VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
AVALIAÇÃO DO TEMPO DE FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS EMPREGANDO RESÍDUOS AGROINDUSTRAIS
1 Luana Souza Corrrea, 2 Christiane Pereira Rocha, 3 Ubirajara Coutinho Filho,
3 Vicelma Luiz Cardoso
1 Discente do curso de Engenharia Química da UFU/MG
2 Discente do Mestrado em Engenharia Química da UFU/MG
3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG
1,2,3
Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100
e-mail: vicelma@ufu.br
RESUMO - Resíduo da agroindústria é de baixo custo, boa disponibilidade e pode ser convertido em produtos de importante valor econômico e ao mesmo tempo promover a redução da disposição de resíduo no meio ambiente. Neste trabalho foi avaliado o tempo de fermentação em estado sólido para produção das enzimas invertase, amilase e celulase com Aspergillus niger ATCC 16404, 1057 e 9029, empregando resíduos da fábrica de suco de maracujá e de beneficiadora de arroz. O estudo proposto selecionou a linhagem de Aspergillus niger e o melhor tempo de fermentação. Os resultados obtidos mostraram que o Aspergillus niger ATCC 16404 proporcionou maior atividade para as enzimas citadas anteriormente e o tempo de fermentação selecionado para a produção das mesmas foi de 4 dias.
Palavras-Chave: fermentação em estado sólido, linhagens Aspergillus niger, tempo de fermentação.
INTRODUÇÃO
O Brasil produz uma grande quantidade de subprodutos agroindustriais e um exemplo de atividade que gera subprodutos e biomassa que não são aproveitados de forma integral é a produção de suco de maracujá. O Brasil detém o título de maior produtor e exportador do suco desta fruta e durante o processamento da mesma, as cascas e sementes correspondem de 65 a 70% da massa, o que faz com que este tipo de indústria gere toneladas de resíduos de processo (Togashi et al., 2007; Ferrari et al., 2004).
Com uma produção anual de cerca de 10 milhões de toneladas de arroz, o Brasil ocupa o décimo lugar na lista dos produtores mundiais.
Estima-se atualmente uma produção mundial de 100 milhões de toneladas de arroz a cada ano, gerando um volume considerável de grãos e de cascas desse produto agrícola. A aplicação de resíduos do arroz é uma forma de utilizar substratos alternativos e solucionar problemas de poluição para as indústrias e de custo na produção de enzimas.
A fermentação no estado sólido (SSF) pode ser definida como o processo que se refere à cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou material inerte), onde o conteúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de
atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro, não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida (Del Bianchi et al., 2001).
Na fermentação em estado sólido os fungos representam um dos microrganismos mais promissores pela variedade de produtos de seu metabolismo e devido ao desenvolvimento das hifas que permite aos mesmos maior penetração no substrato e nas regiões porosas entre as partículas da matéria-prima.
Entre os produtos de interesse estão as enzimas geradas pelo Aspergillus. niger que participam de reações químicas diversas associadas às células vivas, produção de alimentos, características funcionais de produtos de limpeza e ao próprio organismo pela ingestão e pelo uso em medicamentos, complementos alimentares e cosméticos feitos com estas enzimas.
Aspergillus niger é uma espécie do gênero Aspergillus, reino fungi, filo Deuteromycota, classe Eurotiomycetes e ordem Eurotiales que apresenta coloração branca amarelada com formação de pedúnculos e uma ponta colorida. Duas importantes razões que justificam o uso comercial deste fungo em grande escala são a grande variedade de produtos que esta espécie é capaz de produzir e o fato do A. niger ser considerado um
microrganismo GRAS (reconhecido como de uso seguro) na produção de alimentos.
Assim o objetivo desse trabalho é avaliar o tempo de fermentação e selecionar, dentro das três linhagens de Aspergillus niger estudadas, a que apresentou maior atividade das enzimas invertase, amilase e celulase.
MATERIAL E MÉTODOS
O microrganismo utilizado foi o Aspergillus niger nas seguintes linhagens: ATCC 16404, 1057 e 9029 adquiridos da Coleção de Cultura Tropical da Fundação André Tosello - Brasil. Os fungos foram armazenados em meio sólido de agar batata glicose (Prodisa 1022) sob refrigeração a 5 ± 1oC.
Meio de Cultivo
Para o preparo do inóculo foram utilizados como meio de cultura uma solução de água de batata e glicose 20 g/L colocadas em erlenmeyers de 250 mL de volume . Este foi tampado com tampão de algodão envolto em gase e autoclavados a 1,0 atm durante 20 min. Esporos de Aspegillus niger, obtidos por raspagem do meio de manutenção, foram inoculados por dois dias em temperatura ambiente de 28 ± 3ºC. O fungo foi manuseado na capela de fluxo laminar.
Obtenção e Preparo das Amostras de Casca de Maracujá e Farelo de Arroz
As cascas de maracujá foram obtidas na cidade de Formiga - MG, na Trevo Agaricus Produtos Naturais, e as mesmas foram secadas no sol por 5 dias sob temperatura de 35 ± 3ºC e depois trituradas. O farelo de arroz foi gentilmente cedido por Comercial Alvorada também de Formiga - MG.
