Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Maria Helena Tavares de Matos
ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRAESTRUTURAL DE
FOLÍCULOS PRIMORDIAIS OVINOS CONSERVADOS EM
SOLUÇÃO SALINA 0,9% E TCM 199
Fortaleza, Ceará
Julho de 2003
Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Maria Helena Tavares de Matos
ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRAESTRUTURAL DE
FOLÍCULOS PRIMORDIAIS OVINOS CONSERVADOS EM
SOLUÇÃO SALINA 0,9% E TCM 199
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução Animal Orientador: Dr. José Ricardo de Figueiredo
Fortaleza, Ceará Julho de 2003
M425a Matos, Maria Helena Tavares de.
Análise morfológica e ultraestrutural de folículos primordiais ovinos conservados em solução salina 0,9% e TCM 199/Maria Helena Tavares de Matos. 2003.
65p. il.; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Ovino. 2. Reprodução animal. 3. Folículos Primordiais. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.0824
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Análise morfológica e ultraestrutural de folículos primordiais
ovinos conservados em solução salina 0,9% e TCM 199
Maria Helena Tavares de Matos
Aprovada em 18/07/2003
Banca examinadora:
____________________________ __________________________________ Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Prof. Dr. Marcos Antonio Lemos de Oliveira Orientador Examinador
_____________________________ Prof. Dr. José Ferreira Nunes Co-orientador/Examinador
Aos meus pais, Ao Dr. José Ricardo de Figueiredo, Dedico.
“Antes de começar a reformar o mundo, dá três voltas ao redor de tua própria casa”.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela coragem e força para vencer mais uma etapa! Aos meus pais (Eduardo José Pereira de Matos e Maria Tavares de Matos) e à minha irmã Márcia Andréa Tavares de Matos, que viveram comigo a história de cada passo dessa caminhada. Sei que vocês sempre estiveram felizes quando estive feliz, angustiados quando a angústia me assaltou, exultantes com o meu sucesso, preocupados com as minhas desilusões. Agradeço pela compreensão, pelo apoio e, principalmente, pelo amor de vocês. Eu os amo muito!
Ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo, exemplo de pessoa íntegra, humilde e excelente profissional. Obrigada pela paciência, por acreditar em meu trabalho e por ajudar a trilhar meu caminho tanto na pesquisa, como na vida pessoal.
Aos meus co-orientadores Prof. Dr. José Ferreira Nunes e Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, pesquisadores dedicados e entusiastas, sempre dispostos a ajudar em algo relacionado ao trabalho ou fora dele. Minha admiração e respeito.
Às minhas amigas Vanessa Anderson Costa, Tatiana Feitosa e Camilla Harumi, com quem compartilhei momentos de alegria e de frustrações, que me fizeram sorrir e me encorajaram para o sucesso.
Aos companheiros do LAMOFOPA, pela amizade e espírito de cooperação. A contribuição de vocês foi fundamental para a realização deste trabalho: Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Christiani Andrade Amorim, José Roberto Viana Silva, Juliana Jales de Holanda Celestino, Marcos Antônio Leal Ferreira, Regiane Rodrigues dos Santos e Sônia Helena Furtado Costa.
À Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci e à Profa. Dra. Sônia Nair Báo, pela atenção, dedicação e pelos ensinamentos oferecidos durante o estágio no Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília.
Ao Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, especialmente, ao Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas, pelo apoio técnico durante a realização deste trabalho.
Aos meus colegas e amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), especialmente, um forte agradecimento aos meus amigos de coração: Cesarino Aprígio Lima, Luziana Tavares Braga, Viviane Moura de Farias e Vivina Monteiro. Espero que a nossa amizade seja para sempre. Admiro cada um de vocês!
Aos meus tios Joaquim Antunes e Clélia Ramos e às primas Micheline e Milene Ramos de Carvalho, pelo carinho com que me acolheram em Brasília, contribuindo imensamente para a realização deste trabalho.
A todos os professores do PPGCV, sempre dispostos a dar uma palavra de apoio e amizade.
Às secretárias do PPGCV, Alzenira Andrade e Adriana Albuquerque, pelo carinho, atenção e respeito sempre dispensados.
Ao Sr. José Adauto de Souza, pela doação dos ovários utilizados neste experimento, sem os quais não seria possível a realização deste trabalho.
À Universidade Estadual do Ceará, pela oportunidade de realização do Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos durante todo o período de realização do curso de mestrado.
A todos que não foram aqui mencionados, mas que direta ou indiretamente me ajudaram durante a realização deste trabalho. Os meus mais sinceros agradecimentos.
RESUMO
O objetivo do presente trabalho foi investigar as características morfológicas e ultraestruturais de folículos primordiais ovinos conservados em solução salina 0,9% e TCM 199, utilizando diferentes temperaturas (4, 20 ou 39 ºC) e tempos (2, 4, 12 ou 24
h) de incubação. No abatedouro, o par ovariano de cada animal foi dividido em 25 fragmentos. Um fragmento ovariano foi escolhido aleatoriamente e imediatamente fixado em Carnoy para avaliação morfológica (controle - tempo zero - tratamento 1). Os outros 24 fragmentos foram aleatoriamente distribuídos em tubos contendo 2 mL de solução salina 0,9% ou TCM199 a 4, 20 ou 39 ºC, por 2, 4, 12 ou 24 h (tratamentos 2-25). A análise histológica mostrou que a conservação de fragmentos ovarianos em solução salina 0,9% a 20ºC por até 24 h e em ambas as soluções a 39ºC por 4, 12 ou 24 h aumentou significativamente (P < 0,05) a porcentagem de folículos primordiais degenerados quando comparado ao controle. Ao contrário, a conservação a 4ºC em ambas as soluções manteve a porcentagem de folículos primordiais morfologicamente normais similar ao controle. A análise histológica mostrou a integridade morfológica dos folículos primordiais ovinos conservados a 20ºC por até 24 h em TCM 199, mas estes resultados não foram confirmados pela análise ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão revelou que somente os folículos primordiais conservados a 4ºC por até 24 h, a 20ºC por até 12 h e a 39ºC por até 2 h em ambas as soluções permaneceram ultraestruturalmente normais. Em conclusão, este estudo mostra que folículos primordiais ovinos podem ser conservados com sucesso a 4ºC por até 24 h, a 20ºC por até 12 h e a 39ºC por 2 h em solução salina 0,9% ou TCM 199.
ABSTRACT
The aim of this work was to investigate the morphological and ultrastructural features of sheep primordial follicles after preservation in 0.9% saline solution and TCM 199 at different temperatures and incubation times. At the slaughterhouse, the ovarian pair of each animal was divided into 25 fragments. One ovarian fragment was taken randomly and immediately fixed in Carnoy for morphological evaluation (control – time zero – treatment 1). The other 24 fragments were randomly distributed in tubes containing 2 mL of 0.9% saline solution or TCM 199 and maintained at 4, 20 or 39ºC for 2, 4, 12 or 24 h (treatments 2-25). Histological analysis showed that the storage of ovarian fragments in 0.9% saline solution at 20ºC for up to 24 h and in both solutions at 39ºC for 4, 12 or 24 h significantly increased (P < 0.05) the percentage of degenerated primordial follicles when compared with control. In contrast, the preservation at 4ºC in both solutions, kept the percentage of morphologically normal primordial follicles similar to control values. The histological analysis revealed a morphological integrity of sheep primordial follicles stored at 20ºC for up to 24 h in TCM 199, but these results were not confirmed by ultrastructural analysis. The transmission electron microscopy revealed that only primordial follicles stored at 4ºC for up to 24 h, at 20ºC for up to 12 h and at 39ºC for up to 2 h in both solutions were ultrastructurally normal. In conclusion, this study shows that sheep primordial follicles can be preserved successfully at 4ºC for up to 24 h, at 20ºC for up to 12 h and at 39ºC for 2 h in 0.9% saline solution or TCM 199.
SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
INTRODUÇÃO 01
REVISÃO DE LITERATURA 02
1) O ovário mamífero 02
2) Oogênese e foliculogênese em ruminantes 02
2.1) Oogênese 02
2.2) Foliculogênese 03
3) Classificação e caracterização estrutural dos folículos ovarianos 04 3.1) Formação e início do crescimento de folículos primordiais
in vivo
04
3.2) Crescimento de folículos primários e secundários 05
3.3) Crescimento de folículos antrais (terciários) 05
4) População folicular 06
5) Atresia 07
5.1) Degeneração 08
5.2) Apoptose 08
5.3) Métodos utilizados para análise da atresia folicular 09
5.3.1) Histologia Clássica 09
5.3.2) Microscopia Eletrônica de Transmissão 09
5.4) Taxa de degeneração folicular in vivo 11
6) Estado atual da biotécnica de MOIFOPA 11
7) Resfriamento de folículos pré-antrais caprinos e ovinos 12
JUSTIFICATIVA 14
OBJETIVOS 16
Objetivos específicos 16 Artigo: Análise morfológica e ultraestrutural de folículos primordiais
ovinos conservados em solução salina 0,9% e TCM 199 18
CONCLUSÃO GERAL 53
PERSPECTIVAS 54
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ATP- :Adenosina Trifosfato
CGP - :Células Germinativas Primordiais
DNA - :Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) GDF - :Fator de Diferenciação de Crescimento
FIV - :Fertilização In Vitro
FSH - :Follicle-Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)
ºC - :Grau Celsius
HC - :Histologia Clássica
h - :Horas
IA - :Inseminação Artificial
KL - :Kit Ligand
LAMOFOPA - :Laboratório de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais
LH - :Luteinizing Hormone (Hormônio Luteinizante)
MOIFOPA :Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
µm - :Micrômetro
MET - :Microscopia Eletrônica de Transmissão
mL - :Mililitro
PBS - :Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato Salina)
REL - :Retículo Endoplasmático Liso
RER - :Retículo Endoplasmático Rugoso
SE - :Sincronização de Estro
TCM - :Tissue Culture Medium
INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de novas biotecnologias relacionadas à área de reprodução animal é uma das prioridades para aumentar o potencial reprodutivo de machos e fêmeas de alto valor zootécnico ou em via de extinção. Atualmente, as biotécnicas mais correntemente utilizadas têm sido a sincronização de estro (SE), a criopreservação de gametas, a inseminação artificial (IA), a transferência embrionária (TE) e a fecundação in vitro (FIV). Por outro lado, biotécnicas como a clonagem, a transgênese e a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA), estão em aperfeiçoamento e certamente terão sua aplicabilidade prática no futuro.
No que diz respeito à MOIFOPA, esta baseia-se no isolamento, conservação (resfriamento e/ou criopreservação) e cultivo de folículos ovarianos pré-antrais, podendo assim, contribuir para a melhor compreensão dos diversos fatores implicados na foliculogênese inicial e no processo de atresia folicular (FIGUEIREDO, 1995). Além disso, o domínio desta biotécnica poderá fornecer milhares de oócitos aptos à maturação e fecundação in vitro. Estes oócitos seriam de fundamental importância em programas de multiplicação de animais de elevado potencial genético e/ou em via de extinção (BEM et al., 1997).
Os folículos primordiais constituem o pool de reserva folicular e são a classe predominante (95%) de folículos pré-antrais (ERICKSON, 1986). Desta forma, estes folículos representam uma importante fonte de oócitos que pode ser utilizada em estudos in vitro (CARROLL et al., 1990). Na tentativa de otimizar as condições de conservação in vitro de folículos pré-antrais, vários meios têm sido testados, merecendo destaque a solução salina 0,9% (CARVALHO et al., 2001) e o TCM 199 (FERREIRA et al., 2001).
Nas seções seguintes, serão abordados aspectos relacionados à oogênese, foliculogênese, atresia folicular, bem como o estado atual da biotécnica de MOIFOPA. Finalmente, será mostrada a importância do desenvolvimento de protocolos de conservação de folículos pré-antrais in vitro para a melhoria da eficiência reprodutiva destes animais. A contribuição científica deste trabalho será apresentada sob a forma de um artigo científico submetido ao periódico Theriogenology.
REVISÃO DE LITERATURA 1) O ovário mamífero
O ovário mamífero é constituído pelas regiões cortical e medular. A região cortical contém folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento, bem como corpos lúteos, álbicans e hemorrágicos. A região medular é localizada na porção mais interna do ovário, com exceção dos eqüídeos, sendo constituída por tecido conjuntivo (fibroblastos, fibronectina e fibras colágenas do tipo I e II), nervos e sistemas vasculares responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ, 1996).
O ovário desempenha uma função endócrina, responsável pela produção e liberação de hormônios esteróides e diversos peptídeos e uma função exócrina ou gametogênica, responsável pela produção e liberação de oócitos (HAFEZ, 1996), a qual é exercida pela interação de dois fenômenos que ocorrem no ovário, a oogênese e a foliculogênese (SAUMANDE, 1991).
2) Oogênese e foliculogênese em ruminantes 2.1) Oogênese
Conforme descrito por RÜSSE (1983), a oogênese em ruminantes consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. A oogênese inicia-se antes do nascimento, mas somente alguns oócitos conseguem completar este processo meses ou anos mais tarde no animal adulto, após a fecundação (WASSARMAN, 1988). Em ovinos e bovinos, ainda na vida embrionária, por volta do 20° e 30° dias de gestação, respectivamente, ocorre a migração de CGP do saco vitelíneo, para a região das gônadas primitivas. Após um processo marcado pelo crescimento celular e pela redistribuição de organelas citoplasmáticas, as CGP dentro do ovário multiplicam-se ativamente e transformam-se em oogônias (GORDON, 1994). Dois tipos de células germinativas com funções diferentes resultam da última divisão mitótica das CGP. Uma inicia, imediatamente, outra divisão mitótica e dá origem a uma
linha de células oogoniais, enquanto a outra permanece em intérfase e divide-se periodicamente, originando novas CGP que divide-se diferenciarão posteriormente em oogônias. Em ovinos e bovinos, a diferenciação das CGP em oogônias ocorre no 31º e 42º dia de gestação, respectivamente (RÜSSE, 1983).
A seguir, as oogônias entram em meiose e diferenciam-se em oócitos (HIRSHFIELD, 1991). A fase que antecede este processo meiótico é marcado pela replicação do DNA (GORDON,1994). Nesta fase, as oogônias passam então a ser denominadas de oócitos. Estes, então formados, começam a primeira divisão meiótica, passando pelos estágios da prófase I (leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno) da primeira divisão meiótica (HIRSHFIELD, 1991). No estágio de diplóteno ou vesícula germinativa da prófase I, ocorre a primeira interrupção da divisão meiótica e formação dos oócitos primários, que permanecem neste estágio até à puberdade (MOORE & PERSAUD, 1994). Na puberdade, imediatamente antes da ovulação, com o pico dos hormônios luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH), os oócitos que terminaram seu crescimento retomam a meiose e o núcleo passa do estágio de vesícula germinativa para diacinese (MOORE & PERSAUD, 1994). Em seguida, ocorre o rompimento da vesícula germinativa, progressão para metáfase I, anáfase I e telófase I, expulsão do primeiro corpúsculo polar e formação do oócito secundário (BETTERIDGE et al., 1989). Inicia-se a seguir a segunda divisão meiótica, onde o núcleo do oócito evolui até o estágio de metáfase II, quando ocorre a segunda interrupção da meiose (GORDON, 1994). O oócito permanece neste estágio até ser fecundado pelo espermatozóide, quando então, completa a meiose e expulsa o segundo corpúsculo polar, formando o oócito haplóide fecundado (MOORE & PERSAUD, 1994).
2.2) Foliculogênese
A foliculogênese, evento iniciado na vida pré-natal na maioria das espécies, pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com o estágio de folículo de De Graaf ou pré-ovulatório (SAUMANDE, 1991).
