1. RESUMO
O polímero derivado polimerizado de guanidina (DPG) apresenta atividades antifúngicas e antimicrobianas in vitro; entretanto, os relatos in vivo quanto a sua atividade cicatrizante são parcos na literatura científica. Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar o efeito cicatrizante de uma formulação tópica contendo este polímero, no tratamento de feridas cutâneas superficiais, a cada 12 horas, por 21 dias, após indução experimentalmente no dorso de roedores. Diariamente, por inspeção direta, verificou-se o efeito da terapia sobre a pele e região perilesional. Ao término do experimento, os animais foram eutanasiados e amostras cutâneas da lesão e perilesionais foram coletadas para análise histopatológica, considerando-se ulceração, necrose, re-epitelização, angiogênese, infiltrado inflamatório e intensidade da fibroplasia. Clinicamente, os roedores não apresentaram dermatite e até o final do período experimental, nenhuma ferida demonstrou total coalescência das bordas. Histologicamente, o DPG demonstrou aumento significativo de fibroblastos (p<0,05) quando comparado ao grupo não tratado, sugerindo ação cicatrizante do polímero sintético testado em baixa concentração. Assim, nas condições experimentais preconizadas, concluiu-se que o DPG não foi nocivo à superfície cutânea e demonstrou efeito cicatrizante promissor.
2. INTRODUÇÃO
A pele é a primeira barreira de proteção individual do organismo (ISAAC et al., 2010), possuindo espessura variável e compondo parte do sistema tegumentar.
Anatomicamente, é considerada o maior órgão entre as diferentes espécies de mamíferos (OLIVEIRA, 2012).
Tanto pela extensão quanto por suas características anatômicas, a pele está sujeita a diferentes estímulos danosos, entre eles mecânicos, térmicos, químicos ou biológicos, os quais podem afetar diretamente a fisiologia natural e destruir parcial ou totalmente este órgão e seus anexos (PASSARINI JUNIOR et al., 2012).
O processo de cicatrização caracteriza-se por complexa cascata de eventos celulares, bioquímicos, moleculares e vasculares que interagem mutuamente para a reconstituição tecidual, apresentando distintas fases sobrepostas (PISTORE et al., 2014).
Inúmeras opções de tratamentos conservativos para feridas cutâneas superficiais estão disponíveis no mercado, com o intuito de promover a rápida coaptação das bordas, prevenir infecções secundárias, reduzir a ação deletéria de micro-organismos patogênicos, minimizar a sensibilidade local, impedir a progressão da extensão da lesão ao favorecer o desenvolvimento celular necessário para a cicatrização, evitar possíveis complicações e procedimentos cirúrgicos e re- estabelecer a função tecidual e estética (MARTIN et al., 2013).
No entanto, apesar dos avanços na indústria farmacêutica, cada medicamento demonstra distinto valor econômico, variado graus de resposta terapêutica e efeitos colaterais, não havendo nenhum totalmente eficiente (GAUGLITZ et al., 2011). Deste modo, pesquisas propondo a investigação de medicamentos alternativos são justificáveis, visando tratamentos promissores e menos onerosos.
Assim, justifica-se a avaliação de um novo produto de amplo espectro, como o polímero sintético derivado polimerizado de guanidina (DPG) mediante aos efeitos antibacteriano (OULÉ et al., 2008; OULÉ et al., 2012) e antifúngico (OULÉ et al., 2015) in vitro bem estabelecidos na literatura. Além disso, possui baixa toxicidade e custo. Deste modo, perante a elevada casuística de lesões cutâneas e ausência de dados quanto à atividade cicatrizante deste polímero sintético, justifica-se avaliar por exame histopatológico, o efeito cicatrizante de formulação tópica contendo o DPG.
