FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE
CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX ATENDIDOS NA FMTAM
MARLY MARQUES DE MELO
MARLY MARQUES DE MELO
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA
VIVAX ATENDIDOS NA FMTAM.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profª. Dra. Maria das Graças Costa Alecrim Co-orientadores: Franklin Simões de Santana Filho
Mônica Regina Farias Costa
FICHA CATALOGRÁFICA
MARQUES, Marly de Melo
Determinação das Concentrações Sanguíneas de Cloroquina e
Desetilcloroquina em Pacientes com Malária vivax Atendidos na FMTAM. Marly Marques de Melo. - Manaus – AM:UEA; FMTAM, 2009.
LXXXVI,p
Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. Universidade do Estado do Amazonas
Chloroquine and desethylchloroquine levels in late parasitological failure cases of malaria vivax from Manaus, Brazil
FOLHA DE JULGAMENTO
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE
CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM
MALÁRIA VIVAX ATENDIDOS NA FMTAM.
MARLY MARQUES DE MELO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.
Banca Julgadora:
_____________________________________ Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra.
Presidente
_________________________________ Prof. José Luiz Fernandes Vieira, Dr.
Membro
___________________________________ Profª. Cíntia Mara Costa de Oliveira, Dra.
AGRADECIMENTOS
Dedico este trabalho Aos meus pais , Maria Lucia Marques e Valentim Brito de Lima, pelo exemplo de
vida, lutas e vitórias conquistadas, pela participação definitiva no meu caráter e personalidade, e em especial ao meu filho Ildemar Rodrigues Lima Junior pelo amor incondicional, companheirismo, incentivo e solidariedade constantes. Aos meus irmãos, Francisco Melo, Marileide Melo, Marilucia Marques,
Marilena Marques e Sidney Marques, aos meus sobrinhos, cunhados e cunhadas,
pelo carinho, amor. As palavras seriam poucas para expressar toda minha gratidão.
Ao meu amigo Ildemar Rodrigues Lima
,
pelo apoio, solidariedade, convívio e amizade, faltam palavras para expressar minha sincera gratidão.Dedico-lhes esse êxito com muita gratidão!
A Deus pela luz com a qual ilumina os caminhos que sigo em minha vida.
A minha orientadora professora Doutora Maria das Graças Costa Alecrim, pela oportunidade, confiança, orientações durante a realização deste trabalho, além da possibilidade de participação e colaboração no grupo de pesquisa da Gerência de Malária, e em especial, pela sua amizade.
Ao Professor Dr. José Luiz Fernandes Viera, chefe do Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Pará, pela amizade, atenção, orientação e por ter compartilhado seus conhecimentos técnicos e científicos para a concretização deste estudo, o meu obrigada.
Ao meu co-orientador e amigo Franklin Simões de Santana Filho pelas valorosas recomendações e ensinamentos na elaboração e execução deste estudo.
A Mônica Regina Farias Costa, pelo incentivo de uma verdadeira amiga, destituída de interesses e vaidades.
Aos dois anjos que Deus na sua infinita bondade colocou no meu caminho, Larissa Borges e Margareth Tavares pelo incentivo amigo e verdadeiro, apoio solidário, pela organização das atividades laboratoriais e análise dos resultados, sem as quais não teria conquistado esta vitória.
A todos os funcionários da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, que em algum momento estiveram comigo, meu sincero agradecimento pela amizade, apoio, paciência e carinho.
Aos amigos e colegas Mauro Gomes Coelho, Rosemary Viana, Maria Lucia Mota, Irislene Figueiredo, Ednildo Rocha e Marta Lavareda, aos revisores, Eckner Lessa, Raimunda Barreto e Marinete Quadros, minha gratidão pelo companheirismo e convívio.
Aos meus amigos, secretários do mestrado Conceição Tufic e Marcos André Castro, minha eterna gratidão.
Aos meus amigos e colegas de curso Ádila Dias e Luiz Francisco Rocha e Silva, pela incondicional amizade e pelo incentivo de sempre.
Aos médicos do ambulatório em especial, Dr. Orlando, Dra. Leni, Dra Vera Márcia, enfermeira Almada e sua equipe, meus agradecimentos sinceros.
Aos novos amigos da farmácia (UFPA), Michelle, Juan, Patrícia e especialmente a Priscila, meu agradecimento sincero.
Aos pacientes anônimos que, voluntariamente, contribuíram para o conhecimento da malária através de suas próprias mazelas.
A Universidade do Estado do Amazonas – UEA, pelo Programa de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas.
A Superintendência da Zona Franca de Manaus - SUFRAMA, financiadora do Programa de Pós-graduação da UEA.
A Fundação de Apoio Institucional MURAKI, pelo suporte na compra das passagens para o convidado e membro da banca julgadora deste estudo.
A Universidade Federal do Pará – UFPA/Laboratório de Toxicologia que através de sua estrutura laboratorial viabilizou parte deste trabalho.
Ao Ministério da Saúde (Secretaria de Vigilância em Saúde/GerênciaTécnica de Malária) e a Organização Pan-Americana da Saúde que, através da RAVREDA, proporcionou o desenvolvimento deste estudo.
EPÍGRAFE PEGADAS DE JESUS Os caminhos de Nosso Senhor;
Só quem ama percorreu;
Só quem sonha conheceu;
São caminhos cheios de amor;
Que nem sempre o sonhador;
É capaz de entender
Alguém me disse que sonhou
Que estava numa praia
Caminhando com Jesus
E olhando o céu viu sua vida
Tanta estrada percorrida
Sempre em busca de uma luz
E olhando as marcas na areia
Viu ao lado de seus passos as pegadas de Jesus
E aí ele falou:
"-Não te entendo meu Senhor"
E olhou para o chão:
"- Nos caminhos mais difíceis eu não vejo tuas marcas
porque me deixaste só?"
