ESCUELA PROFESIONAL ING. AMBIENTAL
CURSO DE BIOTECNOLOGÍA
MODELACION DE ENZIMAS EXTREMÓFILAS DE INTERES BIOTECNOLÓGICO USANDO EL
PROGRAMA CN3D V.4.3.1
Docente:
Hebert Hernan Soto Gonzales
Estudiante:
Rivera Bustamante, Gian Franco Vasquez Ticona, Juan Manuel
ILO-PERÚ
2022
INDICE
I. INTRODUCCIÓN ... 3
II. OBJETIVOS ... 3
a. Generales ... 3
b. Específicos ... 3
III. MARCO TEORICO ... 3
IV. DESARROLLO ... 6
a. Indicación sobre proteínas a buscar... 6
b. Búsqueda de proteínas en Blast ... 6
c. Descarga de la estructura y uso del programa Cn3d 4.3 ... 6
d. Traducción de la secuencia en EMBOSS Backtranseq ... 2
e. Búsqueda de nucleótidos similares en Blastn ... 3
V. CUESTIONARIO ... 4
a. ¿Qué es una proteína? ... 4
b. ¿Qué son las proteínas (enzimas) extremófilas y que aplicaciones tiene en la biotecnología? ... 5
c. Historia de las enzimas extremófilas ... 6
VI. CONCLUSIONES ... 7
VII. BIBLIOGRAFÍA ... 8
I. INTRODUCCIÓN
El término “extremófilo” es antropocéntrico. Describe a cualquier organismo capaz de crecer de forma óptima bajo condiciones ambientales (temperatura, pH, radiación, etc) extremas, es decir, condiciones consideradas hostiles, desde una perspectiva humana, para nosotros y la gran mayoría de organismos vivos que conocemos. El avance en los estudios de ecología y taxonomía microbiana ha permitido explorar los ambientes “extremos” y describir numerosos microorganismos extremófilos. En concreto, el estudio de sus propiedades estructurales y fisiológicas es de lo más fascinante, ya que se encuentran completamente adaptados, de forma altamente selectiva, a unas condiciones ambientales extremas. Con estas características, los extremófilos resultan idóneos para explorar su potencial en la biotecnología, ya que una gran parte de procesos biotecnológicos se desarrollan bajo condiciones extremas. Se han encontrado numerosas aplicaciones biotecnológicas para los extremófilos: permiten optimizar los procesos industriales y descubrir nuevos procesos más eficientes, comprender y conocer mejor el origen y el límite de la vida, pero también tendrían el potencial de generar un enorme impacto en nuestra forma de vida en el futuro, por ejemplo, con el desarrollo de los biocombustibles.
II. OBJETIVOS
a. Generales
• Determinar la estructura molecular de enzimas extremófilas.
b. Específicos
• Aplicación de enzimas extremófilas en ingeniería ambiental.
• Aprender el uso del programa CND3
III. MARCO TEORICO
BACTERIAS TERMOFILAS
Las bacterias termófilas son aquellas que se desarrollan a temperaturas superiores a 45ºC, pudiendo superar incluso los 100ºC (hipertermófilos) siempre que exista agua en estado líquido, lo que se consigue si la presión es elevada como ocurre en las profundidades oceánicas. Los termófilos se caracterizan a nivel de membrana porque poseen una proporción
alta de lípidos saturados de cadena larga, lo que hace que tenga la fluidez adecuada a altas temperaturas. En cuanto a las proteínas, se ha visto que poseen gran estabilidad debido a enlaces de tipo covalente e interacciones hidrofóbicas.
MECANISMO DE ADAPTACION
Los organismos termófilos (Bacteria y Archaea) pueden responder al estrés térmico mediante diferentes mecanismos de adaptación: modificando la estructura de las proteínas, las interacciones proteína-proteína y lípido-proteína, así como la estructura de la membrana.
Para el crecimiento de los microorganismos, las enzimas deben ser intrínsecamente estables a elevadas temperaturas.
El término “adaptación a la homeoviscosidad” se refiere a la habilidad de las bacterias para mantener su membrana en fase líquido-cristalina, a través de la variación de la composición de lípidos cuando están sujeta a cambios ambientales o de temperatura. La termoadaptación de la capa lipídica puede involucrar un incremento en la longitud de la cadena acilada, saturación o ciclización de los ácidos grasos.
