UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO CAMPUS DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA – PRODUÇÃO VEGETAL
Alana Juliete da Silva Santos
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO EM MANGUEIRA CV. PALMER CULTIVADA NO VALE
DO SÃO FRANCISCO
Petrolina- PE 2019
ALANA JULIETE DA SILVA SANTOS
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO EM MANGUEIRA CV. PALMER CULTIVADA NO VALE
DO SÃO FRANCISCO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós- Graduação em Agronomia – Produção Vegetal do Campus de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Agronomia – Produção Vegetal.
Orientador: Dr. Vespasiano Borges de Paiva Neto Coorientador: Dr. Ítalo Herbert Lucena Cavalcante
Petrolina- PE 2019
Santos, Alana Juliete da Silva S
237c
Caracterização da atividade da redutase do nitrato em mangueira cv. Palmer cultivada no Vale do São Francisco / Alana Juliete da Silva Santos. - Petrolina, 2019.
79 f. il.
Dissertação (Mestrado em Agronomia – Produção Vegetal) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus de Ciências Agrárias, Petrolina - PE, 2019.
Orientador: Prof. Dr. Ítalo Herbert Lucena Cavalcante.
Referências.
1. Manga. 2. Manga - Cultivo. 3. Nitrogênio. I. Título. II.
Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 634.34
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF
Bibliotecária: Ana Cleide Lucio CRB – 4 / 2064
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter cuidado de mim em todo o tempo, por ter me fortalecido e sempre ter me orientado nas escolhas. Pela saúde e capacidade pra chegar aonde cheguei.
A Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) e ao Programa de Pós-graduação em Agronomia- Produção vegetal (PPGA-PV) pela oportunidade de realização do mestrado.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo para realização da pesquisa.
As fazendas FRUTAVI/ARGO e Sebastião da manga pela parceria e disponibilidade do campo para estudo.
Aos meus pais, Ângela Maria e Belarmino Francisco, que confiaram em mim e me apoiaram em tudo, que nunca me deixaram faltar nada essencial e me enchem todos os dias de conselho, proteção e amor. Obrigada pela base familiar que vocês me deram!
Ao meu namorado, Wendel Júnior, pelo companheirismo, incentivo e dedicação, por ter me ajudado durante esse processo e por ter sido compreensivo nos momentos em que precisei me ausentar. Você foi minha calmaria durante esse tempo!
Aos dois irmãos que o mestrado me deu, Luciana Sanches e Daniel Carreiro. Vocês poderiam ter sido apenas companheiros de trabalho, mas se tornaram meus companheiros de vida. Por nunca terem me deixado na mão e por sempre terem me dado a garantia de que eu não estaria sozinha. Por todos os momentos de alegria e crescimento que vocês me proporcionaram, por tudo, muito obrigada!
Às minhas amigas, em especial Iasmin Oliveira, Eduarda Vilela, Fernanda Oliveira, Priscilla Maria e Samile Santos, por me animarem e acreditarem em mim, sem cobrança e com paciência. Mesmo distantes se fizeram presentes com cada palavra de ânimo, cuidado e consolo.
Aos colegas de turma Vagner Pereira, Allan Marques e Vanuza de Souza pelo apoio quando necessário. Em especial a Kátia Araújo, minha parceira de estudo e amiga pra vida, sempre presente e me ajudando em tudo.
Aos colegas e amigos do grupo FRUTVASF, Jenilton Gomes, Poliana Martins, Luan Silva, Jackson Teixeira, Jasmine Sena, Jaynne Lino, Laiane Eugênia e Stefany Rodrigues que de alguma forma contribuíram com o meu trabalho, principalmente com as atividades em campo e laboratoriais. A contribuição de vocês foi essencial para que tudo desse certo!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Vespasiano Borges de Paiva Neto, pelos ensinamentos, confiança, palavras de encorajamento e motivação. Por acreditar em mim e me proporcionar crescimento pessoal e profissional.
À Mônica Cristina Rezende Zuffo Borges, pelos ensinamentos em laboratório, paciência e disponibilidade sempre que eu precisei.
Ao meu Coorientador, Prof. Dr. Ítalo Herbert Lucena Cavalcante, pela contribuição no desenvolvimento do trabalho.
À todos que de alguma forma contribuíram para que essa etapa fosse concluída com sucesso, muito obrigada!
RESUMO
O nitrogênio (N) é um dos macronutrientes mais requeridos para a cultura da mangueira (Mangifera indica L.). Quando absorvido na forma de nitrato (NO3-
) são necessários processos redutivos para posterior assimilação em compostos orgânicos. A primeira etapa do processo de redução é catalisada pela redutase do nitrato (RN), enzima chave na regulação do metabolismo de N. Devido o seu papel regulador, a RN é indiretamente correlacionada com a produtividade das culturas. Diante disso, o trabalho teve como objetivos avaliar a variação da atividade da redutase do nitrato (aRN) ao longo do dia, verificar as melhores condições para o ensaio e fazer a caracterização da atividade da enzima em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens de mangueira, cultivada no Vale do Submédio São Francisco, em diferentes fases fenológicas, visando entender como a planta modula a redução do nitrato ao longo do seu ciclo vegetativo/reprodutivo. O material vegetal foi coletado em plantas dispostas aleatoriamente, em pomar comercial de mangueira, localizado em Petrolina- PE e Maniçoba, distrito de Juazeiro-BA. A quantificação da atividade da redutase do nitrato (aRN) baseou-se no método do ensaio in vivo. Para a triagem dos fatores foi utilizado o planejamento fatorial completo 24. Para a caracterização, os dados foram submetidos a ANOVA pelo teste „F‟ e as médias comparadas pelo teste de Tukey. A atividade da redutase do nitrato é influenciada por fatores ambientais, principalmente pela radiação solar. Para a obtenção da maior atividade da enzima em tecidos foliares e radiculares, recomenda-se a coleta do material vegetal em torno das 10 horas. Os fatores avaliados não atuam de forma independente. A condição que favorece a obtenção da maior atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens é pH 8,5, n-propanol 1% e 50 mM de nitrato de potássio (KNO3). O melhor tempo de incubação em folhas é 60 minutos e em raízes 45 minutos. As folhas de 2º fluxo e raízes constituem os principais sítios de assimilação de NO3- na cultura da mangueira, podendo haver modulação em função da adubação com fonte de nitrato nas diferentes fases fenológicas.
