Inactivação Térmica de Bactérias Lácticas em Meio de
Elevado Teor de Etanol
Ana Isabel de Sousa Teles
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Viticultura e Enologia
Orientador: Doutor Manuel José de Carvalho Pimenta Malfeito Ferreira
Co-orientador: Mestre Sara Correia Santos
Júri:
Presidente: Doutor Jorge Manuel Rodrigues Ricardo da Silva, Professor Catedrático
do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa.
Vogais: - Doutor Manuel José de Carvalho Pimenta Malfeito Ferreira, Professor
Auxiliar com Agregação do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa;
- Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista.
Agradecimentos
Terminado este trabalho, gostaria de agradecer ao ISA, e a todas as pessoas que contribuíram para a sua realização, nomeadamente:
Ao Doutor Manuel Malfeito Ferreira, pelos conhecimentos transmitidos, apoio, compreensão e amizade;
À Sara Correia Santos, pela ajuda, compreensão, apoio e pela simpatia;
À Eng. Ana Carla Silva, pela ajuda no laboratório;
À D. Lena e D. Manuela, pela ajuda na preparação do material;
Aos meus colegas de laboratório, nomeadamente a Ana Ramos, pela paciência e apoio, á Inês Morais, Viviana Monteiro, Sandro Martins, Inês Oro, Rita Abreu, Virna Dutra e Paulo Firmino, pela ajuda e amizade;
i
Resumo
Este trabalho teve como objectivo determinar as resistências térmicas de várias espécies de bactérias lácticas, eventualmente responsáveis por alteração de vinhos, permitindo quantificar os tratamentos de pasteurização aplicáveis a nível industrial. Foram estudadas cinco estirpes de bactérias lácticas: Oenococcus oeni, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus mali, L. hilgardii e L. plantarum, representativas da diversidade de bactérias lácticas habitualmente encontradas em vinho.
Os ensaios de morte térmica foram realizados em meio sintético com 10% (v/v) de etanol, sendo testadas temperaturas entre 38ºC e 46ºC. A partir destes ensaios foram calculados os valores de redução decimal (D) para as cinco estirpes. Os valores de D variaram entre 8,3 minutos (D44) para Lactobacillus mali, e 36,6 minutos (D46) para
Oenococcus oeni. Os valores de Z foram 5,3ºC; 5ºC; 3,2ºC; 3,2ºC e 2,5ºC para Oenococcus oeni, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus mali, Lactobacillus plantarum, respectivamente. Em face destes valores foi possível demonstrar que, como na prática industrial se pretendem reduções de 6 D, se consegue uma redução térmica aceitável em menos de 1 segundo a 60ºC.
Palavras-chave: Bactérias Lácticas de Alteração, Inactivação Térmica, Valores de D,
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Abstract
The objective of this work was to determine the thermal resistances of various lactic acid bacteria, eventually responsible for spoiling wines, allowing to quantify the pasteurization treatments applicable at industrial level.
This work consisted in the study of five strains of lactic acid bacteria: Lactobacillus mali, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides and Oenococcus oeni, representative of the diversity of lactic acid bacteria usually found in wine.
The thermal death assays were performed in synthetic medium with 10% (v/v) ethanol, and tested at temperatures between 38ºC and 46ºC. Through the tested temperatures the strains’s D-values (time to reduce 90% of population) were calculated. The D values varied from 8.3 minutes (D44) for Lactobacillus mali, and 36.6 minutes (D46) for
Oenococcus oeni. The Z-values were 5.3ºC; 5ºC; 3.2ºC; 3.2ºC and 2.5ºC for Oenococcus oeni, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus mali, Lactobacillus plantarum, respectively. With these values, industrial processes requiring a 6 D reduction conducted at about 60ºC for one second, are more than sufficient to guarantee the inactivation of contaminating lactic acid bacteria in the wine.
Keywords: Spoilage Acid Lactic Bacteria, Thermal Inactivation, D-values, Z-values,
iii
Extended Abstract
Lactic acid bacteria are important in oenology, since they can be responsible for changes that decrease the quality and acceptance of the final product. The lactic acid bacteria growth in must and wine can be the cause of some defects or taints. The bacteria usually involved are Oenococcus oeni (also involved in malic acid conversion), Lactobacillus, Leuconostoc and Pediococcus.
In must and wine, there can be a limited number of bacterial species, since this media are particularly selective due to its acid pH, nutritional composition and ethanol concentration.
From all the bacterial species initially present in must, not all have the same biologic potential. Tolerance to toxic substances and the nutritional requirements are different. Certain bacterial specie can rapidly and permanently disappear, while others can adapt, survive and easily multiply in wine, after alcoholic fermentation, for example Oenococcus oeni.
The objective of this work was to determine the thermal resistances of various lactic acid bacteria, eventually responsible for spoiling wines, allowing to quantify pasteurization treatments applicable at industrial level.
This work consisted in the study of five strains of lactic acid bacteria: Lactobacillus mali, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides and Oenococcus oeni, representative for the diversity of lactic acid bacteria usually found in wine.
Due to previous studies that refer the loss of ethanol adaptation from lactic acid bacteria isolated from must and wine, we tested various hypothesis of ethanol adaptation. Namely, strain inoculation directly in wine, resistance to ethanol concentrations in wine and liquid MRS; inoculation in wine, from liquid MRS with ethanol. According to the results, the chosen method was the adaptation from inoculation in MRS broth with ethanol, since it was the method that allowed better adaptation to high ethanol concentrations.
The heat treatment consisted in testing 4 temperatures: 38ºC, 40ºC, 42ºC e 44ºC. The exception was Oenococcus oeni, which was tested under the temperatures of 40ºC, 42ºC, 44ºC e 46ºC. Through the tested temperatures the D-values (time to reduce 90% of population) were calculated. The D-values for each strains were: Lactobacillus hilgardii D38=116 minutes, D40=79.4 minutes, D42=32.6 minutes and
D44=8.4 minutes; Lactobacillus mali D40=142 minutes, D42=45.1 minutes and D44=8.3
minutes; Lactobacillus plantarum D40=356 minutes, D42=24 minutes and D44=8.4
minutes; Leuconostoc mesenteroides D40=355 minutes, D42=60.4 minutes and
iv D46=36.6 minutes. Lactobacillus mali presented a lower value of D (D44=8.3 minutes),
while Oenococcus oeni presented a higher value (D46=36.6 minutes). That means that
Oenococcus oeni was the strain most resistant to temperature.
From these values it was possible to determine the thermal resistance for each strain represented by the Z-value, which corresponded to the temperature increase required to reduce 10 fold (one log cycle) the D-value. Of all the strains, Lactobacillus plantarum presented a lower thermal resistance with a value of Z=2.5ºC; while Oenococcus oeni, presented a higher thermal resistance with a value of Z=5.3ºC, but still within the expected range (5ºC for vegetative cells). Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus mali presented a value of Z=3.2ºC and Lactobacillus hilgardii presented a value of Z=5ºC.
In conclusion, the industrial processes requiring a reduction 6 D conducted at about 60ºC for one second, are more than sufficient to guarantee the inactivation of contaminating lactic acid bacteria in the wine.
