valores da variação de entropia e entalpia à temperatura de desnaturação, verifica-se que estes não variam substancialmente com o pH (tendo em conta a sua ordem de grandeza). Deste modo é possível comparar estes valores (tabela 2) com os da bibliografia [1]. Para um pH de 10,0, os valores teóricos apresentam um ΔSm de

120kcal.mol-1 e um ΔHm de 0,38kcal.mol-1.deg-1. Confrontando os valores, conclui-se

que estes são muito semelhantes.

Ainda assim, analisando o valor de ΔHm (assim como ΔSm) numa ordem de grandeza

abaixo, observa-se um aumento de ∆Hm com o aumento do pH (que não se verificou

apenas para pH de 11,0), que surge como consequência de ser necessário fornecer mais energia ao sistema para que ocorra a alteração conformacional proteica. Já o aumento de ∆S_m (que, novamente, não se verificou apenas para pH de 11,0) revela uma maior desorganização do sistema e consequente reestruturação do solvente.

Quanto à Tm, por observação geral dos gráficos obtidos, nomeadamente o gráfico das

variações da fracção de proteína desnaturada com a temperatura (figura 8), verificamos que à temperatura de transição a fracção de proteína desnaturada é de aproximadamente 0,5 em cada um dos pH estudados, como seria de esperar, uma vez que nesta fase metade das moléculas proteicas presentes na amostra se encontram no estado nativo (a outra metade no estado desnaturado).

Relativamente aos valores numéricos obtidos, e apresentados na tabela 1, é possível verificar que estes diminuem com o aumento do pH. Esta conclusão vem de encontro ao que foi dito para as curvas de fD, ou seja, com o aumento do pH as curvas tendem a

deslocar-se para a esquerda, o que faz com que a temperatura ao qual se dá a transição do estado naturado para o desnaturado seja menor.

Apesar dos bons resultados numéricos, há a salientar que grande parte dos cálculos foram obtidos com recurso a dados aproximados. Assumiu-se que o valor do pK característico da ionização das Tyr era constante e igual a 10,1 (a 25ºC) e que a proteína funcionava como a soma dos seus aminoácidos aromáticos.

Em suma, pode-se concluir que a metodologia utilizada para estudar a estabilidade térmica da α-quimiotripsina, para além de ser simples e pouco dispendiosa, é eficaz, uma vez que através dela se obtiveram resultados bastante aceitáveis.

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12 4. BIBLIOGRAFIA

[1] Thermal unfolding of proteins at high pH range studied by UV absorbance. Melo, E. Pinho et al. s.l. : Elsevier Science B.V., 1997. Journal of biochemical and biophysical methods. Vol. 34, pp. 45-59.

[2] Nelson, David L. e Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ª. New York : W. H. Freeman and Company, 2005. pp. 213-215.