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17 OH PROGESTERONA ELISA LDN (17 α-OHP ) Uso pretendido e princípio do teste
Para a determinação direta de 17 α-HIDROXIPROGESTERONA por EIA em soro e plasma humano.
O princípio do teste imunoenzimático segue o cenário competitivo típico de ligação. A competição ocorre entre um antígeno não marcado (presente nos padrões de controle e amostras de pacientes) e um antígeno marcado com enzima (conjugado) para um número limitado de sítios de ligação do anticorpo na microplaca. Os procedimentos de lavagem e decantação removem os materiais não ligados. Após a etapa de lavagem, o substrato da enzima é
adicionado. A reação enzimática é interrompida pela adição de solução de parada. A absorbância é medida em
um leitor de placas de microtitulação. A intensidade da cor formada é inversamente proporcional à concentração de 17 α-OHP na amostra. Um conjunto de padrões é utilizado para construir uma curva padrão a partir do qual a quantidade de 17 α-OHP em amostras de paciente e controles pode ser lida diretamente.
Cuidados e advertências
Este kit é destinado para uso in vitro.
Pratique as seguintes boas práticas de laboratório quando manusear reagentes: · Não pipetar com a boca.
· Não fumar, beber ou comer em áreas onde os reagentes ou amostras estiverem sendo manipulados. · Usar roupas protetoras e luvas descartáveis quando manusear as amostras e reagentes.
· Lave bem as mãos após a realização do teste.
· Evitar o contacto com os olhos, usar óculos de segurança, em caso de contato, lave com água imediatamente e entre em contato com um médico.
· Os usuários devem ter uma compreensão completa deste protocolo para o uso com sucesso deste kit. Confiável desempenho só serão alcançados pela adesão estrita e cuidadosa com as instruções fornecidas.
· Evite a contaminação microbiana dos reagentes.
· Uma curva padrão deve ser estabelecida para cada corrida.
· É recomendado a todos os clientes preparar seus próprios materiais de controle ou pools de soro que devem ser incluído em cada corrida a um nível elevado e baixa para avaliar a confiabilidade dos resultados.
· Os controles (incluído no kit) devem ser incluídos em cada corrida e devem cair dentro de limites de confiança estabelecidas.
· Quando o uso de água é especificado para diluição ou reconstituição, usar água deionizada ou destilada. · Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente e misturados suavemente,
antes da utilização. Evite repetidos congelamentos e degelos dos reagentes e amostras.
. Inadequadas técnicas processuais, pipetagem imprecisa, lavagem incompleta, bem como de impróprio
armazenamento pode ser indicada quando os valores de ensaio para o controle não refletem faixas estabelecidas. · Durante a leitura da microplaca, a presença de bolhas nos micropoços irá afetar as densidades ópticas (DO). Retire cuidadosamente as bolhas antes de realizar a etapa de leitura.
· A solução de substrato (TMB) é sensível à luz e deve permanecer incolor se adequadamente armazenado. Instabilidade ou de contaminação pode ser indicada pelo desenvolvimento de uma cor azul, caso em que deve não podem ser utilizados.
· Quando dispensar o substrato e a solução de parada, não utilizar pipetas em que esses líquidos tenham entrado em contato com qualquer parte de metal.
· Para evitar a contaminação dos reagentes, use uma ponteira descartável nova para dispensar cada reagente, padrão , amostra e controle.
· Não misture vários números de lote de componentes do kit dentro de um teste e não usar nenhum componente além da data de validade impressa no rótulo.
· Kit reagentes devem ser considerados como resíduos perigosos e eliminados de acordo com regulamentos local e / ou nacional
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Limitações
· Não utilizar amostras muito hemolisadas, lipêmicas, ictéricas ou soro estocado inadequadamente.
· Quaisquer amostras ou soros controle contendo azida ou timerosal não são compatíveis com este kit, pois podem levar a resultados falsos.
· Tampão de ensaio apenas pode ser utilizado para diluir qualquer amostra de soro. O uso de qualquer outro reagente pode levar a resultados falsos.
· Os resultados obtidos com este kit nunca deve ser usado como a única base para um diagnóstico clínico. Por
exemplo, a ocorrência de anticorpos heterófilos em pacientes regularmente expostos a animais ou produtos de animais produtos tem o potencial de causar interferências em testes imunológicos. Por conseguinte, o clínico deve incluir todos os aspectos de um paciente, incluindo a frequência de exposição à animais / produtos se resultados falsos positivos são suspeitos.