A atividade da enzima foi maior na fase vegetativa do que na reprodutiva e foi favorecida pela aplicação de potássio usado na maturação de ramos e desenvolvimento do fruto.
Palavras-chave: Mangifera indica. Nitrogênio. Atividade enzimática.
ABSTRACT
Nitrogen (N) is one of the most requested macronutrients for mango trees (Mangifera indica L.). When absorbed as nitrate (NO3-
), reductive processes are required for further assimilation into organic compounds. The first step of the reduction process is catalyzed by nitrate reductase (NR), an essential enzyme for the regulation of N metabolism. Due to its regulatory function, NR is indirectly correlated with crop yield. The aim of this study was to evaluate the variation of nitrate reductase activity (NRa) throughout the day, to verify the best conditions for the test and to characterize the enzyme activity in first and second flow leaf and young roots of mango trees grown in the sub-middle São Francisco Valley, in different phenological phases, in order to comprehend how the plant modulates the nitrate reduction throughout its vegetative/reproductive cycle. The vegetal sample was collected in plants randomly cultivated in a commercial orchard of mango located in Petrolina-PE and Maniçoba (district of Juazeiro-BA). The quantitation of nitrate reductase activity (NRa) was based on the in vivo method. For factor screening, it was done using a complete factorial design 24. For the characterization stage, the data were submitted to ANOVA by the 'F' test and the means were compared by the Tukey test. Nitrate reductase activity is influenced by many environmental factors, mainly by solar radiation.
To obtain the highest activity of the enzyme in leaf and root tissues, it is recommended to collect the vegetal samples at around 10 o'clock. The factors evaluated do not act independently. The condition that promotes the highest nitrate reductase activity in second flow leaf, first flow leaf and roots is pH 8,5, n-propanol 1% and 50 mM of potassium nitrate (KNO3). The best incubation time for leaf is 60 minutes and for roots is 45 minutes. Second flow leaf and roots are the main sites for assimilation of NO3-
in the mango trees and could be modulated as a function of fertilization with a source of nitrate in the different phenological phases. The activity of the enzyme was higher in the vegetative than in the reproductive phase and it was increased by the application of potassium used in fruit maturation and fruit development.
Keywords: Mangifera indica. Nitrogen. Enzymatic activity.
LISTA DE FIGURAS Capítulo 1
Figura 1. Esquema do manejo da floração em mangueira (Mangifera indica L.) em condições semiáridas. ... 18
Capítulo 2
Figura 1. Curva de calibração para estimar a atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens em mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer. ... 34 Figura 2. Diagrama de Pareto do planejamento fatorial completo 24 obtido para a atividade da enzima redutase do nitrato (aRN) em folhas de 2º fluxo vegetativo de mangueira (Mangifera indica L.) (a linha vertical define 95% do intervalo de confiança). ... 35 Figura 3. Diagrama de Pareto do planejamento fatorial completo 24 obtido para a atividade da enzima redutase do nitrato (aRN) em folhas de 1º fluxo vegetativo de mangueira (Mangifera indica L.) (a linha vertical define 95% do intervalo de confiança). ... 36 Figura 4. Diagrama de Pareto do planejamento fatorial completo 24 obtido para a atividade da enzima redutase do nitrato (aRN) em raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) (a linha vertical define 95% do intervalo de confiança). ... 36 Figura 5. Gráfico de efeitos do planejamento fatorial completo 24 da interação entre os fatores tempo de incubação, n-propanol e KNO3 para folhas de 2º fluxo (A) e raízes (B) de mangueira (Mangifera indica L.). ... 40 Figura 6. Gráfico de efeitos do planejamento fatorial completo 24 da interação entre os fatores tempo de incubação, KNO3 e pH para folhas de 2º fluxo (A) e raízes (B) de mangueira (Mangifera indica L.). ... 41 Figura 7. Gráfico de efeitos das interações duplas do planejamento fatorial completo 24 entre os fatores KNO3 e N-prop (A), tempo de incubação e N-prop (B); KNO3 e pH (C) para folhas de 1º fluxo de mangueira (Mangifera indica L.).
... 43 Figura 8. Gráfico de quadrado das interações duplas do planejamento fatorial completo 24 entre os fatores KNO3 e N-prop (A), tempo de incubação e N-prop
(B); KNO3 e pH (C) para folhas de 1º fluxo de mangueira (Mangifera indica L.).
... 45 Figura 9. Gráfico de cubo do planejamento fatorial completo 24 para a interação entre os fatores tempo de incubação, KNO3 e pH em folhas de 2º fluxo (A) e raízes (B) de mangueira (Mangifera indica L.). ... 46 Figura 10. Gráfico de cubo do planejamento fatorial completo 24 para a interação entre os fatores tempo de incubação, n-propanol e KNO3 em folhas de 2º fluxo (A) e raízes (B) de mangueira (Mangifera indica L.). ... 47
Capítulo 3
Figura 1. Detalhe das folhas de mangueira de 1º e 2º fluxo vegetativo coletadas para a quantificação da atividade da enzima redutase do nitrato. ... 58 Figura 2. Variação diurna da atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo, e raízes jovens de mangueira cv. Palmer. ... 59 Figura 3. Valores médios de radiação solar obtidos da estação meteorológica da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Campus de Ciências Agrárias (CCA), em diferentes dias e fases fenológicas da mangueira (Mangifera indica L.). ... 60 Figura 4. Atividade da redutase do nitrato em folhas e raízes de mangueira cv.
Palmer nas fases de pré-poda e poda, nos dias 14/04/2019 e 29/04/2019 respectivamente, na área 1 da fazenda Sebastião da manga em Petrolina-PE.
