1. Validação de Método

Tópicos

1. Validação de Método 2. Esterilidade

3. Endotoxina Bacteriana 4. Teor Microbiológico

5. Contagem Microbiana e Pesquisa de Patógenos 6. Considerações Finais

7. Monitoramento Ambiental

8. Referências

1. Validação de Método

Os métodos compendiais mais comumente utilizados em laboratórios de microbiologia são os seguintes:

➢ USP <61> Microbiological Examination Of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests

➢ USP <62> Microbiological Examination Of Nonsterile Products: Tests For Specified Microorganisms

➢ USP <71> Sterility Tests

➢ USP <85> Bacterial Endotoxin Tests

➢ USP <1033>Biological Assay Validation

➢ USP <1208>Sterility Testing

➢ USP <1223>Validation Of Alternative Microbiological

➢ EP 2.06.01 Sterility

➢ EP 2.06.12 Microbiological Examination Of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests

➢ EP 2.06.14 Bacterial Endotoxins

1. Validação de Método

Os métodos compendiais mais comumente utilizados em laboratórios de microbiologia são os seguintes:

➢ USP <61> Microbiological Examination Of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests

➢ USP <62> Microbiological Examination Of Nonsterile Products: Tests For Specified Microorganisms

➢ USP <71> Sterility Tests

➢ USP <85> Bacterial Endotoxin Tests

➢ USP <1033>Biological Assay Validation

➢ USP <1208>Sterility Testing

➢ USP <1223>Validation Of Alternative Microbiological

➢ EP 2.06.01 Sterility

➢ EP 2.06.12 Microbiological Examination Of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests

➢ EP 2.06.14 Bacterial Endotoxins

1. Validação de Método

Eu preciso validar métodos microbiológicos ?

➢De acordo com a RDC 166/2017- Dispõe sobre a validação de métodos analíticos.

➢§ 4º Estão excluídos desta Resolução os métodos microbiológicos, para

os quais deve ser apresentada justificativa técnica para a abordagem

escolhida, baseada na Farmacopeia Brasileira ou em outros

compêndios oficiais reconhecidos pela Anvisa.

1. Validação de Método

Definindo a necessidade: A validação deve demonstrar que o método analítico produz resultados confiáveis e é adequado à finalidade a que se destina, de forma documentada e mediante critérios objetivos.

RDC 166/2017- Apresentar justificativa técnica para métodos microbiológicos , baseada nos compêndios FB adequabilidade.

Adequabilidade: Deve ser demonstrada ao uso pretendido, nas condições

operacionais do laboratório, por meio da apresentação de um estudo de validação

parcial.

1. Validação de Método

De acordo com a 17025

Item 7.2 Seleção, verificação , validação de métodos.

7.2.1. A seleção e verificação dos métodos (já conhecidos internacionalmente e normalizados), deve realizar uma verificação se os parâmetros executados esta dentro dos padrões estabelecidos e documentar.

7.2.2 O desvio ou alteração/adaptação ou desenvolvimento de um novo método

deve ser realizado uma nova validação qualitativa ou quantitativa.

1. Validação de Método

Legislação vigente no Brasil

Farmacopeia Brasileira 6°Edição - 15.08.2019- Métodos Microbiológicos Rápidos; (liberação de produtos e alguns processos).

RDC 301⁄2019 – 21.08.2019- PIC’s:

QRM (Quality Risk Management) avaliar parâmetros críticos e

interações produto;

1. Validação de Método

Validação Considerações Gerais

Validação de métodos microbiológicos compartilham os

mesmos conceitos com os métodos físico-químicos,

porém deve haver uma abordagem especial, dada a

natureza única dos sistemas biológicos.

1. Validação de Método

Capitulo 1223,1225 USP

➢ Capítulo exclusivo para a Validação dos métodos microbiológicos

➢ Baixa carga microbiana < 100 UFC/ml ou g de amostra.

➢ Mesmos métodos de neutralização.

➢ Diversos neutralizantes foram propostos e relacionados com a respectiva classe de biocidas incorporados ao produto, orientando a especificidade da reação de neutralização. Exemplo: Polissorbato e lecitina foram indicados para a neutralização de parabenos e sais quaternários de amônio.

➢ Inocuidade do neutralizante deve ser comprovada evitando falsos negativos.

➢ Critério de aceitação: recuperação ≥ 70%.

1. Validação de Método

Brasil- Farmacopeia Brasileira sexta edição (2019)

➢ Inclui Ensaios Microbiológicos Alternativos;

➢ Os testes microbiológicos alternativos podem ser agrupados em quantitativos, qualitativos e de identificação;

➢ Método de liberação de produto terminado;

➢ Premissas para validação desses métodos;

➢ Critério de aceitação: recuperação ≥ 50%

1. Validação de Método

Fatores que influenciam ...

➢ Meio de cultura;

➢ Material de referência;

➢ Crescimento microbiano;

➢ Temperatura;

➢ Atividade de água;

➢ Definição nutrientes básicos.

1. Validação de Método

Preparo de Meios de Cultura :

➢ Formulações de substâncias capazes de promover a multiplicação e crescimento de microrganismos.

➢ Importante: água, pH, esterilização (tempo e aparência do meio), fusão, componentes termolábeis.

➢ capacidade de promover o crescimento de microrganismos alvo.

➢ capacidade de inibir os microrganismos indesejáveis.

1. Validação de Método

Crescimento Microbiano

➢ Para avaliar adequadamente todas as fontes de variabilidade é imprescindível um abrangente conhecimento dos processos de crescimento celular, a fase em que o microrganismo se encontra impacto direto na recuperação.

➢ A maioria dos estudos envolvendo crescimento microbiano está relacionada ao

aumento do número de células, ou seja, crescimento populacional.

