DNA especifico com marca fluorescente
Produto:
1. DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda).
2. Buffer(tampão) de Hibridação
3. Reagentes para solução de montagem (DAPI + antifade)
Estas sondas estão desenhadas para serem utilizadas nas células interfásicas ou metafasicas, obtidas através de procedimentos padrões citogenéticos, veja:O Manual ACT CytogeneticsLaboratory . 2nd ed. New Cork: Raven Press;
1991.
Materiais necessários que não estão incluídos
• Solução ultra pura de Formamida
• 2XSSC*
• Etanol em solução 70, 90. 100%
• Pepsina*
• Detergente não iônico
• pH-medidor ou papel para medir pH
• Coverslip/lamínula
• Soluções de lavado (1 y 2)*
• Adesivo de contato
• 0,2 ou 0,5ml PCR tubos
• Frascos coplin
• Câmera úmida
• Termômetro calibrado
* Ver abaixo as instruções de preparação.
Equipamento necessário:
Microscópio fluorescente: nem sempre o microscópio usado nas reações imunoistoquímica ou em outras analises fluorescentes são apropriado. Os requisitos para observar corretamente as reações FISH são os seguintes
:
o Fonte de excitação: Recomenda-se uma lâmpada de 1oo watts de mercúrio com uma vida útil de 200hs. É necessário que uma vez posicionada, a lâmpada esteja corretamente alinhada
.
o Objetivos: para localizar o alvo (interfases ou metafases) são recomendadas objetivas de 10, 20 e/ou 40x. A análise da reação requer de uma objetiva fluorescente de imersão com uma abertura numérica ≥
Eliminado: <#>¶
Eliminado: ¶
Fluorocromo Excitação(nm) Emissão (nm)
Verde 495 519
VERMELHO 550 570
DAPI 350 470
• Microcentrifuga
• Micropipetas para 1 a 10 µL volumes
• Vórtex
• Timer/ cronômetro
• Banho- maria
• Incubadora
Preparação de Reagentes:
2XSSC:
Cloreto de sódio(NaCl) 300mM Citrato de sódio desidratado(Na3C6H5O7) 30mM
Ajustar o pH a 7.0 com gotas de ácido clorídrico (HCl) 1N
Solução de Desnaturação:
Formamida Ultrapura 70%
2XSSC 30%
AjustarpH:7-8.
Armazenar a 4ºC. descartar depois de 7 dias.
Solução Pepsina:
Diluir 0.5 mg de pepsina em 1ml de ácido clorídrico(HCl) 0,1N.
Solução de lavado 1:
Em um coplin adequado para 80ml, adicione 16ml de 2XSSC, 64ml de agua destilada e 0.240ml de detergente não iônico.
Solução de lavado 2:
Em um coplin adequado para 80ml, adicione 80ml de 2XSSC e 0.80ml de detergente nãoiônico
Precauções e advertências (leia com atenção):
• Reagente analítico. Somente para investigação. Este produto
Não
está aprovado para diagnóstico ou uso terapêutico• As reações e interpretações dos mesmos devem ser realizadas por profissionais qualificados e corretamente treinados.
• Toda amostra biológica deve ser tratada como possível portadora de agentes infecciosos.
• Evitar expor as amostras a acido ou alcalinos em concentrações elevadas e altas temperaturas. Estes fatores podem danificar o DNA e causar falhas na reação FISH.
• A falha ou omissão de qualquer passo do protocolo detalhado a continuação pode levar a resultados errôneos ou inaceitáveis.
• O buffer(tampão)hibridizador contém formamida, um teratogênico e portanto deve-se evitar o contato com a pele ou membranas mucosas.
• Recomenda-se o uso de aventalde trabalho durante o procedimento
• Todo material perigoso deve ser jogado fora de acordo com as normas da sua instituição.
Protocolo de utilização
Considerações preliminares:
• Durante a aplicação deste protocolo não é necessário agir em condições de luz tênue. As sondas LIVE foram desenvolvidas para não perderem sua fluorescência durante curtos períodos (horas) de exposição à luz artificial.
• Embora seja altamente recomendável mantê-las a -20 ºC, as sondas LIVE não perdem sua ação depois de 48hs a temperatura ambiente.
• O buffer(tampão)hibridizador mostrará resultados em 30 minutos de hibridização. Uma hibridização maior a 30 minutos não interfere na qualidade da reação.
• Recomenda-se usar 45ºC para 30 minutos até aproximadamente 8hs de hibridização. Se a reação for mostrada no dia seguinte, a temperatura deverá ser de 37ºC.
Esfregaço/smear celular
Para o esfregaço celular é muito importante não usar temperaturas extremas (chamas, chama- secagem)
Tratamento prévio
Em geral as sondas LIVE funcionam bem sem qualquer tratamento prévio, contudo a presença de fragmentos celulares ou hibridização em algumas amostras como mucosa bucal, amniocitos, etc. requerem que se limpe o DNA especifico para melhorar a hibridização.
• Sobre a amostra do esfregaço aplique uma gota de solução de Pepsina.
Adicione um Coverslip/lamínula.
• Incube em uma câmara úmida a 37ºC (o tempo varia com a severidade do tratamento, com 5 minutos como mínimo).
• Descarte o Coerslip/lamínula e enxague rapidamente embaixo de agua corrente.
• Desidrate em series de etanol: 70,90 y 100% 1 minuto em cada um.
• Espere que se seque completamente.
