Agradecimentos
Ao Professor Doutor João Gonçalves, meu orientador externo de mestrado, muito obrigado por me ter recebido no seu grupo e pela possibilidade de realizar o meu projecto de mestrado no seu laboratório. À Professora Doutora Filomena Caeiro, minha orientadora interna de mestrado, por todo o apoio, simpatia e disponibilidade.À Faculdade de Farmácia e ao Professor Doutor Moniz Pereira por terem possibilitado a realização do meu projecto de Mestrado.
A todos os elementos do laboratório que me ensinaram tudo o que sei de ciência, me ajudaram quando nada parecia funcionar, obrigado Fred, me ajudaram a ser crítico, a pensar por mim mesmo e me aturaram durante este último ano. Obrigado malta.
À Inês, por me aturares, pela companhia, por tudo o que me ensinaste, por me teres ajudado em todos os aspectos e fases da minha tese, por me teres ajudado em tudo, obrigado por tudo e por mais um pouco.
Aos meus pais, a quem devo tudo. Obrigado por me terem educado a acreditar que posso fazer sempre melhor, que afinal até “conxigo” quando me esforço, por toda a compreensão, por todo o carinho, por serem a minha base em todos os aspectos e por tudo o resto. Muito obrigado aos dois. À minha Família, sem a qual não me imagino, obrigado por me terem amparado e ajudado quando precisei. Aos meus avós por sempre me terem ajudado em tudo o que puderam e por sempre terem acreditado mas minhas capacidades. À minha madrinha por seres a “minha madrinha”, aquela a quem conto tudo, ou quando não conto descobre. A todos os meus tios e primos, que apesar de serem muitos não são de mais. Obrigado a todos.
À Vanessa, por seres tudo para mim! Porque não existo sem ti ao meu lado, porque fazes parte de tudo o que faço e de tudo o que sou. Obrigado miúda.
À Eliane por seres uma caracoleta, por estares sempre lá, pela paciência para me aturares há cinco anos, pelos gelados de côco e AfterEight que mais ninguém gosta. Vou ter saudades tuas...
À Catarina Samora, à Catarina Tavares, à Inês, ao João e à Rita obrigado pelas sextas feiras, pelas conversas em frente ao C8, por serem realmente meus amigos, por saber que posso sempre contar com vocês, por tudo... Obrigado.
Índice
Agradecimentos iv
Índice v
Símbolos e Abreviaturas viii
Relação estrutura/função das proteínas da família APOBEC e sua interacção com a proteína Vif do HIV-1
Resumo x
Abstract xi
I - INTRODUÇÃO 1
1.1 - Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) 1
1.1.1 - Genoma e Partícula viral do HIV-1 1
1.1.2 - Ciclo Replicativo do HIV-1 2
1.2 - Factor de infecciosidade viral (Vif) 3
1.3 - Família de desaminases de citidina (APOBEC) 4
1.3.1 - Factor de restrição APOBEC3G 5
1.4 - Inibição da actividade antiviral do APOBEC3G e APOBEC3F pela Vif 6 1.5 - Complementação proteica aplicada ao estudo de interacções
proteína-proteína 7
1.6 - Interacção Vif-APOBEC3G como potencial alvo terapêutico 8
1.7 - Objectivos 8
II - MATERIAIS E MÉTODOS 9
MATERIAIS 9
2.1 - Químicos e Reagentes Gerais 9
2.2 - Estirpes bacterianas 9
2.3 - Linhas celulares 9
MÉTODOS 10
2.7 - Produção, purificação e análise de DNA 10
2.7.1 - Análise e isolamento de DNA por electroforese em gel de agarose 10
2.7.2 - Produção de DNA 10
2.7.3 - Quantificação de DNA 10
2.7.4 - Sequenciação automática de DNA 10
2.8 - Clonagens 11
2.8.1-Amplificação de DNA através da reacção de polimerização
em cadeia (PCR) 11
• Clonagem de Vif, A3G, A3F, A3C e A2 em pcDNA3.1ZIP-B1
e pcDNA3.1ZIP-B2 11
2.8.2 - Mutagénese dirigida - overlap PCR 11
2.8.3- Digestões de DNA com enzimas de Restrição 12
2.8.4 - Ligação do fragmento de DNA ao plasmídio 12
2.8.5 - Produção de bactérias competentes para electroporação 12 2.8.6 - Transformação de bactérias por electroporação 13 2.8.7 - Identificação de colónias positivas para a clonagem 13
2.9 - Expressão e análise de proteínas em HEK293T 13