Jesus respondeu:
"- Os passos são só meus, jamais te abandonei,
É QUE NOS MOMENTOS MAIS DIFÍCEIS DE VIVER
RESUMO
A determinação das concentrações sanguíneas de cloroquina (CQ) e desetilcloroquina (DCQ) foi estudada em 14 pacientes com malária por Plasmodium vivax, sendo sete sensíveis e sete resistentes, do estado do Amazonas. Os pacientes receberam esquema oral de CQ 25 mg/kg dividido em três dias e primaquina 0,5 mg/kg/dia durante sete dias, conforme preconizado pelo manual de terapêutica da malária. As concentrações sanguíneas de CQ e DCQ foram quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência nos dias três (D3), sete (D7), quatorze (D14) e vinte oito (D28) após a instituição da terapia. A média geométrica da densidade parasitária dos participantes resistentes e sensíveis no D0 foi de 2526,65 ± 7050,26 parasitos/mm3
ABSTRACT
The determination of chloroquine (CQ) and disetylchloroquine (DCQ) blood concentrations were obtained from 14 patients with malaria vivax (seven) of Amazonas state harboring resistant strains (7) and sensitive strains (7). According to the Ministry of Health, the enrolled patients underwent supervised oral treatment with CQ 25 mg/kg within three days plus primaquine 0,5 mg/kg/day during seven days. The blood concentrations of CQ and DCQ were measured by high efficiency liquid chromatography on Day 3 (D3), Day 7 (D7), Day 14 (D14) e Day 28 (D28) of the therapy. On D0, the geometric mean of the parasitic density (GMPD) in patients with failures and responsive ones were 2526,65 ± 7050,26 parasites/mm3 (16 - 16.465) and 2730,10 ± 2581,49 parasites/mm3 (125 – 8400) respectively. All the seven patients who failured presented recurrent parasitemia on D28 with GMPD - 2926,75 ± 2216,54 (543-6980 parasites/mm3). The CQ mean blood concentrations on D3, D7, D14 e D28 of patients harboring sensitive strains were 2519,04 ± 2013,8 ng/mL, 1251,22 ± 1250,5 ng/mL, 642,05 ± 1275,67 ng/mL and 203,49 ± 361,5 ng/mL, respectively. In the same group the levels of DCQ mean blood concentrations observed were 793 ± 637 ng/mL, 657,2 ± 498 ng/mL, 709,34 ± 586 ng/mL and 580,3 ± 432,4 ng/mL. On D3, D7, D14 e D28, the CQ mean blood concentrations in patients with recurrent parasitemia were 670 ± 629,7 ng/mL, 411,8 ± 381,2 ng/mL, 384,3 ± 324,3 ng/mL 209,9 ± 187,94 ng/mL respectively. In relation to DCQ the levels were 495,5 ± 306 ng/mL, 873,8 ± 767 ng/mL, 660 ± 456,4ng/mL e 506 ± 289 ng/mL respectively. There were no significant difference in the comparison blood concentrations of CQ to DCQ among groups in the days of follow-up (p>0,05). Therefore, on D3 a significant difference in the levels of whole CQ (CQ+DCQ) blood levels was confirmed comparing patients with sensitive P.vivax strians to resistant cases. All individuals with parasitic recurrence showed whole CQ blood concentrations higher than 100 ng/mL on D28 attesting the existence of CQ-resistant P. vivax in Manaus, Amazonas.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Agente etiológico: Gênero: Plasmodium ...01
Figura 2. Anopheles (N) darlingi;principal transmissor na região Amazônica...02
Figura 3: Distribuição da malária no mundo...03
Figura 4. Ciclo dos Plasmodium SP...06
Figura 5. Ação Terapêutica dos antimaláricos...09
Figura 6. Fórmula estrutural da Cloroquina...10
Figura 7. Estrutura da Ferriprotoporfirina IX, β-Hematina e hemozoína...11
Figura 8. Fórmula estrutural da desetilcloroquina...15
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
CEM Concentração efetiva mínima
cm Centímetro
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
dL Decilitro
DP Desvio padrão
DR Dia de recorrência parasitária
D0 Dia de inclusão - primeira avaliação clínico-parasitológica D1 Segunda avaliação clínico-parasitológica
D2 Terceira avaliação clínico-parasitológica D3 Quarta avaliação clínico-parasitológica D7 Quinta avaliação clínico-parasitológica D14 Sexta avaliação clínico-parasitológica D21 Sétima avaliação clínico-parasitológica D28 Oitava avaliação clínico-parasitológica F+V Plasmodium falciparum + Plasmodium vivax FT Fracasso terapêutico
FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FUNASA Fundação Nacional de Saúde
Hb Hemoglobina
IPA Índice parasitário anual
mg Miligrama
mL Mililitro
mm3 Milímetro cúbico
ng Nanograma
MS Ministério da Saúde
OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS Organização Pan-Americana de Saúde pH Potencial hidrogeniônico
P. falciparum Plasmodium falciparum P. malariae Plasmodium malariae P. ovale Plasmodium ovale P. vivax Plasmodium vivax
PCR Reação em cadeia da polimerase
RCPA Resposta clínico-parasitológica adequada
SIVEP_MALÁRIA Sistema de Informações de Vigilância Epidemiológica Nacional-Notificação de Caso de Malária
RAVREDA Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas
SVS Secretaria de Vigilância em Saúde
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
SUMARIO
1 INTRODUÇÃO... 01
1.1 Considerações gerais... 15
1.1.1 Plasmódios humanos e seus vetores... 15
1.2 Epidemiologia ... 16
1.2.1 Malária no mundo ... 16
1.2.2 Malária nas Américas e no Brasil ... 17
1.3 Ciclo biológico do Plasmodium no homem ... 18
1.4 Malária causada pelo P. vivax ... 20
1.5 Tratamento da malária... 21
1.6 Cloroquina ... 23
1.6.1 Química ... 24
1.6.2 Mecanismo de ação da cloroquina ... 25
1.6.3 Propriedades farmacocinéticas da cloroquina... 28
1.6.4 Desetilcloroquina... 29
1.6.5 Terapêutica da malária vivax... 29
1.6.6 Resistência do P. vivax à cloroquina... 31
1.6.7 Concentrações séricas efetivas da cloroquina ... 34
1.6.8 Determinação das concentrações séricas da cloroquina ... 34
1.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 36
2 Objetivos... 37 2.1 Geral ... 37 2.2 Específicos ... 37 3 Material e Métodos... 38 3.1 Local do Estudo... 38 3.2 Participantes... 39
3.3 Exame microscópico do sangue e determinação da parasitemia ... 39
3.3.1 Coleta de sangue ... 40
3.4 Dosagem Sanguínea de cloroquina... 40
3.5 Diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)... 41
3.6 Tratamento dos pacientes... 41
3.6.1 Medicamentos Utilizados... 41
3.6.2 Tratamento com cloroquina e primaquina... 41
3.6.3 Tratamento concomitante... 42
3.6.4 Tratamento alternativo... 42
3.7 Clareamento Parasitário... 43
3.8 Determinação das concentrações do antimalárico... 43
3.8.1 Equipamentos e Acessários... 43
3.8.1.1 Reagentes e solventes... 43
3.8.1.2 Preparação das soluções padrão... 44
3.8.1.3 Solução de estoque... 44
3.8.1.4 Soluções intermediárias ... 44
3.8.1.5 Soluções de Trabalho ... 44
3.8.1.6 Solução do padrão interno ... 44
3.8.1.7 Condições cromatográficas ... 45
3.8.2 Procedimento de extração de cloroquina e desetilcloroquina ... 45
3.8.3 Curva de Calibração ... 45
3.8.4 Determinação das concentrações de cloroquina e desetilcloroquina ... 46
3.10 Considerações éticas ... 47
3.11 Consentimento após a informação... 47
3.12 Custos financeiros do projeto... 48
4. Resultados e Discussão – Artigo... 49
5. CONCLUSÃO... 59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 60
7 ANEXOS ... 78
7.1 Termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE ... 78
7.2. Certificado físico-químico da droga... 81
7.3 Autorização para uso das amostras ... 83
7.4 Ofício a CONEP... 84
7.5 Aprovação da CONEP ... 85
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
1.1.1 Plasmódios humanos e seus vetores
A malária humana é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por quatro espécies de protozoários unicelular do gênero Plasmódio, pertencentes ao filo Apicomplexa, classe Sporozoea, ordem Eucocciida e família Plasmodiidae - Plasmodium: P. malariae (Laveran, 1881), P. vivax (Grassi e Feletti, 1890), P. falciparum (Welch, 1897) e P. ovale (Stephens, 1922); tem como sua principal via de transmissão ao homem a picada infectante das fêmeas de alguns insetos dípteros culicídeos do gênero Anopheles, (Garnham, 1998; Gilles, 1998). (Figura 1).
Figura 1 - Agente etiológico: Gênero: Plasmodium Fonte: (OMS, 2008).
No Brasil, várias espécies são vetores em potencial, predominando o Anopheles (N) darlingi como principal transmissor na região Amazônica, sendo esta mais antropofílica e eficaz na transmissão (Tadei e Dutary – Thatcher, 2000).( figura 2).
Figura 2. Anopheles (N) darlingi como principal transmissor na região Amazônica.
Fonte: (TADEI & DUTARY – THATCHER, 2000); (FORATTINI, 2002).
1.2 Epidemiologia
1.2.1 Malária no mundo
Fonte: WHO/RBM
Áreas onde ocorre transmissão de malária
Sem malária
Figura 3: Distribuição da malária no mundo. Fonte: (OMS), 2008.
A malária vivax fora do continente africano (África Sub sahareana) corresponde a 55% dos casos mundiais da doença, sendo relevante no sudeste da Ásia, na Índia e nas Américas Central e do Sul. Setenta e cinco por cento (75%) das formas clínicas ocorrem na Ásia, incluindo o Oriente Médio, 15%-20% nas Américas Central e do Sul e 5%-15% na África (Luxemburger, 1999; Miller et al., 2002; Pukrittayakamee et al., 2004).
1.2.2 Malária nas Américas e no Brasil
No Brasil, a malária figura como uma das principais endemias parasitárias, sendo a região amazônica responsável por 99,8% dos casos notificados no país. Na maioria dos estados amazônicos, a maior incidência é no período de junho a setembro. A incidência parasitária anual (IPA) da malária, na Amazônia Legal, no período de 2003 a 2006, ficou entre 18,3 e 26,6 casos por mil habitantes, respectivamente. Em 2007 o IPA geral do país foi de 18,7/1000 habitantes (MS, 2007; SIVEP, 2008).