... 61 Figura 5. Atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo, e raízes jovens de mangueira cv. Palmer aos 12 e 32 dias após a aplicação de paclobutrazol, no dia 22/01/2019, nas áreas 3 e 4, respectivamente, da fazenda Francês em Maniçoba-BA. ... 63 Figura 6. Atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo, e raízes jovens de mangueira cv. Palmer na fase de maturação de ramos um dia após a segunda aplicação de sulfato de potássio (K2SO4), 14/12/2019, na área 2 da fazenda Sebastião da manga em Petrolina-PE. ... 65 Figura 7. Atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo, e raízes jovens de mangueira cv. Palmer nas fases de pré-indução e indução floral, dia 08/01/2019 e 15/01/2019 respectivamente, na área 2 da fazenda Sebastião da manga em Petrolina-Pe. ... 67
Figura 8. Atividade da redutase do nitrato em folhas de 2º e 1º fluxo vegetativo e raízes de mangueira cv. Palmer na fase de floração plena, dia 23/02/2019, na área 2 da fazenda de Sebastião da manga em Petrolina-Pe. ... 69 Figura 9. Atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo, e raízes jovens de mangueira cv. Palmer na fase de frutificação, dia 18/04/2019, na área 2 da fazenda Sebastião da manga em Petrolina-Pe. ... 70 Figura 10. Atividade total da redutase do nitrato em mangueira cv. Palmer nas diferentes fenofases. ... 71
LISTA DE TABELAS Capítulo 2
Tabela 1. Níveis mínimos (-1) e máximos (+1) dos fatores estudados na quantificação da atividade da redutase do nitrato (aRN) em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer.
... 32 Tabela 2. Matriz com Planejamento Fatorial completo 24, com 2 níveis e 4 fatores, para a quantificação da atividade da redutase do nitrato (aRN) em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer. ... 33 Tabela 3. Síntese da análise de variância para folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens (material vegetal) de mangueira cv. Palmer em diferentes tempos de incubação. ... 48
Capítulo 3
Tabela 1. Informações gerais referentes às áreas estudadas. ... 56 Tabela 2. Fenofases da cultura da mangueira objeto da coleta de material para análises de atividade da enzima redutase do nitrato e respectivos locais de coleta de folhas e raízes... 57
Anexo
Tabela 1. Síntese da análise de variância para folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens (material vegetal) de mangueira cv. Palmer nas diferentes fenofases. ... 79
SUMÁRIO
RESUMO ... 6
ABSTRACT ... 7
CAPÍTULO 1 ... 13
INTRODUÇÃO ... 13
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 14
A cultura da mangueira ... 14
Metabolismo do nitrogênio (N) ... 19
A redutase do nitrato (RN)... 21
REFERÊNCIAS ... 23
CAPÍTULO 2 ... 29
VERIFICAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA ANÁLISE DA REDUTASE DO NITRATO EM MANGUEIRA (Mangifera indica L.) ... 29
RESUMO ... 29
ABSTRACT ... 29
INTRODUÇÃO ... 30
MATERIAL E MÉTODOS ... 32
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35
CONCLUSÕES ... 49
REFERÊNCIAS ... 49
CAPÍTULO 3 ... 53
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA REDUTASE DO NITRATO NAS DIFERENTES FENOFASES DE MANGUEIRA CV. PALMER CULTIVADA NO VALE DO SÃO FRANCISCO ... 53
RESUMO ... 53
INTRODUÇÃO ... 54
MATERIAL E MÉTODOS ... 56
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59
CONCLUSÕES ... 72
REFERÊNCIAS ... 72
ANEXO ... 79
CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO
A mangicultura na região semiárida se destaca por diversos motivos, dentre eles as condições climáticas que, associadas a podas e utilização de reguladores vegetais, possibilitam a produção de frutos em qualquer época do ano (MOUCO, 2008). Para manter uma boa produtividade na região, é feito o manejo da mangueira com o uso de reguladores de crescimento, podas e adubação.
Na cultura da mangueira o crescimento vegetativo é determinante para a produção, de modo que quanto maior o número de brotos vegetativos, maior a chance de ocorrência de panículas e frutificação. No semiárido nordestino, devido às condições de elevadas temperaturas, é indispensável se trabalhar com ramos maduros, com no mínimo três meses de idade, no processo de indução floral (ALBUQUERQUE et al., 2002). Nesse caso, após a colheita, recomenda-se ao produtor de manga estimular a emissão de novos fluxos vegetativos mediante poda, manejo nutricional e irrigação, a fim de possibilitar o amadurecimento dos brotos gerados a partir da poda (MOUCO, 2008), pois é clara a importância dessa maturação de ramos em plantas com fins comerciais no semiárido (CAVALCANTE et al., 2018).
O estado nutricional da planta é outro fator importante que afeta a floração em mangueira, portanto, o manejo da adubação, principalmente para potássio (K), enxofre (S) e nitrogênio (N), é crucial durante a fase de maturação de ramos (CAVALCANTE et al., 2018). O N é um dos nutrientes mais absorvidos, com efeito direto na distribuição de fotoassimilados entre a parte vegetativa e reprodutiva, modificando a fisiologia e morfologia da planta, estando relacionado com a fotossíntese, crescimento radicular, absorção iônica de nutrientes e desenvolvimento celular (QUEIROGA et al., 2007). No momento da indução floral, os teores de N devem estar no limite médio inferior da oferta adequada, para garantir a fase reprodutiva em vez de fluxos vegetativos (DAVENPORT et al., 2003).
As duas principais formas de N encontradas na solução do solo são nitrato (NO3-
) e amônio (NH4+
), porém, em solos tropicais, o nitrato é a principal forma de aquisição pelas plantas (MARSCHNER; MARSCHNER, 2012).
Quando absorvido na forma nítrica, para ser utilizado é necessário ser reduzido
e assimilado em um processo dependente de energia e catalisado por enzimas (TAIZ; ZEIGER, 2017). Ao ser absorvido pelas raízes, o NO3-
pode ser reduzido ou estocado nos vacúolos dos tecidos radiculares ou na parte aérea, para onde é translocado via xilema por meio do fluxo transpiratório (SANTOS, 2010; TAIZ;
ZEIGER, 2017). Na cultura da mangueira foi observada a redução do nitrato tanto na raiz quanto nas folhas (SOUZA et al., 2016).