2.9.1 - Transfecção de HEK 293T por fosfato de cálcio 13
2.9.2 - Lise de células HEK 293T 13
2.9.3 - Resolução de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS 14
2.9.4 - Immunoblot (Western Blot) 14
2.10 - Purificação e concentração de Vírus por Ultracentrifugação 14
2.11 - Ensaio de actividade da β-lactamase 15
III - RESULTADOS 16
3.1 - Detecção da interacção da Vif do HIV-1 com A3G humano, ex vivo,
através de um sistema de complementação proteica. 16
3.2 - A Vif do HIV-1 interage, ex vivo, com APOBEC3F, APOBEC3C e APOBEC2 19 3.3 - Os aminoácidos 122, 127 e 128 do A3G são importantes para a interacção
com a Vif do HIV-1 20
3.4 - As mutações YRHHY>A5 e DRMR>A4 na Vif do HIV-1 não são capazes de
abolir a interacção com A3G, A3F, A3C ou A2 21
3.5 - A substituição da sequência DRMR por SEMQ na Vif do HIV-1 favorece a
interacção com A3F, A3C e A2 23
3.7 - A interacção Vif/A3G é alterada pela presença de HIV-1Δvif 24
IV - DISCUSSÃO 26
V - BIBLIOGRAFIA xii
Simbolos e Abreviaturas
ReagentesDMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium EDTA - Ácido etilenodiamina tetraacético Et-Br - Brometo de etídio
LB - Luria-Bertani
PBS - Tampão de fosfato salino, phosphate buffer saline SOB - Super optimal broth
TBE - Tampão tris-borato-ácido etilenodiamina tetraacético TBS - Tris buffered saline
TAE - Tris-acetate-EDTA buffer TE - Tris-EDTA
Geral
aa - aminoácido
AGM - Africam green monkey
APOBEC1 - apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 1 APOBEC2 - apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 2
APOBEC3 A-H - apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3 A-H CA - Cápside
CCR5 - Chemokine receptor 5 CD4 - Cluster designation 4 Cul5 - Culina 5
DNA - Ácido desoxibonucleico, Deoxyribonucleic acid E. coli - Escherichia coli
EloC - Elonguina C EloB - Elonguina B
Env - Poliproteína do envelope
Gag - Group specific antigen polyprotein h - Horas
HA - Hemaglutinina
HRP - Peroxidase de rábano selvagem, horseradish peroxidase IN - Integrase
kb - Kilo base kDa - Kilo Dalton
LTR - Long terminal repeats MA - Matriz
min - Minutos
mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro, messenger ribonucleic acid NC - Nucleocápside
Nef - Negative regulator factor nm - Nanómetros
O/N - Durante a noite, over night ORF - Open reading frame
PCR - Reacção de polimerização em cadeia, polimerase chain reaction Pol - Polimerase
PR - Protease
RE - Retículo Endoplasmático Rev - Regulador da expressão viral RNA - Ácido ribonucleico, ribonucleic ácid rpm - Rotações por minuto
RT - Transcriptase reversa, reverse transcriptase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis SIV- Vírus da imunodeficiência de símios, simian imunodeficience virus SIDA - Sindrome da imunodeficiência adquirida
SU - Superfície UV - Ultravioleta
U - Unidade enzimática TA - Temperatura ambiente
Tat - Trans-activating transcriptional activator TM - Transmembranar
Vif - Factor de infecciosidade viral, viral infectivity factor Vpr - Viral protein R
Resumo
A desaminase de citidina humana APOBEC3G (A3G) é capaz de restringir a replicação de HIV-1 que não expressa Vif, através da desaminação da cadeia negativa de cDNA viral. A proteína Vif do HIV-1 induz a degradação proteossomal de A3G, impedindo que este factor de restrição seja encapsidado. Este processo faz com que a interacção da Vif com factores de restrição celulares da família APOBEC seja um bom alvo para o desenvolvimento de novas terapias antivirais.Escolhemos, para estudar esta interacção, um ensaio de complementação proteica (PCA) baseado na enzima TEM-1 β-lactamase, no qual cada um dos domínios inactivos da enzima está fundido com cada umas das proteínas em estudo. A interacção das proteínas alvo resulta numa β-lactamase funcional, capaz de provocar a hidrólise mensurável de um substrato por espectrofotometria.
