UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO MESQUITA”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO
FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E
SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVO
DE EMBRIÕES BOVINOS
Andréa Renesto
Médica VeterináriaAgosto de 2004
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO MESQUITA”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO
FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E
SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVO
DE EMBRIÕES BOVINOS
Andréa Renesto
Orientador: Profa. Dra. Lia de Alencar Coelho
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Reprodução Animal).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Agosto de 2004
iii
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
ANDRÉA RENESTO – Nascida aos 10 dias de março de 1977 em Pereira
Barreto – SP. Graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE – no período de Janeiro de 1995 a Dezembro de 1999. No período de Fevereiro de 2000 a Agosto de 2001 cursou a Especialização Lato Sensu em Reprodução Animal, na Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE. Em fevereiro de 2001 ingressou na Especialização Lato Sensu em Julgamento das Raças Zebuínas, da Faculdade de Agronomia e Zootecnia de Uberaba – FAZU, obtendo o título de Especialista em Julgamento das Raças Zebuínas em Dezembro de 2001. Graduou-se como Jurada efetiva das Raças Zebuínas através do Colégio Técnico de Jurados das Raças Zebuínas da Associação Brasileira dos Criadores de Zebu, no período de Junho de 1999 a Outubro de 2001. Ingressou no Programa de Mestrado em Medicina Veterinária, Área de Concentração Reprodução Animal, pela faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP - Jaboticabal-SP, em março de 2002.
Agradeço a Deus por essa existência, pela coragem,
vontade e principalmente pela força
nos momentos mais difíceis...
Dedico este trabalho aos meus pais!
É mais uma prova do sinônimo de amor e carinho que
vocês me proporcionaram durante toda minha existência.
.... Vocês que abriram mão de muitos sonhos em função
dos meus... Não há palavras que expressem minha
gratidão e meu amor!!!
“ Se um dia já homem feito e realizado, sentires que a
terra cedeu a teus pés, e que tuas obras morreram, que
não há ninguém a tua volta para te estender a mão,
esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade,
volta a tua infância e balbucia, entre lágrimas e
esperanças, as últimas palavras que sempre estarão na
tua alma: Mãe, Pai...
v
Rui Barbosa
Aos meus irmãos, que tanto amo, Silvana e Éden:
Obrigada pelo apoio incessante e por acreditarem em
mim, mesmo nas horas em que eu cheguei a duvidar!!
“ À medida que o nosso amor progride, mais nos convencemos
de que Deus existe e de que a alma é imortal”.
(Dostoievski)
Ao meu querido amigo Irineu Gonçalves Filho;
“ A imortalidade de que se reveste a natureza humana
faz o homem sempre presente.
Presente pela cultura que transmitiu.
Presente pela amizade que conquistou.
Presente pelo exemplo que legou.
Sempre presente porque o homem é educador.”
Ofereço:
A Profa Dra. Lia de Alencar Coelho
Ao Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
A Profa Dra. Caliê Castilho
Obrigada ... pela orientação,
valiosos ensinamentos,
pela confiança e inestimável apoio,
pela amizade e convivência enriquecedora...
À vocês, minha eterna admiração!!
Em especial a minha querida amiga Caliê... não tenho
palavras de agradecimento, admiração e respeito...
“ É muito melhor ousar fazer coisas grandiosas,
triunfar gloriosamente, mesmo que com alguns fracassos no
meio do caminho, do que se igualar aquela pobres almas que
não aproveitam nem sofrem muito,
pois vivem na penumbra cinza de quem não sabe o que é a
vitória nem a derrota”
vii
“ ...E encontrei liberdade e segurança
em minha loucura:
a liberdade da solidão e
a segurança de não ser compreendido,
pois aqueles que nos compreendem
nos escravizam de algum modo...”
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta e indireta de muitas pessoas. Manifesto minha eterna gratidão a todas elas!!
À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, e ao departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal – DRA pelas instalações, condições de trabalho e oportunidade oferecida.
À Universidade do Oeste Paulista pelo incentivo a pesquisa, por ceder os animais da segunda fase do trabalho e colocar a disposição às instalações da Fazenda Experimental, em nome da amiga Profa Dra. Caliê Castilho, que me guiou no caminho da pesquisa. Não tenho palavras de agradecimento... é só sentimento!!! À Gilmar Garcia que gentilmente forneceu os animais e toda instalação da Agropecuária J Garcia para os experimentos da primeira fase do trabalho.
“ A arte suprema do mestre consiste em despertar alegria, provocando curiosidade pelo conhecimento criativo. A única finalidade da educação deve consistir em preparar indivíduos que pensem e ajam como pessoas – independentes e livres”.
(Albert Einstein)
À todos os funcionários que me acompanharam no campo, ajudando intensamente na realização desse trabalho. Fica aqui minha gratidão, vocês foram fundamentais para o projeto...e, foram... incansáveis!!