Keywords: Spoilage Acid Lactic Bacteria, Thermal Inactivation, D-values, Z-values,
v
Lista de Figuras
Figura 1 – Distribuição da diversidade de espécies de bactérias lácticas no mosto
antes da fermentação alcoólica.. ... 3
Figura 2 – Distribuição da diversidade de espécies de bactérias lácticas no vinho depois da fermentação alcoólica.. ... 3
Figura 3 – Esquema das vias metabólicas do metabolismo das bactérias lácticas... 13
Figura 4 – Esquema da degradação do ácido tartárico. ... 14
Figura 5 – Esquema da formação de histamina e putrescina, a partir dos aminoácidos histidina e ornitina. ... 15
Figura 6 – Esquema da formação de Carbamato de Etilo. ... 16
Figura 7 – O Valor D. ... 19
Figura 8 – O Valor Z. ... 20
Figura 9 – Esquema do ensaio das curvas de crescimento. ... 24
Figura 10 – Esquema da adaptação ao etanol, inoculação em vinho. ... 26
Figura 11 – Esquema do teste de resistência ao etanol em vinho. ... 27
Figura 12 – Esquema do teste de resistência ao etanol em MRS com etanol. ... 28
Figura 13 – Esquema da adaptação ao etanol em vinho a partir de MRS com etanol. ... 29
Figura 14 – Esquema da adaptação ao etanol, em MRS com etanol. ... 30
Figura 15 – Esquema do ensaio da morte térmica. ... 31
Figura 16 – Curvas de crescimento de Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus mali, Lactobacillus plantarum e Leuconostoc mesenteroides. ... 33
Figura 17 – Curva de crescimento de Oenococcus oeni. ... 33
Figura 18 – Fase exponencial das curvas de crescimento para Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus mali. ... 34
Figura 19 – Fase exponencial das curvas de crescimento para Lactobacillus plantarum e Leuconostoc mesenteroides. ... 35
Figura 20 – Fase exponencial das curvas de crescimento para Oenococcus oeni. .... 35
Figura 21 – Relação entre UFC/mL com D.O., para Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus mali. ... 36
Figura 22 – Relação entre UFC/mL e D.O. para Lactobacillus plantarum e Leuconostoc mesenteroides ... 36
Figura 23 – Relação entre UFC/mL e D.O. para Oenococcus oeni. ... 37
Figura 24 – Valores de D para Lactobacillus hilgardii ... 42
Figura 25 – Valores de D para Lactobacillus mali ... 43
Figura 26 – Valores de D para Lactobacillus plantarum ... 44
vi
Figura 28 – Valores de D para Oenococcus oeni ... 45 Figura 29 – Valores de Z para Oenococcus oeni; Leuconostoc mesenteroides;
vii
Lista de Tabelas
Tabela 1 – As principais bactérias lácticas dos mostos e dos vinhos ………. 2 Tabela 2 – Exemplos de valores de D e respectivas temperaturas, para estirpes de
bactérias lácticas, em vinho (12,1% etanol)……….…… 21
Tabela 3 – Valores das taxas de crescimento na fase exponencial, para cada estirpe
……… 35
Tabela 4 – Número de células (UFC/mL) em vinho, para a estirpe
Lactobacillus hilgardii, nas diferentes percentagens de etanol, ao longo do tempo ……… 37
Tabela 5 – Número de células (UFC/mL) em Vinho, por cada estirpe, nas diferentes
percentagens de etanol, ao longo do tempo ……….… 38
Tabela 6 – Número de células (UFC/mL) em MRS líquido, por cada estirpe, nas
diferentes percentagens de etanol, ao longo do tempo ……….. 39
Tabela 7 – Número de células (UFC/mL) no vinho, por cada estirpe, nas várias
percentagens de etanol, ao longo do tempo ………. 40
Tabela 8 – Os vários valores de D e Z, para as diferentes estirpes de bactérias lácticas
……… 47
viii
Índice
Lista de Figuras ………. v
Lista de Tabelas ……….. vii
1. Introdução ... 1
1.1 Bactérias lácticas no vinho ... 1
1.1.1 Lactobacillus ... 4
1.1.2 Leuconostoc ... 5
1.1.3 Oenococcus ... 5
1.1.4 Pediococcus ... 6
1.2 Factores limitantes de crescimento em vinho ... 6
1.2.1 pH ... 7
1.2.2 Etanol ... 7
1.2.3 Temperatura ... 8
1.2.4 Dióxido de Enxofre (SO2) ... 8
1.3 Bioconversão do ácido málico ... 9
1.4 Defeitos provocados por Bactérias Lácticas ... 10
1.4.1 Pico láctico ... 11
1.4.2 Doença da gordura ou doença dos vinhos viscosos ... 12
1.4.3 Doença do “amargor” ... 13
1.4.4 Doença da Volta ... 14
1.4.5 Produção de aminas biogénicas ... 15
1.4.6 Carbamato de Etilo ... 16
1.5 Tratamentos térmicos em vinhos e mostos ... 16
1.5.1 Parâmetros Industriais de Morte Térmica... 18
1.6 Objectivos ... 22 2. Material e Métodos ... 23 2.1 Estirpes utilizadas ... 23 2.2 Curvas de Crescimento ... 23 2.3 Adaptação ao etanol ... 24 2.3.1 Inoculação em Vinho ... 24
ix
2.3.2 Teste de resistência ao etanol ... 26
2.3.3 Adaptação ao etanol em vinho a partir de MRS com etanol ... 28
2.3.4 MRS com Etanol ... 30
2.4 Morte térmica ... 30
2.4.1. Parâmetros de quantificação de morte térmica ... 31
3. Resultados e Discussão... 33
3.1 Curvas de Crescimento ... 33
3.1.1 Determinação das Taxas de Crescimento... 34
3.1.2 Relação entre UFC/mL e D.O., na fase exponencial ... 36
3.2 Adaptação ao etanol ... 37
3.2.1 Inoculação em vinho ... 37
3.2.2 Teste de resistência ao etanol ... 38
3.2.3 Adaptação ao etanol em vinho a partir de MRS com etanol ... 39
3.2.4 MRS com etanol ... 41
3.3 Morte térmica ... 41
3.3.1 Determinação dos Valores de D ... 42
3.3.2 Determinação dos Valores de Z ... 46
4. Conclusão ... 50
5. Bibliografia ... 51
1
1. Introdução
1.1 Bactérias lácticas no vinho
As bactérias associadas à produção de vinho apenas incluem as bactérias lácticas e as bactérias acéticas (Barata et al., 2012). As primeiras têm um papel benéfico na bioconversão do ácido málico, embora também possam ser consideradas apenas como agentes de alteração (Terrade e Orduña, 2009; Lonvaud-Funel et al., 2010). As segundas são apenas consideradas como microrganismos de alteração em vinhos. Uma diferença essencial entre estes dois tipos de bactérias está relacionada com o seu metabolismo. O crescimento das bactérias acéticas depende estritamente da presença de oxigénio, enquanto as bactérias lácticas crescem tanto em condições de anaerobiose como de aerobiose (Fugelsang e Edwards, 2007).
Nos mostos e nos vinhos, multiplica-se um número limitado de espécies, uma vez que estes meios são particularmente selectivos pelo seu pH ácido, a sua composição em elementos nutritivos e, em especial no caso do vinho, devido à sua riqueza em etanol. Os géneros mais frequentes em vinho são Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus e Pediococcus (Flanzy, 2003) (Tabela 1).
2
Tabela 1 – As principais bactérias lácticas dos mostos e dos vinhos. Adaptado de
Flanzy (2003).
Géneros Natureza da fermentação Espécies
Pediococcus Homofermentativo P. damnosus
P. parvulus P. pentosaceus Leuconostoc Heterofermentativo L. mesenteroides
Oenococcus Heterofermentativo O. oeni
Lactobacillus Homofermentativo Heterofermentativo facultativo Heterofermentativo L. mali L. casei L. plantarum L. brevis L. buchneri L. fermentum L. fructivorans L. hilgardii
O principal processo de obtenção de energia pelas bactérias lácticas é a fermentação. Estas podem realizar duas vias fermentativas, a via homofermentativa ou a via heterofermentativa. As bactérias lácticas homofermentativas fermentam hexoses, em ácido láctico. Sob crescimento lento e baixas taxas de fluxo glicolítico, as bactérias heterofermentativas produzem outro tipo de ácidos, como o formato, o acetato, o lactato e etanol como produtos (Flanzy, 2003; Zaunmüller et al., 2006).
As bactérias lácticas heterofermentativas, desempenham um papel importante na produção, preservação e melhoria de alimentos. Os produtos da fermentação de açúcares e ácidos orgânicos são essenciais neste processo (Zaunmüller et al., 2006). No entanto, em vinhos estes processos não são relevantes pois a fermentação em causa é a conhecida como fermentação maloláctica, ou bioconversão do ácido málico. As Figuras 1 e 2 mostram as espécies de bactérias lácticas isoladas de mostos e vinhos, respectivamente.
Num trabalho mais pormenorizado, Lonvaud-Funel et al. (2010), referiram que as espécies presentes no mosto em maior proporção são Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sansfransicensis, Bacillus sp., Lactobacillus casei, Oenococcus oeni e
3 Enterococcus sp., representando mais de 80% das estirpes nesta fase de produção (Figura 1).
Figura 1 – Distribuição da diversidade de espécies de bactérias lácticas no mosto antes da fermentação alcoólica. Adaptado de Lonvaud-Funel et al. (2010).
