investigação, 18(1): 35-44, 2019 investigação, 18(1): 35-44, 2019
MSc. Ana Carolina B. R. Pedroso1*, Joel P. C. Souza2, Marcos Luiz D. Júnior2, Dr.ª Veridiana Maria B. D. Moura3, Dr.ª Luciana R. G. Brandstetter1
1 Universidade Federal de Goiás, Departamento de Clínica e Cirurgia Animal, Goiás, Brasil 2 Universidade Federal de Goiás, Goiás, Brasil 3 Universidade Federal de Goiás, Departamento de Patologia Animal, Goiás, Brasil
REVISÃO DE LITERATURA
CLÍNICA DE GRANDES ANIMAIS
PLASMA RICO EM PLAQUETAS E CICATRIZAÇÃO
Platelet rich plasma and wound healing
RESUMO
ABSTRACT
As lesões cutâneas apresentam elevada ocorrência na medicina de equinos. Diversos fatores inerentes à fisiologia e ao comportamento dessa espécie favorecem a ocorrência de lesões em membros distais, além de dificultar o processo cicatricial. Terapias auxiliares foram estudadas, como forma de melhorar a qualidade e acelerar o processo de cicatrização. Dentre elas, destaca-se o plasma rico em plaquetas (PRP), produto derivado do sangue total com concentrações plaquetárias elevadas e rico em fatores de crescimento. A utilização do PRP foi crescente nos últimos anos, contudo ainda existe muita divergência em relação aos seus efeitos benéficos. Diante do exposto, o presente trabalho tem por objetivo revisar as potenciais propriedades de regeneração tecidual do PRP e seus métodos de obtenção, além de ressaltar sua aplicabilidade no tratamento de lesões cutâneas em equinos e suas possíveis contraindicações. Dessa forma, espera-se difundir as informações acerca das vantagens da utilização do mesmo e incentivar a pesquisa, que venha a elucidar as dúvidas, ainda existentes, a seu respeito.
Palavras-chave: cavalos, fatores de crescimento, trombócitos
Skin lesions present high occurrence in equine medicine. Several factors inherent in the physiology and behavior of this species favor the occurrence of lesions in distal limbs, besides hindering the cicatricial process. Auxiliary therapies were studied as a way to improve quality and speed up the healing process. Among them, the platelet rich plasma (PRP), a product derived from whole blood with high platelet concentrations and rich in growth factors, stands out. The use of PRP has been increasing in recent years, however there is still a lot of divergence regarding its beneficial effects. In view of the above, the objective of this work is to review the potential tissue regeneration properties of PRP and its methods of obtaining, in addition to emphasizing its applicability in the treatment of cutaneous lesions in horses and their possible contraindications. In this way, it is hoped to spread the information about the advantages of using it and to encourage research, which will elucidate the doubts that still exist about it.
INTRODUÇÂO
O cavalo ocupa uma posição de destaque na economia dos países desenvolvidos, no entanto, a sua contribuição para geração de renda e de postos de trabalho no Brasil ainda é pouco conhecida. O Brasil possui o maior rebanho de equinos da América Latina e o terceiro mundial. O agronegócio do cavalo movimenta no país, em média, 7,5 bilhões de reais por ano. O rebanho envolve mais de 30 segmentos, distribuídos entre insumos, criação e destinação final e compõe a base do chamado Complexo do Agronegócio Cavalo, responsável pela geração de 3 milhões de empregos diretos e indiretos. Apenas em relação ao mercado de produtos veterinários, o Brasil ocupa o terceiro lugar, atrás apenas de Japão e EUA. Estima-se que o comércio de produtos específicos para equinos movimente cerca de 220,5 milhões de reais por ano, o que ainda é subestimado, já que muitos produtos destinados aos bovinos são também utilizados em equinos (LIMA e CINTRA, 2016).