Aos meus companheiros de trabalho e amigos, Dr. Irineu Gonçalves Filho, Dr. Valdecir Marin Júnior e Dr. Marcelo Moura, inicialmente pela amizade e por
ix acreditarem em mim e posteriormente pela confiança, compreensão e força... Vocês fizeram parte da realização desse sonho e com vocês aprendo mais a cada dia os principais valores da vida: ética, companheirismo, conhecimento, respeito, seriedade e amizade! “... Amigos que se tornaram parceiros, parceiros que se
tornaram amigos. Sementes plantadas e regadas com respeito, admiração e muita amizade!! “
Ao meu querido e doce JV. Obrigada pela sinceridade, pelos olhos cheio de carinho pela beleza e grandeza dos seus sentimentos. Você foi fundamental em um momento da minha vida em que cheguei a achar que as pessoas eram só maldade e que a vida era repleta de injustiças e incompreensão.
“ Parece que tudo já foi dito entre nós. Agora só vale a pena dizer da saudade que você deixou...” (Carlos Drummond de Andrade)
A todos meus familiares que mesmo distantes sempre me apoiaram e torceram por mim em mais essa etapa da minha vida.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Reprodução Animal pela amizade, convívio harmonioso e colaboração. Em especial a Bel e a Roberta pela paciência e atenção.
Ao Médico Veterinário e amigo José Otávio Folino pelo auxílio na colheita de embriões, pela ajuda em um dos momentos mais difíceis e tão engrandecedor que passei na minha vida e principalmente pela amizade! A você e sua esposa Milene, nunca esquecerei o carinho, a amizade, o apoio, o incentivo, as palavras de fé, de esperança... pela mão amiga estendida, pelo estímulo e conforto...
Ao Médico Veterinário Fábio Mustafá pelo auxílio no desenvolvimento dos trabalhos na Fazenda Experimental. Obrigado companheiro!!
Aos funcionários da Avanti Consultoria Pecuária, Carol, Regina e Jú! A realização desse trabalho contou diretamente com a colaboração de vocês... por me apoiarem e principalmente pela compreensão da minha inconstância de humor. E, também aos funcionários da Nelore, Adriana e Maurílio! Obrigada pela força!! Aos pós-graduandos de Jaboticabal, em especial a Déia e Gabriel que foram extremamente prestativos quando precisei de ajuda. Companheirismo é uma qualidade de poucos... Obrigado companheiro!!! Ao Max, Cris, Vi, Letícia, Éricles... A minha amiga irmã Ka (Karina Ueda Stringuetta). Você, mesmo distante, sentia quando eu precisava de uma palavra amiga e de um conforto e mesmo quando eu não queria falar você sempre tinha uma palavra de carinho. Obrigada por você nunca desistir de mim!!!
A minha amiga irmã Lê (Alessandra Reis).... sempre presente em todos os momentos em que precisei, sempre pronta para ouvir! Obrigada pelos sábios conselhos e por me fazer ver, por muitas vezes, a força que existe em mim e que Deus nos dá a todo instante. Obrigada pela amizade e pelos momentos de alegria fraterna que sempre marcaram nossa convivência... Você que une a ação ao sentimento e ao pensamento! Muito obrigada!!!
À minha amiga querida, Janete (Fernanda Prata Cunha)... Muito obrigada pela força e por se preocupar tanto comigo. Você tem sido uma grande amiga... sabemos que podemos contar uma com a outra!!! “Toghethersss... foreverssss....” À minha eterna amiga Maria de Lamare... nem tenho palavras para agradecer toda força que já me deu. Obrigada pelo querer bem e pela confiança! Saiba que você é companheira ímpar... parceira cem por cento!
Àos meus amigos: Lu Kahale, Flor (Fabiana), Verinha, Baraldi, Talita Medeiros, Li, Gabi, Dani Bolota, Dipilik (Bárbara), Dani Tenca, Lala, Dudu, Fer Rezek, Tiago,
xi Kel, Gui, SI, Déia Basso, Bidu, Elaine, Ricardo Porção, Mary, Dedé, Thá, Morcega (Kelma), Paulinha, Flá, Ana Laura, D.Lenita, Mav... enfim a todos MUIIITTOOO OBRIGADA PELO APOIO E PRINCIPALMENTE PELA AMIZADE!!