Pelo contrário, a espécie que existe em maior proporção depois da fermentação alcoólica é Oenococcus oeni, que representa cerca de 80% em vinho (Figura 2).
Figura 2 – Distribuição da diversidade de espécies de bactérias lácticas no vinho depois da
fermentação alcoólica. Adaptado de Lonvaud-Funel et al. (2010). 2% 2% 2% 2% 2% 2% 24% 13% 12% 12% 12% 10% 5% Lactobacillus hilgardii Lactobacillus collinoides Pediococcus pentosaceus Lactobacillus mali Lactobacillus buchneri Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Lactobacillus sansfransicensis Bacillus sp. Lactobacillus casei Oenococcus oeni Enterococcus sp. Pediococcus parvulus 80% 8% 4% 8% Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Lactobacillus hilgardii Pediococcus parvulus
4 Após a extracção do mosto, a população de bactérias varia na ordem de 102-104 UFC/mL. Em seguida, durante os primeiros dias de fermentação alcoólica, geralmente aumenta, mas nunca atinge mais de 105 UFC/mL. Por fim, como o mosto é transformado em vinho, as bactérias lácticas são submetidas a vários factores desfavoráveis. Por um lado, o crescimento explosivo das leveduras cria uma enorme redução de nutrientes, especialmente de certos aminoácidos, que as bactérias são incapazes de sintetizar e que lhes são indispensáveis. Outros elementos como as vitaminas podem faltar. Por outro lado, a toxicidade do meio aumenta continuamente, devido à acumulação de produtos do metabolismo das leveduras, onde o etanol deve ser a principal causa do declínio das bactérias (Chu-Ky et al., 2005; Lonvaud-Funel et al., 2010).
1.1.1 Lactobacillus
O género Lactobacillus inclui bastonetes não esporulantes, Gram positivos, catalase negativa, geralmente não-móveis, longos e finos, ou curtos, como cocobacilos corineformes. Podem ocorrer na forma de células isoladas ou em cadeias de diferentes comprimentos. O principal produto de fermentação é o lactato. Produtos adicionais podem incluir acetato, etanol, CO2, formato, ou succinato
(Fugelsang e Edwards, 2007; Dicks e Endo, 2009).
O crescimento é anaeróbio facultativo, mas um crescimento óptimo pode ser obtido na presença de 5 a 10% de CO2. Todas as espécies necessitam de meios complexos de
crescimento com aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos derivados, vitaminas, sais, ácidos gordos ou ésteres de ácidos gordos e hidratos de carbono fermentáveis. A gama de temperatura de crescimento é de 2ºC-53ºC, com um óptimo entre 30ºC e 40ºC. Todas as espécies são ácido-tolerantes, com o crescimento de pH óptimo entre 5,5 e 6,2. Espécies foram isoladas de diversos nichos, incluindo mosto de uva, vinho, cerveja, entre outros (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
Este género possui o maior número de espécies entre todas as bactérias lácticas. Embora muitos Lactobacillus tenham a capacidade de converter L-malato em L-lactato e CO2, apenas alguns sobrevivem à fermentação alcoólica. As estirpes mais
importantes em geral são Lactobacillus brevis, L. plantarum, L. collinoides, L. buchneri, L. hilgardii, L. fructivorans, L. kunkeei, L. nagelii, L. vini, L. mali e L. fermentum. No final da fermentação alcoólica, o crescimento das bactérias lácticas arranca e o número de células pode aumentar até 107 células/mL (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
5 As estirpes de Lactobacillus menos frequentes no vinho incluem L. pentosus, L. malefermentans, L. homohiochii, L. casei, L. paracasei, L. zeae, L. rhamnosus, L. sakei, L. reuteri, L. helveticus, L. acidophilus e L. delbrueckii. L. lindneri foi recentemente isolado a partir de vinhos australianos (Bae et al., 2006).
As estirpes de Lactobacillus mais frequentemente em vinhos são L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobiosus, L. curvatus, L. delbrueckii, L. diolivorans, L. fructivorans, L. heterohiochii, L. hilgardii, L. jensenii, L. kunkeei, L. leichmanni, L. nagelli, L. paracasei, L. plantarum, L. trichodes, L. vermiforme e L. yamanashiensis (Fugelsang e Edwards, 2007).
1.1.2 Leuconostoc
As bactérias do género Leuconostoc são Gram positivas, catalase negativa, sem mobilidade, elipsoidais ou esféricas. Quando crescem em meio rico em glucose ou em meio sólido podem apresentar uma forma alongada semelhante a Lactobacillus. As suas células podem ocorrer na forma isolada, em pares, ou em cadeias curtas a médias (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
O crescimento em meio de cultura sólido é limitado, mas pode ser estimulado pela presença de 19,8% de CO2, 11,4% de H2, e 78% de N2. O crescimento em meio
sólido é estimulado pela adição de 0,05% (w/v) de cisteína. O crescimento óptimo é registrado a pH 6,5 a 20ºC-30ºC. O crescimento pode ocorrer a 5ºC, mas mais raramente (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
A glucose é fermentada para ácido D (-) láctico, CO2 e etanol, ou acetato. Algumas
estirpes podem produzir acetato adicional em vez de etanol, quando crescem na presença de oxigénio. O L-malato é descarboxilado para L (+) lactato por algumas estirpes e apenas na presença de hidratos de carbono fermentáveis. Os polissacarídeos e álcoois, excepto manitol, não são metabolizados. A fermentação de hidratos de carbono varia consideravelmente entre diferentes espécies de Leuconostoc e é muitas vezes dependente da estirpe. Certas estirpes de Leuconostoc quando crescem em condições ácidas, fermentam sacarose. Leuconostoc mesenteroides, é a principal espécie presente no vinho (Dicks e Endo, 2009).
1.1.3 Oenococcus
O género Oenococcus é composto por bactérias Gram positivas, sem mobilidade, forma elipsoidal a esférica, normalmente dispostas em pares ou cadeias curtas. A morfologia das células pode variar, dependendo das condições de crescimento e do seu tempo de vida (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
6 Quantidades iguais de D (-) ácido láctico, de CO2 e etanol são formados a partir do
metabolismo da glucose. A energia (ATP) é obtida por fosforilação ao nível do substrato. Os polissacarídeos e a maioria dos álcoois não são metabolizados. O crescimento é óptimo a pH 4,8, mas algumas estirpes podem preferir pH 6,0 a 6,8. Em geral, o crescimento é estimulado na presença de 10% de CO2
(Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
Os compostos fenólicos em vinho tinto, reduzem a taxa de consumo de açúcar por O. oeni, mas aumentam o metabolismo do ácido cítrico, o que por sua vez leva ao aumento dos níveis de ácido acético (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009). O. oeni distingue-se de outras bactérias lácticas com base no seu crescimento a pH 4,8, resistência ao etanol. O crescimento é suportado por uma combinação complexa de aminoácidos, péptidos, hidratos de carbono fermentáveis, ácidos gordos, ácidos nucleicos e vitaminas. O crescimento em placas é bastante reforçado pela incubação semi- anaeróbia ou em microaerofilia. O crescimento óptimo ocorre entre 20ºC e 30ºC, mas pode demorar até 10 dias (Dicks e Endo, 2009; König e Fröhlich, 2009).
1.1.4 Pediococcus
As bactérias do género Pediococcus são Gram positivas, sem mobilidade e esféricas, mas podem apresentar uma forma ovoide. As células dividem-se para formar pares (normalmente observada no início ou a meio do crescimento exponencial) ou divididas em duas direcções perpendiculares para formar tétradas. As bactérias que pertencem a este género são anaeróbias facultativas e requerem um meio rico e de açúcar fermentável para o seu desenvolvimento. As células são pequenas (0,5-1,0 mm), catalase e oxidase negativas. O nitrato não é reduzido. A glucose é convertida para ácido láctico pela via Embden-Meyerhof. O CO2 e etanol não são produzidos. A
temperatura óptima de crescimento é de 25ºC- 35ºC, mas é dependente da espécie, a pH 6. Todas as espécies, excepto Pediococcus claussenii, produzem ácido DL-láctico a partir da glucose (Dicks e Endo, 2009; Moreno-Arribas e Polo, 2009).
Entre as espécies de Pediococcus, apenas quatro foram isoladas de vinhos:
Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus inopinatus e Pediococcus pentosaceus (Moreno-Arribas e Polo, 2009).