3) Classificação e caracterização estrutural dos folículos ovarianos
A população folicular ovariana é bastante heterogênea (SAUMANDE, 1991). De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser divididos em: a) folículos pré-antrais ou não cavitários, que abrangem os folículos primordiais, primários e secundários e b) folículos antrais ou cavitários, compreendendo os folículos terciários, de De Graaf ou pré-ovulatório (HULSHOF et al., 1994).
3.1) Formação e início do crescimento de folículos primordiais in vivo Na espécie bovina, entre 120 e 140 dias de vida fetal, uma camada de células somáticas planas, conhecidas também como células da pré-granulosa, originárias do epitélio celômico, circundam os oócitos formando assim os folículos primordiais (RÜSSE, 1983; WANDJI et al., 1992). Para caprinos, o aparecimento de folículos primordiais em fetos foi observado após 62 dias de gestação (BEZERRA et al., 1998). Os folículos primordiais possuem diâmetro médio de 35,23 µm; 18,00 µm e 21,50 µm em bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997), ovinos (AMORIM et al., 2000a) e caprinos (LUCCI et al., 1999a), respectivamente. Após a formação dos folículos primordiais, as células da pré-granulosa param de se multiplicar e entram num período de quiescência. A proliferação celular é retomada somente quando um folículo primordial começa a crescer, dias, meses ou anos após a sua formação (HIRSHFIELD, 1991). Os mecanismos responsáveis pelo início do crescimento folicular, também conhecido como ativação de folículos primordiais, bem como os mecanismos envolvidos na variação do período de início do crescimento folicular são ainda enigmáticos e representam uma das maiores questões relacionadas com a biologia ovariana (FORTUNE et al., 2000). O único fator específico que tem sido relacionado com a ativação de folículos primordiais é o fator stem cell (c-kit). YOSHIDA et al. (1997) relataram que este fator é necessário para a ativação de folículos primordiais. O fator stem cell é produzido pelas células da granulosa, enquanto as células germinativas primordiais e os oócitos expressam receptores para o fator stem cell (MANOVA
et al., 1993). É importante ressaltar que os folículos primordiais representam
Após a ativação, os folículos primordiais gradualmente adquirem células da granulosa de formato cúbico, tornam-se folículos de transição e, em seguida, folículos primários, quando são circundados somente por uma camada de células da granulosa de formato cúbico.
3.2) Crescimento de folículos primários e secundários
Os folículos primários possuem diâmetro médio de 55,06 µm, 35,01 µm e 34,7 µm em bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997), ovinos (AMORIM et al., 2000a) e caprinos (LUCCI et al., 1999a), respectivamente. A multiplicação das células da granulosa dos folículos primários leva à formação de várias camadas de células da granulosa ao redor do oócito, formando os folículos secundários. Em bovinos, o aparecimento de folículos primários e secundários em fetos ocorre aos 140 e 210 dias de gestação, respectivamente (RÜSSE, 1983). Quando duas a três camadas de células da granulosa são formadas, as células da teca podem ser visualizadas em torno da membrana basal (SCARAMUZZI et al., 1993) podendo ser identificada a zona pelúcida (FIGUEIREDO et al., 1995). Os folículos secundários possuem diâmetro que varia de 81 µm a 250 µm em bovinos (BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997) e um diâmetro médio de 66,03 µm e 58,94 µm em ovinos (AMORIM et al., 2000a) e caprinos (LUCCI et al., 1999a), respectivamente. Com o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido folicular, entre as camadas de células granulosa, denominada antro. A partir deste estágio, os folículos passam a ser denominados terciários ou antrais.
3.3) Crescimento de folículos antrais (terciários)
Em bovinos, a formação do antro inicia-se em folículos medindo a partir de 120 µm de diâmetro (LUSSIER et al., 1987; MONNIAUX et al., 1997). Em caprinos, o menor diâmetro observado em folículo terciário de fetos foi de 130 µm (BEZERRA et al., 1998). O aparecimento de folículos terciários na fase fetal, em bovinos, ocorre aos 230 dias de gestação (RÜSSE, 1983). Já a formação de folículos pré-ovulatórios pode ocorrer somente a partir da
puberdade (LUCY et al., 1992). Na espécie ovina, os folículos terciários são formados no 150º dia de gestação (RÜSSE, 1983).
Em bovinos, caprinos e ovinos, os folículos terciários passam por um processo de recrutamento, seleção e dominância que ocorre em intervalos regulares, mas somente alguns folículos podem exercer dominância durante a fase folicular e chegar até a ovulação. Somente na vida pós-natal, sob efeito hormonal, os folículos podem atingir o estágio pré-ovulatório (FORTUNE, 1994). Existem evidências de que o FSH é determinante para a seleção do folículo dominante (ERICKSON & SHIMASAKI, 2001) e que este hormônio influencia o crescimento oocitário (GOSDEN & SPEARS, 1997, GOSDEN, 2002). Nesta fase, os folículos são altamente susceptíveis à atresia. Neste contexto, do total de folículos recrutados, apenas o(s) folículo(s) dominante(s) cresce(m) até o tamanho ovulatório. O mecanismo pelo qual o folículo exerce sua dominância ainda não é completamente conhecido, mas a dominância parece ser mantida por um efeito feedback negativo dos produtos do folículo dominante sobre os níveis de FSH circulante (FORTUNE, 1994). Além dos hormônios, alguns fatores auxiliam no crescimento oocitário, como o Kit-Ligand (KL), produzido pelas células da granulosa e o fator de diferenciação de crescimento-9 (GDF-9), produzido pelo oócito (GOSDEN, 2002). O GDF-9 parece estar diretamente envolvido na regulação do estado de diferenciação das células da granulosa em folículos dominantes, bem como, na ação do FSH nestes folículos(ERICKSON & SHIMASAKI, 2001).
4) População folicular
A população folicular ovariana é dividida em a) folículos pré-antrais ou não cavitários, constituídos pelos folículos primordiais, primários e secundários, e b) folículos antrais ou cavitários compostos pelos folículos terciários, pré-ovulatório ou de De Graaf (HULSHOF et al, 1994). Esta população foi estimada, para bovinos (BETTERIDGE et al., 1989), ovinos (DRIANCOURT et
al., 1991) e caprinos (BEZERRA et al., 1998), em 235.000, 160.000 e 20.000
folículos por ovário, respectivamente.
Vários fatores, além da variação individual, podem afetar o número de folículos presentes no ovário. Dentre eles, podem ser citados raça (CAHILL et
1997), níveis hormonais (PETERS, 1976), genética (ERICKSON, 1966a), estado reprodutivo – fêmeas impúberes, púberes ou prenhes (ERICKSON et
al., 1976) e nutricional do animal (SCARAMUZZI et al., 1993).
5) Atresia folicular
Os folículos ovarianos pré-antrais representam 90% da população folicular (dos quais 95% são folículos primordiais) e são responsáveis pela renovação contínua de folículos antrais no ovário (SAUMANDE, 1991). Entretanto, a grande maioria dos folículos ovarianos pré-antrais (99,9%) não chega até a ovulação, mas sofre um processo conhecido por atresia folicular (FIGUEIREDO, 1995), fazendo com que o desenvolvimento de folículo pré-ovulatório a partir de um folículo primordial seja um evento biológico extremamente raro (IRELAND, 1987).
Segundo INGRAM (1962), vários são os fatores que podem influenciar o processo de atresia, como idade, ciclo reprodutivo, gestação, lactação, hipofisectomia, ovariectomia unilateral, hormônios, nutrição e isquemia.
Observações in vitro sugerem que a atresia não é um processo súbito, envolvendo a morte em conjunto de todas as células da granulosa. A viabilidade de algumas células da granulosa de folículos atrésicos e a ausência de sinais de degeneração dos oócitos, em início de atresia, sugerem que os folículos podem recuperar-se da atresia e retornar à ovulação (HIRSHFIELD, 1989).