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ... 15
II. REVISÃO DA LITERATURA... 17
III. MATERIAL E MÉTODOS... 25
Local do Experimento... 25
Animais ... 25
Tratamentos... 25
Aspiração Folicular... 28
Lavagem e seleção dos oócitos ... 28
Transporte de oócitos ... 29
Maturação in vitro (MIV) ... 29
Fecundação in vitro (FIV) ... 29
Cultivo in vitro (CIV)... 30
Colheita de embriões... 30
Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE ... 30
Análise Estatística ... 30
IV. RESULTADOS... 32
V. DISCUSSÃO ... 38
VI. CONCLUSÃO ... 41
ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN
VIVO DE EMBRIÕES BOVINOS
RESUMO – Visando otimizar o uso alternado das biotecnologias TE e
OPU-FIV o presente trabalho teve como objetivo avaliar em vacas da raça Nelore o efeito do início da superovulação ovariana (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração folicular em fase aleatória do ciclo estral (OPU 1) e avaliar a produção in vitro de embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2) em diferentes momentos da primeira onda folicular induzida após a SOV. As fêmeas (n=23) foram submetidas a OPU 1, em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante de progestágeno (Crestar®). Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se a SOV, utilizando-se FSH (Folltropin®) 180 mg por vaca dividida em 8 doses, durante 4 dias consecutivos. Durante 6a e 7a aplicações de FSH foi administrada 500 µg de PGF2α (Preloban®) e o Crestar foi retirado durante a administração da
sétima dose de FSH. Após 12 horas do término da SOV, as fêmeas receberam 25mg de LH exógeno (Lutropin-V®) para causar ovulação e realizar a IA com tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas, sendo que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH. Sete dias após a 1ª IA as fêmeas foram coletadas. No dia da colheita dos embriões as fêmeas foram divididas em 6 tratamentos, T(0-144) (n=4), 120) (n=5), T(48-96) (n=4), T(72-T(48-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48) (n=3) que variaram de acordo com o momento da administração de PGF2α em relação a colheita de embriões e aspiração na primeira onda após a SOV. A aplicação de PGF2α foi realizada no dia da colheita (dia 0), 48, 72 ou 96 horas após a colheita e a aspiração 144, 96, 72 ou 48 horas após a PGF2α. Não houve diferença significativa na % de oócitos aspirados e embriões produzidos com a alternância das biotecnologias OPU e TE. No entanto, foi observada diferença significativa (p>0,05) no número de oócitos recuperados entre os tratamentos, sendo que a recuperação no T(96-48) foi significativamente menor quando comparada ao T(48-96) e T(72-96),
xiii demonstrando que o momento da aspiração muito próxima da PGF2α (48 horas após) prejudicou a recuperação de oócitos. Concluí-se que a superovulação não afeta a recuperação de oócitos e a produção in vitro de blasctocistos quando a OPU é realizada a partir de 48 horas após a PGF2α na onda subseqüente a superovulação podendo ser utilizada para o incremento na produção de embriões de vacas da raça Nelore.
Palavras chaves: aspiração folicular, competência oocitária, dinâmica folicular,
ASSOCIATION OF THE BIOTECHNIQUES: ULTRASOUND-GUIDED TRANSVAGINAL FOLLICULAR ASPIRATION AND SUPEROVULATION IN
PRODUCTION IN VITRO AND IN VIVO OF BOVINE EMBRYOS
SUMMARY - Aiming at to optimize the alternating use of the biotechnologies
multiple ovulation and embryo transfer (MOET) and Ovum Pick Up and in vitro
fertilization (OPU-FIV) the present work had as objective to evaluate in Nelore
donors breed the effect of the beginning of the superovulation (SOV) at 48-60 hours after the follicular aspiration in randomly phase of the estrous cycle (OPU 1) and to evaluate thein vitro embryo development of recovered oocytes (OPU 2) at different moments of the first folicular wave after the SOV. The females (n=23) were submitted to a OPU 1, in randomly phase of the estrous cycle, followed for the insertion of progesterone (Crestar®). Around 48 - 60 hours after the aspiration the superovulaction was induced with FSH (Folltropin®) 180 mg/ cow divided in 8 doses, during 4 consecutive days. Luteolytis was induced with two doses of PGF2á (Preloban®, 500 µg), during the sixth and seventh infections of FSH and Crestar was removed during the administration of the seventh dose of FSH. 12 hours after the end of the SOV, the females received 25mg of LH (Lutropin-V®) to cause ovulation. Two Artificial inseminations with fixed time were done with interval of 12 hours and the first occurred 12 hours after the LH administration. Seven days after 1ªIA the embryo were collected and all cows divided in 6 treatments, T(0-144) (n=4), T(48-120) (n=5), T(48-96) (n=4), T(72-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48) (n=3) that accordance with the injection of PGF2 á , embryo recovery and aspiration in the first wave after the SOV. The PGF2 á application was carried in the embryo recovery (day 0), 48, 72 or 96 hours after and aspiration 144, 96, 72 or 48 hours after the PGF2 á. There was no significant difference in % of oocytes recovery and embryos development with the alternation of the biotechnologies OPU and SOV. However, significant difference (p>0,05) in the number of oocytes recovery between the treatments was observed. The recovery in T(96-48) was significantly lesser when compared with T(48-96) and T(72-96), demonstrating that
xv the moment of the aspiration very next to the PGF2á (48 hours after) harmed the oocytes recovery. The results of the present study concluded that the superovulation not affect the oocytes recovery and the embryo development when the OPU is carried 48 hours after the injection of PGF2á in the subsequent wave after the superovulation and may to be used for the increment of embryos yield of Nelore donors.