1.2 Factores limitantes de crescimento em vinho
Existem quatro parâmetros distintos que determinam a taxa de crescimento das bactérias lácticas no vinho: pH, temperatura, conteúdo em etanol e concentração de SO2. Outros factores também existem, mas de menor importância, que apenas podem
7 ser determinantes em condições específicas. Nenhum destes factores pode ser considerado independente dos outros, actuando em conjunto (Flanzy, 2003).
1.2.1 pH
A maioria das bactérias lácticas são neutrófilas (Guzzo e Desroche, 2009), em geral, o pH óptimo para o seu crescimento está perto de neutralidade (Hutkins e Nannen, 1993). Alguns géneros de bactérias como Lactobacillus e Oenococcus mostram um comportamento mais acidófilo. Isto é, para valores de pH inferiores a 3,0, o crescimento bacteriano é difícil ou impossível. É importante não esquecer a influência de outros factores presentes no vinho (Lonvaud-Funel, 1995).
O pH do vinho afecta o metabolismo de açúcares e também tem um efeito selectivo sobre as espécies. Em vinhos com pH abaixo de 3,5, O. oeni geralmente domina, enquanto em vinhos com pH acima de 3,5, dominam espécies de Lactobacillus e Pediococcus. A capacidade das bactérias obterem energia a partir do metabolismo da glicose é inibida pelo baixo pH do vinho. O pH óptimo para o catabolismo da glicose por O. oeni e L. plantarum situa-se entre 4,5 e 6,0 (Lonvaud-Funel, 1995).
1.2.2 Etanol
O etanol produzido durante a fermentação alcoólica tem impacto no crescimento microbiano, em particular nas bactérias lácticas. É difícil especificar as concentrações que irão impedir completamente o desenvolvimento de bactérias lácticas. Radler (1966), Peynaud Domercq (1968) e Henick-Kling (1986) relataram um aumento de inibição para teores de etanol, superior a 5% (v/v). Wibowo et al. (1985) afirmou que a capacidade das bactérias lácticas sobreviverem e crescerem em vinho diminui à medida que a concentração de etanol aumenta acima de 10% (v/v). O crescimento óptimo (ou seja, fase lag mais curta, taxa de crescimento rápido e o rendimento mais elevado das células) na presença de 10% a 14% (v/v) ocorre entre 18ºC e 20ºC, enquanto o crescimento óptimo a 30ºC é obtida a 0% a 4% (v/v) de etanol. Estes dados são indicativos do forte impacto de temperaturas mais elevadas na toxicidade do etanol. O grau de tolerância ao etanol é, no entanto, dependente da estirpe e também depende, além da temperatura, do pH e do estado do azoto do ambiente. Os detalhes específicos de sensibilidade para o etanol das várias espécies de bactérias lácticas do vinho, são reduzidos e a informação é contraditória. Davis et al. (1988) relataram que estirpes de Lactobacillus e Pediococcus são em geral mais tolerantes a altas concentrações de etanol que O. oeni. De acordo com Wibowo et al. (1985), a maioria de Lactobacillus spp. pode tolerar cerca de 15% (v/v), enquanto Lactobacillus trichodes foi isolado a partir de vinhos com 20% de etanol.
8 Guerzoni et al. (1995) estudaram os efeitos do pH, temperatura, etanol e das concentrações de malato em L. plantarum e O. oeni. A comparação dos resultados obtidos a partir das duas estirpes representativas confirmou que L. plantarum é mais resistente à acção combinada de vários stresses, pelo menos quando o etanol era inferior a 6% (v/v).Este estudo sugere que L. plantarum é, portanto, mais competitivo nas etapas iniciais da fermentação alcoólica. No entanto, condições mais severas, como por exemplo concentrações de etanol superiores a 6% (v/v), favorecem O. oeni. Henick- Kling (1993) relataram que O. oeni era apenas parcialmente inibido por concentrações de etanol superiores a 5% (v/v) e capaz de tolerar 14% (v/v) de etanol, enquanto o crescimento de L. plantarum parava a partir de concentrações de etanol de 5-6% (v/v). As estirpes de L. casei e L. brevis foram descritas como sendo mais tolerantes e têm sido bem sucedidas para induzir a fermentação maloláctica (Toit et al., 2011).
1.2.3 Temperatura
A temperatura influencia a velocidade de crescimento de todos os microrganismos (leveduras e bactérias). A maioria das bactérias lácticas é descrita como mesófila, com crescimento óptimo entre 25ºC e 30ºC, em laboratório. No vinho, a temperatura óptima de crescimento é diferente da que é obtida em cultura de laboratório. Um teor mais elevado de etanol conduzirá a uma diminuição da temperatura óptima de crescimento. Uma redução da temperatura de 5ºC é suficiente (conjuntamente com outros factores desfavoráveis), para diminuir a biomassa formada e para prolongar a fermentação maloláctica por 3 semanas (Lonvaud-Funel, 1995).
A temperatura óptima para o crescimento das bactérias lácticas no vinho é de 20ºC e 25ºC. A 15ºC ou menos, o crescimento bacteriano é menor. No entanto, Ribéreau-Gayon et al. (1975) afirmam que uma vez que se tenha iniciado a fermentação maloláctica a 15ºC, esta pode prosseguir a temperaturas mais baixas, mas a uma taxa mais lenta. Guerzoni et al. (1995) estudaram os efeitos de vários factores físico-químicos (pH, SO2, concentração de etanol e temperatura) em O. oeni.
O aumento da temperatura apenas afecta positivamente a fase lag de O. oeni, mas não de L. plantarum. Um aumento de temperatura tem uma influência negativa sobre O. oeni e positiva sobre L. plantarum (Toit et al., 2011).
1.2.4 Dióxido de Enxofre (SO2)
O dióxido de enxofre é outro factor que desempenha um papel essencial no crescimento e desenvolvimento de bactérias lácticas, durante a fermentação
9 maloláctica. Este composto é encontrado no vinho em concentrações variáveis, de acordo com as condições de vinificação e dependendo da estirpe de levedura responsável pela fermentação alcoólica. O dióxido de enxofre é adicionado aos vinhos para inibir o crescimento de microrganismos indesejáveis e pelo seu efeito antioxidante (Lonvaud-Funel, 1995).
O dióxido de enxofre no vinho existe sob duas formas livre e ligada. Três formas libertadas de SO2 estão presentes no vinho: SO2 molecular, bissulfito (HSO3-) e sulfito
(SO32-). A forma predominante varia de acordo com o pH do vinho. O SO2 molecular é
o principal responsável pelo efeito antimicrobiano. Este pode difundir-se para o interior das células bacterianas e reagir com os constituintes da célula. Uma vez no interior da célula interfere com pontes de proteínas e associadas com co-enzimas e vitaminas, o que finalmente provoca a morte celular (Chang et al., 1997).
A sensibilidade de bactérias lácticas ao SO2 varia. Geralmente, a concentrações de
50 a 100 mg/L de SO2 ligado e 1-10 mg/L de SO2 livre, o crescimento de bactérias
lácticas e da fermentação maloláctica podem ser inibidos. Henick-Kling (1993) relataram uma redução da actividade maloláctica em cerca de 13 % para valores de 20 mg/L de SO2 ligado, de 50 % para valores de 50 mg/L de SO2 ligado e uma inibição
total para valores de 100 mg/L de SO2 ligado.
A valores de pH baixo, o efeito inibidor do SO2 será mais perceptível, uma vez que a
percentagem de SO2 molecular activo é maior. Delfini e Morsiani (1992) investigaram a
resistência do SO2 de estirpes de bactérias lácticas de O. oeni e Lactobacillus spp.
isolados de vinhos. Estes autores explicaram que os diferentes mecanismos de resistência de O. oeni e Lactobacillus spp. podem envolver a existência de um sistema de transporte de sulfito através da parede da célula, que por sua vez pode ser afectado pelo pH. Uma vez que o pH do vinho é normalmente de 3,5, o SO32- é de
pouca importância em enologia. Ambas as espécies podem permanecer inactivas durante um longo período de tempo, sem perder a capacidade de crescimento, mesmo na presença de grandes quantidades de SO2. Algumas estirpes cresceram, na
presença de diferentes concentrações de SO2 em caldo nutritivo e foram ressuspensas
em meio com 10 mg/L de SO2, mais do que normalmente seriam capazes de tolerar.