O nosso trabalho incidiu sobre aminoácidos e regiões de Vif e A3G descritos como importantes para a interacção destas duas proteínas, como são os casos do aa D128 do A3G ou as regiões D14RMR e Y40RHHY da Vif.
Tal como descrito o nosso trabalho mostra que, o resíduo 128 de A3G é essencial para a interacção com Vif e que os aminoácidos 122 e 127, descritos como importantes apenas para interacção com Gag, podem também estar envolvidos na interacção com Vif. Ao contrário do esperado, não verificámos qualquer tipo de redução da interacção de Vif com A3G, em resultado das alterações nas regiões DRMR ou YRHHY da Vif.
O resultado mais inesperado foi a obtenção de valores elevados da interacção da Vif DRMR>SEMQ com outros membros da família APOBEC, nomeadamente A3F, A3C e A2, mas não com A3G. Este resultado pode resultar do facto de a mutação na Vif corresponder à substituição da região DRMR da Vif do HIV-1 pela sequência SEMQ da Vif do SIVAGM. Poderemos levantar a hipótese que esta região da Vif pode estar envolvida na escolha do APOBEC que a Vif inibe.
Palavras-chave: APOBEC3G, APOBEC3C, APOBEC3F, APOBEC2, Ensaio de
complementação proteica (PCA), HIV-1 e Vif.
Abstract
Human cytidine deaminase APOBEC3G (A3G) restricts replication of Vif-deficient HIV-1 by deaminating the minus chain of the viral cDNA. HIV-HIV-1 Vif prevents this host restriction factor from entering the virion by inducing their proteasomal degradation. Therefore the interaction between these cellular restriction factors and Vif is a good target for antiviral drug design.To study this interaction we used a TEM-1 β-lactamase complementation assay (PCA), in which the inactive domains of the enzyme are fused to each of the proteins in question. The interaction of our proteins will result in a functional TEM-1 β-lactamase capable of hydrolysing a substrate measurable by spectrophotometry.
We mutated several residues of both A3G and Vif described as being involved in the Vif/A3G interaction, like the amino acid D128 of A3G and the D14RMR and Y40RHHY regions of Vif. Our work shows that, as previously described, the A3G 128 residue is essential for the interaction with Vif. We also determined that the A3G amino acids at positions 122 and 127, that were previously described as essential for interaction with Gag might also be important for Vif interaction. Both DRMR and YRHHY mutations to alanines in Vif did not show any detectable effect upon the Vif/A3G interaction.
Some of the most unexpected results came from the high levels of detectable interaction of a DRMR to SEMQ mutated version of Vif with A3F, A3C and A2 but not with A3G. This particular mutation in Vif corresponds to the substitution of the DRMR that we find in HIV-1 Vif, to the sequence found in SIVAGM Vif. We can only speculate on the relevance of this region, but it is possible that the different affinities of these motifs are the result of an evolutive fine-tuning mechanism designed to, ultimately, improve HIV-1 infection.