A atresia folicular não é igualmente prevalente em todos os estágios de desenvolvimento folicular (FORTUNE, 1994). Em ratos, folículos pré-antrais atrésicos são raros, sendo a atresia predominante em folículos antrais (HIRSHFIELD, 1988). Independentemente da fase na qual ocorre, e apesar de ser um fenômeno natural, a atresia reduz de maneira significativa o número de oócitos viáveis durante a vida útil de um animal, fazendo com que o potencial do ovário seja fracamente aproveitado.
A atresia pode ocorrer por via degenerativa (SAUMANDE, 1991) e/ou apoptótica (FIGUEIREDO, 1995).
5.1) Degeneração
A isquemia é uma das principais causas do desencadeamento da morte celular por degeneração (FARBER, 1982). A redução da oxigenação celular durante a isquemia resulta em diminuição da produção de ATP afetando o funcionamento da bomba de Na+/K+ presente na membrana celular. As mudanças na permeabilidade membranária provocam alterações nos níveis intracelulares de Na+, K+ e Ca++. O aumento do influxo de Na+ para o
citoplasma, que ativa a Na+/K+ ATPase, associado com modificações na distribuição de Ca++ e com aumento de água intracelular podem levar ao aumento do volume celular, vacuolização citoplasmática e, conseqüentemente, degeneração (JENNINGS et al., 1975, BARROS et al., 2001). JURKOWITZ-ALEXANDER et al. (1992) demonstraram que células da glia, em condições de anóxia, podem ter seu volume aumentado em até 200% em relação ao normal. Com a evolução da degeneração, a morte celular é identificada histologicamente como necrose.
5.2) Apoptose
No tocante à apoptose, esta é altamente dependente da expressão de genes. O balanço estabelecido entre o produto dos genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos pode determinar a morte celular por apoptose (HURWITZ & ADASHI, 1992). Quando a apoptose é desencadeada ocorre um desequilíbrio iônico celular e a ativação de endonucleases dependente de Ca++ e Mg++. A
ativação dessas endonucleases causa a fragmentação da molécula de DNA a cada 180 pares de bases nitrogenadas (HUGHES & GOROSPE, 1991; HURWITZ & ADASHI, 1992). A primeira característica da apoptose é a condensação periférica da cromatina nuclear (HURWITZ & ADASHI, 1992). Em seguida, ocorre compactação da célula e fragmentação citoplasmática e nuclear, resultante da formação de múltiplos corpos apoptóticos (HURWITZ & ADASHI, 1992), bem como, redução do conteúdo protéico (BLONDIN et al., 1996).
5.3) Métodos utilizados para análise da atresia folicular
A atresia folicular pode ser detectada por vários métodos, tais como: Histologia Clássica (ANDRADE et al., 2002a), Microscopia Eletrônica de Transmissão (O´SHEA et al., 1978; SILVA et al., 2000), Eletroforese (HUGHES & GOROSPE, 1991), Autoradiofrafia (TILLY et al., 1991), Citometria de Fluxo, ELISA (BLONDIN et al., 1996), Técnica de Tunnel (DRIANCOURT et al., 1997). Dentre os métodos citados, a Histologia Clássica e a Microscopia Eletrônica de Transmissão são os mais correntemente utilizados.
5.3.1) Histologia clássica
A histologia é um método clássico, que avalia a morfologia do citoplasma e do núcleo. Entretanto, a histologia clássica (HC) não avalia a integridade das organelas citoplasmáticas. GOSDEN (2000) observou que a HC é relativamente pouco precisa se realizada imediatamente após a descongelação do tecido ovariano, pois ela detecta somente as alterações superficiais, enquanto as alterações das organelas podem se manifestar após várias horas.
Na análise histológica, as alterações indicativas de atresia em folículos pré-antrais ocorrem primariamente no oócito, sendo a picnose nuclear o primeiro sinal de atresia (JORIO et al., 1991; WOOD et al., 1997). Mais recentemente, SILVA et al. (2002) demonstraram que oócitos de folículos primordiais caprinos são mais sensíveis à degeneração do que as células da granulosa.
5.3.2) Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
A MET é considerada uma boa técnica para avaliação das organelas celulares e das mudanças ultraestruturais (SALEHNIA et al., 2002) ocorridas durante a atresia folicular, sendo, portanto, um método mais preciso. Além disso, recomenda-se utilizar a MET para avaliar a qualidade dos folículos e, particularmente, a dos oócitos inclusos nos mesmos (van den HURK et al., 1998). A MET também é eficiente logo após a descongelação do tecido ovariano, pois é possível detectar alterações súbitas nas organelas e aumento
de volume das mitocôndrias (GOSDEN, 2000). Alguns autores destacaram a importância da análise ultraestrutural após conservação in vitro de folículos pré-antrais caprinos, mostrando que folículos considerados normais após avaliação histológica poderiam apresentar alterações degenerativas na sua ultraestrutura (SILVA et al., 2000; CARVALHO et al., 2001).
As características ultraestruturais de folículos pré-antrais frescos de vacas (FAIR et al., 1997), ovelhas (TASSEL & KENNEDY, 1980), mulheres (OKTAY et al., 1997), porcas da Índia (ADAMS & HERTIG, 1964), camundongas (WASSARMAN & JOSEFOWICZ, 1978) e cabras (LUCCI et al., 2001) têm sido descritas em muitos trabalhos. Estudos têm mostrado que muitas características ultraestruturais dos folículos são semelhantes entre as diversas espécies (van WEZEL & RODGERS, 1996). Entretanto, há variações entre as espécies no que se refere à presença e aparência de algumas organelas (ASSEY et al., 1994).
Na espécie ovina, folículos primordiais normais possuem numerosos vacúolos e mitocôndrias de diferentes formatos espalhados por todo o ooplasma (TASSEL & KENNEDY, 1980). Também são observados complexos de golgi bem desenvolvidos, assim como retículo endoplasmático liso (REL) e rugoso (RER), isolados ou em associação com mitocôndrias ou vesículas. Na espécie caprina, SILVA et al. (2001) sugeriram que esta associação pode estar relacionada com um mecanismo de transporte de substratos para dentro da mitocôndria. As células da granulosa de folículos primordiais contêm um número pequeno de organelas (RÜSSE, 1983).
Ultraestruturalmente, os oócitos inclusos em folículos primordiais ovinos degenerados apresentam um progressivo aumento dos vacúolos citoplasmáticos e retração oocitária, eventos que precedem o aparecimento de alterações nas células da granulosa. Também são observados sinais de danos às membranas e cristas mitocondriais presentes no ooplasma. As células da granulosa tornam-se túrgidas e ocorre diminuição do número de organelas no seu citoplasma (TASSEL & KENNEDY, 1980). Já em folículos antrais, a picnose nuclear e a vacuolização citoplasmática ocorrem primariamente nas células da granulosa (HAY et al., 1976). Em seguida, ocorre o aparecimento de alterações degenerativas nas células tecais (O`SHEA et al., 1978) e, finalmente, no oócito (HAY et al., 1976).
5.4) Taxa de degeneração folicular in vivo
Estudos sobre estimativa da população folicular observaram taxas de degeneração de 6% e 0,1% para folículos pré-antrais caprinos e ovinos, respectivamente (LUCCI et al., 1999a; AMORIM et al., 2000a). Ao contrário, WOOD et al. (1997) obtiveram uma taxa de 65% de folículos pré-antrais felinos degenerados.
Recentemente, SILVA et al. (2002) mostraram que, na espécie caprina, a taxa de degeneração in vivo de folículos secundários (16,8%) era superior à encontrada em folículos primordiais (8,5%) e primários (14,3%), indicando que os folículos secundários são mais sensíveis à degeneração.
6) Estado atual da biotécnica de MOIFOPA
Em virtude da grande perda folicular que ocorre naturalmente in vivo, e na tentativa de utilizar de maneira eficiente o potencial de gametas femininos no futuro, vem sendo desenvolvida a biotécnica de MOIFOPA. Esta biotécnica visa a recuperação dos folículos pré-antrais do ambiente ovariano para, em seguida, cultivá-los in vitro até o estágio de maturação, prevenindo assim, a ocorrência da atresia. Atualmente as etapas mais estudadas desta biotécnica são o isolamento, criopreservação e posterior cultivo in vitro dos folículos pré-antrais.