Assim, o nível de resistência de bactérias lácticas ao SO2, pode ser melhorado pela
adaptação (Ribéeau-Gayon et al., 2006; Toit et al., 2011).
1.3 Bioconversão do ácido málico
A fermentação maloláctica é uma bioconversão secundária no vinho, durante a qual o ácido L-málico é degradado para ácido L-láctico e dióxido de carbono. A fermentação maloláctica ocorre, geralmente, depois da fermentação alcoólica, levada a cabo por
10 leveduras. É importante para a desacidificação de vinhos ácidos e para a modificação do aroma. Pode ocorrer espontaneamente por acção de bactérias lácticas naturalmente presentes no vinho, ou pode ser induzida pela adição de uma ou mais estirpes de bactérias lácticas no vinho comercial (Osborne et al., 2000).
A população de bactérias lácticas que sobrevive à fermentação alcoólica é da ordem de 103 UFC/mL. A partir 106 UFC/mL inicia-se a degradação do ácido málico,
marcando o início da “fermentação” ou bioconversão maloláctica. O crescimento da população ocorre geralmente após uma fase de latência. A velocidade e a duração desta bioconversão estão relacionadas com a composição do vinho e com a temperatura. Esta última, pode ser controlada em ambiente de adega, através da regulação térmica das cubas, idealmente a 20ºC. No entanto, se a fermentação maloláctica já tiver iniciado, o arrefecimento do vinho abaixo de 18ºC, só retarda o processo, não o pára (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Em geral, o ácido málico é completamente degradado e o tempo requerido está estritamente relacionado com a quantidade de bactérias presentes bem como com a sua actividade maloláctica específica. Os parâmetros que afectam o crescimento, determinam a velocidade do processo. Os principais factores são o pH, o teor alcoólico, a temperatura e o nível de sulfitos. Não é raro encontrar vinhos com pH, teor alcoólico, temperatura e concentração de SO2 óptimos nos quais a fermentação
maloláctica é extremamente difícil de arrancar, sendo outros inibidores que não estes responsáveis (Terrade e Orduña, 2009; Lonvaud-Funel et al., 2010).
No final da fermentação maloláctica, o vinho contém uma população muito elevada de bactérias lácticas, 107 células/mL, quase exclusivamente composto por
Oenococcus oeni, o que indica a sua grande importância nos vinhos (Flanzy, 2003). É neste momento que ocorre a sulfitagem final na produção de vinho, destinada a eliminar todos os microrganismos (Moreno-Arribas e Polo, 2002; Terrade e Orduña, 2009; Lonvaud-Funel et al., 2010).
1.4 Defeitos provocados por Bactérias Lácticas
O crescimento das bactérias lácticas na fermentação do mosto ou vinho pode estar na origem de defeitos, ou alterações mais ou menos importantes. As bactérias envolvidas são habitualmente Oenococcus oeni (também envolvida na bioconversão do ácido málico), ou espécies de bactérias mais temidas do género Lactobacillus ou Pediococcus (Bartowsky, 2008).
Dependendo da natureza das estirpes, do substrato transformado e de quando as populações de bactérias se multiplicam, o vinho poderá sofrer alterações. Um caso
11 particular é o pico láctico, causado pela reversão da sequência de crescimento das leveduras e bactérias lácticas. Os outros defeitos são principalmente relacionados com as espécies, ou mais precisamente de estirpes particulares com vias metabólicas indesejáveis tais como a degradação do ácido tartárico, degradação do glicerol. Podem ocorrer numerosos cenários de contaminação, que podem formar aroma e flavor indesejáveis. Felizmente, as ocorrências e a maioria dos cenários de contaminação são incomuns e podem ser evitados com uma correta higiene, durante o processo de vinificação e maturação (Bartowsky, 2008; Lonvaud-Funel et al., 2010).
1.4.1 Pico láctico
Durante a fermentação alcoólica, o crescimento rápido e em massa das leveduras não deixa espaço para as bactérias lácticas. Dificulta e impede a multiplicação das bactérias durante os primeiros dias e finalmente elimina-as no meio. Priva as bactérias de elementos essenciais, especialmente durante o crescimento muito activo das leveduras. É a situação mais comum. Mas várias razões podem causar um cenário diferente (Lonvaud-Funel et al., 2010).
As bactérias lácticas podem ser encontradas num ambiente bastante favorável, por exemplo, devido ao pH elevado do mosto. A competição entre os microrganismos favorece as bactérias conduzindo a um crescimento precoce. Eventualmente, acabam por ser numerosas o suficiente para interferir com as leveduras, que por sua vez, começam a encontrar dificuldades para o fim da fermentação (Lonvaud-Funel et al., 2010).
A utilização dos açúcares e descarboxilação do ácido málico são os metabolismos bacterianos mais favorecidos nesse momento. A degradação do ácido málico não representa um problema. O mesmo não acontece para os açúcares. A quase totalidade das bactérias lácticas são heterofermentativas, portanto, o seu metabolismo pode levar à síntese de ácido D-láctico, mas também de ácido acético. Esta é a causa do aumento da acidez fixa e da acidez volátil, que caracteriza o pico láctico. A acidez volátil é constituída por uma parte de ácidos gordos pertencentes à serie que se encontram os vinhos, quer no estado livre quer no estado de sais. A acidez fixa é a diferença entre a acidez total e a acidez volátil (Lonvaud-Funel et al., 2010).
O pico láctico do vinho em garrafa é um caso muito particular, limitado a vinhos licorosos. Estes vinhos são muito doces, onde a estabilização microbiológica é, em princípio, assegurada através da adição de aguardente, mas se quase todos os microrganismos são eliminados, poderá permanecer algum. Assim as estirpes de bactérias lácticas, mais frequentemente identificadas, como Lactobacillus fructivorans, L. hilgardii, e estirpes de O. oeni, são capazes de sobreviver e multiplicar-se, apesar
12 de um elevado teor de etanol, por vezes superior a 16% (v/v). As estirpes particularmente resistentes ao etanol fermentam uma quantidade significativa de açúcares. Os vinhos são fortemente perturbados devido à multiplicação das bactérias. Tornam-se também gasosos e a acidez volátil é muito superior ao limite tolerado que é 1,0 g/L em vinho branco e rosé, e 1,2 g/L em vinho tinto. A estabilização por esterilização por filtração geralmente é impossível devido à viscosidade do produto. Os processos de estabilização térmica são os mais adequados (Lonvaud-Funel et al., 2010).
1.4.2 Doença da gordura ou doença dos vinhos viscosos
Os vinhos "viscosos" têm uma viscosidade anormalmente alta, fluem com um aspecto oleoso. Mesmo que este defeito não seja muito visível, é absolutamente intolerável quando o vinho é colocado na boca. Na maioria das vezes, os vinhos "viscosos" não têm outro defeito organoléptico. Este problema pode ocorrer em vinhos, em cubas ou barricas em fermentação alcoólica, mas é mais frequentemente encontrado em garrafa. Neste caso, é facilmente diagnosticada apenas alguns meses ou mesmo mais de um ano após o engarrafamento (Fugelsang e Edwards, 2007; Lonvaud-Funel et al., 2010).
Quando a alteração está em curso, os vinhos viscosos contêm grandes populações de bactérias lácticas, geralmente mais que 106 UFC/mL. As bactérias associadas com
este tipo de defeito pertencem ao género Pediococcus, mais precisamente as espécies P. damnosus e P. parvulus. Mas outras espécies, mais raramente, não são excluídas, como é o caso de O. oeni (Fugelsang e Edwards, 2007).
As estirpes de Pediococcus "viscosos" isoladas até agora, mostraram tolerância particularmente elevada aos inibidores habituais de bactérias em vinho. Elas crescem melhor em pH mais ácido, na presença de concentrações mais elevadas de etanol e mais resistentes ao SO2. É essencial recordar que os Pediococcus não são todos
"viscosos", mesmo que seja neste género bacteriano em que esta característica é mais comum (Lonvaud-Funel et al., 2010; Cardoso, 2007). Essas estirpes são facilmente transmitidas de um vinho para outro por contaminação. Quando a cuba está contaminada, constitui um verdadeiro risco para toda a adega. O vinho deve ser isolado e tratado da melhor forma possível para evitar que o incidente se espalhe (Bartowsky, 2008). A agitação mecânica do vinho permite reduzir a viscosidade. Um tratamento pode ser o suficiente para dar ao vinho um aspecto natural. Se o vinho não sofre realmente outra alteração, pode ser recuperado. A sulfitagem, a filtração, e ainda mais eficaz, o tratamento térmico permite estabilizar o vinho antes de engarrafar (Cardoso, 2007; Lonvaud-Funel et al., 2010).