key words: superovulation, follicular aspiration, oocyte competence, follicular
I. INTRODUÇÃO
No atual contexto de evolução da produtividade na pecuária nacional, associado às evoluções científicas e tecnológicas, várias biotecnologias ligadas a reprodução animal vem sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito de aumentar a eficiência reprodutiva, maximizando a produção de animais geneticamente superiores, visando o aproveitamento deste material genético para obtenção do maior número de descendentes, em um curto período de tempo.
Seguindo a evolução das principais biotecnologias adotadas e trabalhadas no Brasil, é importante ressaltar, inicialmente, o papel da Inseminação Artificial (IA), sendo a primeira biotecnologia adotada nos sistemas de produção brasileiros que visa a multiplicação genética de touros de alto valor. Com a introdução de esquemas de ovulações múltiplas, recuperação e transferência de embriões, mais conhecida como Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET), junto com a criopreservação de embriões na década de 80, a bovinocultura passou a ter em mãos ferramentas para aumentar o número de gestações provenientes de fêmeas de alto mérito genético (RODRIGUES, 2001). A produção embrionária através da TE é uma biotécnica mundialmente difundida e vem apresentando um crescimento acentuado onde mais de 500.000 embriões são colhidos e transferidos ou congelados anualmente (THIBIER, 2000).
A Fertilização In Vitro (FIV), por sua vez, é considerada a terceira geração de biotecnologia aplicada ao Melhoramento Genético, após a IA e a TE. No início da década de 90, com a introdução da aspiração folicular guiada por ultra-sonografia (Ovum Pick-up) seguida pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV), a expectativa no incremento da produtividade das fêmeas aumentou.
Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias também vêm sendo amplamente utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção e, ao longo da sua evolução, tem revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser um processo economicamente viável, bastante divulgado e empregado na pecuária moderna.
xvii No entanto, segundo BO et al., (2000) alguns inconvenientes podem ser observados nos programas de superovulação como a necessidade de iniciar o tratamento hormonal em momento determinado do ciclo estral e pouca consistência na produção de embriões viáveis pelas doadoras, sobretudo quando se considera que 20% a 30% das doadoras não produzem nenhum embrião transferível. A variabilidade na produção de embrião pode ser influenciada por fatores relacionados com o tratamento superovulatório ou em maior grau por fatores individuais associados às características da dinâmica folicular ovariana (BO et al., 1995; BO et al., 2000) ou condição ovariana no momento da superovulação (MONNIAUX et al., 1983; DIAZ, 2001).Sem contar que repetidos tratamentos superovulatórios em novilhas e vacas afetam a fertilidade podendo causar cistos e dificuldade para estabelecimento de prenhez posterior (GALLI et al., 2003).
A FIV pode contribuir como uma alternativa para a superovulação e maior produção de embriões por unidade de tempo quando comparada a TE. No entanto, mesmo com os progressos obtidos nos processos de maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) para o desenvolvimento embrionário, esta técnica ainda apresenta algumas desvantagens que precisam ser melhoradas e solucionadas. As taxas de blastocistos bovinos oriundos de oócitos maturados e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas na última década, onde somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994; THOMPSON; DUGANIZICH, 1996; DAYAN, et al., 2000) dos oócitos selecionados morfologicamente antes de serem submetidos a MIV resultam em embriões viáveis.
Tendo em vista que as biotecnologias MOET e OPU-PIV são de extrema importância para aumentar a velocidade de ganho genético do rebanho nacional, o presente trabalho visando a otimização pelo uso alternado destas biotecnologias testou:
- o efeito do início da superovulação (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração folicular em fase aleatória do ciclo estral – aspiração referência (OPU 1);
- a produção in vitro de embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2) em diferentes momentos da primeira onda folicular após a SOV.
II. REVISÃO DA LITERATURA
O ciclo estral (CE) bovino é compreendido pelos eventos reprodutivos que se apresentam entre dois períodos de receptividade sexual (cio). As fêmeas da espécie bovina ao atingirem a puberdade exibem comportamento estral em média a cada 21 dias, variando de 17 a 24 dias tanto em raças européias (ROBINSON; SHELTON, 1991; WRIGHT; MALMO, 1992; BO; ADAMS; MAPLETOFT; 2000) quanto zebuínas (GALINA; ARTUR, 1990; PINHEIRO, et al., 1998; FIGUEIREDO, et al., 1997; GAMBINI, et al., 1999) até que a prenhez se estabeleça.