A assimilação de nitrato é de importância biológica fundamental, sendo a principal via pela qual o nitrogênio é convertido na forma orgânica. A primeira etapa do processo se dá com a redução de NO3-
a nitrito (NO2-
), reação catalisada pela enzima redutase do nitrato (RN). A segunda etapa é a redução do NO2-
a amônia (NH3+
), catalisada pela enzima redutase do nitrito. O primeiro passo dessa reação é considerado o limitativo, tornando a redutase do nitrato um fator limitante para o crescimento, desenvolvimento e produção de proteínas (CRAWFORD, 1995; SOLOMONSON; BARBER, 1990).
A RN é um complexo enzimático composto por duas unidades idênticas apresentando três grupos prostéticos cada, o FAD, o heme e a Molibdopterina.
A enzima é regulada por diversos estímulos ambientais e intrínsecos à planta que regulam os mecanismos transcripcional, traducional e pós-traducional (CAMPBELL, 1999). A redutase do nitrato é considerada enzima chave na regulação do metabolismo de N. Por esse motivo, a sua atividade poderia estar relacionada, indiretamente, com a produtividade das culturas, considerando que plantas com alta atividade da redutase do nitrato (aRN) teriam maior capacidade de assimilar o nitrato disponível e maior capacidade de resposta à adubação nitrogenada (VIANA; KIEHL, 2010).
Nesse contexto, esse trabalho teve como objetivo verificar a atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxos e vegetativos e sistema radicular jovem em mangueira (Mangifera indica L.) cultivada no Vale do Submédio São Francisco, dada a escassez dessas informações na literatura.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA A cultura da mangueira
A manga (Mangifera indica L.) é uma fruta de origem asiática (CUNHA et al, 2002) que encontra, no Brasil, boas condições para o seu desenvolvimento e produção, concentrada em especial na Região Nordeste
(ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2018). A possibilidade de produção o ano inteiro é o diferencial de maior interesse no cultivo da mangueira nas condições semiáridas. Para isso, deve-se realizar o manejo adequado da parte aérea de modo que favoreça a floração (MOUCO, 2010) e atentar para o manejo nutricional, pois, o atendimento adequado das exigências nutricionais faz com que as plantas frutíferas expressem todo o seu potencial genético (AULAR; NATALE, 2013).
A concentração de macronutrientes em mangueira varia durante os diferentes estádios fenológicos do ciclo de produção, como repouso (dormência), floração, frutificação, crescimento de frutos e colheita (ZUAZO et al., 2008; RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010). O nitrogênio é um dos nutrientes que tem grande influência no crescimento e desenvolvimento das plantas, pois participa de diversos compostos essenciais para o crescimento vegetativo e reprodutivo da mangueira (BALLY, 2009). López et al. (2012) estudaram a evolução de nutriente foliar em três diferentes cultivares de mangueira, no México, e observaram que o nitrogênio apresenta diferença no seu desempenho ao longo da vida da folha. Porém, nem sempre as mudanças nas concentrações de nutrientes estão associadas com eventos fenológicos.
As folhas jovens de mangueira apresentam maiores teores de nitrogênio em comparação com as folhas maduras. Isso pode ser atribuído ao efeito e concentração, pois, as folhas jovens ainda não estão totalmente expandidas. À medida que as folhas atingem a sua plenitude fisiológica, os teores de N se estabilizam em uma concentração menor, que tende a diminuir ainda mais próximo à senescência da folha, o que está relacionado com a remobilização (ALMEIDA et al., 2014).
Em condições tropicais o crescimento da mangueira tende a ser desuniforme, de modo que em uma planta, em diferentes partes da copa, podem apresentar flores, frutos e fluxo em repouso (DAVENPORT, 2009).
Alguns procedimentos são eficazes para induzir uma florada uniforme, que pode ser estimulada por fatores ambientais, como a mudança de temperatura (RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010), ou por fatores antropogênicos como poda, irrigação, aplicação de fertilizantes nitrogenados e exposição ao etileno (DAVENPORT, 2009).
A sincronização do crescimento vegetativo das copas das mangueiras no pomar, bem conhecido como poda, é o primeiro passo necessário no programa de manejo da floração. Esse trato cultural resulta num crescimento uniforme ao longo da planta e permite que os ramos estejam no mesmo estádio fisiológico de maturidade, tornando o manejo mais eficiente (DAVENPORT, 2003; RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010). É essencial que as plantas sejam bem irrigadas nesse momento da poda a fim de se obter uma rápida resposta na brotação, pois, qualquer estresse hídrico nessa fase, por menor que seja, pode inibir o crescimento vegetativo (DAVENPORT, 2003).
As mangueiras podem produzir basicamente três tipos de brotos.
Brotos vegetativos com apenas folhas; brotos generativos que possuem panículas terminais; e brotos mistos com folhas e inflorescências dentro dos mesmos nós (DAVENPORT, 2007, 2009; SANDIP et al., 2015). A profundidade da poda, o manejo de nitrogênio foliar e manejo da água são três fatores importantes que determinam a ocorrência ou não de um segundo fluxo indesejável. Esses fatores interagem para promover ou evitar uma segunda emissão de broto vegetativo (DAVENPORT, 2003).
Plantas que receberam a poda de uniformização desenvolveram gemas e panículas florais uniformemente por todo o dossel, enquanto que nas plantas que não foram podadas foi observado um florescimento irregular, com presença de gemas florais, panículas em desenvolvimento e panículas com abertura floral na mesma planta (OLIVEIRA et al., 2017). De acordo com esses autores, a poda associada com a aplicação de paclobutrazol (PBZ) favorece um maior número de panículas por ramo e uma maior porcentagem de floração.
O PBZ é um triazol que reduz os níveis do promotor vegetativo (PV).