13
1.4.3 Doença do “amargor”
O amargor excessivo de certos vinhos tintos é devido à reacção química entre a acroleína, ou o seu precursor 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA), e compostos fenólicos. Ele provém da degradação do glicerol por bactérias lácticas que têm uma via metabólica particular que conduz ao 1,3-propanodiol. O primeiro passo é a desidratação do glicerol, por uma enzima complexa o glicerol desidratase e o segundo passo é a redução de 3-HPA intermediário em 1,3-propanodiol. O 3-HPA pode ser oxidado em ácido 3-hidroxi-propiónico (3-HPA) (Figura 3).
Figura 3 – Esquema das vias metabólicas do metabolismo das bactérias lácticas. Adaptado de
Fugelsang e Edwards (2007).
As estirpes de bactérias lácticas do vinho que seguem o caminho do glicerol desidratase, identificadas até agora pertencem aos géneros Lactobacillus heterofermentativos, Lactobacillus hilgardii e L. diolivorans. No vinho, embora real, este problema é raro, muito mais rara que a doença da gordura. O amargor é muito mais predominante na indústria da sidra. Independentemente do caminho tomado, o desaparecimento de glicerol é geralmente completo e obviamente prejudicial para a qualidade, seja por causa do amargor ou aumento da acidez, o vinho é definitivamente alterado (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Os vinhos com a doença do amargor apresentam odor fraco, sabor insípido na primeira etapa da doença e amargo quando está avançada, cor do vinho rançosa, turvação e precipitação da matéria corante com formação de um sedimento de lamelas no fundo da garrafa (Lepe e Leal, 2004).
14
1.4.4 Doença da Volta
A volta é caracterizada por uma alteração visual do vinho que se torna muito turvo e a cor é fortemente deteriorada. É na degustação que o vinho é profundamente afectado. Este resultado é devido à degradação do ácido tartárico, o principal ácido do vinho, que conduz, entre outras, a um aumento na concentração de ácido acético, portanto, á acidez volátil. Esta doença é descrita como a mais frequente nos vinhos de regiões quentes. É provável que estes vinhos, geralmente menos ácidos, abriguem uma maior diversidade de bactérias lácticas, incluindo as estirpes capazes de degradar o ácido tartárico. Parece que esta alteração é rara, principalmente por ser causada por um escasso grupo de bactérias capazes de usar ácido tartárico como substrato. Radler (1972) estudou o metabolismo do ácido tartárico por espécies homo e heterofermentativas dos géneros Pediococcus, Lactobacillus e Leuconostoc. Apenas algumas estirpes de L. plantarum e L. brevis foram capazes de degradar o ácido tartárico. Existem duas vias metabólicas, representadas na Figura 4 (Lepe e Leal, 2004; Lonvaud-Funel et al., 2010).
Figura 4 – Esquema da degradação do ácido tartárico. Adaptado de Lepe e Leal (2004). O pH é um factor limitante desta alteração. Somente existem ataques bacterianos ao ácido tartárico a pH superior a 3,5, e a temperaturas superiores a 25ºC (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Os vinhos contaminados, tintos e brancos, apresentam turvação e alteração da cor. Podem ainda surgir à superfície bolhas de gás, como se fermentasse lentamente. Quando a doença está avançada aparecem à superfície iridescências coloridas, como se fossem ilhotas flutuantes de gordura. O odor e sabor alteram-se profundamente, chegando a ser repugnantes, pela formação de compostos derivados da tetraidropirina (Lepe e Leal, 2004).
15
1.4.5 Produção de aminas biogénicas
As aminas biogénicas são formadas a partir da descarboxilação de aminoácidos devido à actividade de certas bactérias lácticas. Como tal, estes compostos encontram-se em uma variedade de alimentos fermentados, como o queijo, linguiça seca, chucrute, miso, e molho de soja. No vinho, histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, feniletilamina, e outros foram identificadas. As descarboxilações de histidina e a ornitina, formam histamina e putrescina, respectivamente (Figura 5) (Lonvaud-Funel, 2001; Fugelsang e Edwards, 2007).
As estirpes de bactérias lácticas que podem produzir histamina em vinhos pertencem a várias espécies, incluindo O. oeni. Estas estirpes estão naturalmente presentes nas uvas. Estudos epidemiológicos realizados para identificar estirpes produtoras de histamina em áreas diferentes demonstraram que estão espalhados por toda a vinha, irregularmente (Lonvaud-Funel et al., 2010).
A produção aminas biogénicas é maior quando o vinho permanece em contacto com as borras e gradualmente libertam os péptidos e proteínas (Lonvaud-Funel, 2001; Lonvaud-Funel et al., 2010).
Do ponto de vista da saúde, o consumo de quantidades excessivas de alimentos contendo aminas biogénicas pode resultar em dores de cabeça e outros sintomas (Fugelsang e Edwards, 2007).
Não há dúvida de que o inventário das actividades metabólicas realizadas pelas bactérias lácticas no vinho está longe de terminar. É igualmente certo de que será difícil concluir como muitos outros substratos são certamente transformadas. A sua utilização pode não ser detectada na análise, mas os produtos do seu metabolismo são capazes de alterar o vinho, mesmo em concentrações muito baixas (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Figura 5 – Esquema da formação de histamina e putrescina, a partir dos aminoácidos histidina
16
1.4.6 Carbamato de Etilo
Além de ácido málico, algumas bactérias lácticas heterofermentativas do vinho são capazes de formar pequenas quantidades de citrulina a partir da degradação do aminoácido arginina (Figura 6). A excreção de citrulina é de preocupação toxicológica, uma vez que é um precursor para a formação de carbamato de etilo no vinho, sendo este cancerígeno. Mira de Orduña et al. (2001), concluiu que o risco de formação de citrulina por bactérias lácticas em vinhos, com altas concentrações de arginina residual pode ser reduzido através da realização da fermentação maloláctica de culturas puras de Oenococcus e por precisamente estabelecer a conversão maloláctica completa, seguindo-se a inibição da actividade bacteriana (Moreno-Arribas e Polo. 2009).
Os resultados da pesquisa indicam a necessidade de cuidado na selecção de culturas iniciadoras para a fermentação maloláctica no vinho, uma vez que a formação de citrulina a partir da degradação de arginina, pode resultar na produção de carbamato etilo, mesmo a temperaturas normais, durante o armazenamento prolongado (Moreno-Arribas e Polo, 2009).
Figura 6 – Esquema da formação de Carbamato de Etilo. Adaptado de Fugelsang e Edwards
(2007).
1.5 Tratamentos térmicos em vinhos e mostos
Na prática, os tratamentos que requerem a utilização da temperatura são a pasteurização de mostos ou vinhos, e o engarrafamento a quente. A temperatura (55ºC a 65ºC de acordo com a constituição do vinho) é a de uma pasteurização clássica, sendo no vinho utilizada apenas para a destruição de microrganismos. Além disso, a temperatura do tratamento não é atingida e mesmo a descida da temperatura noutro local não é imediata. É necessário ter em conta os períodos a temperaturas letais e a duração do aumento da temperatura e a diminuição da temperatura (Lonvaud-Funel et al., 2010).