Em gatas (JEWGENOW & STOLTE, 1996), gambás (BUTCHER & ULLMAN, 1996) e macacas (FORTUNE et al., 1998), já foi observado o crescimento de folículos pré-antrais isolados após o cultivo in vitro, porém sem a formação de antro. Nas espécies bovina (GUTIERREZ et al., 2000; McCAFFERY et al., 2000), ovina (CECCONI et al., 1999), caprina (HUAMNIN & YONG, 2000) e humana (ROY & TREACY, 1993), folículos pré-antrais isolados foram cultivados in vitro e se desenvolveram até o estágio antral. Embriões de ratas (DANIEL et al., 1989) e porcas (WU et al., 2001) foram produzidos a partir de oócitos provenientes de folículos pré-antrais cultivados e fecundados in
vitro. Entretanto, os resultados mais relevantes foram observados em
camundongos, nos quais foi obtido o nascimento de animais a partir de folículos pré-antrais crescidos, maturados e fecundados in vitro (EPPIG &
SCHROEDER, 1989). CARROLL et al. (1990) obtiveram também o nascimento de camundongos após congelação, descongelação, crescimento, maturação e fecundação in vitro de oócitos oriundos de folículos pré-antrais.
Uma etapa limitante para o sucesso da MOIFOPA é a manutenção da qualidade dos oócitos inclusos nos folículos pré-antrais durante o transporte dos ovários até os laboratórios especializados em biotécnicas reprodutivas. Com o objetivo de solucionar essa limitação, foram realizados vários estudos sobre conservação, por resfriamento, de folículos pré-antrais caprinos e ovinos. 7) Resfriamento de folículos pré-antrais caprinos e ovinos
Os estudos sobre resfriamento de folículos pré-antrais caprinos e ovinos realizados no Laboratório de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais (LAMOFOPA - FAVET – UECE) avaliaram o efeito de diferentes meios, temperaturas (4º, 20º ou 39ºC) e tempos de incubação (4, 12 ou 24 h) sobre a porcentagem de folículos normais. Estes trabalhos indicaram a incidência global da degeneração folicular, considerando todas as classes de folículos pré-antrais juntas (folículos primordiais, primários e secundários). Os principais meios utilizados foram o PBS (SANTOS et al., 2001), TCM 199 (FERREIRA et al., 2001; ANDRADE et al., 2002b) e as soluções Braun-Collins (SILVA et al., 2000; CARVALHO et al., 2001; ANDRADE et al., 2001), à base de água de coco (SILVA et al., 2000; ANDRADE et al, 2002a) e salina 0,9% (ANDRADE et al., 2001). Os resultados mostraram que a conservação de fragmentos ovarianos caprinos e ovinos a 4ºC por até 24 h, tanto em soluções pobres (salina – COSTA et al., 2000) ou ricas (TCM 199 – FERREIRA et al., 2001) em nutrientes, manteve a porcentagem de folículos morfologicamente normais similar ao controle. Especificamente na espécie ovina, a conservação de fragmentos ovarianos a 20ºC por 4 h em PBS (SANTOS et al., 2001) e nas soluções salina 0,9% e Braun-Collins (ANDRADE et al., 2001) e por 12 h em TCM 199 e na solução à base de água de coco (ANDRADE et al., 2002a,b), manteve a porcentagem de folículos pré-antrais normais similar ao controle. Por outro lado, a preservação de folículos pré-antrais caprinos e ovinos à 39ºC, que é a temperatura fisiológica do animal, em todos os tempos de incubação testados (até mesmo 4 h), aumentou significativamente a taxa de degeneração folicular quando comparada ao controle.
CARVALHO et al. (2001) mostraram que a taxa de degeneração in vitro de folículos secundários caprinos é superior a de folículos primordiais após conservação à 39ºC por 4 h em solução salina 0,9%, à 20ºC por 24 h e 39ºC por 12 h em solução Braun-Collins.
Dentre os meios utilizados no resfriamento, a solução salina 0,9% é isosmótica e de fácil aquisição e, embora seja pobre em nutrientes, vem sendo muito utilizada como meio de conservação durante o transporte por curto período de tempo (máximo 1 hora) de ovários ovinos (AMORIM et al., 1996), caprinos (LUCCI et al., 1997; RODRIGUES et al., 1998), bovinos (SCHELLANDER et al., 1990; SOLANO et al., 1994; SCHERNTHANER et al., 1997) e de lhamas (DEL CAMPO, 1994). O meio TCM 199 é rico em nutrientes, como glicose, vitaminas e aminoácidos (MIGLIORISI et al., 1987) e também tem sido utilizado com sucesso na preservação de ovários bovinos (FIGUEIREDO et al.,1993) e de complexos cúmulos-oócito (TWAGIRAMUNGU
et al.,1998) durante o transporte. Além disso, o TCM199 foi utilizado na
lavagem e cultivo oocitário, bem como no cultivo de embriões caprinos (CROZET et al., 1995). No entanto, a susceptibilidade de folículos primordiais ovinos à atresia, após conservação in vitro em solução salina 0,9% e TCM 199 ainda não foi avaliada. Além disso, não é conhecido se o tempo de 2 h de incubação (tempo necessário para o transporte dos ovários até o laboratório) poderia manter a viabilidade dos folículos primordiais ovinos após conservação
JUSTIFICATIVA
Os folículos primordiais constituem 95% dos milhares de folículos pré-antrais presentes no ovário mamífero (ERICKSON, 1986). Por serem pequenos e possuírem metabolismo baixo, os oócitos inclusos em folículos primordiais podem ser mais tolerantes ao processo de conservação do que os oócitos inclusos em folículos primários e secundários (OKTAY et al., 2000). Desta forma, a conservação in vitro de folículos primordiais representa uma valiosa fonte para o fornecimento de oócitos normais, que podem ser destinados à criopreservação e/ou cultivo in vitro de folículos pré-antrais, ou no futuro, para a produção in vitro de embriões (CARROL et al.,1990; TELFER et al., 2000).
Entretanto, o crescimento e o desenvolvimento oocitário dependem da sobrevivência e manutenção da qualidade, tanto do oócito, como das células da granulosa durante o processo de conservação (EPPIG, 1979). Na tentativa de otimizar as condições de conservação in vitro dos folículos pré-antrais, vários meios têm sido testados, como a solução salina 0,9% (CARVALHO et
al., 2001), solução à base de água de coco (SILVA et al., 2000), Braun-Collins
(ANDRADE et al., 2001), PBS (SANTOS et al., 1999) e TCM199 (FERREIRA et
al., 2001). Estes estudos indicaram somente a incidência global da
degeneração folicular após a conservação, considerando conjuntamente todas as classes de folículos pré-antrais (primordiais, primários e secundários). Assim, ainda não foi avaliada a susceptibilidade à atresia, especificamente de folículos primordiais ovinos, após conservação in vitro.
Uma forma de avaliar o grau e o tempo necessário para a ocorrência dos sinais de atresia consiste na manutenção dos folículos primordiais em soluções isotônicas, em diferentes temperaturas e tempos de incubação. A solução salina 0,9% foi utilizada neste trabalho por ser de baixo custo, fácil aquisição e isosmótica. Embora seja de composição simples, esta solução apresentou resultados comparáveis com os meios ricos em nutrientes, como o TCM 199, durante a conservação in vitro de folículos pré-antrais ovinos a 4 ºC (ANDRADE et al., 2002b).
Embora a temperatura de 39ºC não tenha mostrado resultados satisfatórios em outros trabalhos de conservação, mesmo com o menor tempo de incubação utilizado (4 h) (SILVA et al., 2000, CARVALHO et al., 2001), esta
foi novamente testada neste estudo por ser a temperatura fisiológica do animal e a temperatura mais utilizada, em média, para o transporte de ovários e para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais (WU et al., 2001). Nesse sentido, testou-se um tempo de incubação menor (2 h), ou testou-seja, um tempo necessário para o transporte dos ovários até os laboratórios especializados.