Reação de hibridização flourescente in situ
Protocolo 1: Desnaturação usando Fornamida
Preparação da sonda:
• Descongele o tubo da sonda, misture no vortex
• Centrifugue rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
• Em um tubo PCR adicione:
7µl de buffer(tampão)hibridização 1µl de sonda
• Misture no vortex
• Centrifugue rapidamente Desnaturação:
NOTA: Pelo menos 30 minutos antes da desnaturação, aqueça a solução a temperatura desejada. Com um termômetro calibrado certifique a temperatura no interior do COPLIN.
• Na parte de tras da lâmina marque a região parahibridizar(os 8µl hibridram aproximadamente uma região de 22x22mm).
• Mergulhe a lâmina na solução desnaturação a 60-75º por 1-5min (dependendo da idade do esfregaço/smear)
• Usando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em 70% etanol agitando por alguns segundos para eliminar a formamida restante.
• Desidrate em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.
• Espere que se seque completamente.
• Desnature a solução desonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5 minutos. Isto pode ser feito com um dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo em água fervendo em um suporte de poliestireno
• Coloque a solução de sonda em gelo por algunos segundos. Centrifugue rapidamente para recolher a parte evaporada.
• Adicione a solução de sonda na região para hibridizar.
• Coloque um COVERSLIP/LAMINULA/ do tamanho apropriado.
• Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha de Parafilm® que ultrapasse o tamanho do coverslip/lamínula.
Hibridação: O buffer hibridizador LIVE outorga excelente resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC
• Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida. Incubar pelo menos por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC
Protocolo 2: Desnaturação com Hidróxido de Sódio
Este protocolo preserva de maneira ideal a morfologia dos cromossomas, permite a reação FISH no mesmo dia da preparação do esfregaço-smear celular e dá resultados de alta qualidade. Além disso, de acordo com a qualidade da suspenção celular é possível observar um padrão de bandas similar ao da banda G.
NaOH as vezes pode gerar autofluorescência em um núcleo e /ou cromossomas. Neste caso se recomenda envelhecer levemente os esfregaços/smear a 37-45ºC 2 horas.
Preparação da sonda:
• Descongele o tudo da sonda, misture no vortex
• Centrifugar rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
• Em um tubo PCR adicionar:
7µl de buffer(tampão) hibridização 1µl de sonda
• Misturar no vortex
• Centrifugar rapidamente Desnaturação:
• Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).
• Mergulhe a lâmina em uma solução de NaOH 0.1M em etanol 70% a temperatura ambiente por 6 minutos.
• Utilizando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em etanol 70%
agitando por unos segundos para eliminar o NaOH restante.
• Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.
• Esperar que seque completamente.
• Desnaturar a solução de sonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5 minutos. Isto pode ser feito em dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo em agua fervendo em um suporte de poliestireno.
• Coloque a solução sonda em gelo por unos segundos. Centrifugue rapidamente para recolher a parte evaporada.
• Adicione a solução de sonda na região para hibridizar
• Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado.
• Sele as bordas com adesivo de contato ou coloque uma folha de Parafilm® que exceda o tamanho do coverslip/lamínula.
NOTA: uma vez terminado o processo anterior, é uma boa alternativa colocar a lâmina em uma superfície quente a 71ºC por 4 minutos. Em geral neste passo extra acontece melhores resultados, contudo se pode diminuir levemente a
Protocolo3: Co-desnaturação
Este protocolo foi desenhado para unificar o tempo da co-desnaturação com a temperatura. Aqui, os parâmetros são os mesmo para células esfregaços/smear preparadas no dia ou as guardadas a -20ºC
Preparação da sonda:
• Descongele o tubo da sonda, misture no Vortex
• Centrifugue rapidamente
• Descongele o buffer(tampão) hibridização
• Em um tubo PCR adicione:
7µl de buffer(tampão) hibridização 1µl de sonda
• Misture no vortex
• Centrifugue rapidamente Co-Desnaturação:
• Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).
• Adicione a sonda na região para hibridizar.
• Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado.
• Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha deParafilm® que exceda o tamanho do coverslip/lamínula.
• Coloque a lâmina montada em uma superfície quente (hibridizador,placa termostática, etc.). Em ocasiões é conveniente colocar uma gota de água sobre a chapa aquecedora e depois colocar sobre esta a lâmina montada, desta forma se consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície quente melhorando a transferência de temperatura.
Um tratamentode 15 minutos a 71°C tem funcionado bem independente da idade doesfregaço/smears.
Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC.
• Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC.
Reação de hibridização flourescente in situ
Revelado: (O mesmo procedimento para os protocolos 1, 2 e 3)
Nota: Pelo menos 30 minutos antes da lavagem, aqueça a solução de lavado 1 para 71°C (+/-1ºC).Com um termômetro calibrado confira a temperatura dentro do coplin.
Descongele a solução de lavado 2 a temperatura ambiente.
• Retirea lâmina da câmera úmida.
• Com cuidado retire o adesivo ou a folha deParafilm®
• Mergulhe a lâmina em uma solução 2XSSC a temperatura ambiente até o coverslip/lamínula cair.
• Mergulhe a lâmina na solução de lavado 1 por exatamente 2 minutos
• Mergulhe a lâmina na solução de lavado 2 pelo menos 1 minuto.
• Retire a lâmina e drene o excesso de liquido ligeiramente.
• Coloque uma gota na solução de montagem na região hibridizada.
• Coloque o coverslip/lamínula do tamanho apropriado.
• Drene o excesso da solução de montagem pressionando com cuidado e secando com toalhas de papel.
• Remova alguma bolha de ar pressionando com cuidado.
• A reação está pronta para ser lida