O P. vivax é a espécie responsável pelo maior número de casos no Estado do Amazonas, dos 113.796 casos notificados em 2008, 82,0 % foram causados por esta espécie. A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas notificou no ano de 2008 6.876 casos de malária, sendo o P. vivax responsável por 6.029 dos casos, cabendo ao P. falciparum apenas 825 dos diagnósticos positivos. Em 2007 a Fundação registrou 14.249 casos, havendo uma diminuição signicativa no ano anterior (FMTAM; 2008, SIVEP, 2008).
1.3 Ciclo biológico do Plasmadium no homem
O ciclo endógeno começa após a picada infectante da fêmea do anofelino, que inocula esporozoítas da saliva (que serve como anticoagulante) de plasmódios nos capilares subcutâneos, os quais ganham a corrente sangüínea e se aderem à superfície dos hepatócitos. A transmissão pode ocorrer através da via materno-fetal, de transfusão de sangue e seus derivados e, menos freqüentemente, mediante o compartilhamento de seringas contaminadas com sangue de usuários de drogas - malária induzida (Gilles, 1998; Garnham, 1998). (Figura 4).
Assim que começam as divisões nucleares, os parasitas passam a ser chamados esquizontes e, no fim da esquizogonia, dão lugar à formação de milhares de elementos filhos, os merozoítas. O ciclo pré-eritrocítico dura de 6 a 16 dias, dependendo da espécie do Plasmodium. A célula hepática rompe-se liberando os merozoítas, muitos dos quais são fagocitados e destruídos pelas células de Kupffer (células presentes no fígado com ação fagocitária). (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
Os sobreviventes invadem as hemácias e dão início ao segundo ciclo de reprodução assexuada dos plasmódios, possibilitando o início do ciclo eritrocitário. No hospedeiro humano, os períodos médios de incubação das espécies P. vivax e P. falciparum são, respectivamente, de 12-17 dias e 7-10 dias. A doença se inicia com a multiplicação parasitária assexuada nos eritrócitos e continua pela reinfecção promovida pelos merozoítos em outras hemácias. Uma pequena quantidade de parasitos se diferencia em gametócitos, que são essenciais na transmissão da infecção através da picada do vetor. No interior do trato digestivo do anofelino, as células sexuais por sua vez irão desenvolver o ciclo evolutivo sexual dos plasmódios com formação do zigoto, oocito e, finalmente esporozoitos. Posteriormente, essas formas poderão infectar seres humanos (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
O ciclo de diferenciação e multiplicação do plasmódio nos hepatócitos possui algumas peculiaridades para as espécies P. vivax e P.ovale. Algumas formas dormentes desses parasitos não desenvolvem a esquizogonia tissular (esquizontes pré-eritrocíticos) e interrompem o ciclo replicativo assexuado no interior do hepatócito (hipnozoítos), podendo vir a ser continuado posteriormente, promovendo-se assim o quadro de recaída da malária (Krotoski, 1985; Lopez-antuñano, 1990)
quiescência e variações médias que vão de 15 dias (zonas tropicais) a 20 meses (zonas temperadas), podendo se estender por anos (Krotoski, 1985; Warrell, 1998).
Figura 4. Ciclo dos Plasmodium SP
Fonte: www.imm.ul.pt/html/Ciclo_Vida.bmp,2008
1.4 Malária causada pelo P. vivax
O P. vivax é menos patogênico, quando comparado ao P. falciuparum, habitualmente não alcançando altas densidades parasitárias e seqüestro nos capilares e vênulas (Pukrittayakamee et al., 2000), embora o roseamento de hemácias parasitadas já tenha sido relatado (Chotivanich et al. 1998). A infecção por P. vivax causa a forma clínica de malária, denominada febre terçã benigna, cuja evolução clínica apresenta predomínio de formas menos graves e baixa letalidade, significando que a mesma venha a ser uma forma benigna de adoecimento. As infecções maláricas por esta espécie possuem atualmente maior importância como causa de morbidade e de grandes perdas sócio-econômicas mundiais em conseqüência do elevado número de casos (Mendis et al., 2001).
alertando para a necessidade de melhor conhecimento da fisiopatogenia e manejo clinico adequado dos pacientes (Kochar et al., 2009; Rogerson & Carter, 2008; Tjitra et al, 2008).
Nas Américas, os aspectos clínicos da malária causada pelo P. vivax mostram-se similares aos de outros continentes. Febre ou história recente de febre (temperatura superior a 38°C) está quase sempre presente. O padrão da febre nem sempre é regular como o esperado. Outros sintomas inespecíficos são: calafrios, astenia, dor de cabeça, mialgia, tosse e sintomas gastrintestinais (Ventura 1997). Febre, icterícia e hepatosplenomegalia são os achados mais freqüentes ao exame físico (Alecrim, 2000; Blair et al, 2003).
1.5 Tratamentos da malária
O tratamento adequado e oportuno tanto previne a ocorrência de casos graves e, conseqüentemente a morte por malária, quanto elimina fontes de infecção para os mosquitos, contribuindo para a redução da transmissão da doença
(Brasil/MS/FUNASA/CENEPI, 2001). Uma vez que o diagnóstico da malária foi confirmado, a terapêutica apropriada deve ser iniciada imediatamente. Esta deve ser guiada por três fatores principais: a espécie infectante do Plasmódio, o estado clínico do paciente e a susceptibilidade da droga aos parasitos infectantes, que é determinada pela área geográfica onde a infecção foi adquirida (CDC, 2008).
A quimioterapia da malária tem como objetivos interromper a esquizogonia sangüínea responsável pela patogenia e pelas manifestações clínicas da infecção; proporcionar a erradicação das formas latentes do parasito (hipnozoítas) do P. vivax e do P. ovale no ciclo tecidual, evitando as recaídas; e reduzir as fontes de infecção para os mosquitos, eliminando as formas sexuadas dos parasitos, (Brasil/SVS/, 2001).
compartilham esta propriedade, mas são de ações mais lentas, menos eficazes e devem ser combinadas com outros antimaláricos. A primaquina é usada clinicamente para erradicar formas tissulares latentes, responsáveis pelas recaídas nas malárias por P. vivax e P. ovale (Tracy & Webster, 2002).
O tratamento da malária é complexo. Dificilmente, apenas um medicamento é utilizado, em geral, são duas ou três diferentes drogas associadas (Brasil/SVS/GVE, 2005). A cloroquina é o fármaco de primeira escolha para malária vivax. Na malária falciparum recorre-se ao quarten, a quinina associada a doxiciclina e/ou clindamicina, a mefloquina e derivados de artemisina (Tracy & Webster, 2002).
A inexistência, até o momento, de um único tratamento igualmente efetivo contra ambas espécies de plasmódio mais prevalentes no Brasil (P. vivax e P. falciparum) e a grande dificuldade para, na maioria das vezes, diferenciar clinicamente a infecção por uma espécie ou por ambassimultaneamente, levaram à necessidade do estabelecimento do diagnóstico laboratorial específico para o tratamento adequado dos pacientes (Brasil/MS/FUNASA/CENEPI, 2001).
Há uma busca contínua por novas drogas antimaláricas ou novos métodos que reforcem a aceitação das drogas pelos pacientes. Muitos autores têm investigado se a redução da dose, duração ou freqüência do tratamento, poderiam ser tão eficazes quanto aqueles usados nos esquemas padrões (Ferraroni, 1983; Andrade et. al, 1992 e Pinto et. al, 2003;).
1.6 Cloroquina
recuperação da cloroquina como fármaco de eleição no tratamento e profilaxia da malária (Vale at al., 2005). (figura 5).