A biotécnica de MOIFOPA, no seu sentido amplo, tem como meta final a produção in vitro de um grande número de embriões a partir de oócitos inclusos em folículos pré-antrais que seriam crescidos, maturados e fecundados in vitro. Visto que milhares de folículos primordiais podem ser recuperados a partir de um único ovário, utilizando-se os métodos de isolamento disponíveis, torna-se impossível a manipulação de um grande número destes folículos no mesmo dia em que são isolados, sem afetar a sua viabilidade antes do cultivo in vitro. Desta forma, o desenvolvimento e a utilização de protocolos de conservação de oócitos inclusos em folículos primordiais in situ possibilitará a manipulação, de forma fracionada, dos milhares de folículos primordiais provenientes de ovários de animais de alto valor genético ou em via de extinção. A utilização destes protocolos colaborará para a implantação de bancos de germoplasma animal (transporte seguido de conservação), otimizando o aproveitamento do potencial oocitário dos pequenos ruminantes, incrementando assim, a eficiência da reprodução, particularmente na espécie ovina.
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar o efeito da solução salina 0,9% e TCM 199 sobre a conservação de folículos primordiais ovinos em diferentes temperaturas e tempos de incubação.
Objetivo Específico
Elaborar um método de conservação e transporte de folículos primordiais, aproveitando o potencial oocitário de ovinos;
Analisar morfológica e ultraestruturalmente os folículos primordiais ovinos conservados em solução salina 0,9% e TCM 199 em diferentes temperaturas e tempos de incubação.
ARTIGO
Título: Morphologic and ultrastructural analysis of sheep primordial follicles preserved in 0.9% saline solution and TCM 199
MORPHOLOGICAL AND ULTRASTRUCTURAL ANALYSIS OF SHEEP PRIMORDIAL FOLLICLES PRESERVED IN 0.9% SALINE SOLUTION AND
TCM 199
M. H. T. Matos1a, E. R. Andrade1, C. M. Lucci2, S. N. Báo2, J. R. V. Silva1, R. R. Santos1, M. A. L. Ferreira1, S. H. F. Costa1, J. J. H. Celestino1, J. R.
Figueiredo1
1 Laboratory of Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles –
LAMOFOPA, Faculty of Veterinary, State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
2Laboratory of Electron Microscopy, Department of Cell Biology, University of
Brasília, Brasília, DF, Brazil
aCorresponding author: Universidade Estadual do Ceará – Faculdade de
Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, LAMOFOPA, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP: 60740-000, Fortaleza – Ceará – Brasil. Tel.: +55-85-299-2752; fax: +55-85-299-2740.
E-mail adress: htmatos@yahoo.com (M. H. T. Matos).
Acknowledgements
This study was partially sponsored by CAPES, Brazil, and supported by Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução of State University of Ceará, Brazil.
Abstract
The present work investigated the morphological and ultrastructural features of sheep primordial follicles after preservation in 0.9% saline solution and TCM 199. At the slaughterhouse, the ovarian pair of each animal was divided into 25 fragments. One ovarian fragment was taken randomly and immediately fixed for morphological evaluation (control). The other 24 fragments were randomly distributed in tubes containing 2 mL of 0.9% saline solution or TCM 199 and maintained at 4, 20 or 39ºC for 2, 4, 12 or 24 h. Histological analysis showed that the storage of ovarian fragments in 0.9% saline solution at 20ºC for up to 24 h and in both solutions at 39ºC for 4, 12 or 24 h significantly increased (P < 0.05) the percentage of degenerated primordial follicles when compared with control. In contrast, the preservation at 4ºC in both solutions, kept the percentage of morphologically normal primordial follicles similar to control values. The histological analysis revealed a morphological integrity of sheep primordial follicles stored at 20ºC for up to 24 h in TCM 199, but these results were not confirmed by ultrastructural analysis. The transmission electron microscopy revealed that only primordial follicles stored at 4ºC for up to 24 h, at 20ºC for up to 12 h and at 39ºC for up to 2 h in both solutions were ultrastructurally normal. In conclusion, this study shows that sheep primordial follicles can be preserved successfully at 4ºC for up to 24 h, at 20ºC for up to 12 h and at 39ºC for 2 h in 0.9% saline solution or TCM 199.
Keywords: Sheep, Primordial follicle, Preservation, Morphology, Ultrastructural
The mammalian ovary contains a follicular reserve that is determined before birth and cannot be replenished. This reserve contains thousands of primordial follicles, which are the most predominant type of reproductive cells in ovarian tissue, corresponding to 95% of the preantral follicles population [1]. Since the vast majority of primordial follicles become atretic during their growth and maturation in vivo, these follicles provide a valuable source for studies on in vitro development of oocytes and eventual in vitro production of embryos [2]. The biotechniques developed for isolation [3, 4, 5], cryopreservation [6] and culture [7] of preantral follicles aims to prevent follicular atresia by rescuing the preantral follicle population from the ovaries and by culturing the follicles in vitro up to the maturation stage.
Since oocytes enclosed in primordial follicles are small and less metabolically active, they may be more tolerant to the preservation process than metaphase II oocytes [8]. Preservation of primordial follicles requires not only the survival of oocyte and granulosa cells but also maintenance of the gap junctions and the metabolic cooperation which is essential for oocyte growth and development [9]. In addition, the maintenance of follicular quality after preservation is extremely important and should be investigated, because structural or ultrastructural damages can significantly affect further in vitro growth and maturation of oocytes within primordial follicles [10]. Some authors have emphasized the importance of ultrastructural evaluation after in vitro preservation of preantral follicles, showing that morphologically normal follicles after histological analysis may present degenerative changes at ultrastructural level [11, 12].
Recently, some studies have demonstrated that the quality of the oocytes enclosed in preantral follicles depends on the preservation medium, temperature and incubation time used during ovary transportation from the field to the laboratory where the research is done. 0.9% saline solution is largely cited as a preservation medium for ovary transportation during short periods of time (cattle: [13]; goat: [14]) and for preservation of goat [12] and sheep [15] preantral follicles in situ. TCM 199 has been successfully used in the preservation of goat [16] and sheep [17] preantral follicles. Carvalho et al. (2001) [12] showed that after preservation in Braun-Collins and 0.9% saline solutions, the degeneration rate of goat secondary follicles was higher than that observed in primordial follicles. However, the studies performed in sheep indicated only the overall incidence of follicular degeneration after preservation, considering all classes of preantral follicles (primordial, primary and secondary follicles together). In these studies, a high rate of follicular degeneration was observed after storage at 39ºC in all incubation periods (even for 4 h). On the other hand, the effect of 0.9% saline solution and TCM 199 for a lower incubation period, such as 2 h, the time usually required for ovary transportation to the laboratory, was not investigated. In addition, ultrastructural analysis of sheep primordial follicles preserved in vitro has not been reported yet.
The aims of the present study were to evaluate the effect of 0.9% saline solution and TCM 199 on the preservation of sheep primordial follicles, at
different temperatures and incubation times, and to investigate the histologic and ultrastructural morphology of the preserved primordial follicles.
Materials and methods
Source of ovaries
Ovaries (n=10) from five adult mixed breed ewes were collected at a local slaughterhouse. Under aseptic conditions, the ovaries were stripped of surrounding fat tissue and ligaments, washed once in a 70% alcohol solution, and then twice in 0.9% saline solution.
Media
The media tested were: (1) sterilized 0.9% saline solution (0.9% NaCl; osmolarity: 300 mOsmol/L; pH: 7.2) and (2) TCM199 (osmolarity: 280 mOsmol/L; pH:7.2; Cultilab, SP, Brazil).
Experimental protocol
At the slaughterhouse, the pair of ovaries from each animal was divided into 25 fragments. Then, one ovarian fragment was taken randomly, a small piece removed for transmission electron microscopy (TEM), and the remainder immediately fixed in Carnoy for histological examination (control – treatment 1 – time 0). The other 24 fragments were randomly distributed into 15 mL tubes (Corning Glass Works, Corning, NY) containing 2 mL of 0.9% saline solution or
TCM 199 at 4, 20 or 39ºC and stored for 2, 4, 12 or 24 h (Treatments 2 to 24) as shown in Fig. 1. The temperatures were maintained using thermoflasks filled with water at 4, 20 or 39ºC and were monitored at the beginning and at the end of the treatments. Each treatment was repeated five times.