Nos equinos, a frequência dos ferimentos cutâneos é muito alta, quando comparada às outras espécies (BERTONE, 1989). A cicatrização de feridas é um processo complexo, no qual ocorre interação entre eventos celulares, moleculares e que resulta na formação da cicatriz (GOSS, 1992). Os cavalos têm a cicatrização lenta e dificultosa, o que leva ao desenvolvimento de feridas crônicas e, consequentemente, altos custos com tratamentos (DUGRILLON e KLUTER, 2002). Essas feridas possuem menor disponibilidade de fatores de crescimento (STADELMANN et al. 1998), que agem como sinalizadores na regulação de vários processos envolvidos na cicatrização (EVERTS et al. 2006) e utilizam
as plaquetas como principal suprimento (reserva, fonte) de fatores de crescimento (DeROSSI et al. 2009). Nesse contexto, pesquisas têm sido desenvolvidas a fim de buscar novas alternativas para o tratamento de feridas em equinos.
Dentre as alternativas disponíveis para a melhoria na cicatrização de feridas em cavalos, cita-se o plasma rico em plaquetas (PRP), que é um produto derivado da centrifugação do sangue total, rico em citocinas e fatores de crescimento. O PRP tem sido usado como opção terapêutica em diversas enfermidades, tanto em humanos, quanto em animais domésticos, porém não existem evidências suficientes para confirmar sua eficácia. Em relação às feridas cutâneas de equinos, os seus resultados dependem da localização da lesão, da forma de obtenção e composição do PRP, da forma de apresentação (gel ou líquido), da via e frequência de aplicação, do volume e do momento em que é administrado durante o processo de cicatrização (SOUZA et al. 2014).
Anatomia e função das plaquetas
As plaquetas são pequenos fragmentos citoplasmáticos anucleados de forma discoide, com 5 a 7 μm de diâmetro e largura inferior a 3 μm (TABLIN, 2000), com origem nos megacariócitos e na medula óssea. Elas possuem citoesqueleto contrátil formado por actina e miosina, além de estruturas intracelulares que contém glicogênio e três tipos de grânulos (grânulos densos, α-grânulos e grânulos lisossomais). Quando em latência, as plaquetas não são trombogênicas e precisam de ativação. Quando ativadas, elas mudam de forma e desenvolvem pseudópodes, que promovem a agregação plaquetária e a liberação do conteúdo dos seus grânulos (EVERTS et al. 2006).
Os grânulos densos das plaquetas armazenam adenosina difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP), cálcio, serotonina, histamina, dopamina e catecolaminas. O ADP promove a agregação plaquetária, enquanto o ATP participa na resposta das plaquetas ao colágeno. A serotonina é um cofator necessário para a agregação e formação de fibrina, além de promover a modulação da diferenciação e proliferação dos queratinócitos, a vasoconstrição e o aumento da permeabilidade vascular. A histamina possui efeitos pró e anti-inflamatórios (LANSDOWN, 2002).
Os α-grânulos armazenam proteínas adesivas, fibrinolíticas, antibacterianas e fungicidas, proteínas de membrana, fatores mitogênicos, proteoglicanos e famílias de proteínas básicas, além de citocinas e quimiocinas. As proteínas adesivas são aquelas que participam da formação do coágulo, como fibrinogênio, fibronectina, vitronectina e trombospondina-1 (ANITUA et al. 2004). O fibrinogênio, além de crucial na coagulação, potencializa o efeito da interleucina-3 nos progenitores hematopoiéticos humanos (ZHOU et al. 1993). A fibronectina e a vitronectina participam do processo de cicatrização (LARIVIERE et al. 2003) e, juntamente com a fibrina, promovem a osteocondução por meio da sua ação na adesão celular, melhorando a qualidade de enxertos ósseos (MARX, 2004).
Dentre as proteínas fibrinolíticas, o inibidor do ativador do plasminogênio do tipo-1 (PAI-1) participa da regulação da fibrinólise e se liga à vitronectina, melhorando as interações da célula com a matriz extracelular (MINOR e PETERSON, 2002). A osteonectina, que também é secretada pelos osteoblastos, forma um complexo com o plasminogênio e o ancora com o colágeno (KELM et al. 1994).
As trombocidinas, também armazenadas nos α-grânulos, são consideradas proteínas antibacterianas e fungicidas, embora essa informação ainda necessite de comprovação científica (KRIJGSVELD et al.