Durante o ciclo estral ocorrem importantes alterações no córtex ovariano que incluem crescimento e atresia de vários folículos antrais até o aparecimento do folículo ovulatório, bem como a formação e lise do corpo lúteo (CASTILHO, 1999). O crescimento folicular na espécie bovina exibe padrão contínuo de crescimento e atresia dos folículos ovarianos (MATTON, et al., 1981; WOOLUMS; PETTER, 1994) que se inicia na vida fetal, passa pela puberdade (EVANS, et al., 1997) e continua na vida reprodutiva até a seniIidade (HAFEZ, 1993). Muitos estudos com ultra-sonografias seriadas foram realizados e demonstraram que durante o ciclo estral de novilhas ou vacas zebuínas e européias ocorrem duas (PIERSON; SIROIS; SAVIO, 1988; GINTHER; KNOPF, 1989; FIGUEIREDO, et al., 1997) ou três (SAVIO, et al., 1988; GAMBINI, et al., 1998; BARROS, et al., 1993; FIGUEIREDO, et al., 1997; CASTILHO, et al., 2000) ondas de crescimento folicular.
Este processo contínuo de crescimento e regressão dos folículos, que leva ao crescimento do folículo pré-ovulatório, é conhecido como dinâmica folicular, enquanto que o padrão de crescimento e atresia de um grupo de folículos ovarianos é denominado onda de crescimento folicular (LUCY, et al., 1992). Cada onda folicular é composta por 3 fases: recrutamento ou emergência, seleção e dominância (SIROIS, 1990).
xix A emergência da primeira onda folicular é observada em torno de um dia e meio após a ovulação (ADAMS, et al., 1992; GINTHER, et al., 1997) quando um conjunto de folículos antrais dependentes de FSH começa a se desenvolver. Foi observado um aumento na concentração plasmática de FSH que antecede 1 a 2 dias a emergência de cada onda folicular (ADAMS, et al., 1992; GIBONS; GINTHER, 1999). Em torno de 3 a 4 dias após a emergência da onda o FSH reduz para níveis basais e o futuro folículo dominante é selecionado, continua seu crescimento, enquanto o restante dos folículos detém seu crescimento ou regridem e são chamados de subordinados (BODENSTEINER, et al. 1996; GINTHER, et al., 1997; GINTHER, et al., 2000).
A fase de seleção do folículo dominante durante a primeira onda folicular foi observada por GINTHER et al. (1996), como a divergência na taxa de crescimento entre o futuro folículo dominante (FD) e o maior folículo subordinado (FS) 2,8 dias após a
emergência da onda quando o futuro folículo dominante apresentou 8,5 mm de diâmetro e o maior subordinado 7,2 mm. CASTILHO; RENESTO; GARCIA (2003), estudando a
seleção folicular em novilhas da raça Nelore observaram que em média 84 horas após a ovulação o maior folículo subordinado medindo 5,5 mm cessa seu crescimento, enquanto o futuro dominante com 7,5 mm continua a se desenvolver. Nas novilhas da raça Nelore, 24 horas antes da divergência no crescimento folicular foi observada a menor concentração plasmática de FSH.
Existe uma relação funcional entre a concentração de estradiol e FSH em novilhas. O aumento ou decréscimo na concentração de estradiol no início da divergência resulta em decréscimo ou aumento, respectivamente, na concentração de FSH (KULICK, et al., 1999; GINTHER, et al., 2000b).
Provavelmente o responsável pela queda do FSH antes da seleção é a produção de estradiol e inibina, sobretudo pelas células da granulosa do folículo dominante, que atuam inibindo a liberação de FSH pela hipófise anterior (FINDLAY; CLARKE, 1987). As concentrações de FSH são mantidas em níveis basais até o folículo dominante da primeira onda perder sua dominância, resultando em aumento nos níveis de FSH e subseqüente emergência da segunda onda folicular (BODENSTEINER, et. al., 1996).
Alguns trabalhos têm demonstrado que qualquer folículo saudável ou em
crescimento é capaz de se tornar dominante. O aumento da concentração sérica de FSH, decorrente da destruição do folículo dominante após a divergência, resulta na dominância do maior folículo subordinado (KO, et al., 1991, GINTHER, et al., 2000). Da mesma forma, um folículo aleatoriamente escolhido dentre um grupo de folículos de 5 mm, no início da onda folicular, pode ser direcionado para a dominância após a aspiração de todos os outros da onda (GIBBONS; GINTHER, 1997).
Tratamentos com FSH no início do desenvolvimento folicular estimulam muitos folículos a obterem diâmetro de dominância (ADAMS, et al., 1994), sendo à base dos protocolos de superovulação com FSH para colheita de embriões.