Acredita-se que esse promotor seja uma giberelina (DAVENPORT, 2003;
UPRETI et al., 2013), nesse caso, o PBZ inibe a biossíntese de giberelinas. O declínio consistente do PV com aumento nas citocininas e ácido abscísico, em combinação com carboidratos suficientes acumulados nas gemas, favorecem induções florais em mangueira (SANDIP et al., 2015). O produto deve ser depois da emissão de pelo menos dois ramos/fluxos vegetativos (MOUCO, 2015). Essa aplicação induz mudanças na fisiologia da planta, como a melhoria na absorção de nutrientes, realocação rápida de fotoassimilados, aumento da
relação C:N, equilíbrio hormonal e alteração no balanço hídrico (UPRETI et al., 2013), promovendo assim a maturação dos ramos (TAIZ; ZEIGER, 2017).
No manejo da floração, são realizadas pulverizações com sulfato de potássio (2% a 2,5%) após 30 dias da aplicação do PBZ, para conter a emissão de ramos vegetativos, participando do processo de maturação dos ramos (MOUCO, 2015). As brotações vegetativas sofrem alterações distintas desde o início do desenvolvimento até a maturação. Inicialmente os ramos são de cor verde clara. Mais ou menos duas semanas após adquirem coloração avermelhada e pouca lignificação. Após dois meses está com uma lignificação maior e uma coloração verde escura, aspecto de um ramo maduro. As folhas acompanham a maturação do ramo (SANDIP et al., 2015).
O estresse hídrico reduz as porcentagens de crescimento vegetativo, a área foliar da mangueira e o período entre a plena floração e maturidade em consequência do seu efeito significativo na redução da concentração de N (HELALY et al., 2017). Esse manejo não é capaz de induzir a floração quando realizado independentemente. No entanto, a idade do último fluxo impactado pela duração do estresse é o que impulsiona esse evento, que evita a iniciação da parte aérea e mantém a planta em repouso até que ocorra o acúmulo de idade nas folhas e ocorra o florescimento devido à redução do promotor vegetativo (PV), que depende da idade foliar (RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010).
Após os brotos alcançarem a maturidade prossegue com a indução floral (RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010; JAMEEL et al., 2018), que é a pulverização via foliar com sais de nitrato para estimular a brotação reprodutiva, somente se as gemas estiverem diferenciadas. As aplicações devem ser feitas em períodos do dia com temperaturas mais amenas. Deve-se atentar bem ao tempo certo de iniciar a indução floral, tomando como base a idade dos ramos, o teor de N e observando o efeito da temperatura, pois, ao iniciar mais cedo o resultado é broto vegetativo ao invés de flores. Porém, se as plantas estiverem prontas para receber o estímulo, em um período de dez dias é possível ver brotos florais (DAVENPORT, 2003; DAVENPORT, 2007).
O KNO3 induz a atividade da redutase do nitrato (RN), enzima chave na via de assimilação de nitrato para a síntese de aminoácidos, em particular a metionina (ANUSUYA et al., 2018), que promove o florescimento na mangueira e é precursor do etileno (SUDHA et al., 2012). Esses autores registraram maior
teor de N em plantas tratadas com KNO3 em comparação ao uso de uréia, NH4NO3 e Ca(NO3)2, o que pode melhorar a floração, frutificação e rendimento em cultivares de manga.
Na figura 1 estão representadas as diferentes fases do manejo da floração em mangueira no Semiárido brasileiro. Como visto, o manejo inicia com a poda de produção após a colheita. Depois da brotação de no mínimo dois fluxos vegetativos faz a aplicação do PBZ. Aos 30 dias do PBZ iniciam as pulverizações com sulfato de potássio (em torno de três) e aos 80 dias pode ser feita a redução da lâmina de água. As pulverizações com uma das fontes de nitrato devem ser iniciadas quando os ramos se apresentarem maduros para dar início ao florescimento dos ramos e à produção de frutos (MOUCO, 2015).
Figura 1. Esquema do manejo da floração em mangueira (Mangifera indica L.) em condições semiáridas.
Existe um promotor florigênico (PF) em folhas de mangueira em níveis regidos pela temperatura, que é translocado via floema para gemas apicais e induz a floração (DAVENPORT, 2009; RAMÍREZ et al., 2010). Alta taxa de PF/PV favorece a indução floral, baixa taxa PF/PV favorece crescimento vegetativo e razões intermediárias favorecem brotos mistos. Em condições quentes, para induzir a floração, os níveis de PV devem cair para níveis suficientemente baixos para aumentar a razão PF/PV (SANDIP et al., 2015).
Temperatura máxima superior a 30°C e mínima superior a 25°C favorece o crescimento vegetativo, enquanto que temperaturas variando entre 18°C (mínima) e 28°C (máxima) induzem o florescimento (LIMA FILHO et al., 2002).
30 dias
50 dias Poda pós
colheita PBZ após
2º fluxo vegetativo
Maturação de ramos
Indução floral:
nitratos
Nos trópicos, a idade do último fluxo é o fator dominante que regula a floração (DAVENPORT, 2007).
Durante a fase de floração o teor de N diminui, provavelmente devido à atividade enzimática e à síntese de hormônios que estimularam a produção de carboidratos necessários para a divisão e alongamento celular para os novos brotos (ZUAZO et al., 2008). Costa et al. (2011) observaram também que nas folhas de mangueira os maiores teores de N ocorrem antes da floração, e que na plena floração e formação de frutos, os níveis desse nutriente são mais baixos. Galli et al. (2009) encontraram teores excessivos de N em folhas de mangueira na fase vegetativa, decrescendo nas fases seguintes. Urban et al.
(2004) ao estudarem o efeito inibitório da floração e crescimento do fruto na fotossíntese foliar de mangueira, observaram que o teor foliar de N por unidade de massa foi diminuindo do início até o final da fase de floração, tanto em folhas de brotos vegetativos quanto nas folhas próximas às inflorescências.
Resultados diferentes podem ser encontrados na literatura. Faria et al.
(2016) observaram, em folhas de mangueira cv. Tommy Atkins, maior conteúdo de N na fase de floração. Esse resultado pode ser devido às aplicações de nitrato de cálcio para o manejo da indução floral que favoreceram as altas concentrações do nutriente. Medeiros et al. (2004) também relatam que os teores foliares de N são maiores no florescimento do que nas outras fases fenológicas da cultura da manga.