2000). As glicoproteínas de membrana mais importantes são a CD40 ligante, o fator tecidual e a P-selectina. A CD40 ligante tem papel na resposta imune e leva à inflamação, produção de integrinas e síntese de interleucinas e quimiocinas (ANAND et al. 2003). O fator tecidual é um iniciador da cascata extrínseca da coagulação e regulador natural da angiogênese (CARMELIET et al. 1996), além de regular a ligação do plasminogênio e sua ativação (FAN et al. 1998). A P-selectina é a glicoproteína de membrana mais estudada e faz a mediação das interações entre plaquetas e leucócitos (McEVER, 2002).
Os fatores mitogênicos são os fatores de crescimento essenciais para o processo de cicatrização. São eles: fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento de transformação-β (TGF-β), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e fator de crescimento epidermal (EGF). Essas proteínas estão envolvidas no estímulo à quimiotaxia, proliferação e maturação celular, além de possuírem potentes efeitos angiogênicos e mitogênicos para células endoteliais (FOLKMAN et al. 2001).
Dentro da família das proteínas básicas estão o fator plaquetário-4 (PF-4), a β-tromboglobulina e as endostatinas. O PF-4 é um regulador negativo para a angiogênese e um potente inibidor da proliferação de células endoteliais, além de quimioatrativo para neutrófilos e fibroblastos (SULPICE et al. 2002). Os α-grânulos também são fonte de citocinas e quimiocinas, como a proteína regulada na ativação, expressa e spor célula T normal (RANTES), uma quimiocina depositada no endotélio inflamado e que leva à captura de
monócitos (SCHOBER et al. 2002). Outras quimiocinas liberadas são interleucina-8, proteína inflamatória do macrófago-1α (MIP-1α), oncogene-α de crescimento regulado, antígenos nucleares extraíveis-8 (ENA-8) e proteína quimiotática do monócito-3 (MCP-3), todas envolvidas na atração de leucócitos e ativação de outras plaquetas, além de modularem a produção de moléculas inflamatórias pelas células endoteliais (GEAR e CAMERINI, 2003). Por sua vez, os grânulos lisossomais secretam hidrolases ácidas, catepsinas D e E, elastase e outras enzimas degradativas (RENDU e BROHARD-BOHN, 2001).
As plaquetas, assim como os neutrófilos e os macrófagos, exercem papel importante na cicatrização e são ativadas na primeira fase deste processo (SAMPSON et al. 2008), participando da hemostasia. Esse processo ocorre por meio de uma interação balanceada entre plaquetas, endotélio, proteínas plasmáticas de coagulação e substâncias de baixo peso molecular. A lesão vascular causa mudanças no endotélio e exposição do colágeno subendotelial, o que promove adesão, agregação, ativação plaquetária e consequente liberação do conteúdo dos grânulos plaquetários. A serotonina e o ADP, liberados dos grânulos densos, auxiliam na vasoconstrição e estimulam outras plaquetas a degranularem, promovendo o plug hemostático. Ocorre a ativação da fosfolipase A2 das membranas das plaquetas e posterior liberação do ácido araquidônico, que é convertido em tromboxano A2, que também causa agregação plaquetária e liberação de fatores de crescimento. Esse processo é denominado hemostasia primária (SIXMA et al. 1984).
A hemostasia secundária se dá pela ativação dos fatores de coagulação e formação da rede de fibrina, que estabiliza o plug plaquetário (DHALL et al. 1983). Finalmente acontece a fibrinólise, pela ativação dos leucócitos e liberação das citocinas inflamatórias, que irão ativar o sistema fibrinolítico, levando à lise do coágulo (EVERTS, 2006).
Além da sua atuação na hemostasia, as plaquetas ainda estão envolvidas na liberação de citocinas e fatores de crescimento
armazenados nos α-grânulos e que são importantes na quimiotaxia de outros componentes celulares, na fibroplasia e na angiogênese. Para que haja a liberação dessas substâncias, as plaquetas precisam ser ativadas, o que acontece a partir do seu contato com agentes fisiológicos, como trombina, tromboxano, colágeno, ADP, fator ativador de plaqueta, serotonina e epinefrina; e com agentes farmacológicos, como ionóforo de cálcio, cloreto de cálcio e seus análogos (CARMONA et al. 2007). A ativação também pode acontecer quando as plaquetas entram em contato com superfícies sólidas (SAMPSON et al. 2008). Cerca de dez minutos após a sua agregação e ativação, as plaquetas liberam as proteínas pré-sintetizadas e armazenadas nos seus grânulos e, em cerca de uma hora, 95% já foram liberadas. Essas proteínas continuam sendo produzidas e liberadas pelas plaquetas, em concentrações menores, por até dez dias, enquanto essas células permanecerem viáveis (PIETRZAK e EPPLEY, 2005). A concentração de plaquetas no sangue dos equinos varia de 100.000 a 300.000 plaquetas/µL (SCHALM, 1975).