La transducción de la energía en la membrana citoplasmática a elevadas temperaturas se realiza por: 1) un ajuste en la composición de la membrana, 2) el uso del ion sodio como acoplador de iones, y 3) las altas velocidades de la bomba de protones de la cadena respiratoria.
ENZIMAS DE INTERES INDUSTRIAL AISLADAS DE MICROORGANISMOS TERMOFILOS
➢ AMILASAS. - El almidón que se encuentra en muchas plantas como reserva de alimento y los polisacáridos son la fuente de carbono y energía de varios microorganismos. Debido a la compleja estructura del almidón, se requieren diferentes enzimas para su degradación, como la alfa-amilasa, la pululanasa tipo I y II y la ciclodextrina glicosiltransferasa. El tratamiento biológico del almidón involucra su licuefacción y sacarificación, procesos que requieren la termoestabilidad de las enzimas.
➢ CELULASAS. - La celulosa se puede transformar en glucosa por cuatro enzimas diferentes: la endoglucanasa, la exoglucanasa, la beta-glucosidasa y las xilanasas.
Estas enzimas tienen varias aplicaciones biotecnológicas: la producción de alcohol;
mejoramiento de la producción de jugos; detergentes limpiadores (provoca colores brillantes y suavidad), lavado de mezclilla, pretratamiento de biomasa celulósica y en cultivos de forraje, para mejorar la calidad y digestibilidad de los animales; para la sacarificación enzimática de desechos de agricultura e industriales, y en el blanqueo de la pulpa de madera. A la fecha, se han encontrado microorganismos termófilos como Thermotoga maritima, T. neapolitana y T. thermarun, hongos y levaduras que producen xilanasas y enzimas relacionadas que se activan a altas temperaturas y en amplios rangos de acidez.
➢ PROTEASAS. - Las proteasas rompen las proteínas en péptidos o en aminoácidos.
Se clasifican, de acuerdo a su sitio catalítico, en proteasas de serina, de cisteína, o metaloproteasas. El uso comercial de estas enzimas es amplio; las proteasas de serina, resistentes a la desnaturalización por detergentes y a condiciones alcalinas, se utilizan como aditivos en detergentes domésticos, en el remojado en la industria de la piel;
como modificadores de la proteína de soya y ablandadores de carne en la industria de alimentos; también se utilizan en la industria cervecera. La termolisina es la única proteasa termofílica con aplicación industrial: se utiliza en la producción del dipéptido aspartame, usado como endulzante bajo en calorías. La mayoría de proteasas extremófilas son del tipo serina, estables a altas temperaturas, altas concentraciones de detergentes y agentes desnaturalizantes.
➢ LIPASAS. - Son usadas para hidrolizar lípidos, produciendo ácidos grasos y glicerol.
Sin embargo el interés en el estudio de las lipasas se ha incrementado recientemente a causa de su capacidad de trabajar en disolventes orgánicos, realizando reacciones de síntesis entre alcoholes y ácidos. Las lipasas catalizan varias reacciones como: 1) hidrólisis de lípidos; 2) acidólisis (remplazamiento de un ácido graso esterificado por un ácido graso libre; 3) transesterificación (cambio de ácidos grasos por triglicéridos);
y, 4) síntesis de ésteres. Las lipasas son producidas principalmente por hongos. Por
ejemplo, de Mucor miehei se aisló la Lipozima y de Aspergillus oryzae la Lipolasa, ambas producidas por la empresa Novozymes, en Dinamarca.
IV. DESARROLLO
a. Indicación sobre proteínas a buscar
Las proteínas para buscar fueron dadas por el docente por un paper, las proteínas dadas fueron:
- Ribonuclease
- Phosphatase
- Alginate lyase
- Pectate lyase
b. Búsqueda de proteínas en Blast
Luego de ello, estuvimos buscando en el Blastp proteínas similares a las que nos dieron, las elegidas fueron:
- ESCHERICHIA COLI RIBONUCLEASE HI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/1RBV - Pectate Lyase C https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/1O8I
- Mannosyl-3-Phosphoglycerate Phosphatase
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/3ZTW
- alginate lyase Dp0100 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/6JPN
c. Descarga de la estructura y uso del programa Cn3d 4.3
Ribonucleasa Liasa Pectate
Fosfatasa Alginato de Liasa
d. Traducción de la secuencia en EMBOSS Backtranseq
Se abre la secuencia de alineamiento y se cliquea las primeras letras que sale en la barra emergente, nos conducirá a una pagina
Se copia el texto que sale al final de la pagina que se abrió al cliquear en las letras como se observa en la figura.