Processo de Fermentação
Foram colocados em erlenmeyer de 250 mL de volume, 30 g de material composto por metade de casca de maracujá e metade de farelo de arroz.
O substrato foi hidratado com 30 mL de inóculo a temperatura ambiente de 28 ± 3ºC e este foi fermentado por 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas. Ao final da fermentação o pH foi medido e a extração de células e enzimas foi realizada utilizando filtro com papel qualitativo, marca Quanty, Cinza-007, diâmetro de 11 cm, JP 40.
Adicionou-se ao erlenmeyer 200 mL de água deionizada e Tween 80 a 1% e agitou-se manualmente durante 5 min.
Crescimento Celular
A quantidade de células viáveis foi avaliada pela contagem do número de esporos em câmara de Neubauer, visando manter a concentração de esporos na mesma ordem de grandeza para todas as fermentações. Para tal, diluia-se a suspensão de esporos do inóculo e promovia a homogenização com uma vigorosa agitação.
Colocava-se esta solução, com o auxilio de uma micropipeta estéril, entre a câmara de Neubauer e a lamínula, previamente limpas com alcool 70%.
Realizava-se a contagem dos esporos em microscópio óptico utilizando-se um aumento de 400 vezes (objetiva de 40 vezes e ocular de 10 vezes) para leitura de 8 campos uniformemente distribuidos por um dos reticulados da câmara e depois repetida para o segundo reticulado. O cálculo da concentração de esporos na suspensão foi realizado de acordo com a Equação 1 (Madigan et al., 2004).
x
o
-4
esporos n esporos em 16 quadrados
= diluição
mL 10 mL
(1)
O crescimento celular também foi determinado através do método de análise da massa seca. Para tal, adicionava-se 200 mL de água deionizada e 4 mL de Tween 80 a 1% no substrato fermentado. O caldo extraído era centrifugado, o sedimentado foi lavado e colocado para secagem a temperatura de 90 ± 1oC até peso constante.
Atividades Enzimáticas
Utilizando o método das taxas iniciais em relações de formação de açúcar redutor da hidrólise de soluções dos substratos sacarose (1%), amido solúvel (1%) e carboximetilcelulose (0,5%) determinou-se as atividades da invertase, amilase e celulase. A quantidade de açúcar redutor gerado foi determinado pelo método do DNS (Miller, 1959). As dosagens de atividades foram feitas em duplicata. Uma unidade de atividade foi definida pela hidrólise de 1 µmol/min de substrato e foi expressa em U/100 g de sólidos.
Para os ensaios de atividade, 5 mL da amostra de caldo fermentado diluído em 1:5 de água deionizada foram adicionados a 20 mL de solução de sacarose (1%), amido solúvel (1%) e carboximetilcelulose (0,5%) com pH ajustado para 4,5 para as enzimas invertase, amilase e celulase, respectivamente. As misturas foram incubadas a 37 ± 0,5 ºC em mini-reator com 100 mL de volume sob agitação magnética. As amostras de 1 mL eram colhidas nos tempos 0, 5, 10 e 15 min e realizada a determinação da atividade.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Estes testes foram realizados visando selecionar o melhor tempo de fermentação e a linhagem de Aspergillus niger para a produção das três enzimas estudas. Vale ressaltar que todos os experimentos foram realizados em duplicata.A Figura 1 mostra a atividade da enzima invertase em função do tempo obtida para as culturas de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029. Observa-se nesta figura que após 4 dias de fermentação o aumento na atividade invertásica foi menor principalmente para a linhagem ATCC 16404. Por outro lado, esta linhagem apresentou valores maiores de atividade. Assim para a produção desta enzima a linhagem selecionada foi a ATCC 16404 com 4 dias de fermentação. A Figura 2 apresenta a atividade da enzima amilase em função do tempo, para as três linhagens de Aspergillus niger estudadas. Esta figura mostra que para a linhagem de Aspergillus niger ATCC 16404 após o tempo de 4 dias de fermentação não houve aumento significativo na atividade, porém a ATCC 10577 mostrou crescimento na atividade até o sexto dia e a ATCC 9029 até o sétimo dia. Por outro lado, até o quarto dia a atividade da ATCC 16404 foi superior e no sexto dia estas atividades praticamente se igualaram para todas as linhagens. Assim avaliando a atividade da enzima amilase selecionou o menor tempo de fermentação (4 dias) utilizando o Aspergillus niger ATCC 16404.
0 2 4 6 8
TEMPO (DIA) 0
40 80 120 160
ATIVIDADE INVERTASE U/100g
Asp ergillu s nige r ATCC 16404 Asp ergillu s nige r ATCC 10577 Asp ergillu s nige r ATCC 9029
Figura 1 - Atividade da enzima invertase (a) e amilase (b) em função do tempo, empregando três linhagens de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029.