Primaquina Cloroquina Cloroquina Primaquina Primaquina Homem Glândula
salivar Intestino médio
Ciclo eritrocítico
Esquizogonia
Esporogonia
AÇÃO DOS ANTIMALÁRICOS
Hipnozoito
(ARÉVALO-HERRERA et al., 2002; WONGSRICHANALAI, 2002; HASTINGS, 2003; WHITE, 2004)
Ciclo exoeritrocítico
Figura 5. Ação Terapêutica dos antimaláricos.
Fonte: Arévalo-Herrera, 2002; Wongsrichanalai, 2002; Hastings, 2003; White, 2004)
1.6.1 Química da cloroquina
Quimicamente, a cloroquina é denominada de 7 cloro-4-[[4-(dietilamino-1-metilbutil ] amino] quinolina, apresentando peso molecular 319,88 e fórmula molecular C18H26ClN3. É um pó cristalino branco ou levemente amarelo, inodoro e de
As formas d (dextrógiras), l (levógira) cloroquina apresentam potência igual no modelo da malária aviária, sendo que o isômero d é menos tóxico do que o isômero l em mamíferos. Um átomo de cloro ligado na posição 7 do anel quinolínico, confere maior atividade antimalárica tanto na malária aviária quanto na humana (Brocks & Mehvar, 2003).
Figura 6. Fórmula estrutural da Cloroquina. Fonte: Vale, 2005.
1.6.2 Mecanismo de ação da Cloroquina
O mecanismo de ação da cloroquina não é bem conhecido, mas pode envolver: ligação direta ao grupo heme, inibição de uma ferriprotoporfirina IX polimerase não identificada (inibição de polimerização da heme), inibição de uma fosfolipase vacuolar, inibição da síntese de proteína, interação com o DNA (Foley & Tilley, 1997).
destes fármacos ao parasito intra-eritrocítico. Vários experimentos in vitro estabeleceram que fármacos antimaláricos quinolínicos agem por interferência na cristalização da hemozoína, que tem por unidade básica a β-hematina , como demonstra a Figura 10 (Sullivan Jr. et al., 1998).
É consenso que estes fármacos inibem a formação da hemozoína. Persiste, entretanto, uma divergência sobre como isto ocorre (Egan & Marques, 1999).
Figura 7. Estrutura da Ferriprotoporfirina IX, β-Hematina e hemozoína. Fonte: Adaptado de Pagola et al., 2000; Wiser, 2003.
Os parasitos degradam cerca de 75% da hemoglobina dos eritrócitos e a utilizam como fonte alimentar. A hemoglobina é importada para dentro de um compartimento acídico do parasito, conhecido como vacúolo alimentar, e é quebrada por enzimas proteolíticas, chamadas plasmecinas, em peptídeos que, posteriormente, são degradados a aminoácidos (Egan & Marques,1999). O resíduo livre heme ou ferriprotoporfirina IX (Fe (III) PP IX) é tóxico ao parasito. A Fe (III) PP IX é polimerizada formando um composto inerte, insolúvel e não tóxico ao parasito, o pigmento malárico hemozoína (Egan & Marques,1999).
Slater & Cerami (1992), sugeriram que a reação de formação da hemozoína no parasito é catalisada por uma enzima, que seria inibida pelos antimaláricos quinolínicos. Esta conclusão foi baseada nas condições extremas que,
β-Hematina - unidade básica dos cristais de
He Heme ou
aparentemente, seriam requeridas para a formação por síntese da β-hematina e na observação que um extrato de membrana plasmodial aparentemente catalisa esta formação.
Entretanto, Dorn et al. (1995) encontraram que a formação de β-hematina é independente de proteínas e sugeriram que ela é autocatalítica, sendo que o agente catalítico no extrato do parasito é, de fato, a própria hemozoína. Uma outra hipótese é que os antimaláricos quinolínicos podem inibir a formação de hemozoína, pela interação direta com a Fe (III) PP IX.
Egan et al. (1994), demonstraram que a cloroquina, quinina e amodiaquina são capazes de inibir a polimerização espontânea da Fe (III) PP IX em solução de ácido acético, enquanto a 9-epiquinina e outras substâncias inativas na fase eritrocítica da malária não são.
Dorn et al. (1998), também relataram que a formação de β-hematina é inibida por antimaláricos quinolínicos sob condições mais brandas, que se aproximam mais daquelas que são esperadas in vivo. Assim, o efeito primário dos fármacos antimaláricos que atuam na fase eritrocítica da doença é a ligação com a Fe(III)PPIX e a inibição da sua polimerização para formação da hemozoína. Secundariamente, a Fe (III) PP IX e o complexo FE (III) PP IX-fármaco acumulam-se e ficam disponíveis para exercer acumulam-seus efeitos tóxicos (Orjih et al., 1994).
A base precisa para os efeitos tóxicos da Fe (III) PP IX livre e seus complexos com antimaláricos quinolínicos no parasito não está completamente estabelecida (Egan & Marques, 1999).
Outra hipótese é que a Fe(III)PPIX lisa o parasito via um mecanismo colóidoosmótico, possivelmente pela inibição da manutenção do gradiente de cátions (Egan & Marques, 1999).
Alguns autores têm sugerido que o mecanismo de ação da cloroquina pode ser similar aos dos quinolinimetanóis (Slater, 1993), entretanto, as evidências que sustentam as interações heme como modo de ação das 4-amoniquinoleínas não está completamente esclarecida, assim como, não está claro se o heme é o único alvo de ação dos antimaláricos quinolinometanóis (Chou et al., 1980; Chevli & Fitch, 1982).
Estudos iniciais sugeriram que a cloroquina assim como a quinina pode inibir a replicação do DNA e a síntese do RNA do Plasmodium, ainda que, através de elevadas concentrações de droga (Parker e Irvin 1952, Cohen & Yielding 1965, citados em Foley & Tilley, 1998; Thelu et al., 1994).
Os efeitos morfológicos no parasito seguidos ao tratamento com a cloroquina são similares aos efeitos observados pelo tratamento com o quinina e mefloquina, por exemplo, há uma expansão inicial de o vacúolo alimentar (Jacob et al., 1987; Olliaro et al., 1989; Peters et al., 1977).
É largamente aceito que a cloroquina exerce seu efeito antimalárico pela interação com o processo de degradação da hemoglobina dentro do parasito, provavelmente por meio uma interação com a hematina (Dorn, et al., 1998; Ridley 1997a; Ridley et al., 1997b), embora o completo mecanismo de ação, seja até hoje debatido (Asawamahasakda, et al., 1994; Ward et al., 1997), a inibição da polimerização da hematina tem sido usada como marcante representante do tipo de atividade antimalarial das 4-aminoquinolinas (Slater et al., 1992; Raynes et al.,1996; Hawley et al., 1998).
A cloroquina é eficientemente absorvida quando administrada pela via oral, alcançando concentrações máximas no plasma dentro de 3 h (variando entre 2 a 12 h). Rapidamente metaboliza-se através das enzimas do citocromo P450, nos metabólitos ativos disetilcloroquina e bisetilcloroquina. Ambas são depuradas lentamente com meia-vida de 20 a 60 dias. A biodisponobilidade por via oral é de 70 a 75%. Pela via intramuscular ou intravenosa a concentração sanguínea assemelha-se aquela da via oral, porém o nível máximo é alcançado entre 5 a 20 minutos. Ligam-se às proteínas plasmáticas em torno de 55%. Tem elevada capacidade de ligação tecidual, particularmente a tecidos dérmicos e oculares contendo melanina. Concentram-se, preferencialmente, nos eritrócitos, sobretudo os infectados. (Ducharme & Farinotti, 1996; Warrel, 1998; Karunajeewa et al, 2008).
No interior das hemácias alcançam concentrações três vezes superiores aquelas do plasma. Também se concentra nos leucócitos e nas plaquetas. Atravessa a barreira placentária e, em tratamentos prolongados, pode causar lesão no feto e alcança pequena concentração no leite materno. É excretada, principalmente, pela via renal, com meia vida de eliminação de 1 a 2 meses. (Nosten et al., 2006; Lee et al. 2008).
1.6.4 Desetilcloroquina
A desetilcloroquina é um metabólito que apresenta atividade antimalárica similar ao fármaco original (figura 3) (OMS, 2006).