Fatores de crescimento
Os fatores de crescimento são peptídeos sinalizadores liberados pelos α-grânulos plaquetários, que possuem papel central nos processos de cicatrização e regeneração tecidual (WERNER e GROSE, 2003). Eles interagem com receptores da superfície das células, aumentando a transcrição gênica e a síntese proteica. As proteínas sintetizadas desencadeiam a proliferação e diferenciação celular, além de estimularem a produção de matriz extracelular e a angiogênese, o que leva a uma melhora do processo de reparação tecidual (BOSCH et al. 2011).
A secreção ativa dos fatores de crescimento é estimulada pela coagulação e tem início cerca de dez minutos após a formação do coágulo. Após essa liberação inicial, as plaquetas continuam sintetizando e liberando fatores de crescimento por cerca de sete dias.
A sua liberação acontece através da membrana celular plaquetária, quando são transformados em seu estado bioativo pela adição de histonas e cadeias de carboidratos. Após a liberação, os fatores de crescimento se ligam imediatamente à superfície externa das membranas das células presentes na ferida, via receptores transmembrana (MARX, 2004), que induzem a ativação de proteína endógena sinalizadora. Essa sinalização causa a expressão da sequência gênica normal da célula, que induz a sua proliferação, formação de matriz extracelular, produção de osteoides e síntese de colágeno (MARX, 2001b; SCHMITZ e HOLLINGER, 2001).
Os fatores de crescimento podem ser classificados como morfométricos ou mitogênicos. Os morfométricos são aqueles envolvidos no crescimento ósseo, pela transformação de células tronco mesenquimais multipotentes em células osteoprogenitoras, na presença de proteína óssea morfogênica. Os mitogênicos são aqueles relacionados ao aumento da população de células cicatriciais por mitogênese (HOCK e CANALIS, 1994). Os principais fatores de crescimento mitogênicos, já citados anteriormente, são PDGF, TGF-β, VEGF, FGF, IGF e EGF. Dentre esses, os mais importantes são o PDGF e TGF-β (CROMACK et al. 1991).
O TGF-β tem papel central no processo de cicatrização por meio do recrutamento de macrófagos, fibroblastos e do estímulo à produção do colágeno e diminuição da sua degradação pela inibição das metaloproteinases (MONTEIRO et al. 2009). O TGF-β também suprime a liberação de peróxido de hidrogênio pelos macrófagos (TSUNAWAKI et al. 1988), reduzindo a morte celular por estresse oxidativo (ROBERTS e SPORN, 1990). Ele é ativado durante a fase inflamatória (MOLLOY et al. 2003) e possui
três isoformas, que têm regulação diferenciada com base no estresse celular, injúrias do tecido ou exposição à citocinas. O TGF-β1 é ativado em condições ácidas ou por clivagem proteolítica (CHANG et al. 1997) e é liberado na sua forma inativa ligado à proteína, sendo eliminado rapidamente após a ativação (LEE, 2000). Essa isoforma possui efeitos anti-inflamatórios, pela inibição da expressão e liberação de algumas citocinas pró-inflamatórias e catabólicas, como interleucina-1β, TNF-α, interleucina-6 e interleucina-8, que estimulam a síntese de metaloproteinases (BENNETT e SCHULTZ, 1993). O TGF-β1 também está associado ao desenvolvimento de tecido de granulação exuberante devido à sua função pró-fibrótica. Dessa forma, a sua permanência elevada no final do processo de cicatrização pode não ser benéfica (THEORET e WILMINK, 2013).