0 2 4 6 8
TEMPO (DIA) 0
2 4 6 8 10
ATIVIDADE AMILASE (U/100g)
Aspergillus niger ATCC 16404 Aspergillus niger ATCC 10577 Aspergillus niger ATCC 9029
Figura 2 - Atividade da enzima amilase em função do tempo, empregando três linhagens de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029.
A Figura 3 apresenta a atividade da enzima celulase em função do tempo utilizando as linhagens de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029.
0 2 4 6 8
TEMPO (DIA) 0
2 4 6
ATIVIDADE CELULASE (U/100g)
Aspergillus niger ATCC 16 404 Aspergillus niger ATCC 10 577 Aspergillus niger ATCC 90 29
Figura 3 - Atividade da enzima celulase em função do tempo para três linhagens de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029.
Na Figura 3 verifica-se que a atividade da enzima celulase de Aspergillus niger ATCC 10577 aumenta até o sexto dia e depois diminui, sendo que no quinto dia as duas linhagens (ATCC 1604 e 10577) apresentaram atividades semelhantes.
Para a linhagem ATCC 9029 a atividade aumenta até o sétimo dia. Porém, semelhante ao
comportamento da amilase até o quarto dia a atividade da celulase foi maior para o Aspegillus niger com ATCC 16404, e para esta linhagen após 4 dias de fermentação o aumento na atividade foi comparativamente inferior. Assim analisando os resultados para a celulase foi selecionado támbem 4 dias de fermentação e o Aspergillus niger ATCC 16404. Pois tempos maiores de fermentação elevam o custo de processo.
A Figura 4, mostra o crescimento celular em número de esporos/mL para as três linhagens de Aspergillus niger estudadas. Nesta figura observa- se que a cultura de Aspergillus niger ATCC 16404 cresceu até o quinto dia, sendo que a taxa de crescimento foi maior até o quarto dia. Os Aspergillus niger 10577 e 9029 cresceram até o sétimo dia, porém a taxa de crescimento também foi maior até o quarto dia para as duas linhagens.
Os resultados mostram também o o crescimento foi muito próximo para as três linhagens estudadas. Porém, a atividade da linhagem ATCC16404 foi maior para a maioria das enzimas estudadas até o quarto dia, como já mencionado, e o crescimento desta linhagem também foi maior neste período, sendo que no quarto dia todas atingiram a ordem de 109 número de esporos/mL.
Assim, selecionou-se a linhagem de Aspergillus niger ATCC 16404 e 4 dias de fermentação.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo (dia) 1E+004
1E+005 1E+006 1E+007 1E+008 1E+009 1E+010 1E+011
Crescimento Microbiano (no esporos / mL)
Asp ergillus niger ATCC 16404 Asp ergillus niger ATCC 10577 Asp ergillus niger ATCC 9029
Figura 4 - Crescimento microbiano em função do tempo para três linhagens de Aspergillus niger ATCC 16404, 10577 e 9029.
Hermann et al. (2003), produzindo amilase e pectinas liase de Aspergillus awamori, encontrou como melhor tempo de fermentação 39 horas utilizando bagaço de laranja e farelo de arroz como substrato. Terzi et al. (2003) encontrou como melhor tempo de fermentação semi-sólida para a produção de poligalacturonase 64 horas, utilizando Aspergillus niger 3T5B8 e como substrato farelo de trigo.
Comparando os resultados de atividade para as três enzimas estudadas, verifica-se que a
invertase apresentou valores muito superiores aos obtidos para a amilase e celulase, sendo que para estas duas últimas os valores foram próximos.
Este comportamento foi observado para as três linhagens avaliadas. Nota-se também que o tempo de fermentação para os Aspegillus niger ATCC 10577 e 9029 foi maior em relação a ATCC16404.
Conforme discussão anterior foi selecionado o Aspergillus niger ATCC 16404 e o tempo de fermentação de 4 dias para os próximos estudos envolvendo substratos provenientes da indústria de suco de maracujá e de beneficiadora de arroz.
CONCLUSÃO
A fermentação em estado sólido empregando como substrato casca de maracujá e farelo de arroz e Aspergillus niger ATCC 16404 10577 e 9029, mostrou que o melhor tempo de fermentação para a produção das enzimas invertase, amilase e celulase foi de 4 dias utilizando a linhagem de A.niger ATCC 16404. Os resultados mostraram também que a atividade da invertase foi superior em relação as obtidas para as enzimas amilase e invertase empregando o substrato anteriormente mencionado.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J., 2004. Microbiologia de Brook. Prentice Hall, São Paulo. 10. ed.
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TOGASHI, C.K., FONSECA, J.B., SOARES, R.T.N., GASPAR, A.R.E., 2007. Composição em ácidos graxos dos tecidos de frangos de corte alimentados com subprodutos de maracujá, Revista Brasileira de Zootecnia, 36 (6), 2063-2068.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao apoio financeiro da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais), a CAPES e ao CNPq – Brasil.