A superovulação é uma eficiente técnica para se obter várias progênies de fêmeas geneticamente superiores e pode ser realizada mediante aplicação seriada de FSH no início da 2aonda folicular, ou seja, entre os dias 9 a 12 do ciclo estral (GOULDING, et al., 1990). A resposta ovariana a superovulação depende do número de folículos presentes no ovário sensíveis a gonadotrofina e do estágio da onda folicular no momento em que a aplicação de FSH é iniciada (DRIANCOUT, 2001). No entanto, um dos principais inconvenientes observados nos programas de superovulação é a necessidade de iniciar o tratamento hormonal em momento determinado do ciclo estral (BO, et al., 2000).
Outro inconveniente da SOV é a baixa consistência na produção de embriões viáveis pelas doadoras, um terço das doadoras tratadas não respondem a SOV, por outro lado um terço produz em média 3 embriões e somente o terço restante resulta em grande número de embriões transferidos (GALLI, et al., 2003). Esta variação na resposta, têm-se transformado em fator limitante para o uso em larga escala da tecnologia (ARMSTRONG, 1993; MAPLETOFT; PIERSON, 1993, BO, et al., 1995). Dentre os fatores que podem ser responsabilizados por tais variações, podemos citar a influencia do tipo, o grau de pureza, a dose e o esquema de administração do hormônio (BECKER; PINHEIRO, 1986; MAPLETOFT; PIERSON, 1994), estado nutricional da doadora (YAAKUB, et al., 1999; SIDDIQUI, et al., 2002), histórico reprodutivo, idade, estação do ano, efeito de repetidas superovulações (MAPLETOFT; PIERSON, 1994), raça, Bos indicus quando comparada a raças européias (BARROS; NOGUEIRA, 2001), além da condição folicular no início do tratamento superovulatório (MONNIAUX, et al., 1983; GRASSO, et al., 1989; PIERSON; GINTHER, 1988; BUNGARTZ; NIEMMAN, 1994, BO, et al., 1995) que pode estar diretamente relacionada a fase ideal para se iniciar a estimulação hormonal exógena.
A estimulação hormonal com FSH pode ser iniciada antes da emergência da onda folicular ou no dia da emergência (GOULDING, et al., 1990; NASSER, et al., 1993; ADAMS; ROBERTS, et al., 1994; BO, et al., 1995; STOCK, et al., 1996), ou seja, antes dos folículos subordinados iniciarem seu processo de atresia (BO, et al., 1995).
xxi Segundo PIERSON et al. (1988), GRASSO et al. (1989), GUIBAULT et al. (1991) e ADAMS et al. (1993), o início de tratamentos com gonadotrofinas na presença de um folículo dominante ou após a seleção do folículo dominante resulta em uma redução da resposta superovulatória.
BERGFELT et al. (1994) e MERTON et al. (2002), iniciaram a superovulação 48 e 38 a 46 horas, respectivamente, após a aspiração e obtiveram melhores resultados.
Em vista dessas informações, uma alternativa para se obter uma melhor resposta superovulatória é controlar a dinâmica folicular (BO, et al., 2000), ou a emergência da nova onda folicular em programas de transferência de embriões. A sincronização da emergência da onda folicular tem como objetivo remover o efeito supressivo do folículo dominante e iniciar uma nova onda (BO, et al.,1995; 2000), situação que ocorre normalmente em animais entre os dias 8º e 12° após a detecção do estro.
Existem diferentes métodos pelos quais se pode controlar a dinâmica folicular em bovinos. Estudos demonstraram que a eliminação do folículo dominante, por métodos físicos ou hormonais, resultam em aumento de FSH e desta forma emergência de uma nova onda folicular num período de tempo conhecido (ADAMS, et al., 1992; BO; GHINTHER, et al., 1996; MIHM, et al., 1997). A possibilidade de utilização de estradiol (BO, et al., 1993,1994; CARRIERE, et al., 1995) ou estradiol associado a progestágenos (BO, et al., 1991; 1996) para sincronizar a onda folicular, vem sendo muito utilizado em protocolos de superovulação em bovinos (BO, et al., 1995b, 1996; BROADBENT, et al., 1995; ANDRADE, et al., 2002a,b,c; OLIVEIRA, et al., 2002). Quando a progesterona é usada associada ao estrógeno, a emergência da nova onda folicular ocorre ao redor de 4 ou 5 dias após o tratamento ( BO, et al., 1995, 1996; CACCIA; BO, 1998; MAPLETOFT, et al., 1999). BO et al. (2000), demonstraram que o início do tratamento com gonadotrofinas 4 dias após o tratamento com progesterona e estradiol resulta em resposta superovulatória semelhante a iniciada na emergência da segunda onda folicular ou entre os dias 8º e 12º do ciclo estral.
O mesmo foi observado em vacas da raça Nelore, onde trabalhos utilizando métodos hormonais para sincronizar a onda folicular para início da SOV demonstraram que não há comprometimento da morfologia do embrião ou taxa de gestação, quando comparado ao protocolo padrão e elimina a necessidade de observar o cio, permitindo a superovulação de grande número de doadoras em curto período de tempo (AZEVEDO; COELHO,1991; ANDRADE; OLIVEIRA, et al., 2002; ANDRADE, et al., 2003).