O PDGF é o primeiro fator de crescimento presente na ferida (EVERTS et al. 2006) e pode ser derivado de plaquetas, leucócitos e células endoteliais. Ele aumenta a resposta inflamatória e o influxo de neutrófilos e macrófagos (PIERCE et al. 1991), estimula a síntese do tecido de granulação (MUSTOE et al. 1991) e a contração e remodelamento durante a última fase da cicatrização (STENBERG et al. 1991), pois é mitogênico para fibroblastos e miócitos e tem a capacidade de induzir o fenótipo dos miofibroblastos nos fibroblastos (BARRIENTOS et al. 2008). A sua isoforma mais potente é a PDGF-BB, que é liberada em sua forma ativa e tem meia-vida de dois minutos (LEE, 2000).
O VEGF fica retido nos coágulos de fibrina, onde mantém sua habilidade de induzir a proliferação de células endoteliais, migração de monócitos e o aumento de secreção de interleucina-6 e interleucina-8 (TEZONO et al. 2001). É produzido em maiores níveis só após a fase inflamatória e é um potente estimulador da angiogênese (ANITUA et al. 2005).
O FGF se liga à fibrina e dá suporte ao crescimento prolongado das células endoteliais (SHANI et al. 2003), além de ser um potente estimulador da angiogênese e regulador da migração e proliferação
celular. O IGF é altamente expresso no início da fase inflamatória, auxilia na proliferação e migração de fibroblastos e no aumento da produção de colágeno (MOLLOY et al. 2003). Já o EGF tem efeitos limitados às células basais da pele e induz a replicação e migração celular (SAMPSON et al. 2008).
Plasma rico em plaquetas (PRP)
O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma fração de plasma do sangue autólogo que possui uma concentração muito maior de plaquetas do que a do sangue total (MARX, 2001a). É um produto autógeno, atóxico, com baixo risco de transmissão de doenças infectocontagiosas (PIERCE et al. 1991) e com grande potencial na integração de vários tipos de enxertos, além de ser estimulante na cicatrização de feridas (VENDRAMIN et al. 2009). Há relatos da sua utilização para tratamento de feridas desde 1985 (DRIVER et al. 2006) e em cirurgias cardiotorácicas e maxilofaciais em humanos desde 1990. É empregado em diversos procedimentos de cirurgia plástica e ortopedia (LAKKARAJU, 2013). Em modelos animais, o emprego do PRP já foi relatado em neovascularização de córneas em coelhos, regeneração de tecido conjuntivo e reepitelização de feridas cirúrgicas (BAUER et al. 2009). Na medicina equina, o PRP vem sendo pesquisado desde o início dos anos 2000 em tratamento de feridas, tendinites, desmites, osteoartrites e consolidação de fraturas (PEREIRA et al. 2013).
O PRP é uma mistura natural de mediadores estimulantes e inibitórios, que possuem efeitos biológicos sinérgicos no ambiente da ferida (STEEL et al. 1999). Esses mediadores são moléculas bioativas, como alguns fatores de crescimento, que estimulam componentes celulares ou facilitam etapas importantes no processo de reparo tecidual (LAKKARAJU, 2013). A sua ação é mais complexa do que se pensa, uma vez que as plaquetas possuem centenas de proteínas que também podem estar envolvidas no processo de reparo, além dos fatores de crescimento (ANDIA et al. 2012).
Apesar da literatura ainda ser muito conflitante no que diz respeito aos resultados da utilização do PRP, devido à falta de padronização das técnicas de obtenção e dos protocolos de tratamento (SAMPSON et al. 2008), existem estudos que relatam suas propriedades antibacterianas, antifúngicas e analgésicas, além do seu uso como adjuvante na formação da matriz de fibrina (LAKKARAJU, 2013). Derivados de plaquetas têm sido usados em milhares de pacientes nos EUA na última década e, de acordo com dados do Serviço Americano de Saúde, o seu uso é de eficácia comprovada, especialmente em feridas severas (MARGOLIS et al. 2001).