17 O tratamento pode ser realizado no vinho, "a granel", antes do engarrafamento, sendo a esterilização por filtração preferida. As restrições são as mesmas em ambos os casos: o vinho tratado é "estéril", mas o problema de contaminação do tratamento posterior permanece (rolhas, garrafas, operação de tiragem, etc.) (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Recentemente, devido ao aumento do risco de contaminação do vinho por leveduras "nocivas", como Brettanomyces, os tratamentos de mostos durante a fermentação aplicam-se. Neste caso, o mosto é aquecido até uma temperatura de cerca de 80ºC-90ºC, muito rapidamente (permutador de calor tubular ou de placas). Esta temperatura é mantida durante alguns segundos, e depois arrefecida também muito rapidamente. Mais uma vez, quando o tratamento é feito com cuidado, os riscos de desvios organolépticos são mínimos. A mesma operação pode ser executada em vinhos tintos durante o envelhecimento ou vinhos brancos doces (Lonvaud-Funel et al., 2010). O processo de engarrafamento a quente tem como objectivo destruir os microrganismos do vinho susceptíveis de se desenvolver e alterar o vinho em garrafa. O vinho é aquecido a uma temperatura de 43ºC-45ºC durante 30 segundos, é colocado em garrafa a esta temperatura, arrefece espontaneamente. A temperatura, relativamente baixa, está associada a um tempo de exposição elevado, uma vez que a queda da temperatura, é muito lenta nas garrafas armazenadas. E este processo, proposto por Baillot Estiveaux nos anos 60 denominado termolização, é utilizado actualmente, tanto no engarrafamento dos vinhos tintos como nos vinhos brancos e é particularmente eficaz para vinhos doces (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Do ponto de vista da estabilidade biológica dos vinhos, os resultados obtidos são excelentes e as críticas de perda de qualidade organoléptica não se justificam, quando o tratamento é feito correctamente. É importante controlar os aspectos físicos do processo, como o tempo de exposição do vinho a temperatura fixa e as outras configurações da enchedora, para que o nível de enchimento seja consistente com as normas em vigor após o resfriamento. A escolha da rolha deve reflectir os critérios dimensionais e seu tratamento superficial. Para um tratamento de engarrafamento, a estabilização físico-química do vinho deve primeiro ser assegurada, em especial, na casse proteica (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Em todos os casos, algumas regras são fundamentais: O tratamento deve ser feito na ausência do ar;
O nível de temperatura e tempo de exposição deve ser estabelecido de acordo com os objectivos e os meios utilizados. Em geral, na prática, o tratamento é muitas vezes excessivo, o que pode explicar as críticas frequentemente feitas;
18 No caso de tratamento de doenças microbianas, devem ser tratados o mais cedo possível, logo que o problema é identificado. É também evidente que o tratamento destrói os microrganismos e, assim, parando a sua actividade, mas não corrigindo os defeitos analíticos ou organolépticos já criados por este desenvolvimento microbiano (Lonvaud-Funel et al., 2010).
Em resumo, em enologia, em termos de controlo da actividade microbiana é possível utilizar um tratamento térmico para:
Acelerar o crescimento: aquecimento da colheita, aquecimento de cubas para a fermentação maloláctica;
Parar o crescimento: a destruição térmica de leveduras ou bactérias. Por exemplo, o tratamento de mostos em caso de contaminação por Brettanomyces, engarrafamento a quente, pasteurização dos vinhos (vinhos espumantes) (Lonvaud-Funel et al., 2010).
1.5.1 Parâmetros Industriais de Morte Térmica
A morte térmica, a uma determinada temperatura, corresponde à taxa de morte depende do número de células viáveis presentes. É dada pela seguinte equação:
dN/dt = -cN (1)
Onde:
dN/dt, é a taxa de morte;
N, é o número de células viáveis presentes e c, é a constante de proporcionalidade.
O sinal de menos significa que N está a diminuir (Adams e Moss, 1995).
Para informações sobre o número de células sobreviventes após o período de aquecimento, esta equação pode ser integrada entre o tempo zero e o tempo t para dar:
Loge (N/N0) = -ct (2)
ou
19 Onde, N e N0 são os números de células viáveis presentes no tempo t e 0,
respectivamente (Adams e Moss, 1995).
Em termos industriais, é mais conveniente representar a equação (2) em termos logarítmicos na base de 10 como:
Log10 (N/N0) = -kt (4)
Onde, k = c/loge 10 = c/2,303.
A partir da equação (4), é evidente que um gráfico de log do número de células sobreviventes a uma dada temperatura em função do tempo, deve dar uma linha recta com uma inclinação negativa, k. Quando a temperatura aumenta, de modo que o declive da curva de sobrevivência também aumenta. A partir desta relação pode derivar uma medida da resistência ao calor de um organismo, que é útil para o cálculo da letalidade dos processos térmicos (Adams e Moss, 1995).
O valor D ou tempo de redução decimal é definido como, o tempo a uma dada temperatura para que a sobrevivência da população seja reduzida por 1 ciclo logarítmico, a 90% (Figura 7). A temperatura à qual se aplica um valor D é indicada por um subscrito, por exemplo D65. Um valor de D pode ser obtido a partir de um
gráfico log10 de sobreviventes em função do tempo, em que é o inverso do declive, 1/k
(Adams e Moss, 1995).
20 Alternativamente pode ser calculada a partir de:
D = (t2 – t1)/(logN1 – logN2) (5)
Onde, N1 e N2 são os sobreviventes para os tempos t1 e t2, respectivamente. Uma
consequência da equação (5), é que nunca se pode prever com certeza quantas reduções decimais um processo de calor deve atingir (a sua letalidade) para um produto ser estéril, pois não há logN2 para N2 = 0 (Adams e Moss, 1995).
Á medida que a temperatura é aumentada, o valor de D diminui. Este é um processo exponencial no intervalo de temperaturas utilizadas no processamento térmico de alimentos, de modo que o gráfico do log D contra temperatura dá uma linha recta (Adams e Moss, 1995).
A partir disto, pode derivar um outro parâmetro importante para o processamento térmico, Z, que é a mudança de temperatura que resulta numa mudança de dez vezes (1 log) em D (Figura 8).
Z = (T2 – T1)/(logD1 – logD2) (6)
Figura 8 – O Valor Z. Adaptado de Adams e Moss (1995).
O conhecimento do valor Z de um organismo é importante, se quisermos ter em conta o efeito letal de diferentes temperaturas experimentadas durante um processo de aquecimento (Adams e Moss, 1995).
21
Tabela 2 – Exemplos de valores de D e respectivas temperaturas, para estirpes de
bactérias lácticas, em vinho (12,1% etanol). Adaptado de Splittstoesser (1975).
Estirpe T (ºC) Valor de D
Lactobacillus plantarum 45 0,35 min.
Leuconostoc mesenteroides 45 0,12 min.
22
1.6 Objectivos
Este trabalho foi realizado tendo em conta a ausência de dados actuais sobre a inactivação térmica de bactérias lácticas, responsáveis por alterações do vinho.
Assim, tivemos como objectivo determinar as resistências térmicas, na presença de etanol, de diferentes bactérias lácticas, responsáveis por alterações de vinhos, tendo em vista estabelecer as bases para o dimensionamento dos tratamentos térmicos aplicados na indústria do vinho.
As bactérias lácticas escolhidas para o estudo foram: Lactobacillus mali, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides e Oenococcus oeni. Devido à existência de estudos que afirmam que as bactérias lácticas isoladas de vinho e mosto, perdem a sua adaptação ao etanol, foram testadas várias hipóteses de adaptação destas bactérias ao etanol.
23
2. Material e Métodos
2.1 Estirpes utilizadas
Neste trabalho prático foram utilizadas 5 estirpes de bactérias lácticas provenientes da Colecção Espanhola de Culturas Tipo (CECT), nomeadamente as estirpes Lactobacillus hilgardii CECT 4786isolada de vinho, Lactobacillus mali CECT 4149T de
mosto de vinho, Lactobacilus plantarum CECT 748T de couves em conserva, Leuconostoc mesenteroides CECT 219T de azeitonas fermentadas e
Oenococcus oeni CECT 217T isolada de vinho. As estirpes foram mantidas em MRS
Agar (Man Rogosa Sharpe, Biokar Diagnostics, Beauvais, agar 20 % v/v) (Anexo I).
2.2 Curvas de Crescimento
As curvas de crescimento foram feitas, com o objectivo de relacionar a densidade óptica (D.O.) com o número de células viáveis (Anexo III). Para as curvas de crescimento das estirpes, 100 mL de MRS líquido foram inoculados num balão Erlenmeyer, com ansada de biomassa de uma estirpe, previamente crescida em MRS Agar. Este volume foi dividido em alíquotas de 1,5 mL incubadas a 28ºC. O crescimento foi acompanhado em intervalos de tempo determinados, de 20 em 20 minutos, 30 em 30 minutos, de uma em uma hora, ou de 2 em 2 horas, dependendo da estirpe e da velocidade do crescimento, até o crescimento ter atingido a fase estacionária. Em cada ponto, para uma alíquota, foi medida a D.O a 660 nm em espectrofotómetro (S-20 Spectrophotometer, Boeco Germany). Foram feitas as diluições necessárias e o espalhamento em placa de MRS Agar, em duplicado. As placas foram depois incubadas a 28ºC durante 48-72 h (Figura 9). Com os dados obtidos nesta experiência, foram construídos gráficos das curvas de crescimento, das taxas de crescimento e com a relação entre D.O. e células viáveis, para cada estirpe.