Além dos métodos hormonais empregados para promover a sincronização da emergência da onda folicular em vacas, o método físico através da aspiração folicular guiada por ultra-sonografia transvaginal vem sendo utilizado com sucesso.
BERGFELT et al. (1994), realizaram aspiração folicular de todos os folículos maiores ou iguais a 5 mm de diâmetro, em estágio aleatório do ciclo estral, e constataram aumento no nível sérico de FSH em 24 horas e emergência da nova onda folicular em torno de 48 horas após a aspiração folicular. O mesmo foi constatado por trabalhos com aspiração somente do folículo dominante, tanto em novilhas Bos taurus (AMARIDIS, et al., 1999; ADAMS, et al., 1994; BERGFELT, 1994) quantoBos indicus (BURATINE, et al., 2000).
SHAW et al. (1999) e MERTON (2003), estudando procedimentos de superovulação com aspiração prévia do folículo dominante observaram aumento no índice de embriões viáveis de 3,9 a 5,9. GRADELA et al. (2000), avaliando em vacas Nelore a resposta da SOV iniciada na presença ou ausência do FD e após a aspiração do FD observaram que a resposta superovulatória das doadoras não diferiu entre os grupos, mas a taxa de viabilidade embrionária foi maior nos grupos sem FD (69,4%) e FD aspirado (68,99%) quando comparados ao grupo com FD presente (48,54%).
No início da década de 90, com a introdução da Ovum Pick-up, seguida pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV), a expectativa no incremento da produtividade das fêmeas aumentou. A aplicação da OPU-FIV é de grande importância para a multiplicação rápida de animais, e exibe algumas vantagens quando comparada com a MOET. NIBART et al. (1995), demonstraram que se
xxiii pode obter até 18 gestações em três meses utilizando aspiração folicular, enquanto com a TE clássica, no mesmo período, seria possível obter apenas 5 gestações. Desta forma pela OPU-FIV é possível produzir 2 a 3 vezes mais embriões por unidade de tempo quando comparado à TE convencional. Outras vantagens da OPU-PIV são a obtenção de oócitos em qualquer fase do ciclo estral sem tratamento gonadotrófico (MERTON, et al., 2003), possibilitando realizar repetida recuperação de oócitos de animais vivos sem trauma aparente do trato reprodutivo, permitindo, desta forma, a produção de embriões oriundos de vacas senis (BROGLIATTI; ADAMS, 1996), com patologias reprodutivas adquiridas (LOONEY, et al., 1994; HASLER, et al., 1995; RODRIGUES; GARCIA, 2000), prenhes, durante o primeiro trimestre de gestação (BUNGARTZ, et al., 1995; MEINTJES, et al., 1995) ou em novilhas pré-púberes (ARMSTRONG, et al.; ADAMS, 1994; BROGLIATTI, 1996). Outra vantagem particular da FIV em relação a outras biotecnologias é a maximização do uso do sêmen, permitindo maior produção de embriões com doses de alto valor comercial e inclusive sêmen sexado (FABER, et al., 2003).
Entretanto, as taxas de blastocistos bovinos oriundos de oócitos maturados e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas na última década, somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994, THOMPSON; DUGANIZICH, 1995), 15 a 20% (HENDRIKSEN, et al., 2000) ou 35% (DAYAN, 2001) dos oócitos selecionados morfologicamente antes de serem submetidos a MIV resultam em embriões viáveis. Segundo PEIXER et al. (1995), além dos baixos índices de blastocistos, a produção in vitro de embriões ainda apresenta algumas limitações: qualidade biológica dos embriões, dificuldades na criopreservação dos embriões e dos oócitos, menor viabilidade dos oócitos obtidos de bezerras em relação aos de vacas e novilhas, e o custo, que é superior ao embrião produzido pela transferência de embriões (TE).
Buscando obter maior número de embriões em curto espaço de tempo, os protocolos têm geralmente consistido de uma ou duas aspirações semanais usando animais superovulados ou não (LOONEY, et al., 1994; BOLS; BUNGARTZ, et al., 1995; HASLER, et al., 1995; STUBBINGS, 1995). Embora a
aspiração realizada 2 vezes por semana aumente o número de folículos, oócitos recuperados e embriões produzidos (GIBBONS, et al., 1994), a alta freqüência e o curto intervalo entre as aspirações afeta negativamente o número de oócitos (HASLER, et al., 1995; BOUSQUET, et al., 1999) a longo prazo.
Têm sido reportadas taxas de recuperação de oócitos em torno de 2 a 3 por doadora, por sessão de aspiração (PIETERSE, et al., 1988), 4,7 (BOUSQUET, et al., 1999), 9,7 (DAYAN, et al., 2000) e acima de 11 oócitos (BORDIGNON, et al., 1997) .