1. Validação de Método

Crescimento Microbiano

1. Validação de Método

➢A natureza dos microrganismos podem afetar os ensaios, sobretudo com as amostras que tenham atividade antimicrobiana.

➢Crescimento e preparo dos microrganismos determinam seu estado

fisiológico, o que tem direta influência nos resultados de testes

microbiológicos.

1. Validação de Método

Microrganismos

Fatores que podem influenciar o desempenho de métodos, em relação aos microrganismos:

➢ Natureza dos microrganismos teste;

➢ Condições de manutenção dos microrganismos (até a 5 geração);

➢ Preparo do inóculo;

➢ Condições específicas do teste Necessidade de padronização;

➢ Condições fisiológicas das células microbianas;

➢ Homogeneidade da população microbiana.

1. Validação de Método

Quantitativos:

Contagem de células viáveis em meios sólidos(UFC)

➢ Em placas de Petri (pour plate ou spread plate)

➢ Membrana Filtrante

➢ Spiral Plate (automação) Número Mais Provável

➢ Sistemas de tubos de ensaio

➢ Sistemas Simplate

1. Validação de Método

Neutralização de agentes antimicrobianos.

Após a revisão dos requisitos básicos para iniciar a validação da metodologia microbiológica, segue algumas informações primordiais:

As formulações possuem conservantes?

Conhecemos todos?

Quais os inativantes?

“A inativação e extremamente importante antes de qualquer validação”.

1. Validação de Método

Antimicrobianos.

Inibição química:

➢ Polissorbatos (Tween), lecitina de soja ou de ovo, histidina, enzimas, agentes redutores, EDTA.

Diluição:

➢ Uso de diluição seriada Filtração e lavagem:

➢ Membrana Filtrante e lavagem com água peptonada 0,1%.

1. Validação de Método

Alguns antimicrobianos e neutralizantes (USP)

1. Validação de Método

Alguns antimicrobianos e neutralizantes (Farmacopeia Brasileira)

1. Validação de Método

Neutralização de agentes antimicrobianos.

➢ Método de neutralização deve ser validado, obedecendo a dois critérios:

• Eficácia do neutralizante ;

• Toxicidade do neutralizante frente ao microrganismo;

1. Validação de Método

Validação de neutralizante:

Eficácia e toxicidade do neutralizante

Alíquotas: T=0 e 15 minutos Diluição em salina, água ou solução tampão seguida de plaqueamento Diferença na contagem entre 0 e 15 minutos:

Tubo C: neutralização ineficaz

Tubo D: neutralizante tóxico ao organismo teste.

1. Validação de Método

Diluição

➢ Diluição pode neutralizar a ação antimicrobiana pois esta ação é dependente da concentração.

➢ A relação entre agentes antimicrobianos e concentração difere de

ativo para ativo, porém é constante para determinada molécula.

1. Validação de Método

Filtração

➢ Passagem da amostra através de membranas.

➢ A membrana é incubada em condições adequadas para promover o crescimento de microrganismos que estiverem retidos.

➢ Pode haver aderência do agente antimicrobiano à membrana.

➢ Membranas de difluorido de polivinilideno (baixa aderência).

➢ Lavagem com soluções adequadas.

1. Validação de Método

Método de Referência

➢ Método investigado a fundo que descreve com clareza e exatidão as condições e procedimentos para medir os valores de uma ou mais propriedades.

➢ Que demonstrou ter exatidão e precisão apropriada para o uso pretendido, de

maneira que pode-se utilizar para avaliar a exatidão e precisão de outros

métodos empregados para realizar um material de eficiência. Em geral, trata-se

de um método normatizado.

1. Validação de Método

Validação parcial

A validação parcial deve avaliar, pelo menos, os parâmetros de precisão, exatidão e seletividade.

Importante: A utilização de método analítico não descrito em compêndio oficial reconhecido pela Anvisa requer a realização de uma validação analítica completa , conforme parâmetros estabelecidos, levando-se em consideração as condições técnico-operacionais.

E importante realização um verificação periódica das validações.

1. Validação de Método (Método de Referência)

Método investigado a fundo que descreve com clareza e exatidão as condições e procedimentos para medir os valores de uma ou mais propriedades.

Que demonstrou ter exatidão e precisão apropriada para o uso pretendido, de maneira que pode-se utilizar para avaliar a exatidão e precisão de outros métodos empregados para realizar um material de eficiência.

Em geral, trata-se de um método normatizado.

1. Validação de Método

Considerações gerais:

➢ “A

validação deve garantir, por meio de estudos experimentais que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.

➢

Para tanto deve apresentar precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação adequadas à análise. (Padrão do microrganismo)

➢

Deste modo é importante ressaltar que todos os materiais e equipamentos devem

apresentar-se devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e

treinados.”

1. Validação de Método

Validação microbiológica

➢ Testes quantitativos, pela sua natureza, fornecem dados numéricos, o que permite o uso de técnicas estatísticas paramétricas.

➢ Por outro lado testes microbiológicos qualitativos, como por

exemplo, testes de esterilidade podem requerer ferramentas

estatísticas não paramétricas.

1. Validação de Método

Protocolo de validação A documentação deverá indicar os responsáveis pela elaboração, revisão e aprovação. Deve também conter os seguintes documentos:

➢ Título, número, revisão

➢ Objetivo

➢ Escopo / área de aplicação (matriz, analito/concentração)

➢ Reagentes e material

➢ Amostragem e amostras

➢ Procedimento Operacional detalhado

➢ Método analítico

➢ Resultados

➢ Referências Normativas

➢ Biossegurança (quando necessário)

1. Validação de Método

Cont.Protocolo de validação O protocolo de validação deverá especificar:

➢ Definição de responsabilidades ;

➢ Descrição dos métodos utilizados para registro e avaliação dos resultados, incluindo métodos estatísticos;

➢ Pontos críticos da validação (cepas referência, métodos de manutenção, padronização do inóculo);

➢ Qualificação dos analistas ;

1. Validação de Método (FBVI)

1. Validação de Método

Capitulo 1225 USP-Validation Compendial

1. Validação de Método

Amostra: Parâmetros Exatidão (USP):

➢ Definição: Mede a proximidade dos resultados do método tradicional, ou a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor aceito como referência.