A análise foliar baseia-se na premissa de que a folha é altamente sensível à disponibilidade de nutrientes no solo, de modo a refletir os efeitos líquidos da profundidade do solo, implicações das interfaces raiz-solo, translocação e condições fisiológicas, sendo assim considerado o centro da atividade fisiológica das plantas (RAMÍREZ; DAVENPORT, 2010). Esses autores afirmam que conhecer o teor de nutriente foliar é valioso para determinar as exigências nutricionais da planta e estabelecer a fertilização ideal no estágio específico de desenvolvimento.
Metabolismo do nitrogênio (N)
O nitrogênio (N) é essencial para a síntese de proteínas nas plantas e a deficiência desse elemento pode comprometer o complexo enzimático do vegetal (CARNEIRO et al., 2015). Além da função estrutural, o N atua como sinalizador para a transcrição de genes específicos relacionados com a sua
absorção, transporte e assimilação, bem como para o balanço hormonal endógeno de auxinas e citocininas, que atuam no crescimento e desenvolvimento vegetal (MILLER et al., 2007; GARNICA et al, 2010).
A concentração de N no solo é reduzida, por outro lado o N atmosférico é abundante, mas não está prontamente disponível para absorção pelas plantas, precisa ser transformado nas formas inorgânicas para ser absorvido pelas vias radiculares. Os íons amônio (NH4+
) e nitrato (NO3-
) são as fontes de N mais disponíveis, sendo o NO3-
a principal e maior fonte na maioria dos solos (MARSCHNER; MARSCHNER, 2012), porém, a preferência de absorção entre ambos pode variar de acordo com a espécie (SILVA, 2016). No entanto, uma maior concentração de N no solo não significa maior absorção do nutriente e síntese de proteína pelas plantas, pois, esses processos dependem de vários fatores como disponibilidade de C, energia, atividade de enzimas e condições climáticas como temperatura e chuva (FERREIRA et al., 2015).
O NO3-
é absorvido ativamente via sistema simporte, com transporte simultâneo de dois H+ e um NO3-
para o interior da célula, com o custo energético de dois moles de ATP para cada mol de NO3-
absorvido. A absorção do NH4+
ocorre passivamente via sistema uniporte, estando prontamente disponível para incorporação sem gasto de energia (TAIZ; ZEIGER, 2017).
Os vegetais assimilam a maior parte do NO3-
em compostos orgânicos por meio de processos redutivos. A primeira etapa desse processo é a redução do NO3-
a nitrito (NO2-
), que ocorre no citosol e é catalisada pela enzima redutase do nitrato (RN) (DEBOUBA; DGUIMI; GHORBEL, 2013), que envolve a transferência de dois elétrons por meio do NAD(P)H ou NADH. Esse elemento é altamente reativo e potencialmente tóxico, sendo transportado para os cloroplastos nas folhas ou para os plastídios nas raízes. A segunda etapa do processo segue com a redução do NO2-
a NH4+
. Essa reação é catalisada pela enzima nitrito redutase e envolve a transferência de seis elétrons, tendo a ferredoxina como cofator (SOLOMONSON; BARBER, 1990; KERBAUY, 2008;
MARSCHNER; MARSCHNER, 2012; TAIZ; ZEIGER, 2017).
O NH4+
, seja absorvido, advindo da assimilação do nitrato, ou da fotorrespiração, é incorporado em compostos orgânicos, glutamina e glutamato, por meio das enzimas Glutamina sintetase (GS) e Glutamato sintase (GOGAT), que translocam N orgânico entre as células fonte e dreno e geram todos os
demais compostos nitrogenados. O amônio também pode ser assimilado por uma rota alternativa através da enzima Glutamato Desidrogenase (GDH), que é ativada quando o NH4+
está em concentrações elevadas (KERBAUY, 2008;
MARSCHNER; MARSCHNER, 2012; TAIZ; ZEIGER, 2017).
A assimilação de NH4+
tem um menor gasto de energia metabólica em comparação com a assimilação de NO3-
, com uma economia de 9%, visto que não requer a atividade da enzima RN. Em contrapartida, a assimilação de NO3-
envolve uma transferência de dez prótons e oito elétrons (BRITTO;
KRONZUCKER, 2002; FAGERIA, 2009).
O NO3-
pode ser assimilado na raiz ou ser transportado para as folhas e ser assimilado na parte aérea (BREDEMEIER; MUNDSTOCK, 2000). Há relatos de aRN em tecido não fotossintetizante, no entanto, a redução do NO3-
nas folhas é menos dispendiosa quando comparada com a redução na raiz. Os tecidos fotossintetizantes são locais mais adequados para esse evento, pois, os oito elétrons utilizados no processo completo de redução advém da fase fotoquímica da fotossíntese (MARTUSCELLO et al., 2016). Souza et al. (2016) observaram a redução do nitrato em folhas e raízes de mangueira (Mangifera indica L.) ao quantificarem a aRN nesses tecidos, sendo maior no tecido radicular. Oliveira et al. (2005) também observaram a atividade da enzima em folhas e raízes de Bactris gasipaes, porém maior atividade nas folhas.
O metabolismo de N é importante para a formação de aminoácidos e proteínas, essenciais para um maior desenvolvimento e produtividade das culturas. Portanto, faz-se necessário entender o processo de aproveitamento e assimilação desse nutriente com o objetivo de promover uma maior eficiência no uso de N no sistema solo-planta (VIANA, 2007).
A redutase do nitrato (RN)
A redutase do nitrato (RN) é a primeira enzima do metabolismo e assimilação do nitrogênio (N), catalisando a reação de nitrato (NO3-
) a nitrito (NO2-
), e desempenha um importante papel na resposta das plantas à deficiência desse elemento (KICHEY et al., 2006, 2007; ANDREWS et al., 2013; KAUR et al., 2015). Além disso, a sua atividade determina a taxa de assimilação de NO3-
em compostos orgânicos nitrogenados (LILLO, 2008;
HEIDARI et al., 2011), ou seja, baixa atividade da redutase do nitrato (aRN) indica baixa assimilação de N (MARTUSCELLO et al., 2016).