Figura 8. Fórmula estrutural da desetilcloroquina
R1 R2
Fonte: Cardoso & Bonato, 2005
Holmberg et. al. (1983) demonstraram que a desetilcloroquina tem meia vida de 25% inferior quando comparada a meia vida da cloroquina, porém pode ser prolongada depois do aumento da dose do fármaco.
A maior parte da biotransformação da cloroquina em desetilcloroquina ocorre no fígado com a participação do complexo enzimático P-450 (CYP-450). Várias enzimas deste complexo participam do metabolismo de antimaláricos no organismo humano (Guzman & Fonseca, 2006).
1.6.5 Terapêutica da malaria vivax
A cloroquina tem um papel central no tratamento como na profilaxia da malária, principalmente nos países em desenvolvimento, pelo seu baixo custo, eficácia e segurança (Whitby, 1997). Possui ação esquizonticida nos eritrócitos infectados pelos P. vivax, P. ovale e P. malariae, além de exercer efeito gametocitocida nas espécies mencionadas e limitada ação, quando há sensibilidade, sobre algumas cepas de P. falciparum (Warrel, 1998; Brasil, 2001).
Os comprimidos contendo 250 mg de sal, na forma de difosfato ou sulfato, equivalentes a 150 mg de base livre, são os mais usados pelo Ministério da Saúde. Existem apresentações injetáveis de cloroquina, porém o seu uso não tem sido recomendado, pelo alto risco de efeitos cardiotóxicos agudos e graves, não estando disponível no Brasil, (Brasil, 2001). O esquema de primeira escolha, recomendado para tratamento das infecções por Plasmodium vivax com cloroquina em 3 dias e primaquina em 7 dias está representado na Tabela 1.
regiões, consiste em 10 mg/kg no primeiro dia, seguida de 7,5 mg/kg no segundo e terceiro dias. Ambos correspondem a uma dose total de 25 mg/kg (1.500 mg de base para um adulto com 60 kg) (Brasil, 2001).
A primaquina é responsável pela cura radical prevenindo recaídas (Brasil, 2001), uma vez que algumas formas dormentes de P. vivax (e P.ovale) não desenvolvem a esquizogonia tissular (esquizontes pré-eritrocíticos) e interrompem o seu ciclo replicativo assexuado no interior do hepatócito (hipnozoítos), podendo vir a ser continuado posteriormente, promovendo-se assim o quadro de recaída da malária vivax (Krotoski, 1985; Warrell, 1998).
Tabela 1. Tabela de Tratamento Fonte: MS -2004
1.6.6 Resistência do P. vivax à Cloroquina
Um dos aspectos limitantes do sucesso do tratamento da malária é a variação da resposta dos parasitos aos medicamentos comumente utilizados. (Noedl et al., 2003). Segundo a Organização Mundial de Saúde, (1973), define-se resistência do plasmódio às drogas antimaláricas a capacidade de uma determinada cepa, como Grupos
Etários
Drogas e Doses
1º dia 2º e 3º dias 4º e 7º dias
Cloroquina Comprimido
Primaquina Cloroquina comprimido
Primaquina Primaquina Adulto Infantil Adulto Infantil Adulto Infantil
também multiplicar-se, a despeito da administração correta do medicamento de efeito plasmodicida e da absorção deste, o qual é prescrito em doses iguais ou superiores as normalmente recomendadas, mas dentro dos limites de tolerância do indivíduo. OMS,(2003).
Define-se como P. vivax cloroquina-resistente quando ocorre a recorrência ou persistência parasitária até 35 dias do seguimento dos indivíduos tratados, comprovando-se que os níveis de cloroquina e seus produtos de biotransformação (desetilcloroquina e cloroquina) no sangue são ≥ 100ng/ml ou no plasma de ≥ 10ng (Baird, 1997; 2004; Berliner et al., 1948; Coatney et al., 1949). A duração mais curta do período de observação de 28 dias é atualmente recomendada pela OMS (2003). Os critérios metodológicos mais confiáveis para classificar a resposta in vitro do P. vivax aos antimaláricos ainda não estão padronizados, em conseqüência da dificuldade de adaptação dos parasitos em cultivo contínuo (Hamedi et al., 2003; Baird, 2004).
A epidemiologia da resistência do P. vivax à cloroquina é pouco estudada, mostrando-se como um problema sério na Indonésia, Papua Nova Guiné e áreas adjacentes (White, 2004). Relatos iniciais de resistência clínica ocorreram em 1989 em soldados australianos provenientes da Papua Nova Guiné (Rieckmann, 1989; Schuurkamp, 1989). Desde 1989, inúmeros relatos esporádicos de reduzida sensibilidade ao antimalárico têm surgido em diversos países: Miamar (Than et al., 1995); Papua Nova Guiné (Schuurkamp et al.; 1992); Índia (Garg et al., 1995; Dua et al.,1999a; Dua et.al.,200b); Filipinas (Baird et al., 1996); Guiana (Phillips et al., 1996); Brasil (Garavelli e Corti, 1992; Alecrim et al., 1999b; de Santana et al.,2007); Tailândia (Looareesuwan et al., 1999); Peru (Ruebush II et al., 2003a ; Vietnam (Taylor et al., 2000); Etiópia (Teka et al, 2008; Ketema et.al.,2009);Coréia do Sul (Lee et al, 2009).
seguimento. Em 151 pacientes (95,5%) não houve recorrência parasitária e em sete (4,4%) a parasitemia recrudesceu após o 14º dia.
No mesmo município, um estudo de eficácia da cloroquina com base no protocolo da OPAS/OMS de 2004, seguimento clinico-parasitológico de 28 dias, observou o percentual de fracasso terapêutico (10,1%) entre 152 indivíduos avaliados (11/152). Este fato alerta para probabilidade de ocorrência de maior número de casos que possivelmente não são identificados pela atenção básica de saúde, podendo significar um fator co-promotor da endemia malária vivax, interferindo nas ações de controle da disseminação da morbidade (de Santana Filho, 2007).
No Peru, Ruebush II et al. (2003a) investigando a possibilidade de P.vivax resistente a cloroquina, entre 1998 e 2001, conduziu um estudo in vivo na bacia amazônica, peruana e na costa pacífica norte do país. De acordo com o novo protocolo de avaliação da eficácia da cloroquina na malária vivax recomendado pela OMS (2003), foram avaliados 242 pacientes com febre documentada ou relato de história de febre, 177 da região amazônica e 65 da costa pacífica. O tratamento com cloroquina isolada (25mg/kg) foi supervisionado e 212 pacientes (88%) completaram o seguimento de 28 dias. Entre os mesmos, dois apresentaram resistência parasitária à cloroquina comprovada pela dosagem sangüínea dos níveis de cloroquina e desetilcloroquina e pela genotipagem de polimorfismo pela reação em cadeia da polimerase.
Alguns estudos com o uso isolado da cloroquina já foram realizados na América Latina, Soto et al. (2001), na Colômbia, avaliando a eficácia da cloroquina isolada em 27 pacientes com malária vivax, acompanhados por 28 dias e com tratamento supervisionado (25mg/kg), encontrou um percentual alto de resistência de 11% (4), atentando para a importância de se monitorar P. vivax cloroquina-resistente nas Américas.
recorrências parasitárias tardias no D14 e D21, respectivamente, porém os níveis sangüíneos de cloroquina e disetilcloroquina dosados estiveram abaixo da concentração efetiva mínima do antimalárico (≥100ng/ml), não sendo possível comprovar os casos de infecção por P. vivax cloroquina-resistente.
Esta claramente documentada a existência de resistência á cloroquina em P. vivax, se manifestando por falha terapêutica quando usada de forma isolada ou não, no tratamento desta forma da malaria. Dada a importância epidemiológica da malaria por P. vivax e a existência de cepas resistentes desta espécie de Plasmodium, em áreas até então livres deste fenômeno, fez com que as autoridades sanitárias a uma maior mobilização para caracterizar a distribuição da resistência, considerando-se importante para os programas de controle estruturar um sistema para monitorar as variações temporais e espaciais na resposta terapêutica a este medicamento, valendo-se de ferramentas como estudos de eficácia recomendados pela OMS (Teka et al, 2008; Ketema et al,2009; Lee et al, 2009).