Cuidados e advertências
Material Potencialmente Nocivo
Todas as amostras de soro devem ser consideradas um perigo biológico potencial e tratadas com precauções apropriadas.
Riscos químicos
Evite contato com reagentes contendo TMB, peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico.Se contatado com qualquer um destes reagentes, lave com água em abundância. TMB é um cancerígeno.
Coleta e armazenamento das amostras
Aproximadamente 0,1 ml de soro é requerido por determinação em duplicata.
Coletar 4-5 ml de sangue em um tubo adequadamente rotulado e deixar coagular.Centrifugar e cuidadosamente remover a camada de soro.
Armazenar a 4 ° C durante até 24 horas ou a -10 ° C ou inferiores, se as análises são para ser feito numa data posterior. Considerar todas as amostras humanas como possíveis materiais de risco biológico e tomar as precauções adequadas quanto ao manuseio.
Estabilidade da amostra: 7 dias de 2º a 8ºC ou 3 meses a -20ºC (alíquotado) Outros materiais e equipamentos necessários mas não fornecidos no kit - Pipetas de precisão para dispensar 25, 50, 100, 150 e 300 µL
- Ponteiras descartáveis - Água destilada ou deionizada - Agitador de Placa
- Leitor de placas de micropoços com um conjunto de filtros a 450 nm e um limite superior DO de 3,0 ou superior (ver teste etapa do procedimento 11).
Reagentes fornecidos
O kit ELISA 17 α-OHP contém reagentes suficientes para 96 determinações quantitativas. Microplaca revestida com anticorpos policlonais anti 17 α-OHP
- Pronto para uso, poços quebráveis Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses ou como indicado na etiqueta.
Anticorpos ANTI-17 α-OHP -HRP Conjugado PRONTO PARA USO
Conteúdo: anticorpos ANTI- 17 α-OHP -HRP em um buffer a base de proteína com um conservante isento de mercúrio
Volume: 11 mL / frasco Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses ou como indicado na etiqueta.
Preparação: Diluir 1:100 em tampão de ensaio antes do uso (ex.: 20 μll de HRP em 2 mLde tampão de ensaio). Se a placa inteira for utilizada, diluir 0,180 mL de HRP em 18 ml de tampão de ensaio. Descartar qualquer sobra.
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Conteúdo: Sete frascos contendo 17 α-OHP em um tampão proteico com um conservante isento de mercúrio. Preparado pela adição de tampão com uma quantidade definida de 17 α-OHP
Listados abaixo são concentrações aproximadas, consulte os rótulos dos frascos para concentrações exatas:
REFERÊNCIA Padrão Concentração Volume/frasco FR E-2801 Standard A 0 ng/mL 1,0 ml FR E-2802 Standard B 0.1 ng/mL 0,5 ml FR E-2803 Standard C 0,4 ng/mL 0,5 ml FR E-2804 Standard D 1,6 ng/mL 0,5 ml FR E-2805 Standard E 6,5 ng/mL 0,5 ml FR E-2806 Standard F 25 ng/mL 0,5 ml FR E-2851 Controle 1 Consulte os rótulos
dos frascos para os valores esperados e intervalos aceitáveis.
0,5 ml
FR E-2852 Controle 2 0,5 ml
Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses em frasco fechado ou como indicado na rotulagem. Depois de abertos, os padrões devem ser usados dentro de 14 dias ou aliquotado e armazenado congelado. Evitar o congelamento múltiplas e ciclos de descongelamento.
Solução de Lavagem Concentrada - X10
Conteúdo: Um frasco contendo tampão com detergente não-iônico e um preservativo isento de mercúrio. Volume: 50 ml / frasco
Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses ou como indicado na etiqueta.
Preparação: Diluir 1:10 em água destilada ou deionizada antes do uso. Se a placa toda for utilizada, diluir 50 ml do tampão de lavagem concentrado em 450 ml de água.
Substrato TMB - Pronto para Uso
Conteúdo: Um frasco contendo tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogênio em um buffer não contendo DMF ou DMSO.