Light microscopy
To evaluate the morphology of ovine primordial follicles, at the end of each treatment, the ovarian fragments were processed as follow. Small pieces of ovarian fragments from each treatment, including control, were removed for TEM with the remainder being fixed individually in Carnoy for 12 h. Following this, they were dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene and embedded in paraffin wax. Sections of 7 µm were stained by a standard protocol using periodic acid schiff (PAS)-hematoxilyn and examined by light microscopy (Zeiss, Germany) under 40X magnification. The nucleus of the oocyte was used as a marker for analyzing follicles.
Follicular morphology was evaluated based on the integrity of the basement membrane, cellular density, presence or absence of pycnotic bodies and the integrity of the oocyte. Based on these variables, primordial follicles were classified as morphologically normal; type 1 degenerated follicles (only the oocyte was degenerated) or type 2 degenerated follicles (degeneration of both oocyte and granulosa cells).
Transmission electron microscopy
To better evaluate the follicular morphology, ultrastructural analysis was performed using primordial follicles from the control treatment, the treatments that did not differ from control and presented longer preservation time. Only primordial follicles classified as morphologically normal in semi-thin sections were evaluated. Briefly, small pieces of ovarian cortex were fixed in a solution containing 2% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer pH 7.2. After fixation, the specimens were rinsed in buffer and post-fixed in 1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mM CaCl2 in 0.1 M sodium cacodylate buffer. Subsequently the samples were
dehydrated in acetone and embedded in Spurr´s epoxy resin. Thin sections (80 nm) were prepared when the oocyte nucleus was present in the semi-thin sections. Semi-thin sections (3 µm) were stained with toluidine blue while thin sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and examined using Jeol 100 C transmission electron microscope.
Statistical analysis
The percentages of normal and degenerated follicles between the control and other treatments were compared using ANOVA and a Fisher´s PLSD-test (Stat View for PC). Values were considered statistically significant when P<0.05.
Results
A total of 3,638 primordial follicles were examined by histological analysis. The number of follicles ranged from 115 to 152 in each treatment. Morphologically normal primordial follicles (MNPF) were observed by histological analysis in all treatments and these follicles exhibited a healthy spherical oocyte with uniform cytoplasm. Granulosa cells, well-organized in layers, without pycnotic nuclei were observed surrounding the oocyte. Degenerated type 1 follicles exhibited an oocyte that was sometimes retracted, with a pycnotic nucleus and well-organized granulosa cells without pycnotic nucleus. Finally, degenerated type 2 follicles showed retracted oocyte, with or without a pycnotic nucleus, and disorganized low density swollen granulosa cells (Fig. 2).
Storage of sheep primordial follicles in situ in 0.9% saline solution or in TCM 199
The effect of temperature and storage time on the percentage of morphologically normal primordial follicles stored in 0.9% saline solution or in TCM 199 is shown in Figure 3. It was observed that the percentage of normal follicles stored in 0.9% saline solution at 4ºC for up to 24 h, at 20ºC for 12 h and at 39ºC for 2 h was similar (P > 0.05) to control (time zero). A significant decrease (P < 0.05) in the number of MNPF was observed when primordial follicles were stored in saline solution at 20ºC for 24 h and at 39ºC for 4, 12 or 24 h when compared to control. Similar results were obtained when TCM 199 was used, except for the treatment in which the ovarian fragment was stored at 20ºC for 24 h; where the percentage of MNPF was similar (P > 0.05) to control.
The effect of incubation time within each temperature was analyzed, separately, in each solution. At 4ºC the percentage of MNPF was not affected by the incubation time, in both solutions. Similar results were obtained in fragments preserved in TCM 199 at 20ºC. However, in the fragments stored at 20ºC in 0.9% saline solution, there was a significant decrease (P < 0.05) in the percentage of MNPF when stored for 24 h compared to 2, 4 or 12 h. A significant decrease (P < 0.05) in the number of MNPF occurred with the increase of incubation time from 2 h to 4, 12 and 24 h, in both solutions at 39ºC.
With respect to the effect of temperature in the same period of incubation, the results showed that there was a significant decrease (P < 0.05) in the percentage of MNPF in both solutions at all incubation periods tested when the fragments were stored at 39ºC, when compared to 4 and 20ºC, except for the fragments stored for 2 h, when the temperature of 39ºC did not decrease follicular viability when compared with storage at 4º and 20ºC.
The comparison between 0.9% saline solution and TCM 199 at the same temperature and incubation period showed that the percentage of MNPF at 4ºC in all incubation periods tested was not significantly different (P > 0.05). However, a significantly higher (P < 0.05) percentage of MNPF was observed in TCM 199 at 20ºC for 24 h and at 39ºC for 12 h.
Figure 4 shows the distribution of Types 1 and 2 degenerated primordial follicles, in control and after storage in the different treatments, in 0.9% saline solution (Fig. 4a) and in TCM 199 (Fig. 4b). A significant predominance (P < 0.05) of degenerated Type 1 follicles was observed in control and after storage in 0.9% saline solution at 4ºC for 4, 12 and 24 h, at 20ºC for 12 h and in TCM 199 at 4ºC for 12 h and at 20ºC for 2 and 4 h. In contrast, a significant increase (P < 0.05) of degenerated Type 2 follicles was observed after storage in both solutions at 39ºC at all incubation times, except in the fragments stored in saline solution 0.9% for 2 h. Compared to control, a significantly higher (P < 0.05) percentage of Type 1 degenerated follicles was observed in 0.9% saline solution at 4ºC and 20ºC for 12 and 24 h and at 39ºC for 4 h. A greater (P < 0.05) percentage of degenerated Type 2 follicles compared to control was observed in follicles preserved in 0.9% saline solution at 4ºC for 2 and 24 h, at 20ºC for 2, 4 and 24 h and at 39ºC for 4, 12 and 24 h, and in TCM 199 at 20ºC for 24 h and at 39ºC at all incubation periods.
Ultrastructural analysis of sheep primordial follicles in control and after preservation
On average, 8 primordial follicles per treatment were evaluated by ultrastructural analysis. Normal primordial follicles exhibited a highly variable number of vesicles spread throughout the ooplasm. The cytoplasm also contained numerous large pleiomorphic mitochondria, with irregular cristae and continuous mitochondrial membranes, including elongated forms with parallel cristae. Well-developed Golgi complexes were observed. Both smooth and rough endoplasmic reticulum were present, either as isolated aggregations or
as complex associations with mitochondria and vesicles. In normal primordial follicles, there were sometimes a few microvilli and, occasionally, small amounts of zona pellucida material which were visible depending on the plane of section. Granulosa cells had irregularly-shaped nuclei, with a high nuclear-to-cytoplasm ratio. The cytoplasm contained a great number of mitochondria and well-developed rough endoplasmic reticulum. These features were observed in primordial follicles from control group (Fig. 5), as well as in follicles preserved in 0.9% saline solution and in TCM 199 at 4º for up to 24h (Fig. 6), at 20ºC for up to 12 h (Fig. 7), and at 39ºC for up to 2 h (Fig. 8) control.
When stored in TCM 199 at 20ºC for 24 h, follicles seemed to be well preserved in semi-thin sections stained with toluidine blue, however, transmission electron microscopy revealed some discreet changes in their ultrastructure (Fig. 9). In primordial follicles, the oocytes showed signs of degeneration before the primitive granulosa cells. These follicles showed an ooplasm extremely vacuolated, with the vacuoles often fusing to produce a greater vacated area. In addition, initial signs of damage to mitochondrial membranes and cristae were observed. Granulosa cells had a swollen aspect, with a low density of organelles present in their cytoplasm. Some granulosa cells disappeared leaving a vacated space. The follicles contained a retracted oocyte and large irregularity of the follicular, oocyte and nuclear outlines (Fig. 9). However, ultrastructural analysis of primordial follicles stored in TCM 199 at 20ºC for up to 12 h showed the integrity of the oocyte, the granulosa cells, and the basement membrane (Fig. 10), thus confirming the results obtained by classical histology.