1.6.7 Concentrações séricas efetivas da cloroquina
Diversos estudos realizados na década de 1940 a 1960 indicaram que a concentração efetiva mínima de cloroquina deve ser 10ng/ml de plasma. Entretanto duas questões emergem deste valor obtido naquela época, quer sejam a metodologia utilizada e a correlação entre os níveis plasmáticos e no sangue total do fármaco. Os métodos iniciais de análise não faziam a distinção entre a cloroquina e seu principal produto de biotransformação, desetilcloroquina, portanto tal valor de 10ng/ml representa a soma do fármaco e de seu produto de biotransformação, que possuem atividade antimalárica equivalente. O valor de 10ng/ml no plasma deverá servir de orientação para determinação dos teores do fármaco no sangue total, que pode ser estimado em 100 ng/ml (Baird, 2004).
Portanto, a determinação do fármaco e seu produto de biotransformação requerem métodos altamente sensíveis e específicos, no qual se enquadra a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), que obedece aos pré-requisitos analíticos básicos (FDA, 1994).
1.6.8 Determinação das concentrações séricas da cloroquina
Diversas metodologias estão disponíveis atualmente para determinação da cloroquina e de seu principal metabólito em fluídos biológicos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detectores de fluorescência ou ultravioleta (FDA, 2001; Paredes et. al., 2002).
Patchen et. al (1983) descreveram um método de quantificação de cloroquina e do seu principal metabólito, desetilcloroquina, em sangue total coletado em papel de filtro, usando a CLAE com detecção de fluorescência. A metodologia permite uma efetiva avaliação da resistência do parasita à cloroquina nas regiões endêmicas.
As análises de cloroquina e de desetilcloroquina usando detecção por fluorescência foram feitas por Projean et. al (2003) para identificação de isoformas de P450 (CYP2C8, CYP3A4 e CYP2D6) envolvendo a N-desetilação de cloroquina, para uma melhor caracterização da biotransformação do fármaco em humanos. Cardoso e Bonato (2005), também descrevem um método de quantificação de desetilcloroquina e desetilhidroxicloroquina aplicando a CLAE.
Green et. al (2006), usando a CLAE com detector de UV fizeram análise de especialidades farmacêuticas de cloroquina, quinina e sulfadoxina com o objetivo de comparar a validação de dois métodos (refractométrico e colorimétrico). O desenvolvimento e validação de métodos usando fase reversa para potencial análise de falsificação de medicamentos antimaláricos como cloroquina, quinina e mefloquina, também foram descritos na literatura por Gaudiano et. al (2006).
1.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O desenvolvimento de métodos analíticos confiáveis, rápidos, precisos e de baixo custo para determinação de princípios ativos é atrativo (Paredes et al., 2002). Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas (Collins, 1990).
A cromatografia líquida de alta eficiência tem sido o método analítico de escolha para quantificação de níveis plasmáticos de drogas antimaláricas e de seus metabólitos no sangue. Estes incluem a cromatografia de fase normal (a fase estacionária é mais polar) ou de fase reversa (a fase móvel é mais polar) após a extração, usando o detector de ultravioleta (UV) ou por fluorescência (Cardoso et al., 2005; Deng et al.,2006).
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Comparar concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina em sangue de pacientes com malária vivax, com e sem falha terapêutica atendidos no Ambulatório de Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
2.2 Específicos
Determinar as concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina em pacientes com ou sem falhas terapêuticas durante o seu seguimento em 28 dias;
Comparar as concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina nos dois grupos do estudo;
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local do Estudo
O estudo foi realizado na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas – FMTAM, autarquia estadual de referência para assistência, ensino e pesquisa em doenças tropicais, situada em Manaus – Amazonas. Considerada como um grande centro de referência para malária na bacia amazônica foi responsável por quase 15% do atendimento médico dos pacientes com diagnóstico de malária no município e dos provenientes do interior do Estado.
4.2 População do estudo
Figura 9. Foto FMTAM Fonte: Próprio Autor
3.2 Participantes
Foram elegíveis para o presente estudo 14 pacientes, classificados como portador de P. Vivax sensíveis e resistentes, oriundo de um estudo prévio de eficácia da cloroquina em associação a primaquina tendo como base diretriz da OPAS.
3.3 Exame microscópico do sangue e determinação da parasitemia
As lâminas para diagnóstico da malária foram coletadas mediante punção da polpa digital do dedo indicador, este previamente higienizado com álcool iodado, com lanceta estéril, identificadas e a sua preparação para a coloração realizada segundo os procedimentos descritos no Basic Malaria Microscopy (OMS, 1991), usando-se coloração por Giemsa (pH de 7,2). As leituras das mesmas foram realizadas pelos técnicos em microscopia do Laboratório de Malária da FMTAM.
As gotas espessas coletadas, no momento da inclusão dos pacientes e nos dias de seguimento tiveram uma padronização de tamanho para aumentar a precisão da contagem, seguindo um gabarito como modelo, com base na medida recomendada pela (OMS, 2003). Para a contagem de parasitos nas pesquisas posteriores de plasmódio, a mesma técnica de preparo e coloração da gota espessa foi empregada.
A gota espessa de sangue foi negativa quando, ao se examinar, no mínimo 300 campos da lamina, não se encontrou formas assexuadas de P.vivax (OPAS,2004)
Todas as gotas espessas foram examinadas por dois revisores. A densidade parasitária final foi estimada na média das duas contagens. Caso a gota espessa apresentasse resultados divergentes (diferença em densidade parasitária > 50%), as mesmas eram reexaminadas por um terceiro microscopista e a densidade parasitária calculada, extraindo-se a média das contagens dos dois microscopistas concordantes.
3.3.1 Coleta de sangue
Foi colhida uma amostra de sangue venoso de cada paciente que serviu para a realização dos exames hematológicos, dosagem plasmática da fração cloroquina e desetilcloroquina e PCR diagnóstica quando aplicável. O método de colheita de sangue venoso foi a vácuo (Vacutainer ®), por punção venosa, com tubos com EDTA.
3.4 Dosagem sanguínea de cloroquina.
Parte do sangue venoso coletado (tubo com EDTA) foi impregnado em papel de filtro que serviu para a determinação dos níveis sanguíneos da fração cloroquina e desetilcloroquina nos dias D0, D3, D7, D14, D28, em todos os pacientes que mostraram recorrência parasitária nos 28 dias de seguimento (suspeita de fracasso terapêutico), tendo como valor de referência, no dia da recorrência parasitária
Densidade parasitária/µL = número de parasitos contados x leucometria ____
(fracasso terapêutico), níveis ≥ 100ng/mL (BAIRD, 1997, 2004; Patchen 1983; OPAS, 2004; Yonemitsu et al., 2005).
O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) empregado foi segundo Yonemitsu et al. (2005), utilizazando-se o cromatógrafo líquido marca VARIAN®, modelo PRO-STAR. As amostras tiveram seu processamento no Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Pará, sob supervisão do Professor Doutor José Luiz Fernades Vieira.
3.5 Diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
Com a finalidade de confirmação diagnóstica, a PCR das amostras de sangue foi realizada no dia da recorrência parasitária durante os 28 dias de seguimento, conforme técnica padronizada no laboratório da Gerência de Malária da FMTAM, que resulta na amplificação de uma região específica do DNA, utilizando-se iniciadores (primers) pré-desenhados e descritos por Snounou et al. (1993). Nos casos de divergência de diagnóstico, o exame foi repetido.
3.6 Tratamento dos pacientes
3.6.1 Medicamentos utilizados
A cloroquina utilizada na avaliação teve a apresentação em comprimidos de 250mg de sal, sobre a forma de cloridrato, equivalente a 150mg da concentração da base. A primaquina utilizada foi na apresentação em comprimidos de 15mg e 5mg do sal sobre a forma de difosfato, administrada ao inicio da avaliação em complementação ao tratamento curativo. Ambas fez parte de um lote garantido por controle de qualidade físico-química.