A RN em plantas superiores é constituída de duas subunidades idênticas, com três grupos prostéticos cada, sendo eles flavina adenina dinucleotídeo (FAD), heme e um complexo formado pelo molibdênio (Mo) e uma molécula orgânica chamada pterina (SOLOMONSON; BARBER, 1990;
TAIZ; ZEIGER, 2017). Nos tecidos vegetais, esta enzima é a principal proteína que contém Mo, em consequência disso, a deficiência desse nutriente pode ocasionar o acúmulo de nitrato devido à redução da aRN (TAIZ; ZEIGER, 2017).
Muitos fatores regulam a atividade da RN, como por exemplo, nitrato e potássio que induzem a sua atividade em mangueira, o que pode ser observado com a resposta da planta à aplicação de nitrato de potássio (KNO3) (COUTINHO et al., 2016; ANUSUYA et al., 2018). Segundo Oliveira et al.
(2005), a luz e o estado hídrico da planta também modelam a sua atividade.
Guilherme et al. (2019) afirmaram o mesmo quanto à intensidade luminosa, considerando-a um fator regulador da aRN. Segundo Tanan (2019), em Physalis angulata L., nos períodos de maior radiação solar, ao longo do dia, ocorrem os picos de atividade da enzima na raiz, acontecendo o inverso na folha, sendo menor a atividade nesses mesmos momentos. Da mesma forma foi observado em folhas de café (Coffea arabica L.) por Queiroz et al. (1993), um declínio gradual da atividade da enzima no decorrer do período luminoso.
Enquanto Santos et al. (2014) inferiam que em Saccharum officinarum L. a enzima é mais ativa nos horários de maior intensidade de radiação solar global e que os níveis mais baixos encontrados em condições de menor radiação solar podem estar ligados a um mecanismo de controle rápido da enzima. De um modo geral a atividade da enzima varia entre espécies de plantas, formas de crescimento e habitats, sendo menor para espécies lenhosas (RAJSZ et al., 2018).
A expressão dos genes da RN é rapidamente induzida em várias plantas na presença de nitrato (KONISHI; YANAGISAWA, 2011), pois, a síntese da enzima é induzida pelo próprio substrato, o que explica o aumento da sua atividade em maiores doses de N (MARTUSCELLO et al., 2016). O equilíbrio da redutase do nitrato é determinado pela sua taxa de síntese e
degradação. A meia vida da enzima recém sintetizada é de poucas horas na célula e, quando a concentração de nitrato no substrato diminui, a atividade da enzima também diminui rapidamente (TAIZ; ZEIGER, 2017).
A RN é considerada um fator limitante para o crescimento, desenvolvimento e produção de proteínas em plantas que assimilam nitrato (SOLOMONSON; BARBER, 1990), pois, sem esta enzima, não ocorre a assimilação (KAUFHOLDT et al., 2016). Devido ao seu papel regulador, está correlacionada indiretamente com a produtividade das culturas, pressupondo que plantas com alta atividade dessa enzima teriam maior capacidade de assimilar o nitrato disponível e, consequentemente, maior capacidade de resposta à adubação nitrogenada (VIANA, 2007).
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CAPÍTULO 2
VERIFICAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS PARA ANÁLISE DA REDUTASE DO NITRATO EM MANGUEIRA (Mangifera indica L.)1
RESUMO
A redutase do nitrato é a enzima chave na redução do nitrato (NO3-
) em plantas, pois catalisa a primeira reação desse processo e é considerada limitante para a produção dos vegetais. Sua atividade pode ser quantificada pelo método in vivo, por meio da concentração de nitrito difundido do interior da célula vegetal para o meio de incubação. O método pode diferir entre espécies, por esse motivo requer adaptações para cada cultura. O objetivo do trabalho foi verificar as melhores condições para a quantificação da atividade da redutase do nitrato (aRN) em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer, estudando os fatores: tempo de incubação, concentração de n-propanol, concentração de nitrato e pH no meio de incubação. A coleta do material vegetal foi realizada em plantas dispostas aleatoriamente, em pomar comercial de mangueira com aproximadamente cinco anos de idade, em Petrolina-PE. Foram realizados 16 ensaios, em triplicata, sob as condições do planejamento fatorial , com dois níveis (+1 e - 1) para cada fator. Os fatores avaliados não atuam de forma independente. A condição que favorece a obtenção da maior atividade da redutase do nitrato em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens é pH 8,5, n-propanol 1% e 50 mM de nitrato de potássio (KNO3). O melhor tempo de incubação em folhas é 60 minutos e em raízes 45 minutos.
Palavras-chave: Atividade enzimática. Redução do nitrato. Meio de incubação.
ABSTRACT
Nitrate reductase is a key enzyme for nitrate reduction (NO3-
) in plants, as it catalyzes the first reaction of this process and it may be considered limiting for the production of the plants. Its activity can be quantified by the in vivo method, through of the nitrite concentration diffused from the interior of the plant cell to the incubation medium. The method may differ among species; therefore, it requires adaptations for each crop. This work aimed to verify the best conditions for the quantification of nitrate reductase activity (NRa) in first and second flow leaf and young roots of mango trees (Mangifera indica L.) cv. Palmer, studying the factors: incubation time, n-propanol concentration, nitrate concentration, and pH in the incubation medium. The vegetal sample was collected in randomly arranged mango trees five years old, grown in a commercial orchard with approximately, in Petrolina-PE. Sixteen trials were carried out, in triplicate, under the conditions of factorial planning 24, with two levels (+1 and -1) for each factor. The factors evaluated do not act independently. The condition that promotes the highest nitrate reductase activity in first and second flow leaf and
1 Artigo a ser submetido para publicação
roots is pH 8,5, n-propanol 1% and 50 mM of potassium nitrate (KNO3). The best incubation time for leaf is 60 minutes and for roots is 45 minutes.
Keywords: Enzymatic activity. Reduction of nitrate. Incubation medium.