➢ Deve ser demonstrado através do intervalo operacional do teste.

➢ É geralmente expresso como porcentagem de recuperação de

microrganismos no teste. 100% ± 30%.

1. Validação de Método

Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor aceito como referência.

Várias metodologias podem ser usadas:

➢

Usando-se padrão referência-cepa

➢

Comparando-se os resultados de metodologias cuja exatidão tenha sido bem estabelecida

A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do

analito adiciona à amostra ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor

verdadeiro aceito acrescido do intervalo de confiança.

1. Validação de Método

Exatidão

A exatidão do método deve ser determinada usando-se no mínimo 3 concentrações (baixa, média e alta) contemplando a faixa de variação do procedimento, com 5 determinação por concentração.

Deve ser determinada numa mesma corrida analítica e entre corridas (intra e inter corridas).

O desvio não deve exceder o valor de 15%.

É expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a

concentração teórica correspondente.

1. Validação de Método

Precisão (USP)

Definição: grau de concordância junto a resultados de testes individuais através do intervalo operacional do mesmo, quando o procedimento é aplicado repetitivamente em condições normais.

É expressa por meio de desvio padrão ou desvio padrão relativo (coeficiente de variação) em número estatisticamente significativo de amostras.

Outras ferramentas estatísticas também podem ser usadas

1. Validação de Método

Precisão (USP) Determinação:

➢ Tomar uma suspensão de microrganismos com concentração na porção superior do intervalo operacional, efetuar diluições seriadas até o intervalo inferior.

➢ Devem ser analisadas no mínimo 5 suspensões de microrganismos.

➢ De cada suspensão devem ser testadas no mínimo 10 replicatas (para

possibilitar o cálculo estatisticamente significativo de desvio padrão ou desvio

padrão relativo (coeficiente de variação).

1. Validação de Método

➢ Precisão (USP) Desvio padrão relativo de 15 a 35% são aceitáveis.

➢ UFC por placa Desvio padrão relativo esperado 30-300 <35%.

Desvio Padrão Relativo esperado em função do número de colônias por Placa

1. Validação de Método

Precisão (USP) A precisão é considerada em três níveis diferentes:

➢ Repetibilidade se refere ao uso do método dentro do mesmo laboratório num curto espaço de tempo, com os mesmos analistas e os mesmos equipamentos (precisão entre ensaios).

➢ Precisão intermediária: expressa o efeito de variações dentro do laboratório devido a eventos como diferentes dias, diferentes analistas, diferentes equipamentos, etc.

➢ Reprodutibilidade: refere-se a resultados dos estudos de colaboração entre

laboratórios.

1. Validação de Método

Precisão (USP)

Repetibilidade do método é verificada utilizando-se, no mínimo:

3 concentrações de microrganismos (baixa, média e alta) contemplando a faixa de variação do procedimento.

5 determinações por concentração. (RDC 166⁄2017 – Métodos Bioanalíticos) A documentação que apoia os estudos de precisão deve incluir:

➢ Desvio padrão. (descreve a distribuição dos dados no que diz respeito à média e o resultado é expresso como uma percentagem).

➢ Desvio padrão relativo (converte o erro ou a incerteza do resultado em porcentagem. Para calculá-lo, divida o desvio padrão pela média e multiplique o resultado por 100%.).

1. Validação de Método

(precisão intermediária) É o grau de reprodutibilidade dos

resultados de uma mesma amostra, obtidos sob uma

variedade de condições normais do teste, como diferentes

analistas, instrumentos, lotes de amostras, etc. Pode ser

definida como a resistência intrínseca às influências

exercidas por variáveis operacionais e ambientais nos

resultados de determinado método microbiológico (fontes

inevitáveis de variabilidade).

1. Validação de Método

Ruggedness (USP)(precisão intermediária)

➢ É um parâmetro importante para laboratórios que dispõem de múltiplos instrumentos ou trabalham com diversidade de lotes, analistas e turnos.

➢ Determinação: preparar uma suspensão de microrganismos e testar em pelo menos dez replicatas em cada uma das variáveis do método. Calcular desvio padrão ou coeficiente de variação.

➢ Critérios de aceite: coeficiente de variação entre 10 e 15% é aceitável.

1. Validação de Método

Limite de quantificação (USP):

➢ Definição: é o menor número de microrganismos que pode ser determinado com grau de exatidão e precisão aceitáveis dentro de condições experimentais estabelecidas.

➢ Como não é possível obter uma amostra com um número absolutamente

conhecido de microrganismos, é essencial que o limite de quantificação seja

determinado em número de amostras significativo (>5) e de cada uma no

mínimo 5 diferentes pontos através do intervalo operacional da amostra.

1. Validação de Método

Limite de quantificação

➢ Importante: pode haver um limite inerente devido à natureza da enumeração microbiana das contagens bacterianas.

➢ Limite inferior de quantificação: menor quantidade de um analito presente na amostra que pode ser quantificado com exatidão e precisão aceitáveis.

➢ Limite superior de quantificação: maior quantidade de um analito presente na

amostra que pode ser quantificado com exatidão e precisão aceitáveis.

1. Validação de Método

Linearidade (curva de calibração)

➢ Definição: capacidade de produzir resultados que são proporcionais à concentração de microrganismos presentes na amostra num dado intervalo operacional.

➢ Determinação: Para testar, selecionar 5 concentrações através do intervalo

operacional, de cada microrganismo padrão, com 5 replicatas.