Posteriormente a ello nos dirigiremos a https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/ y ahí copiaremos el alineamiento.
Posterior a ello se dará una nueva cadena traducida, la que se usará en el siguiente paso.
e. Búsqueda de nucleótidos similares en Blastn
Luego en el Blastn, se copia el alineamiento traducido para buscar proteínas similares.
Se repetirá el paso con las otras 3 proteínas.
V. CUESTIONARIO
a. ¿Qué es una proteína?
Las proteínas son las macromoléculas más abundantes presentes en las células vivas. Poseen una gran variedad y diversidad en cuanto a su función biológica. Son los instrumentos
moleculares mediante los que se expresa la información génica. Las proteínas están constituidas por aminoácidos (existen 20 de ellos) unidos en forma covalente a través de enlaces peptídicos. A partir de estos 20 aminoácidos, los diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, etc.
Los 20 aminoácidos (genéricamente aa) tienen todos un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (carbono α en la figura siguiente). Difieren en sus cadenas laterales, o grupos R, los cuales varían en estructura, tamaño y carga eléctrica aspectos que influye en la solubilidad en agua de estas moléculas. A los aminoácidos estándar se les ha asignado abreviaturas de tres letras y símbolos de una letra que se utilizan para indicar la composición y secuencia de los mismos en el contexto de las proteínas.
En todos los aminoácidos estándar (salvo la glicina) el carbono α es asimétrico y por lo tanto quiral, estando unido a cuatro grupos sustituyentes diferentes: un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo R y un átomo de hidrógeno. Debido al ordenamiento tetraédrico de los enlaces alrededor del carbono α, los cuatro grupos sustituyentes pueden ocupar dos ordenamientos espaciales distintos que son imágenes especulares no superponibles (enantiómeros). Los dos enantiómeros (o esteroisómeros) de cada aminoácido poseen las mismas propiedades químicas, pero difieren en una propiedad física característica: su capacidad de rotar la luz polarizada.
b. ¿Qué son las proteínas (enzimas) extremófilas y que aplicaciones tiene en la biotecnología?
La palabra extremofilo es un neologismo que fue acuñada en 1974 por el investigador MacElroy (MacElroy, 1974). Es un término híbrido en el que se unen la palabra del Latín Extremus (más externo, distante o alejado) y la palabra Griega filia (atracción, afecto por) resultando su significado en “amigo de condiciones extremas”
Debido a la alta diversidad microbiana y a su versatilidad metabólica los microorganismos son capaces de vivir y desarrollarse en una gran variedad de hábitats y condiciones (Cases y De Lorenzo, 2002). El cuerpo humano (por su importancia médica) y los ecosistemas marinos y de agua dulce (por sus implicaciones ambientales) han sido estudiados en profundidad, sin embargo, otros ambientes como aquellos más extremos (en comparación con los parámetros
fisiológicos del ser humano) han permanecido durante muchos años prácticamente desconocidos ya que inicialmente se consideraron como zonas exentas de vida.
Se les llama extremófilos por soportar sin problemas condiciones de vida extrema y su forma de defensa son las enzimas. Se les da particular importancia a las enzimas que permiten desenvolverse a los extremófilos en circunstancias tan duras
Los extremófilos tienen numerosas aplicaciones, pero también causan problemas, como contaminación, corrosión y formación de “biofilms”. Tanto para las aplicaciones como para los problemas, necesitamos conocer los mecanismos de comunicación que usan estos microorganismos para cumplir sus funciones. La comunicación célula a célula (quorum sensing: QS) es esencial para el desarrollo y supervivencia de estos microorganismos en los ambientes extremos en muchos casos. La mayoría de las bacterias confían en el quorum sensing para una expresión génica coordinada a densidades elevadas, que se basa en la producción y detección de moléculas de señalización conocidas como autoinductores. La importancia del QS es ampliamente estudiada en los mesófilos, sin embargo, apenas se conoce como funciona en los extremófilos
Uno de los problemas que pueden causar los extremófilos es la formación de biofilms termofílicos que causan grandes pérdidas económicas además de contaminación ambiental.