Discussion
This study evaluated specifically the sensitivity of primordial follicles to in vitro preservation conditions and showed that the storage of ovarian fragments in 0.9% saline solution and in TCM 199 at 4ºC kept the number of morphologically normal primordial follicles when compared to control (time zero). In contrast, the preservation in both media at 20º or 39ºC, depending on the incubation period, increased the degeneration rate of sheep primordial follicles in vitro.
The preservation of ovarian fragments at 4ºC for up to 24 h, in both solutions, maintained the percentage of normal primordial follicles similar to that found in control. Although the studies available did not evaluate the effect of media and temperature on the preservation of specifically primordial follicles, usually considering all classes of preantral follicles together, the results from these studies demonstrated that the temperature of 4ºC has been successfully used in the follicular preservation for 24 h in solutions poor (saline- [12, 15]) and rich (TCM 199 – [17]) in nutrients or hyperosmotic (Braun-Collins solution - [18]), which shows that at 4ºC the composition of the medium is not a limiting factor. In addition, Wood et al.(1997) [19] successfully preserved domestic cat ovarian follicles at 4ºC for 48 h. Moreover, Jewgenow et al. (1998) [6] cooled isolated feline preantral follicles at 4ºC without decreasing the percentage of healthy follicles. Roy & Treacy (1993) [20] observed that a lower metabolic rate at low temperatures may be beneficial in maintaining viable human preantral follicles in vitro after isolation. These results may be due to the fact that the reduction in cellular metabolism during preservation at low temperatures (4ºC) can minimize
the metabolic need and increase the follicular resistance to the reduction of nutrients and oxygen during preservation in vitro. Pickering et al. (1990) [21] showed that the meiotic spindle of oocytes is temperature-sensitive during cooling. In the study, the quality of primordial follicles was not evaluated. The oocytes enclosed in primordial follicles may be less susceptible to microtubular disruptions, because most of the microtubular systems remain unorganized, and the chromatin is in a condensed form protected by the nuclear membrane [22]. In spite of the good results obtained in this study, as well as in others, in preservation of primordial follicles at 4ºC, it is unknown if the temperature reduction could affect the culture of primordial follicles in vitro.
This work shows that when the primordial follicles were stored at 20ºC for 12 and 24 h in 0.9% saline solution and in TCM 199, respectively, and at 39ºC for 2 h in both solutions, the percentage of normal primordial follicles was similar when compared to control. Similar results were observed with the preservation of preantral follicles (without specific follicular type) at 20ºC and 39ºC for 12 and 24 h in 0.9% saline solution (goat: [12]; sheep: [15]), TCM 199 (goat: [16]; sheep: [17]) as well as in Braun-Collins or coconut water solution (goat: [18]; sheep: [23]) showing that even in a poor or rich nutrient medium, a high degeneration rate was observed. The increase of cellular metabolism in the normal limit (39ºC) or close to it (20ºC) and oxygen consumption could have caused depletion of intracellular energetic sources followed by consumption of the nutrients and oxygen available in the preservation medium, resulting in the higher degeneration rates found in these treatments. It is important to note that in all studies performed with the preservation of goat and sheep preantral
follicles, a high rate of follicular degeneration was observed after storage at 39ºC in all incubation periods. On the other hand, the best results obtained in our study with preservation at 39ºC (normal metabolism) may be due to the short incubation period (2 h) to which the ovarian fragments were submitted. Smitz et al. (1996) [24] reported that preantral follicles are able to survive for a short incubation time under oxygen deficiency and that glycolisis can sustain its viability during a limited period.
In this study, TCM 199 was more effective than 0.9% saline solution in the preservation of sheep primordial follicles at 20ºC for up to 24 h. The primordial follicles had two nutrient sources, their own energetic sources and the nutrients from the preservation medium. Although these follicles are small, quiescent and possessing low metabolic rate, they are also sensitive to adverse conditions in vitro, such as oxygen and nutrients deficiency. It is suggested that at 4oC for all storage periods tested and at 20ºC for up to 12 h, sheep primordial follicles were
able to survive on their own energetic sources, since the media showed similar efficiency in the preservation of primordial follicles enclosed in ovarian tissue. However, increasing storage time and temperature, the composition of the medium becomes an important factor in the maintenance of follicular viability. The better results observed at higher temperatures and longer storage periods using TCM 199 were probably due to the nutrient composition of this medium, which is rich in inorganic salts, glucose, vitamins and amino acids [25]. This effect has already been demonstrated in the preservation of sheep preantral follicles (all classes taken together), where normal follicles were found after storage at 20ºC in 0.9% saline solution and in TCM 199 for up to 4 and 12 h,
respectively, suggesting that the TCM 199 is an effective medium for preserving preantral follicles for longer periods [17]. In contrast to our results, Ferreira et al. (2001) [16] observed that preservation of goat preantral follicles in TCM 199 at 20ºC increased the percentage of degenerated follicles. However, comparisons between our study results and those of other studies are difficult to perform due to species differences, variation in types of follicles included in the final analysis and different experimental conditions.
In relation to degeneration type present in primordial follicles, the histological analysis showed that in control as well as in fragments stored at 4º and 20ºC, the most common type of degeneration was Type 1 (only in the oocyte). Similar results were also observed with fresh (cow: [1]; rat: [26]; goat: [14,27]; sheep: [28]) and stored preantral follicles at 4ºC (cat: [19]; goat: [11,16,18]; sheep: [15]) as well as in cultured bovine preantral follicles [29,30]. According to Jorio et al. (1991) [28], degeneration of oocytes is the mode of atresia most frequently observed in preantral follicles. Silva et al. (2001) [11] showed that the oocyte of goat primordial follicles were more sensitive to degeneration than granulosa cells. Moreover, the little morphological evidence of biosynthetic activity in the granulosa cells of primordial follicles can make these cells less sensitive to degeneration [31]. In contrast, in treatments where the ovarian fragments were preserved at 39ºC, the most common type of degeneration was Type 2, where in addition to oocyte degeneration, the granulosa cells were disorganized and enlarged in volume. Similar results were observed by Silva et al. (2000) [18] in the preservation of goat preantral follicles in Braun-Collins and coconut water solutions at 39ºC for up to 24 h. Granulosa cell pycnosis is commonly found in
follicles preserved for more than 48 h [19] and may be used as the first histological indicator of atresia in antral follicles [32,33]. Barros et al. (2001) [34] suggested that the exposure of cells to a death signal, such as hypoxia, increased the influx of Na+ to the cytosol, which activated the Na/K ATPase, resulting in expenditure of ATP, cell swelling and consequently cellular degeneration. Another study has demonstrated that metabolic depletion in glial cells under chemical anoxia is followed by cell swelling [35].
By transmission electron microscopy, ultrastructurally normal sheep primordial follicles preserved in 0.9% saline solution at 4ºC for up to 24 h could be observed in our study. Unlike these results, Carvalho et al., (2001) [12] showed that goat preantral follicles can be stored in 0.9% saline solution at 4ºC for up to 12 h. These results suggest that sheep primordial follicles are more resistant to preservation conditions than goat follicles.
The histological analysis of follicles revealed a morphological integrity of sheep primordial follicles stored in TCM 199 at 20ºC for 24 h, but these results were not confirmed by ultrastructural analysis, which exhibited an ooplasm extremely vacuolated. Some authors have emphasized that normal sheep oocytes contain a great number of vacuoles [36,37], but in oocytes showing signs of degeneration they become progressively more numerous [37]. The cytoplasmic vacuoles are also a characteristic sign of degeneration in granulosa [38] and cumulus cells [39] during degeneration in vivo and may represent endoplasmic reticulum swelling [37]. On the other hand, these vacuoles may be altered