1. Validação de Método

Métodos Qualitativos Fatores que contribuem para a variabilidade do resultado dos testes de presença/ ausência devem ser identificados e adequadamente gerenciados.

Um método não-quantitativo fornece apenas uma resposta empírica sobre a presença ou ausência de um organismo específico ou um grupo de organismos relacionados em uma determinada quantidade de amostra representativa.

Uncertainty associated with microbiological analysis – AOAC - 2006

1. Validação de Método

Como avaliar?

➢ Resultados de "presença” ou “ausência" não são facilmente passíveis de análise estatística para expressar reprodutibilidade ou repetibilidade.

➢ Laboratórios têm que ter atenção para que a proporção de falsos negativos ou falsos positivos.

➢ Estes desvios devem ser tratados como uma não-conformidades com as causas

identificadas para ações corretivas.

1. Validação de Método

Especificidade (USP)

➢ Definição: habilidade de detectar uma gama de microrganismos que podem estar presentes na amostra; significa que um valor fornecido como resultado provém somente dos microrganismos presentes, não havendo interferentes.

➢ Determinação: rastrear contra uma gama representativa de microrganismos em diferentes tipos de amostras.

➢ Critérios de aceite: todos os organismos selecionados são isolados e enumerados de amostras de diferentes matrizes.

1. Validação de Método

Especificidade

➢ Capacidade para detectar um grupo de microrganismos específicos, demonstrando que o método é adequado para a finalidade a que se propõe.

➢ Importante estimular o aparecimento de resultados falso positivos, para demonstrar a superioridade do método alternativo em relação ao método tradicional.

➢ Especialmente importante para métodos que não requerem crescimento.

1. Validação de Método

Especificidade

➢ Para métodos baseados em crescimento: testes de promoção de crescimento do(s) microrganismo(s) alvo em meios específicos ou presuntivos e testes de inibição de crescimento para microrganismos indesejáveis.

➢ Métodos que não requerem o crescimento como indicador da presença do

microrganismo alvo: assegurar que a presença de material estranho e outros

microrganismos não interferem no resultado do teste.

1. Validação de Método

Cálculos de especificidade

Especificidade: porcentagem de amostras conhecidas como negativas que dão resultados negativos.

Falso positivo: 100-especificidade

1. Validação de Método

Limite de detecção

Limite de detecção é o número menor de microrganismos na amostra que pode ser detectado nas condições experimentais estabelecidas.

Ex.: ausência de Salmonella sp em 10 g de amostra.

• Refere-se à presença do microrganismo na amostra original e não na alíquota

tomada para realização do teste, e antes de qualquer manipulação como

diluição ou incubação.

1. Validação de Método

Limite de detecção –

Métodos de Inoculação do microrganismo em questão em baixo número (não mais do que 5UFC/mL ou g), e recuperação pelas duas técnicas a compedial e a alternativa).

O nível de inoculação deve ser ajustado até no mínimo 50% das

amostras demonstrarem crescimento pelo método compendial.

1. Validação de Método

Sensibilidade (avaliação) Sensibilidade:

porcentagem de amostras positivas corretamente identificadas como positivas.

Falso negativo: 100-sensibilidade

1. Validação de Método

Pontos críticos:

➢ Promover o crescimento adequado do organismo durante todo o pré- enriquecimento, enriquecimento e nas fases diferenciais de cultura e identificação.

➢ Assegurar a correta composição do meio de cultura, os tempos de incubação e as temperaturas.

➢ Assegurar que os passos confirmatórios do protocolo do teste realmente

identifique o organismo teste.

1. Validação de Método

Como minimizar a ocorrência de resultados falsos?

➢ Em uma situação de vida real, onde os testes são feitos em matrizes naturais, é impossível estimar a probabilidade de detectar falsos resultados.

➢ É essencial, portanto, assegurar, durante o desenvolvimento,

avaliação e uso de qualquer método que a probabilidade de tais

erros ocorrerem é mínima.

1. Validação de Método

Robustez

➢ Definição: medida da capacidade de não ser afetado por pequenas e deliberadas variações nos parâmetros do método e provê uma indicação da confiança durante o uso normal (fontes de variabilidade “evitáveis”).Está relacionada também com adequação do sistema. Variações relacionadas a estabilidade de soluções, diferentes equipamentos, diferentes temperaturas entre outros ;

➢ Trata-se de um parâmetro a ser determinado pelo usuário do método;

➢ Não há concordância sobre padrões para as normas atuais;

➢ Critérios de aceite são problemáticos;

➢ Deve ser definido para cada técnica em particular;

1. Validação de Método

Robustez

No entanto é importante estimar o grau de robustez de um método alternativo.

➢ Não é necessariamente um parâmetro a ser comparado entre os métodos tradicional e alternativo.

➢ Trata-se antes de um parâmetro necessário para a validação do método

alternativo para que o usuário conheça melhor os pontos críticos do método

que vai utilizar.

1. Validação de Método

Resumo Critérios de Aceitação

2. Esterilidade

Os testes de esterilidade aplicam-se a insumos

farmacêuticos, medicamentos e produtos para saúde que,

de acordo com a Farmacopeia, devem ser estéreis, sendo

adequados para revelar a presença de bactérias e fungos.

➢Princípio do teste tradicional:

• Inoculação direta/ filtração;

• Dois meios de cultura;

• Incubação em duas temperaturas;

• Leitura por turbidez (crescimento microbiano);

• 14 dias para liberação do resultado;

• Depende do analista (Presença/Ausência).

2. Esterilidade

Métodos de esterilidade:

➢Aberto: Manifold e kitassato (onde você trabalha em fluxo laminar e realizar o corte da membrana);

➢Sistema fechado Steritest (onde o produto não tem manipulação da membrana, já vai direto para o frasco dos meios);

➢Isolador (que possui todas as condições de uma sala asséptica).