3.6.2 Tratamento com Cloroquina e Primaquina
Como se pretendeu avaliar a eficácia da cloroquina em associação a primaquina e considerando-se que a primaquina possui fraca ação esquizonticida sangüínea, esta droga foi administrada a partir do zero dia de acompanhamento dos pacientes (D0).
O tratamento com cloroquina foi na dose total de 25mg/kg de peso, distribuída em três dias com administração supervisionada diária da droga, no D0 - 10 mg/kg, D1 - 7,5mg/kg e D2 - 7,5mg/kg. A primaquina na dose 0,5mg/kg/dia, por 7 dias,iniciando também no dia zero (D0). (BRASIL, 2001).
Os parâmetros clínicos (febre, persistência de sintomas ou sinais de malária grave) e parasitológicos (desaparecimento parasitário ou persistência de parasitos), bem como os efeitos adversos causados pelo uso da cloroquina foram monitorados durante um período de seguimento de 28 dias.
3.6.3 Tratamento concomitante
Quando necessário, foram administrados medicamentos sintomáticos aos pacientes nas seguintes situações:
- Paracetamol ou dipirona para temperaturas > 37, 8 ºC e/ou algias;
- Em caso de febre, os pais ou responsáveis por menores de idade foram instruídos sobre o uso da aplicação de compressas úmidas;
- Em caso de náuseas e vômitos foi prescrito metoclopramida .
3.6.4 Tratamento alternativo
3.7 Clareamento parasitário
O acompanhamento parasitológico dos pacientes se estendeu até o 28º dia de seguimento (OPAS, 2004), possibilitando o rastreamento da ocorrência de recorrência parasitária.
3.8 Determinação das concentrações do antimalárico
3.8.1 Equipamentos e acessórios
As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência Varian®, composto por uma bomba isocrática modelo ProStart 300, injetor manual reodyne, com loop de 50uL, detector duplo canal ultravioleta e vísivel ProStar, modelo 220. A separação cromatográfica foi realizada a temperatura ambiente empregando-se uma coluna X-TERRA RP8 5μm 4.6 X 150mm (Waters, Saint Quentin-en-Y velines, France).
No preparo das amostras também foram utilizados um agitador de tubos vortex, Q-22ob1, Quimis; Ultra-som, Q-335D, Quimis; Centrífuga, 2K15, Sigma Laborzentrifugen; peagâmetro digital PHS-3B, pHtek; Balança, VL–1mg, Acculab; Homogeneizador BHS-300, Benfer; Bomba de vácuo, Fabbe; desionizador de água Aquapur AQ 0010; microseringa de 50µL, Halmliton; Papel de filtro Qualy (14µg de poro) ; micropipetas automáticas com volume regulável Finnpipette (10µL a 100µL, 20µL a 200µL e 200µL a 1000µL), Labsystems.
3.8.1.1 Reagentes e solventes
com o sistema Aquapur AQ 0010 para a preparação da solução de hidróxido de sódio a 2 M e ácido clorídrico a 0,01 e 1 N.
3.8.1.2 Preparação das soluções-padrão
3.8.1.3 Soluções estoque
As soluções estoques de cloroquina (Sigma) em concentração de 1,4 mg/mL e desetilcloroquina (Sigma) em concentração de 12µg/mL foram preparadas em ácido clorídrico a 0,01 N. Já a solução de quinina (Sigma) em concentração de 2,04mg/mL foi preparada pela dissolução em metanol.
3.8.1.4 Soluções intermediárias
A solução estoque de cloroquina foi diluída em ácido clorídrico a 0,01 N e desetilcloroquina em metanol, a fim de obter-se as concentrações de 20,0 µg/mL e 8 µg/mL, respectivamente.
3.8.1.5 Soluções de trabalho
Foram efetuadas diluições da solução intermediária de cloroquina em ácido clorídrico a 0,01 N e desetilcloroquina em metanol, para obtenção das soluções de trabalho em concentrações de 5,0 µg/mL e 5,0 µg/mL, respectivamente.
3.8.1.6 Solução do padrão interno
A solução estoque de quinina foi diluída em metanol, para obtenção de concentração de 20,0 µg/mL.
3.8.1.7 Condições cromatográficas
A fase móvel foi uma mistura isocrática de acetonitrila e solução aquosa de trietilamina 0,01 M (40:60, v/v) pH 11, ajustado com ácido orto-fosfórico a 50%. A solução preparada foi submetida à filtração e desgaseificação em ultra-som por 10 minutos antes do uso. O fluxo utilizado foi de 1,0 mL/min e comprimento de onda de 333 nm (referencia).
3.8.2 Procedimento de extração de cloroquina e desetilcloroquina
Os “spots” em pequenas peças foram transferidos para tubos de centrífuga de polipropileno de capacidade de 15mL e adicionado1.5mL Hcl 0.1N. Os tubos foram transferidos para um agitador mecânico e submetidos à agitação por 20 minutos. A seguir, os mesmos foram para banho de ulta-som por uma hora. O papel de filtro foi retirado, com auxílio de um palito de madeira e adicionado 0,5mL de NaOH 2M, 100ul do padrão interno e 6mL de metil terc butil éter. Os tubos foram agitados por 15 minutos e centrifugados a 2000 rpm por 15 minutos. A camada orgânica foi separada e evaporada em banho de água a 60 ºC. O resíduo foi ressuspendido com 100 uL da fase móvel e injetado, em volume de 50 uL no cromatógrafo.
3.8.3 Curva de calibração
Foram utilizados calibradores contendo cloroquina e desetilcloroquina, em concentrações de 100, 250, 500, 750 e 1000 ng/mL, respectivamente, os quais foram analisados em quintuplicata. As relações das áreas e do padrão interno foram plotadas no eixo da ordenada e as concentrações na abscissa. Foi realizada a regressão linear para obtenção da equação da reta e calculado o coeficiente de correlação de Pearson (r).
Os ensaios foram realizados em quintuplicata e as relações das áreas de cada substância de interesse e do padrão interno foram projetadas no eixo da ordenada e as concentrações na abscissa. A regressão linear foi feita para obtenção da equação da reta e o coeficiente de Pearson (r) foi calculado para estabelecer a correlação entre as concentrações dos fármacos e as respectivas relações das áreas do analito e do padrão interno (ANVISA, 2003; FDA, 2001).
3.8.4 Determinação das concentrações de cloroquina e desetilcloroquina
As concentrações de cloroquina e desetilcloroquina foram determinadas a partir da relação entre as áreas dos picos dos referidos fármacos e do padrão interno, que foi plotado na curva de calibração, para obtenção das concentrações de interesse.
3.9 Análise estatística dos Resultados
Foi montado um banco de dados no programa Microsoft Excel. A analise foi realizada com os pacotes estatísticos EPI Info 6.04 e SPSS; programa BioEstat 3.0 (Ayres et al.,2003 foram usados os testes de Qui-quadrado com correção de Yates para comparar proporções e o teste t de Student para comparação entre médias. Também, foi estimada a razão de probabilidades (Odds Ratio) usando intervalo de confiança de 95% para medir a força de associação entre duas variáveis. Foi considerado um nível de significância estatística menor ou igual a 5% para rejeitar a hipótese nula.
3.10 Considerações Éticas
continuação dos trabalhos, toda equipe conheciam integralmente o protocolo do estudo, com verdadeiro rigor metodologico.
3.11 Consentimento após informação
O presente estudo foi executado segundo as normas da Organização Mundial da Saúde para a Prática Clínica Adequada, além de todos os requisitos legais que rege a Resolução 196 a éticos para pesquisas envolvendo seres humanos no Brasil.
O presente estudo é parte integrante das atividades de investigação científica da RAVREDA – Rede de Vigilância da Resistência dos Plasmódios aos Antimaláricos na Bacia Amazônica, estando em conformidade com os preceitos da ética em pesquisa com seres humanos.