O efeito sistêmico do PRP é um aspecto polêmico, que vem sendo discutido com resultados contraditórios. Em 2010, a Agência Mundial de Doping dos EUA incluiu o PRP na lista de substâncias consideradas doping em humanos, o que foi posteriormente cancelado devido à falta de provas. Porém, muitos fatores de crescimento continuaram na lista de substâncias proibidas em 2011 e 2012 (SOUZA et al. 2014). Até 2012 apenas um estudo havia encontrado um possível efeito sistêmico do PRP em pacientes humanos portadores de tendinopatia patelar. Esses pacientes apresentaram uma redução significativa na concentração sérica de EGF e VEGF até três horas após a aplicação intratendínea do PRP (BANFI et al. 2006). Em 2013, um estudo observou efeito sistêmico de vários fatores de crescimento, também em pacientes humanos que receberam PRP intratendíneo, sendo que alguns deles apresentaram elevação na sua concentração sérica (WASTERLAIN et al. 2013). O mesmo estudo relatou que o método utilizado para a preparação do PRP e a técnica de ativação podem afetar a magnitude desse efeito. Os estudos possuem resultados antagônicos, portanto o
efeito sistêmico do PRP pode causar tanto um aumento quanto uma diminuição da concentração dos fatores de crescimento no soro, plasma ou sangue total (SOUZA et al. 2014).
Método de obtenção do PRP
O PRP é obtido a partir do sangue não-coagulado (FOSTER et al. 2009). O anticoagulante de escolha para a colheita é o citrato de sódio, pois ele se liga aos íons cálcio, formando quelatos, que impedem que ocorra a coagulação do plasma (ANITUA et al. 2004), além de possuir a capacidade de preservar a integridade da membrana das plaquetas (LANDESBERG et al. 2000).
Existem diversos métodos para obtenção do PRP, que variam quanto ao custo, facilidade de preparação, volume de sangue necessário e a concentração de plaquetas que se procura obter (PRADES et al. 2006). Primeiramente, o PRP era obtido por meio de máquinas de autotransfusão. O procedimento era realizado em centro cirúrgico, com técnico especializado, e era necessária colocação de cateter venoso profundo no paciente para colheita de 400 a 450 mL de sangue. Posteriormente foram desenvolvidos protocolos com aparelhos mais simples, que necessitavam apenas de punção venosa periférica e de um menor volume de sangue (50 – 60 mL) para obtenção de cerca de 7 a 10 mL de PRP. Embora fosse mais fácil, esse método ainda representava um alto custo (KEVY e JACOBSON, 2004). Atualmente, o PRP pode ser obtido por centrifugação manual. A concentração plaquetária pode ser aumentada em cerca de quatro vezes quando comparada à do sangue total e o custo deste método é cerca de dez vezes menor do que os anteriores (VENDRAMIN et al. 2006).
Diversos protocolos são descritos para a espécie equina e a maioria deles consiste em duas centrifugações. Na primeira centrifugação, separam-se as células vermelhas e brancas das plaquetas, devido à diferença de densidade. Na segunda centrifugação, concentram-se as
plaquetas, produzindo o plasma pobre em plaquetas (PPP) e o PRP (FOSTER et al, 2009). A quantidade de plaquetas necessária para auxiliar nos processos cicatriciais ainda é incerta (McLELLAN E PLEVIN, 2011), mas sabe-se que a concentração de plaquetas no PRP depende da contagem inicial no sangue total, ou seja, quanto maior o número inicial de plaquetas, mais rico será o PRP (BARBOSA et al. 2008).
Segundo alguns autores (GRAZIANI et al. 2006), a concentração ótima de plaquetas está entre duas vezes e meia e cinco vezes e meia maior que a do sangue total, pois uma concentração superior a essa pode produzir efeitos indesejáveis, como diminuição da proliferação fibroblástica e da função dos osteoblastos. Outros autores relatam que a contagem de plaquetas no PRP deve ser superior a 300.000 plaquetas/µL (WHITMAN et al. 1997) ou, ainda, de três a seis vezes maior do que a do sangue total (SOUZA et al. 2014).
Os concentrados de plaquetas podem ser classificados de acordo com a quantidade de plaquetas e de leucócitos presentes. O PRP puro (PRP-P) é aquele em que as células brancas são intencionalmente eliminadas e ainda não há consenso sobre a quantidade ideal de plaquetas que devem estar presentes (CARMONA et al. 2013). O PRP com leucócitos (PRP-L) é aquele em que a concentração de plaquetas é de cinco a oito vezes maior e a de leucócitos é de três vezes maior do que a do sangue total (EHRENFEST et al. 2009). O concentrado de plaquetas rico em fibrina (PRF) é obtido sem o uso de anticoagulante (CARMONA et al. 2013) e o gel de plaquetas (GP) é o concentrado rico em plaquetas ativado por agentes farmacológicos, formando um polímero de fibrina. Cada metodologia pode resultar em um produto diferente e com possíveis potenciais terapêuticos distintos (SOUZA et al. 2014).