2. Esterilidade

Correspondem: Automação de métodos existentes ou estão baseados em tecnologias novas.

Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez, exatidão, precisão e especificidade

➢ VIABILIDADE MICROBIANA

➢ CRESCIMENTO MICROBIANO

2. Esterilidade

2. Esterilidade

2. Esterilidade

TESTE DE ESTERILIDADE “ TESTE DE VALIDAÇÃO PARA BACTERIOSTASE E FUNGISTASE”

Antes de se estabelecer um procedimento para o teste de esterilidade, deve-se

garantir que qualquer atividade bacteriostática ou fungistática inerente ao

produto não tem influência adversa sobre a confiabilidade do teste,

demonstrando-se que o procedimento utilizado é adequado para o produto sob

exame. O teste de validação para bacteriostase e fungistase deve ser realizado

quando o teste de esterilidade for realizado pela primeira vez para um produto

e sempre que houver modificações na formulação do produto e/ou nas

condições experimentais do teste. E importante avaliar todo crescimento frente

ao controle positivo.

2. Esterilidade

2. Esterilidade

➢ Meio límpido após os 14 dias de incubação – Produto estéril

➢ Meio turvo após os 14 dias de incubação – Produto não estéril Investigação / Identificação / Reteste ( dobro de amostras inicial)

➢ Validação Bacteriostase e Fungistase

Para Filtração por Membrana a quantidade de fluido de lavagem utilizada não deve, ser superior a cinco porções de 200mL.

Observação: Se o crescimento de microrganismo não e obtido na presença da amostra, ou se ele não visivelmente comparável aquele obtido nos controle positivos, a amostra apresenta atividade antimicrobiana que não foi satisfatoriamente eliminada. Nesses casos, devem ser feitas modificações no teste para eliminar a atividade antimicrobiana, tais como diluição, uso de substâncias neutralizantes, aumento do número de lavagens ou uma combinações delas. O teste de validação deve ser repetido para verificar se atividade antimicrobiana foi eliminada pela modificação proposta.

TECNOLOGIAS QUE PODEM SER UTILIZADAS NO TESTE DE ESTERILIDADE

2. Esterilidade

2. Esterilidade

Detecção do CO₂ produzido pelo metabolismo ativo dos microrganismos

Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico de CO₂, recoberto por uma membrana permeável apenas ao CO₂

CO₂ gerado atravessa a membrana e atinge o sensor, que saturado com solução sensível ao pH, tem a cor alterada de verde para amarelo a medida que o nível de CO₂ aumenta. Os detectores produzem sinal proporcional à intensidade de cor e à concentração de CO₂ e os transdutores eletrônicos mudem as mudanças de pressão positivas ou negativas provocadas pela produção ou consumo do gás durante o crescimento microbiano.

2. Esterilidade

Testes de esterilidade – inoculação direta em meio de cultura , medição de CO2.

BACTEC, BACT/ALERT.

2. Esterilidade

2. Esterilidade

Bact Alert

Princípio semelhante ao BACT/ALERT 3D, mas desenhado especificamente para atender a requisitos da Indústria.

Módulo BacT/ALERT 3D Low Temperature (LT) Incubação também a 22.5^oC.

2. Esterilidade

➢ 40 testes por modulo

➢ 240 testes

Podendo aumentar dependo da quantidade de gavetas adquiridas

LES Sensor CO₂ Diffusion CO₂ + H₂O  H₂CO₃  H⁺ + HCO₃^-

2. Esterilidade

• Frascos são continuamente incubados, agitados e monitorados;

• Monitoramento a cada 10 minutos;

• Possibilidade de 2 temperaturas;

• Algorítimos sofisticados para detecção de todos os tipos de microrganismos.

2. Esterilidade

• Curva de crescimento é automaticamente:

• Registrada;

• Analisada;

• Salva.

• Performance superior:

• Excelente recuperação;

• Baixa taxa de falso-positivos.

2. Esterilidade

0 1 2 3 4 5 6 7 6000

5000 4000 3000 2000 1000 0

Days Tested Reflectance Units

1 Sustained acceleration 2 Rate

3 Initial threshold 1

3

2

8 0

• Frascos BacT/ALERT Indústria

• iAST, iNST, iFA Plus, iFN Plus, iLYM

• Específicos para indústria

• Controle de Qualidade específico com micro-organismos farmacopeicos

• iFA Plus & iFN Plus para neutralização antimicrobiana

• Frascos plásticos patenteados

✓ 40 mL TSB

✓ Aminoácidos complexos

✓ Carboidratos

✓ Volume amostra: 1-10 mL

✓ Tampa removível

Sensor colorimétrico

2. Esterilidade

O MESMO SE APLICA AO BACTEC

Cadastrar Scanear Carregar Inocular

2. Esterilidade

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade (implementação de método rápido)

1- ESCOLHA DA TECNOLOGIA:

Realizar a prova de conceito: Verificar se a tecnologia e compatível com o uso pretendido. (Importante fazer os testes nos seu produtos no sistema comodato).

Sempre avaliar os produtos mais expressivos e de curva A.

Ficar atento com relação a representatividade da amostra x tecnologia.

2- SELEÇÃO DO PRODUTO:

O produto deve ser compatível com a tecnologia:

O produto a ser analisado não pode interferir no sistema de detecção (Deve ser feita a redução da possível interferência por meio de adição de etapas no preparo de amostras).

Exemplo: Uso de materiais, diluentes e inibidores.

3- ESTUDO DE VIABILIDADE:

✓ Equipamento;

✓ Estrutura Física;

✓ Mão de obra;

✓ Consumíveis;

✓ Avaliação final da análise pelo método rápido e tradicional.

5. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

✓ Objetivo da validação;

✓ Definição da tecnologia;

✓ Definição do produto;

✓ Descrição da metodologia.

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

4- DOCUMENTAÇÃO

✓ Plano de validação de Métodos Microbiológicos rápidos;

✓ Protocolo de validação

✓ Relatório de validação

✓ Protocolo Estatístico

✓ Relatório Estatístico

Observação: Mostrar a equivalência ao órgão regulador usando programas para tratamentos de dados.

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS RÁPIDOS NA INDÚSTRIA

FARMACÊUTICA

Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:

➢ Confiabilidade e especificidade

➢ Rapidez e agilidade na liberação de resultados

➢ Diminuição do número de etapas de trabalho

➢ Diminuição do erro analítico

➢ Melhoria da qualidade dos processos

➢ Redução de custos

A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica, provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que exige demonstrar a equivalência aos métodos de

referência e o atendimento dos parâmetros de validação analítica

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

Pode ser realizada segundo

procedimentos descritos na USP (Capítulo <1223>) e

demais compêndios farmacopeicos ou no

documento PDA Technical Report 33

Parâmetros de validação Teste Qualitativo Teste Quantitativo

Exatidão Não Sim

Precisão Não Sim

Especificidade Sim Sim

Limite de detecção Sim Sim

Limite de quantificação Não Sim

Linearidade Não Sim

Faixa Não Sim

Repetibilidade Sim Sim

Robustez Sim Sim

Equivalência Sim Sim

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

VALIDAÇÃO DE MMR PARA TESTE DE ESTERILIDADE

Microrganismos teste:

Gram + Gram – Levedura Fungo

filamentoso Anaeróbio Esporulado

Nível de contaminação

20 UFC/mL 2 UFC/mL 0,2 UFC/mL 0,02 UFC/mL

Replicatas

50 a 100 testes pelo método convencional 50 a 100 testes pelo método alternativo

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

VALIDAÇÃO DE MMR APLICADO AO TESTE DE ESTERILIDADE Nível de

inóculo Proporção esperada de N resultados positivos em

N=100 negativos positivos

20 < 0,001 >0,999 100

2 0,135 0,865 87

0,2 0,819 0,181 18

0,02 0,980 0,020 2

Avaliação estatística: Os métodos são equivalentes quando a proporção de resultados positivos e negativos obtidos em cada um deles não apresenta diferença estatisticamente significativa.

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

CEPAS QUANTIFICADAS

2. Estudo de Caso – Teste de Esterilidade

Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades na utilização de MMR:

✓ Custo inicial de aquisição das tecnologias;

✓ Disponibilidade limitada de alguns insumos específicos;

✓ Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por agências como: FDA, ANVISA;

✓ Necessidade de recursos suficientes e expertise tecnológica para realização dos estudos de validação.

DESAFIOS NA IMPLANTAÇÃO DOS MMR

2. Estudo de Caso – O que avaliar?

Quando você realizar uma validação de esterilidade você tem que realizar os mesmos testes do método tradicional avaliando a não inferioridade (Desafiando seu método).

O método rápido tem que ser superior ou igual ao método tradicional.

Lembrando que podemos ter métodos qualitativos e quantitativos, ou

seja muitos métodos rápidos são infinitamente superiores aos métodos

tradicionais.

3. Endotoxina Bacteriana

3. Endotoxina Bacteriana

O que é o teste LAL?

O Teste do LAL é utilizado na determinação das

endotoxinas bacterianas em produtos injetáveis. O

princípio do teste baseia-se no processo de coagulação que

ocorre com a hemolinfa do Limulus polyphemus na

presença de lipopolissacarídeos.

➢Princípio da técnica tradicional in vitro:

➢Temperatura 36

C a 38

C;

➢pH ótimo 6,0 a 8,0;

➢Materiais apirogênicos;

➢Água apirogênica;

➢Determinar a sensibilidade – curva padrão;

➢Determinar MDV do produto;

➢Teste + Controles;

➢Incubação a 37

C por 1h – Gel Clot;

➢Reação baseada na formação de gel – detecção por inversão.

3. Endotoxina Bacteriana

O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)

✓ Método in vitro

✓ Menor custo

✓ Menor capacitação técnica dos analistas

✓ Maior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidão

✓ Ensaios: semi-quantitativo (formação de gel), quantitativos (Cromogênico: baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno)./turbidimétrico (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno.

3. Endotoxina

3. Endotoxina Bacteriana

Teste de Sensibilidade do LAL Realizar a cada lote novo.

Deve ser feito em quadruplicata.

Lambda (concentração do LAL) variar 2 a ¼ .

Ex. sensibilidade = 0,125EU/mL 0,25 -0,125 -0,06 - 0,03 EU/mL

A solução estoque nunca deve ser congelada.

A média geométrica deve ser maior ou igual a 0,5 e menor igual a 2

Devem ser realizados o controle negativo.

3. Endotoxina Bacteriana

Exemplo: Preparação das diluições da solução estoque de endotoxina: 1000 EU/mL

Resultados do teste de confirmação do LAL

Tubos 0,25 EU/mL 0,125 EU/mL 0,06EU/mL O,03 EU/mL Ponto final da formação do gel

Log 10

1 + + - - 0,125 -0,093

2 + + - - 0,125 -0,093

3 + + - - 0,125 -0,093

4 + + - - 0,125 -0,093

Média dos Log 10 -0,093

ANTI Log 10 da Média 0,125

Cálculo e interpretação. O ponto final de gelificação é o último teste da série decrescente de concentração de endotoxina padrão que formou gel. Calcular a média geométrica logarítmica dos pontos finais de gelificação e o antilog da média pela fórmula:

𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑔𝑒𝑜𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟ação 𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑛𝑡𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 𝐸𝑒/𝑓

Ee = soma dos logs das concentrações do ponto final da série de diluições utilizada;

ƒ = número de replicatas.