O DPG é um polímero catiônico pertencente à família das guanidinas, composto por uma mistura de moléculas com comprimentos de cadeias e estruturas diferentes, além de baixo peso molecular (MATHURIN et al., 2012). Nesta contextura, Wei et al. (2009) definiram sete tipos distintos de estruturas, sendo três lineares e quatro cíclicas ou ramificadas. Possui espectro rápido e amplo contra bactérias Gram-positivas e negativas, fungos (ZHANG; JIANG; CHEN, 1999), leveduras e vírus, mesmo em baixas concentrações (OULÉ et al., 2008; VITT et al., 2015; CHOI; KIM; LEE, 2016).
Este polímero sintético possui alta solubilidade e atuação em água destilada, tratada ou mineral (OULÉ et al., 2008), o que o torna ecologicamente viável (ZHANG; JIANG; CHEN, 1999).
Quanto ao seu mecanismo de ação, atua na membrana celular (WEI et al., 2009) gerando inativação celular (OULÉ et al., 2008; VITT et al., 2015; MASHAT, 2016). Choi, Kim e Lee (2016) discorreram ainda que essa substância atua nas
membranas plasmáticas fúngicas induzindo a formação de poros, os quais causam perda de íons K+ seguida de contração e morte celular.
Sua rápida atuação em períodos curtos foi descrita na literatura por Koffi- Nevry et al. (2011), Mathurin et al. (2012) e Oulé et al. (2012), assim como a ação prolongada (MASHAT, 2016).
3. OBJETIVOS
Perante a ocorrência comum de lesões cutâneas superficiais em animais, a busca por novos medicamentos eficazes, de amplo espectro e de baixo custo são justificáveis. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi analisar o potencial cicatrizante de formulação tópica contendo o derivado polimerizado de guanidina por meio de exame histopatológico.
4. METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Franca (processo n°4222230218).
Foram utilizados 18 ratos Wistar, hígidos, machos inteiros, com seis semanas de idade, pesando entre 300 e 350 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto - SP.
Os animais foram anestesiados com cloridrato de xilazina associado ao cloridrato de cetamina, ambos por via intraperitoneal, em aplicação única, na dose de 5 mg/kg e 50 mg/kg, respectivamente, seguindo orientações de Flecknell, Richardson e Popovic (2007).
A remoção circular do fragmento cutâneo na região do terço médio do dorso foi iniciada com trépano cirúrgico (punch) de 20 mm de diâmetro, com regulador de profundidade estabelecida em 0,2 cm, confeccionado em aço inoxidável, não descartável e esterilizável, até a exposição da fáscia muscular.
Logo após a exérese dos fragmentos cutâneos superficiais, principiaram-se os tratamentos tópicos e sistêmicos admitidos para cada grupo experimental. Para isso, os roedores foram distribuídos de forma aleatória em três grupos, contendo seis animais cada:
- GLST (grupo lesão sem tratamento): submetidos à ferida cutânea e tratamentos topicamente somente com solução salina a 0,9%;
- GPDG: submetidos à ferida cutânea e tratados topicamente com derivado polimerizado de guanidina;
- GN: submetidos à ferida cutânea e tratados topicamente com pomada comercial referência (Nebacetin® - 5 mg de sulfato de neomicina e 250 UI de bacitracina zíncica).
Os curativos (exceto no GLST) foram realizados a cada 12 horas, durante 21 dias seguidos e as feridas permaneceram abertas. Associado aos tratamentos tópicos, foi aplicado, o analgésico cloridrato de tramadol, na dose de 5 mg/kg de peso corpóreo, por via subcutânea, a cada 12 horas, até o sétimo dia pós-cirúrgico (FLECKNELL; RICHARDSON; POPOVIC, 2007).
Ao término do período experimental, os animais foram submetidos à eutanásia com pentobarbital sódico (120 mg/kg, via intraperitoneal, em aplicação única) (FLECKNELL; RICHARDSON; POPOVIC, 2007).
Empregando-se técnica cirúrgica convencional (FOSSUM, 2014), foi feito exérese do tecido tegumentar do dorso dos ratos, incluindo toda porção ainda lesionada e margem íntegra de 5 mm, até a musculatura correspondente. As amostras cutâneas foram fixadas em formol tamponado a 10% e processadas de acordo com técnica histológica clássica (CARSON; HLADIK, 2009). Os cortes foram corados em hematoxilina-eosina (HE) e Tricrômico de Masson.