Os voluntários incluídos foram devidamente instruídos em detalhe sobre os objetivos e procedimentos do estudo, assim como de seus direitos como voluntários. A maior idade no Brasil e de 18 anos. Os voluntários que tinham 18 anos de idade ou mais a que concordaram em participar, foi solicitados a assinatura do consentimento informado. Os termos do consentimento foram também assinados por uma testemunha, que foi uma pessoa não associada com a equipe de investigarão. No caso das pessoas analfabetas, foram perguntadas verbalmente pelo seu consentimento, e duas pessoas não associadas com a equipe do estudo assinaram o termo de consentimento como testemunhas. Todos os indivíduos receberam cópias dos termos de consentimento.
3.12 Custos financeiros do Projeto
com recursos cedidos pelo Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Pará-UFPA.
4. Resultados
Os resultados e discussões estão sendo apresentado em forma de artigo:
Chloroquine and desethylchloroquine levels in late parasitological
failure cases of malaria vivax from Manaus, Brazil
Authors
Marques MMa , Costa MRFa, Simões FSFa, Viera JLFd , Borges LGd ,Nascimento MTSd, Alecrim MGC.a, b, c
a
Department of Malaria– The Foundation for Tropical Medicine of Amazonas (FMTAM), Manaus, Amazonas, Brazil
b
Amazonas State University (UEA), Manaus, Amazonas, Brazil c
Nilton Lins University, Manaus, Amazonas, Brazil d
The Federal University of Pará, Belém, Pará, Brazil
Corresponding author: José Luis Fernandes Vieira The Federal University of Pará
Abstract
We report the occurrence of resistance to chloroquine administered at a dose of 25 mg / kg in seven patients with vivax malaria treated in a reference center in Manaus, Brazil, from December 2007 to June in 2008. All patients were evaluated clinically and parasitologically-blood levels of chloroquine and desetilcloroquina were obtained on days 0, 3, 7, 14 and 28 of treatment. The data point to the importance of resistance to chloroquine in Manaus, Amazonas, Brazil.
Keywords: Plasmodium vivax, chloroquine resistance, Amazonas.
1. Introduction
Monitoring the effectiveness of antimalarial treatment is crucial; therefore, resistance to antimalarial drugs in the world is one of the obstacles to controlling the disease. The spread of strains of P. vivax resistant to chloroquine, as the literature, has a broad geographical distribution in various regions of the world as Indo-Pacific, Asia and South America ( Alecrim., 2000; Baird,2004; De Santana et al., 2007; Mendis et al.,2001; OPAS., 2004; Soto et al., 2001).
and desetilcloroquina in patients with and without treatment failure, suggesting the possibility of decreased sensitivity and therapeutic failure related to strains of P. vivax, as in the cases described the blood concentrations of chloroquine and its active metabolite, were above minimum effective concentration for susceptible strains of P. vivax (MEC ≥ 100 ng / mL), as characterized previous studies that establish patterns of parasite resistance ( Baird., 2004).
2. Materials and methods
The study was conducted at the Tropical Medicine Foundation of Amazons (FMTAM), in Manaus, in the period December 2007 to June 2008. The study included 14 patients classified as having P. vivax, seven sensitive and seven resistant, from a previous study involving 154 patients that evaluated the efficacy of chloroquine in combination with primaquine.
Ministry of Health, 2001). - 20 mg / kg - followed by administration of primaquine. The actual rate of therapeutic failure was estimated by performing diagnostic PCR in blood samples collected in D28( Snounou et al ., 1993). The determination of chloroquine (CQ) and desetilcloroquina (DCQ) in whole blood samples collected on filter paper on days D0, D3, D7, D14 and D28 were analyzed at the Federal University of Pará (UFPA) in the toxicology laboratory, using if Cromatogragfia Liquid (HPLC), according to the method described by (Patchen et al., 1983). The study was submitted and approved by the Ethics Committee of the IMT-AM Protocol 25.000.105898/2004-74 (RAVREDA, 2008). The data were analyzed using EXCEL 2007. The frequency of resistance was estimated by means of proportion to their respective confidence interval of 95% with a significance level of 5%.
3. Results
mL and 203.49 ± 361.5 ng / mL, respectively. As for DCQ were 793 ± 637 ng / mL, 657.2 ± 498 ng / mL, 709.34 ± 586 ng / mL and 580.3 ± 432.4 ng / mL. The blood concentrations of CQ at D3, D7, D14 and D28 in patients with recurrent parasite were 670 ± 629.7 ng / mL, 411.8 ± 381.2 ng / mL, 384.3 ± 324.3 ng / mL and 209.9 ± 187.94 ng / mL, respectively. For DCQ values were 495.5 ± 306 ng / mL, 873.8 ± 767 ng / mL, 660 ± 456.4 ng / mL and 506 ± 289 ng / mL, respectively. There was no significant difference in average levels of CQ and DCQ between the groups in several days of study (p> 0.05). However, there was significant difference in blood levels of CQ + DCQ only D3. The average amount of blood concentrations of CQ + DCQ in the days of follow-up are illustrated in Table 1.
TABLE 1: Comparison between the average concentrations of CQ + DCQ in sensitive and resistant patients.
Dia CQ+DCQ Valores de p Pacientes Sensíveis (x ± DP) Pacientes Resistentes (x ± DP) D3 3311,1 ± 2361,8 1069,8 ± 810,64 0,04892 D7 1914,2 ± 1700 1321,5 ± 922,6 0,4631 D14 1351,4 ± 1763 1044,3 ± 667,6 0,6794 D28 783,8 ± 530,3 647,4 ± 227,2 0,5433 4. Discussion
2013.8 ng / mL and 793 ± 637 ng / mL, respectively. Similar results were found in 61 Indian patients treated orally with 25 mg chloroquine base / kg body weight for 3 days and reaching the D2 average blood concentration of CQ, 1980 ng / mL, and 1510 ng / mL present in red cells and 470 ng / mL in plasma from the same patients
(Dua et al.,1999) . In the same study the blood concentration of DCQ was 760 ng /
mL, erythrocyte levels of 540 ng / mL plasma and 220 ng / mL. These figures demonstrate that the CQ was well absorbed from the gastrointestinal tract, indicating that there were other factors that may influence the kinetics of the drug, including rapid excretion or poor absorption (Dua et al.,1999). Assessing levels of QC 785.4 ± 800.1 ng / ml in patients of Manaus. Eleven patients were resistant to P. vivax, with concentrations of 356.6 ± 296.1 ng / mL, lower than those found in patients sensitive
( De Santana et al ., 2007). Among the resistant patients, two had blood
concentrations of CQ + DCQ in sensitive and resistant patients in D3 was 3311.1 ± 2361.8 and 1069.8 ± 810.64 ng / mL, respectively. Statistically significant difference between the two groups with p = 0.04892. This difference was not observed on days 7, 14 and 28. In the study evaluating the mean concentration of CQ + DCQ in erythrocytes and plasma of patients was significantly more sensitive than in resistant patients with p <0.0001 and p <0.02, respectively ( Dua et al., 2000).However, on day 7 no significant difference between the sensitive and resistant cases. Similarly, the mean concentration of CQ in plasma of patients was more sensitive than in resistant patients (p> 0.05), ( Karim et al., 1992), blood concentrations of CQ in D7 were lower in patients resistant than the sensitive ( Hellgren et al .,1989). Confirming the results found in this study.
The relatively low concentration of CQ in resistant patients may be caused by changes in absorption or the inter-individual variability in the pharmacokinetics of CQ ( Dua et al ., 1999).In D28 the average concentrations of CQ+DCQ in sensitive and resistant patients was 783.8 ± 530.3 ng / mL and 647.4 ± 227.2 ng/mL, respectively.
policy. The monitoring of therapeutic levels of this drug is useful for alerting the authorities to control the levels of resistance and determine the extent of the problem in the region, given that P. vivax is responsible for the largest number of malaria cases in Brazil.
Acknowledgments:
This study was part of a scientific protocol for programming multi Amazon Network for Monitoring Antimalarial Drug Resistance (RAVREDA) Secretariat of Health Surveillance / Ministry of Health, with financial support also from the Laboratory of Toxicology, Federal University of Pará (UFPA ) and FMTAM, serving also as a topic for dissertation in the Masters in Tropical and Infectious Diseases at the University of the State of Amazonas (UEA)
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