3. Endotoxina Bacteriana

Determinação de endotoxina em uma amostra:

Para determinação de endotoxina em uma amostra, faz-se quadruplicata de diluições até encontrar o ponto de gelificação. O nível de endotoxina presente é calculado dividindo o valor de  sensibilidade do L.A.L rotulado, pelo valor de antilog da média dos pontos, conforme exemplo:

Sensibilidade 0,125 EU/mL Diluição da amostra

Ponto de gelificação:

1/16 (0,625) log -1,204 1/8 (0,125) log -0,903 Média do log: -1,054 Antilog da média: 0,088

Concentração de endotoxina= Sensibilidade do L.A.L = 0,125EU/mL= 1,42 EU/mL antilog da média 0,088

Realizar o controle da água utilizada como controle negativo em duplicata (Testar na maior sensibilidade).

Tubos 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

1 + + + + -

2 + + + + -

3 + + + - -

4 + + + + -

3. Endotoxina Bacteriana (Limite de endotoxina para produtos)

Se não existir o limite de endotoxina para o produto a ser testado monografia oficial (farmacopeias, listagem do FDA, etc...) ele pode ser calculado através da fórmula abaixo:

Limite de endotoxina (LE) = K onde, M

K=0,2 EU/Kg de peso para drogas intratecais ou 5 EU/Kg de peso para outras drogas parenterais

M=Dose máxima humana recomendada por quilograma de peso corpóreo que possa ser administrado ao paciente no período de 1 hora. Os cálculos de dose são baseados em um peso corpóreo médio de 70 kg. Se a dose pediátrica for mais alta, ela deve ser considerada no cálculo.

Exemplo 1:

Concentração = 25mg/mL Dose Máxima = 2 mL

LE = 5 UE/kg x 70kg = 175 UE /mL 2 mL

Exemplo 2:

Dose Máxima = 1g

Dose por Kg = 1g/70 kg = 0,0143g/kg = 14,3mg/kg LE = 5 EU/kg = 0,35 UE /mg

14,3 mg/kg

Exemplo 3:

Dose Máxima = 50mg/mL Dose por Kg = 1g/m²

LE = 194 UE /m²= 194 UE /g = 0,194 UE/mg 1g/ m²

0,194 UE /mg x 50mg/mL = 9,7 UE/mL

O limite de endotoxina (LE) pode ser expresso em“ mL “ / ” mg “ / “ UI “ dependendo do produto.

3. Endotoxina Bacteriana (Máxima Diluição Válida)

Se o limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em volume (EU/mL)

A MDV é calculada da seguinte forma:

MDV= Limite de endotoxina



3. Endotoxina Bacteriana (Máxima Diluição Válida)

Quando o limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em peso (EU/mg) ou em unidade de do fármaco ativo (EU/unidades) o MDV é calculado da seguinte forma:

3. Endotoxina Bacteriana (Inibição/Potencialização)

A avalição de endotoxina não pode exceder as diluições da MDV.

A média geométrica deve ser maior ou igual a 0,5 e menor igual a 2.

Avaliar as concentrações nas sensibilidades ¼, ½ , 1, 2.

Se os resultados estiver fora do especificado, o teste de inibição/potencialização devera ser repetido após a neutralização.

A inativação ou remoção das substâncias interferentes, ou após a diluição da amostra por fator que não exceda a MDV.

Repetir o teste numa diluição maior não excedendo a MDV ou usar um L.A.L de sensibilidade maior para que a interferência seja eliminada na amostra analisada.

Exemplos: Filtração, neutralização (-glucano), diálise ou aquecimento.

MÉTODOS BASEADOS NA ANÁLISE DE COMPONENTES CELULARES

ELISA: É um ensaio de imunoabsorção ligado a enzima, indicado a presença ou ausência de um anticorpo ou antígeno específico.

Utiliza-se uma placa de microtitulação em poliestireno com amostra contendo o antígeno.

Após a imobilização do antígeno o anticorpo ligado a uma enzima e adicionado e forma um complexo com antígeno e é adicionado um substrato enzimático que produz um sinal visível , em geral por mudança de cor, que indica a presença de antígeno na amostra.

3. Endotoxina

• Uso de microplaca pré-revestida com uma proteína receptora derivada de fago (alta afinidade e especificidade para a região central conservada de LPS - endotoxina);

• Amostra adicionada à microplaca: LPS é ligado à proteína do fago;

• Interferentes removidos na etapa de lavagem;

• Detecção: Fator C recombinante e um substrato de fluorescência não é afetada pelos inibidores;

• Facilita a quantificação confiável da endotoxina na amostra.

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3. Endotoxina (Fator C recombinante)

3. Endotoxina Bacteriana (Teste de Compatibilidade do Produto)

Para efetuar a avaliação de inibição ou potencialização provocada por um produto, testes prévios devem ser conduzidos, por meio de um dos vários métodos. Qualquer esquema de teste deve respeitar a não interferência do produto.

Caso seja, em primeira instância, detectada a interferência do produto no

desenvolvimento do teste, mecanismo auxiliar consistirá em aplicar a

concentração máxima válida ou diluição máxima válida, as quais estarão

delimitando condições de aplicabilidade do teste in vitro, seja conciliando

diluição ainda válida ou sensibilidade do sistema.

3. Endotoxina Bacteriana MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS ENDOSAFE

➢ Método cromogênico cinético rápido para quantificação de endotoxinas.

➢ Maior facilidade analítica

➢ Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de resultados

➢ (15 minutos)

➢ Possibilidade de monitoramento durante processo produtivo

3. Endotoxina Bacteriana MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS ENDOSAFE

Cartucho PTS

Aprovado pelo FDA desde 2006;

Aprovado pela Farmacopeia Europeia 2016 Método fotométrico quantitativo

Observação: Deve ser validado como um método rápido.