As avaliações das lâminas coradas por HE foram quanto a ulceração, necrose, re-epitelização, angiogênese e infiltrado inflamatório polimorfonuclear (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e mononuclear (monócitos e linfócitos) no tecido conjuntivo, utilizando escores de intensidade: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) ou 3 (intenso). As coradas pelo Tricrômico de Masson analisaram escores de intensidade da fibroplasia no tecido conjuntivo: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) ou 3 (intenso).
Os resultados foram analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA), utilizando o programa Graphpad Prism 6.0®. Os resultados das duas colorações dos grupos tratados foram estatisticamente comparados com aqueles do GLST e entre si.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao término do período experimental, nenhuma lesão cutânea demonstrou total coalescência das bordas, incluindo as tratadas com o produto comercial.
Quando confrontado com o GLST, o GDPG demonstrou aumento significativo na necrose (p<0,05), o que consequentemente intensificou a ulceração cutânea. No entanto, observou-se que a necrose estimulou a proliferação celular indiciada pelo aumento significativo de fibroblastos (p<0,05), os quais são os precursores do colágeno, sugerindo ação cicatrizante do polímero sintético testado.
Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo GLST e GDPG com relação à re-epitelização, angiogênese e infiltrado inflamatório, similar ao resultado do grupo tratado com o produto comercial referência.
Gibot et al. (2010) discorreram que nos primeiros dias após a ocorrência da lesão cutânea, há maior concentração de mediadores químicos, o que favorece a vasodilatação e, consequentemente, o aumento de volume local (edema), expandindo a extensão da ferida (ulceração); corroborando com os resultados do estudo ora conduzido.
Ainda em relação à redução das feridas cutâneas, o polímero sintético testado indiciou efeito cicatrizante e mesmo com a consagração do produto comercial aclamado no mercado dermatológico, nenhum grupo proporcionou total cicatrização até o último momento de análise. Esses resultados foram similares aos encontrados por Motta, Milne e Corbett (2004) em humanos com lesões cutâneas crônicas após utilização de curativos diários com gaze contendo DPG a 0,2% por cinco semanas consecutivas.
O DPG, em comparação com os demais grupos, intensificou a ulceração em decorrência da necrose cutânea, a qual estimulou a multiplicação celular, mormente de fibroblastos, os quais são precursores de colágeno e possuem função imprescindível na formação do tecido conjuntivo, pois correspondem à maior parte das células constituintes deste local, além de sintetizarem matriz extracelular para sua sustentação (MARTIN et al., 2013; CAMARGO et al., 2014). Os fibroblastos se diferenciam em miofibroblastos, conferindo a capacidade de contração das bordas da ferida, reduzindo sua dimensão (FAHIMI et al., 2015).
Segundo Ahmed et al. (2015), a proliferação, reorganização e maturação completa do tecido conjuntivo e dos feixes de colágeno podem se estender por
meses, devido à estratificação lenta do epitélio, justificando os resultados do atual estudo quanto à re-epitelização.
Deste modo, mesmo que o DPG não tenha estimulado a angiogênese, provavelmente em decorrência do tempo de análise experimental admitido, a quantidade de vasos sanguíneos presentes na lesão proporcionou oxigenação e quimiotaxia de células e substâncias biológicas para o local (REBOLLA et al., 2013), as quais estimularam ou inibiram proteínas para a continuidade da regeneração cutânea (AHMED et al., 2015).
Considera-se que os resultados obtidos quanto aos resultados do infiltrado inflamatório, possam estar diretamente relacionados com o tempo de análise histopatológica, pois, de acordo com Brasileiro Filho (2016), o pico de células polimorfonucleares é observado precocemente, nos primeiros oito dias decorridos da lesão cutânea, assim como as mononucleares em torno do 7° dia.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante da metodologia preconizada e dos resultados obtidos, admite-se que o derivado polimerizado de guanidina evidenciou efeito cicatrizante em feridas superficiais.
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