A presença de leucócitos no concentrado de plaquetas pode ter efeitos positivos e negativos. Essas células aumentam a resposta inflamatória, atuam na imunidade e na sinalização celular, além de liberarem fatores de crescimento (BOSWELL et al. 2012). Por outro
lado, elas aumentam o catabolismo tecidual, diminuem a síntese de matriz extracelular (McCARREL e FORTIER, 2009) e podem aumentar a dor local (MISHRA e PAVELKO, 2006). O menor efeito catabólico ocasionado pela menor concentração de células brancas talvez seja mais importante do que a alta concentração de plaquetas, cuja finalidade é maximizar o efeito anabólico dos tecidos (BOSWELL et al. 2014).
Um estudo avaliou sete protocolos de obtenção de PRP quanto à capacidade de concentração plaquetária, presença de hemácias e leucócitos e correlação entre a concentração de plaquetas e de TGF-β. Apesar de todos concentrarem as plaquetas cerca de quatro vezes acima da concentração do sangue total e de não haver diferença estatística entre eles, os autores recomendaram os protocolos de Vendramin et al. (2009) e Barbosa et al. (2008), por apresentarem uma maior concentração plaquetária, níveis favoráveis de TFG-β e menor presença de hemácias e leucócitos (PEREIRA et al. 2013).
A ativação do PRP deve ser realizada imediatamente antes do seu uso (WHITMAN et al. 1997), com íons cálcio ou trombina recombinante humana. A trombina bovina era usada anteriormente para a ativação, mas deve ser evitada devido ao risco de rejeição (LANDESBERG et al. 1998). Os compostos de cálcio usados são o cloreto de cálcio ou o gluconato de cálcio, sendo o último um melhor agente, pois é menos irritante e pode ser administrado por via subcutânea (LAKKARAJU, 2013).
O período de viabilidade do PRP também é controverso. Enquanto alguns autores relatam que o período entre a colheita do sangue e a sua utilização não deve ultrapassar quatro horas, visto que a meia-vida do PDGF é de 4,2 horas (LYNCH et al. 1989), outros relatam
que o tempo máximo para sua utilização é de oito horas após sua obtenção, pois após esse período acontece a perda de estabilidade e deficiência na expressão de proteínas secretoras (MARX, 2004).
Uso do PRP na cicatrização de feridas
Os ferimentos cutâneos têm uma frequência muito alta nos equinos, que possuem uma cicatrização lenta e dificultosa, levando a altos custos com tratamentos (DUGRILLON e KLUTER, 2002). Nessa espécie, o fechamento primário das feridas só é bem-sucedido em 24% dos casos (WILMINK et al. 2002). Essas características fazem com que a cicatrização seja uma área de grande interesse clínico, científico e econômico (BERTONE, 1989). A reparação tecidual é um processo dependente das plaquetas, que são responsáveis pela hemostasia e fonte de fatores de crescimento (PIETRZAK et al. 2007).
É frequente a necessidade de enxertos cutâneos em feridas crônicas, tanto na medicina, quanto na medicina veterinária. Porém, devido à baixa concentração de fatores de crescimento nessas feridas, existe uma alta incidência de perda parcial do enxerto e recidiva do ferimento (STADELMANN et al 1998). Um estudo, testando a utilização do PRP nas cirurgias de enxertos cutâneos em feridas crônicas de humanos, mostrou que houve maior percentual de integração, melhor evolução clínica e menor perda total dos enxertos (VENDRAMIN et al. 2010a).
Outra pesquisa, testando a utilização do PRP em enxertos cutâneos em coelhos, mostrou que houve maior concentração de fibroblastos e macrófagos nos animais que receberam tratamento com PRP e, consequentemente, maior quantidade de colágeno na ferida, e, em concordância com diversos outros trabalhos (CARTER et al. 2003; CROVETTI et al. 2004; DeROSSI et al. 2009), concluiu que os fatores de crescimento liberados pelas plaquetas são capazes de tornar a cicatrização mais rápida e eficiente, favorecendo a integração dos enxertos (VENDRAMIN et al. 2010b).