3. Endotoxina Bacteriana

• MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS ENDOSAFE

• INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

• Coeficiente de Variação = < 25%

• CV entre as amostras = < 25%

• SPIKE de recuperação = Entre 50% A 200% Tempo de reação.

• Quanto mais próximo de 100% e o ideal.

Superior a técnica colorimétrica, o mesmo se baseia na medição da turbidez da amostra.

MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – TURBIDIMETRIA

3. Endotoxina Bacteriana

3. Endotoxina Bacteriana

• MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – BIOTEK/LONZA

• TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA - INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

➢ CV Amostra = < 20%

➢ CV Controle Positivo = < 10% Coeficiente de correlação = > 0,98

➢ % Recuperação Spike = 50 a 200% (Lembrando que o ideal e um valor próximo a 100%)

➢ “Agora será cobrado a análise de tendência de produto, onde você vai verificar a tendência de endotoxina ao longo de vida do produto, ou seja o que esta fora da sua normalidade e não somente do produtos fora da especificação”.

3. TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO

➢

O teste´´ in vivo´´ envolve medir o aumento de temperatura retal de coelhos após a injeção intravenosa do produto em teste.

➢

E utilizado 3 animais para cada solução testes, não deve apresentar variação corporal.

➢

Mede a temperatura 3 horas sequenciais com intervalo de 30 min.

➢

É usado para produtos tolerados por essas cobaias em doses inferiores a 10ml/kg por período máximo de 10 minutos.

➢

O procedimento descrito na Farmacopeia Brasileira recomenda o uso de coelhos de ambos os sexos , adultos e sadios. Os animais devem ser mantidos em gaiolas individuais em sala de temperatura climatizada (20±2C) e livre de pertubações que os possam excitar.

➢

Obtido resultado negativo no teste de pirogênio, pode-se usar o mesmo animal após 48h.

➢

Quando o teste for positivo, não se usam os mesmos animais por duas semanas.

3. TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO

O ensaio de pirogênio em coelhos, embora seja

utilizado quando a metodologia do LAL não é

aplicada, ainda é mantido porque tem a seu favor a

situação do envolvimento de toda a reação

fisiológica do animal, constituindo um teste de

segurança para os produtos injetáveis, líquidos para

infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e

descartáveis em geral.

3. Endotoxina Bacteriana (Revalidação)

.

➢ REVALIDAÇÃO:

a)Mudar o fornecedor dos materiais utilizados no teste;

b)Inclusão do produto em compêndio oficial c)Alteração na composição do produto.

d)Mudança de Metodologia.

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

O produto A apresenta uma concentração de 50mg/mL, será

utilizado um L.AL com uma sensibilidade de 0,01 EU/mL, com um

limite de endotoxina 1,17 EU/mg de qual será o meu MDV e quais

passos devo avaliar para realizar a validação?

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

Produto A 50mg/mL

Diluições: 0,5mL amostra + 4,5mL (A) ► 0,5mL (B) + 4,5mL (A) Sensibilidade do LAL: 0,01 UE/mL

(A) – Água apirogênica (B) – Diluente anterior MVD: 5850 vezes

Diluição de uso: 1/100

MDV: 1,17 EU/mg x 50mg/mL= 5850vezes EU/mL 0,01 EU/mL

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso (Avaliação do pH) Sensibilidade do gel 6.0 a 8,0.

Caso necessário fazer a correção do pH utilizando solução de HCl 0,1 N, NaOH 0,1N ou tampão;

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

➢Se o valor absoluto do coeficiente de correlação (r) for 0.980;

➢Se a endotoxina recuperada no controle positivo do produto, denominado SPIKE, estiver dentro da faixa de 50% a 200%.

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

Produto A 50mg/mL

Diluições: 0,5mL amostra + 4,5mL (A) ► 0,5mL (B) + 4,5mL (A) Sensibilidade do LAL: 0,125 UE/mL

(A) – Água apirogênica (B) – Diluente anterior MVD: 468 vezes

Diluição de uso: 1/100

MDV: 1,17 EU/mg x 50mg/mL= 468 vezes EU/mL 0,125 EU/mL

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

Fazer as diluições sequenciais da endotoxina padrão de modo a se obter as seguintes concentrações:

0,25 EU/mL;

0,125 EU/mL, 0,06 EU/mL;

0,03 EU/mL

Controle Negativo (maior sensibilidade);

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

Concentrações

incubadas Diluições 1/10 Diluições 1/100

0,25 EU/mL

1mL do tubo de

endotoxina padrão 0, 5

EU/mL + 1mL do

tubo A

1mL do tubo de

endotoxina a padrão 0, 5 EU/mL + 1mL do tubo B

0,125 EU/mL

1mL do tubo de

endotoxina padrão 0,25

EU/mL + 1mL do

tubo A

1mL do tubo de

endotoxina a padrão 0,25 EU/mL + 1mL do tubo B

0,06 EU/mL

1mL do tubo de endotoxina padrão 0,125 EU/mL + 1

mL do tubo A

1mL do tubo de

endotoxina padrão

0,125 EU/mL + 1mL do tubo B

0,03 EU/mL

1mL do tubo de endotoxina padrão 0,06 EU/mL + 1 mL do tubo A

1mL do tubo de

endotoxina padrão

0,06 EU/mL + 1mL

do tubo B

3. Teste de endotoxina Bacteriana – Estudo de caso

Preparo das diluições do produto^:

“Pool” do produto (mistura de amostras)

4,5mL de água apirógena

+ 0,5mL do tubo A (diluição 1/10)

4,5mL de água apirógena + 0,5mL do tubo (diluição 1/100) B

TUBO A TUBO B TUBO C