Por lo tanto, surge el interés en desarrollar estrategias que interrumpan el quorum sensing del biofilm. Se encontró recientemente, una forma de inhibir la biosíntesis de autoinductores utilizando MTAN (5``metil-tioadenosina).
c. Historia de las enzimas extremófilas
Durante mucho tiempo se pensó que era imposible encontrar algún organismo que viviera en sitios con condiciones extremas, inhabitables para la gran mayoría de los organismos conocidos: temperaturas superiores a 80ºC, presiones aplastantes, oscuridad total, altas concentraciones de sales o minerales, ambientes muy ácidos, o sitios de temperaturas extremadamente bajas. No obstante, cuando las técnicas utilizadas para explorar esos nichos tan extremos se perfeccionaron, se pudo encontrar una diversidad de organismos que habitan en ellos. Se los conoce como “extremófilos”, amantes de las condiciones extremas, y pueden ser bacterias, plantas o animales
Durante el año 1996, el gasto mundial desembolsado en enzimas por industrias relacionadas a la biomedicina y otras áreas se cifró en 2500 millones de dólares; tales biocatalizadores se utilizaron en procesos que van desde la producción de edulcorantes y jeans descoloridos, hasta la identificación de criminales y el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas. Las enzimas habituales son extremadamente lábiles a los cambios de temperatura, pH, salinidad etc., Por tanto, los industriales deben tomar precauciones para protegerlas durante las reacciones que catalizan e incluso durante su almacenamiento.
VI. CONCLUSIONES
• Las aplicaciones de estos microorganismos en nuevos procesos biotecnológicos han despertado el interés en su estudio. Debido a que muchos procesos industriales se llevan a cabo a temperaturas elevadas, las enzimas termoestables están adquiriendo mayor importancia como biocatalizadores.
• Una gran utilidad industrial y de ayuda con el medio ambiente de las bacterias termófilas sería la degradación de los PCBs (policlorobifenilos). Estos compuestos son muy tóxicos y poseen una alta recalcitrancia. Son muy comunes, ya que forman parte fundamental de plásticos, refrigerantes, intercambiadores de calor, etc. El tratamiento biológico para degradarlos es muy lento y la contaminación por otro microorganismo afecta a la eficacia de degración en serie. Se están empleando bacterias termófilas que crecen a 60ºC y pueden utilizar bifenil, 4-clorobifenil y ácido benzoico como fuente de carbono, por lo tanto van a participar en la degradación de los PCBs, y, a esta elevada temperatura la posibilidad de contaminación por otro microorganismo que afecte al proceso es baja.
• En el ámbito de la Biología Molecular, la aparición de las DNA polimerasas termoestables ha facilitado en gran medida la metodología de la PCR gracias a su capacidad para desnaturalizar el DNA. La primera usada fue la Taq polimerasa de Thermus aquaticus, de la que se han ido obteniendo variantes más fieles y eficaces.
VII. BIBLIOGRAFÍA
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• Rivera, G., Tavara, M. & Champi, J. (2021). ELECTROFORESIS. UNAM, 1.
• (2022, September 1). ULTRACONGELADORES. Catalogodelasalud.
https://www.catalogodelasalud.com/documenta/contenido/119725/ULTRACONGELADOR ES.pdf
• (2020, September 1). Concentrador de muestras: Así funciona en el laboratorio - Cromtek.
Cromtek. https://www.cromtek.cl/2021/07/07/concentrador-de-muestras-asi-funciona- en-el-
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• https://porquebiotecnologia.com.ar/Cuadernos/El_Cuaderno_57.pdf
• http://lqtc.fcien.edu.uy/cursos/Fq2/2008/Practicos/Anexo_Practica2_2008.pdf
• https://digital.csic.es/bitstream/10261/230752/1/DIRECCION_DE_TRABAJOS825422.pdf
• http://www.ubiobio.cl/miweb/webfile/media/77/APUNTES%20DE%20APOYO%20DOCENT E/extrem%C3%B3filos%20(PDF).PDF
• https://idus.us.es/bitstream/handle/11441/129955/Delgado%20Romero%2C%20Jos%C3%
A9%20Antonio%20Tesis.pdf?sequence=1&isAllowed=y