INTRODUÇÃO
A mangueira é cultivada em diferentes ambientes, no entanto, para a obtenção de elevada produtividade e qualidade dos frutos é necessária a interação entre os diversos fatores de produção, em especial o fornecimento de nutrientes de acordo com a sua exigência nutricional. O nitrogênio (N) é um dos macronutrientes mais importantes para a cultura, pois é constituinte da clorofila, proteínas, hormônios de crescimento e enzimas, sendo assim o fornecedor de componentes essenciais para produção de ramos, folhas e frutos (RAMÍREZ;
DAVENPORT, 2010). A demanda é maior na fase vegetativa da planta e influencia na relação entre o crescimento vegetativo, emissão de gemas florais e frutificação. Sua deficiência pode afetar negativamente a produção (COSTA et al., 2008).
A eficiência da planta na utilização do N leva em consideração os aspectos de absorção e metabolização desse elemento. Uma vez que o nitrogênio foi absorvido, pode ser assimilado na raiz ou ser transportado para as folhas e ser assimilado na parte aérea (BREDEMEIER; MUNDSTOCK, 2000). Após a sua entrada na célula, o nitrato (NO3-
) pode ser reduzido a nitrito (NO2-
) no citosol ou armazenado no vacúolo da célula para posterior redução e assimilação (CRAWFORD, 1995).
O processo de redução de NO3-
é de importância biológica fundamental e é catalisado pela enzima redutase do nitrato (RN). A reação inicial é a etapa mais limitante para o crescimento, desenvolvimento e produção de proteínas em plantas que assimilam esse elemento (CRAWFORD, 1995), por isso a RN foi considerada enzima chave na regulação do metabolismo de N. Esse seu papel regulador permite que a enzima seja relacionada, indiretamente, com a produtividade das culturas, baseado na pressuposição de que plantas com maior atividade da redutase do nitrato (aRN) tem maior capacidade de redução do nitrato disponível e uma maior capacidade de responder à adubação nitrogenada (BEEVERS; HAGEMAN, 1969).
A quantificação da aRN pode ser feita por ensaios in vitro e in vivo. As técnicas in vitro empregam a extração da enzima por moagem do tecido vegetal em meios de incubação adequado e medem a aRN em um meio de reação (HARPER; COOPER, 1970). Na técnica in vivo é feita a incubação do tecido vegetal original num meio de mistura reacional (HARPER; HAGEMAN, 1972; HARPER; NICHOLAS; HAGEMAN, 1973; JAWORSKI, 1971). Sugere-se que seja feita a adequação do método de análise da atividade da enzima para cada espécie, devido às diferentes respostas que têm sido mostradas na literatura, a fim de se obter um protocolo confiável e reproduzível (OLIVEIRA et al., 2005).
A adequação do método in vivo tem sido realizada variando os fatores que podem influenciar na quantificação da aRN, como por exemplo o tempo de incubação, a concentração de n-propanol, a concentração de nitrato e o pH do tampão (MEGURO; MAGALHÃES, 1982; CARELLI, 1987; OLIVEIRA et al., 2005; SANTOS, 2013; DOVIS et al., 2014). Os autores tem utilizado o método univariado de análise de dados. Tal método é normalmente empregado com o objetivo de identificar a diferença entre os tratamentos, considerando individualmente cada fator estudado e desconsiderando o efeito simultâneo entre esses fatores (MIGUEL et al., 2011). Os dados podem ser analisados pelo método de análise multivariado, onde mais de um fator pode ser estudado simultaneamente, bem como a interação entre os fatores, com o objetivo de conhecer o efeito conjunto numa determinada resposta (GIESBRECHT;
GUMPERTZ, 2004; PAES, 2010; MONTGOMERY, 2013). No entanto, não foi verificado o uso desse método na quantificação da aRN.
Na análise multivariada pode ser utilizado o planejamento fatorial. No planejamento fatorial , o nível de cada fator é reduzido para dois, máximo (+1) e mínimo (-1). A construção dos planos é relativamente simples e a interpretação dos resultados dos experimentos tende a ser clara (GIESBRECHT; GUMPERTZ, 2004). Esse planejamento fornece o menor número de experimentos com os quais os fatores podem ser estudados em um planejamento fatorial completo. Por esse motivo, são projetos muito utilizados em experimentos de triagem de fator (MONTGOMERY, 2013).
Desse modo, o trabalho foi desenvolvido com o objetivo de verificar as melhores condições para a quantificação da atividade da redutase do nitrato
(aRN) em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e em raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer, estudando os fatores: tempo de incubação, concentração de n-propanol, concentração de nitrato e pH no meio de incubação.
MATERIAL E MÉTODOS
As análises laboratoriais foram realizadas nos laboratórios de Química Analítica e de Fisiologia Vegetal da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Campus Ciências Agrárias (CCA), situada no município de Petrolina- PE, em maio de 2019.
A coleta do material vegetal foi realizada em pomar comercial de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer, na fase de frutificação, com aproximadamente cinco anos de idade, plantas espaçadas em 7 x 2 m e área total de 4,7 ha, na fazenda Frutavi, localizada no Perímetro Irrigado Nilo Coelho, Petrolina- PE ( 9°18'19.2" S de latitude, 40°33'55.9" O de longitude, a uma atitude 365,5 m acima do nível do mar).
Foi aplicado o planejamento fatorial completo 24, com 4 fatores em 2 níveis (+1 e -1) (Tabela 1). Os níveis foram escolhidos baseados em experimentos encontrados na literatura (OLIVEIRA et al., 2005; SANTOS, 2013; DOVIS et al., 2014). Foi gerada uma matriz com o total de 16 ensaios realizados em triplicata (Tabela 2). Os parâmetros experimentais selecionados para o planejamento fatorial 24 foram: tempo de incubação (min) e os componentes do meio de incubação (tampão fostafo), concentração de N- propanol (%), concentração de nitrato de potássio (mM) e pH.
Tabela 1. Níveis mínimos (-1) e máximos (+1) dos fatores estudados na quantificação da atividade da redutase do nitrato (aRN) em folhas de 1º e 2º fluxo vegetativo e raízes jovens de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Palmer.
Fatores Níveis
-1 +1
Tempo de incubação (min) 15 75
N-propanol (%) 1 5
Nitrato (mM) 0 200
pH 6,67 8,5