Volume: 22 ml / frasco Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses ou como indicado na etiqueta. Solução de Parada - Pronto para Uso
Conteúdo: Um frasco contendo ácido 2N. Volume: 7 ml / frasco
Estocagem: em 2º- 8oC
Estabilidade: 12 meses ou como indicado na etiqueta. Procedimento de teste
Todos os reagentes devem atingir a temperatura ambiente antes de usar. Uma vez que o procedimento tenha sido iniciado, todas as etapas devem ser completadas sem interrupção.
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1. Prepare soluções de trabalho de tampão de lavagem.
2. Remover o número necessário de tiras. Selar o envelope e retornar quaisquer tiras não utilizadas e manter no refrigerador.
3. Pipetar 25 μL de cada controle, padrão, e amostras nos poços correspondentes. 4. Pipetar 100 μL do conjugado em cada poço. Agitar por 10 segundos.
5. Incubar a placa com agitação (aprox. 200 rpm) por 1 hora à temperatura ambiente.
6. Lavar os poços 4 vezes com tampão de lavagem preparada (300 μL / poço para cada lavagem) e toque a placa firmemente contra papel absorvente para assegurar que ele está seco (O uso de uma lavadora é recomendada). 7. Pipetar 200 μL de substrato TMB em cada poço em intervalos programados.
8. Incubar a placa por 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
9. Pipetar 50 μL de solução de parada em cada poço nos mesmos intervalos de tempo da etapa 7
10. Leia a placa em um leitor de microplacas a 450 nm dentro de 15 minutos após a adição da solução de parada. Se a DO exceder o limite superior de detecção ou se um filtro de 450nm não estiver disponível, um filtro de 405 ou 415 nm podem ser utilizados. As densidades ópticas serão mais baixas, no entanto, isso não afetará os resultados do paciente / controle de amostras.
Cálculo dos resultados
1. Calcular a densidade óptica média de cada Padrão duplicado.
2. Desenhar uma curva padrão em papel semi-log com a média das densidades ópticas no eixo Y e a concentração padrão no eixo-X. Se o software imunoensaio está sendo usado, uma curva de 4 parâmetros é recomendada. 3. Calcular a densidade óptica média de cada duplicata desconhecida.
4. Ler os valores das amostras diretamente a partir da curva padrão.
5. Se a leitura de uma amostra der superior a 20 ng/ml então diluir com o Calibrador A a uma diluição não superior a 1:8. O resultado obtido deve ser multiplicado pelo fator de diluição.
características de ensaio SENSIBILIDADE
O limite inferior de detecção é calculado a partir da curva padrão, por determinação da concentração resultante da média de DO do calibrador A (com base em 10 análises replicadas) menos 2 DP.Portanto, a sensibilidade do teste 17-OHProgesterona ELISA é de 0,037 ng / mL.
INTERVALO DE MEDIDA: é de 0,037 – 25 ng/ml ESPECIFICIDADE (REATIVIDADE CRUZADA)
Os seguintes compostos foram testados para a reatividade cruzada com o ELISA 17-OHP kit com 17-OHP reação cruzada em 100%.
Precisão intra-ensaio
Três amostras foram testadas 20 vezes, na mesma curva de calibração. Os resultados(em ng / mL) estão tabulados abaixo:
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Precisão Inter-ensaio
Três amostras foram testadas 10 vezes durante um período de quatro semanas. Os resultados (em ng / mL) estão tabulados abaixo:
RECUPERAÇÃO
Amostras modificadas foram preparadas por adição de quantidades definidas de 17-OHP a três amostras de pacientes. Os resultados (em ng / mL) estão tabelados abaixo:
LINEARIDADE
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Valores normais esperados
Como para todos os testes clínicos cada laboratório deve coletar dados e estabelecer sua própria faixa de valores normais esperados. Todos os valores são relatados em ng / ml):
Grupo Range (ng / ml)
Recém nascidos:
5- 30 dias < 0,7-2,5 31- 60 dias meninos 0,8-5,0 31- 60 dias meninas 0,5- 2,5
Crianças 3 a14 anos 0,05-2,0
Mulheres Fase folicular 0,1- 1,0 Fase luteinizante 0,6 2,5 Pósmenopausadas 0,13- 0,6 Ovulação: 0,3 – 1,5 Pós ACTH < 3,2 Terceiro trimestre: 2,0 - 12 Homens Adultos 0,5 - 3,0 BIBLIOGRAFIA:
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Reg. ANVISA Nº 80836930005
![Referências técnicas para atuação de psicólogas(os) em Programas de Atenção à Mulher em situação de Violência [2013] - CREPOP CREPOP](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)