24 Figura 9 – Esquema do ensaio das curvas de crescimento.
2.3 Adaptação ao etanol
A adaptação ao etanol foi feita, devido a haver estudos anteriores que relatam que bactérias lácticas isoladas de vinho, perdem a sua adaptação ao etanol, por isso foi necessário adaptá-las e para tal foram feitas várias abordagens.
2.3.1 Inoculação em Vinho 2.3.1.1 Preparação do vinho
Antes de se iniciar este procedimento, os seguintes parâmetros do vinho foram analisados (Anexo II):
- Massa volúmica a 20°C expressa em g/dm3 segundo a Norma Portuguesa (NP)
2142;
- Teor alcoólico volumétrico em percentagem a 20 °C segundo a NP2143; - Acidez total expressa em g/dm3 de ácido tartárico segundo a NP 2139; - Acidez fixa expressa em g/dm3 de ácido tartárico segundo a NP 2141;
- Acidez volátil corrigida expressa em g/dm3 de ácido acético segundo a NP 2140; - pH, através de potenciómetro;
25 - Anidrido sulfuroso total expresso em mg/dm3 segundo a NP 2220;
- Açúcares expressos em g/dm3 segundo a NP 2223;
Estas análises foram realizadas no Laboratório Ferreira Lapa.
O dióxido de enxofre, presente no vinho, tem como objectivo inibir o crescimento microbiano. Desta forma, para retirar um factor limitante do crescimento e permitir o desenvolvimento das culturas inóculas, foi essencial corrigir o seu valor no vinho. O sulfuroso foi neutralizado através da adição de uma solução de acetaldeído, que permitiu reduzir a zero o sulfuroso livre. Como é expresso na reacção abaixo, um mole de etanal reage com 1 mole de sulfito (sulfuroso livre), originando 1 mole de acetaldeído:
CH3CHO + HSO3- CH3CHOHSO3
Através da estequiometria da reacção, foi calculada a quantidade de etanal a adicionar ao vinho de forma a reagir na totalidade com o sulfuroso livre (sulfito).
A percentagem de etanol no vinho foi ajustada a 1,5%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 11%, 12%, 12,5% e 13%. Para aumentar a percentagem de etanol foi necessário adicionar etanol, em que o aumento de 1% de etanol corresponde á adição de 1 mL de etanol em 100 mL de vinho. Para diminuir a percentagem de etanol foi necessário adicionar uma solução de ácido tartárico (5 g/L). Calculou-se qual a quantidade total necessária adicionar desta solução no vinho, de modo a diluir a percentagem de etanol. Neste passo optou-se por adicionar uma solução aquosa de ácido tartárico, de modo que o vinho final tivesse uma acidez total semelhante a um vinho comercial.
O pH do vinho foi acertado a 3,5 com adição de uma solução de HCL 1M, para diminuir e NAOH 1M para aumentar. O vinho foi seguidamente esterilizado por filtração (filtro Milipore 0,22 μm) para eliminar microrganismos indesejados para o ensaio.
Depois de efectuada a neutralização do sulfuroso e o ajustamento do etanol, o vinho foi novamente analisado, para confirmar estes valores.
2.3.1.2 Inoculação
Fez-se um pré-inóculo da estirpe a estudar, em MRS líquido. Atingida a fase exponencial (verificada através da medição da D.O. 0,3-0,5, a 660 nm e do gráfico da relação entre UFC/mL e D.O.), foram retirados 1,5 mL de suspensão celular que foram centrifugados durante 6 minutos a 10 000 r.p.m. Foi retirado o sobrenadante e as células no sedimento, ressuspensas em 1,5 mL de Solução de Ringer (S.R.). O passo de lavagem foi repetido. O sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de S.R. e inoculado
26 para cada uma das percentagens de etanol descritas anteriormente, foi preparado um balão de vidro com 100 mL de vinho ao qual foi adicionado 100 μL de suspensão de cada estirpe. Depois de homogeneizada a suspensão, mediu-se a D.O. a 660 nm. Foi feito um espalhamento em placa de MRS para verificar o crescimento/morte das bactérias no vinho. Nos três dias seguintes mediu-se a D.O. uma vez por dia e repetiu--se o procedimento. As placas foram incubadas a 28ºC durante 48-72h (Figura 10).
(A)
(B)
Figura 10 – Esquema da adaptação ao etanol, inoculação em vinho, (A) centrifugação do
pré-inóculo, (B) inoculação no vinho a várias percentagens de etanol.
2.3.2 Teste de resistência ao etanol
Nesta fase foram testadas duas abordagens. Foi testado o crescimento directamente em vinho e num meio de cultura controlado que pretendia simular as condições do vinho, MRS com adição de etanol.
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2.3.2.1 Em Vinho
No início da experiência foi novamente feito um pré-inóculo em MRS líquido da estirpe a estudar. Atingida a fase exponencial (D.O. 0,3-0,5), foram retirados 1,5 mL de suspensão celular que foram centrifugados durante 6 minutos a 10 000 r.p.m. Foi retirado o sobrenadante e as células, encontradas no sedimento, ressuspensas em 1,5 mL de Solução de Ringer (S.R.). O passo de lavagem foi repetido. O sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de S.R. e inoculado em 3 balões, um com MRS líquido com etanol 0% (controlo), e dois em vinho com 5% e 12 % de etanol. Foi feito o espalhamento em duplicado a partir de cada balão em MRS Agar, e as placas inoculadas a 28ºC durante 48-72h. Nos dois dias seguintes, foi realizado o espalhamento uma vez por dia (Figura 11).
Figura 11 – Esquema do teste de resistência ao etanol em vinho.
2.3.2.2 Em MRS com etanol
A partir de um pré-inóculo em MRS líquido, na fase exponencial (D.O. 0,3-0,5) inoculou-se 1 mL de cultura em 100 mL de MRS líquido com 1,5% de etanol. Homogeneizou-se e fez-se o espalhamento, em duplicado, em MRS Agar. As placas foram incubadas a 28ºC durante 48-72h.
28 Quando a cultura voltou a atingir fase exponencial (D.O. 0,3-0,5) na presença de 1.5 % de etanol, 1mL da suspensão celular foi inoculada em 100 mL de MRS líquido com 3% de etanol. Fez-se o espalhamento, em duplicado, em MRS Agar, voltando a repetir-se este passo nos dias seguintes para MRS líquido com concentrações crescentes de etanol (5%, 7.5% e 10 %) (Figura 12).
Figura 12 – Esquema do teste de resistência ao etanol em MRS com etanol.
2.3.3 Adaptação ao etanol em vinho a partir de MRS com etanol
A partir de um pré-inóculo em MRS líquido, na fase exponencial inoculou-se 1 mL em 100 mL de MRS líquido com 1,5% de etanol. Homogeneizou-se e incubou-se a 28ºC. Atingida a fase exponencial (D.O. 0,3-0,5), homogeneizou-se e inoculou-se 1 mL em 100 mL de MRS líquido com 3% de etanol. Fez-se o mesmo procedimento para MRS com 5% e 7,5% de etanol.
Quando a cultura celular no balão de MRS líquido com 7,5% de etanol atingiu a fase exponencial, para além de se realizar a passagem de inoculo para MRS líquido com 10 % de etanol, foram retirados 1,5 mL de suspensão celular que foram centrifugados durante 6 minutos a 10 000 r.p.m. Foi retirado o sobrenadante e as células, encontradas no sedimento, ressuspensas em 1,5 mL de Solução de Ringer (S.R.). O passo de lavagem foi repetido. O sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de S.R. foi ainda feita a inoculação de 100 μL da suspensão de cada estirpe, em 100 mL de vinho com 7.5 % de etanol. Quando a cultura celular no balão de MRS líquido com 10% de