Por outro lado, existem estudos que relatam ausência de benefícios com o uso do PRP no tratamento de feridas ou na integração de enxertos cutâneos nas diversas espécies. Uma pesquisa, testando os efeitos do PRP no processo de reparação de feridas dérmicas em ratos, não revelou melhora em relação à contração e às análises morfológicas e histomorfométricas (BAUER et al. 2009). Os autores sugeriram aplicações seriadas de PRP para obtenção de resultados positivos. Outro trabalho, que avaliou os efeitos do PRP na cicatrização de feridas nos membros distais em equinos, mostrou que não houve melhora na qualidade da ferida (MONTEIRO et al. 2009), assim como não houve melhora na cicatrização de enxertos cutâneos em estudo realizado na mesma espécie (BONFÁ et al. 2012).
A matriz extracelular consiste em uma complexa rede de ligações cruzadas de proteínas e outras macromoléculas, da qual o colágeno é o principal componente estrutural. Essa proteína é fundamental para a resistência e integridade de todos os tecidos e possui função vital na cicatrização das feridas (ENOCH e LEAPER, 2007). A síntese do colágeno inicia-se pelo menos a partir do terceiro dia após a lesão cutânea e o PRP se mostrou eficaz em induzir a sua expressão durante as fases inflamatória e proliferativa do processo de cicatrização (SOUZA et al. 2014). A deposição de colágeno fica normalmente elevada por determinado período. Em feridas crônicas há produção prolongada dessa proteína e, consequentemente, fibrose e cicatriz excessiva. Um estudo testou o gel de PRP na cicatrização de membros distais de equinos e revelou que houve aceleração da diferenciação epitelial, maior organização das fibras de colágeno sem resposta inflamatória prolongada e, consequentemente, maior força de tensão na ferida (CARTER et al. 2003).
Complicações e contraindicações
Os fatores de crescimento liberados pelas plaquetas não têm ação no núcleo da célula, portanto não mudam a expressão gênica
(EVERTS et al. 2006) e não são mutagênicos. Eles agem por meio da regulação gênica e de mecanismos de controle por feedback (MARX e GARG, 2005), o que faz com que seu uso seja seguro.
A principal contraindicação do uso do PRP é o risco de infecção. Outras contraindicações são em relação ao seu uso em pacientes com disfunções plaquetárias ou trombocitopenia (LAKKARAJU, 2013) e em pacientes com fatores de risco para trombose, pois as plaquetas carreiam proteínas pró-trombóticas. Além disso, o uso de medicação antiplaquetária pode teoricamente limitar a eficácia do PRP (ANITUA et al, 2004).
Considerações finais
Os ferimentos cutâneos são uma ocorrência muito comum na clínica de equinos e, devido à cicatrização deficiente nessa espécie, podem levar a tratamentos longos e onerosos. Dessa forma, as pesquisas com o intuito de desenvolver alternativas para a aceleração e a melhoria da qualidade do processo de cicatrização devem ser incentivadas. O plasma rico em plaquetas é um produto que vem sendo utilizado com sucesso em diversas áreas da medicina e da medicina veterinária, mas os resultados dos trabalhos ainda são contraditórios. Isso se deve ao fato de que ainda não há uma padronização no método de obtenção, na forma e na frequência de aplicação. Além disso, os estudos são realizados com um pequeno número de animais e também sem padronização metodológica adequada, fazendo com que os resultados sejam de difícil comparação. Apesar da maioria dos estudos demonstrarem resultados positivos com o uso do PRP em feridas e em integração de enxertos cutâneos em diversas
espécies, existe a necessidade de maior investigação. Dessa forma, novos estudos devem ser desenvolvidos visando a padronização dos protocolos de obtenção do PRP e da concentração ideal de plaquetas necessária para acelerar o processo de cicatrização. Além disso, devido ao baixo custo e facilidade de obtenção do PRP, seu uso deve ser incentivado e difundido entre os médicos veterinários de equinos. Assim, uma maior quantidade de informações acerca desse produto será disponibilizada e novas inferências poderão ser feitas.
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