Existe também uma ampla variação na produção de oócitos e embriões, KRUIP et al. (1994), relataram variação entre as doadoras de 9 a 26% e HASLER et al. (1995), variação entre 4% a 33%. DAYAN et al. (2000a), observaram variação entre 14 e 54% na produção de embriões em 20 doadoras submetidas a OPU-FIV.
Essa variação pode estar diretamente relacionada ao fato de que o oócito para ser fertilizado in vivo é obtido através da ovulação de um folículo saudável, durante uma fase específica do ciclo estral e os oócitos aspirados para a produção
in vitro são obtidos de folículos em diferentes estágios do desenvolvimento
(LONERGAN, et al., 1994; HENDRIKSEN, et al., 2000), em fases distintas do ciclo estral (MACHATKOVÁ, et al., 1996), portanto expostos a diferentes concentrações de FSH, podendo levar a uma diminuição na competência oocitária (MACHATKOVA, et al., 2004).
Vários estudos têm demonstrado que a fase do ciclo estral e inclusive do desenvolvimento folicular influenciam a competência oocitária, uma vez que o diâmetro do folículo afeta diretamente o oócito (MACHATKOVA, et al., 2004). Em alguns estudos, oócitos provenientes de folículos maiores se desenvolvem melhor
in vitro, onde se observou aumento na produção de embriões de oócitos aspirados
de folículos médios e grandes quando comparado a folículos pequenos (PAVLOK, et al., 1992; LOONERGAN, et al., 1994; ARLOTTO, et al., 1996; HAGEMANN, et al., 1999b). Provavelmente devido a fase de dominância do ciclo estral onde o folículo dominante afeta negativamente a competência oocitária dos folículos subordinados induzindo avanço no estádio de atresia (HENDRIKSEN, et al.,
xxv 2000). No entanto, CAROLAN et al. (1996), SENEDA et al. (2001), não observaram influência do diâmetro folicular sobre a competência do oócito, analisando oócitos aspirados de folículos pequenos e grandes.
MACHATKOVA et al. (1996), comparando a aspiração em diferentes estádios do ciclo estral, demonstraram que oócitos colhidos nos dias 14 a 16 do ciclo apresentavam melhores índices de competência para o desenvolvimento até balstocisto quando comparados aos aspirados nos dias 7, 8 e 9. Em outro estudo, oócitos colhidos de folículos subordinados nos dias 2, 3 e principalmente no dia 7 da onda, demonstram menor competência que aqueles recuperados no dia 5 (VASSENA, 2003). HAGEMAN (1999), MACHATKOVA et al. (2000), concluem que o desenvolvimento até balstocisto é significativamente maior em oócitos colhidos durante a fase de crescimento folicular comparado à fase de dominância independente do diâmetro do folículo, porém a competência oocitária tendeu a aumentar em oócitos oriundos de folículos maiores.
CASTILHO; GARCIA (2003), estudando a fase da 1ª onda e o diâmetro folicular sobre a competência oocitária em Nelore observaram que não houve efeito do diâmetro folicular sobre a produção de balstocistos, mas houve interação do diâmetro com a fase folicular e concluíram que a competência é melhor nos folículos pequenos no início da onda e melhora nos folículos maiores com o avanço da onda. O mesmo foi observado por MACHATKOVA et al. (2004) emBos
III. MATERIAL E MÉTODOS
Local do Experimento
Os experimentos para colheita de material (oócitos e embriões) foram desenvolvidos na Agropecuária J. Garcia localizada no município de Regente Feijó – SP e Fazenda Experimental da Unoeste localizada no município de Presidente Bernardes – SP. Posteriormente os oócitos foram enviados ao Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal – SP, para produção in vitro (PIV) dos embriões.
Animais
Foram utilizadas 23 fêmeas adultas da raça Nelore (Bos taurus indicus), com idade entre quatro a nove anos, pesando em média 500 Kg. As fêmeas, em perfeitas condições sanitárias e reprodutivas foram mantidas em pasto deBrachiaria decumbens, com acesso a água e sal mineralAd libitum.
Tratamentos
As fêmeas foram submetidas a uma aspiração folicular – aspiração folicular referência (OPU 1) em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante de liberação lenta de progestágeno (Crestar® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda). Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se o tratamento de supererovulação ovariana (SOV) utilizando-se FSH (Folltropin® Vetrepharm Inc. Ontário, Canadá) na dose total de 180 mg por vaca, com duração de quatro dias consecutivos, em oito aplicações (quadro 1). Durante a sexta e sétima aplicação de FSH foi administrada por via IM 500µg de PGF2α(Preloban® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda) e o implante de
progestágeno foi retirado durante a administração da sétima dose de FSH.
xxvii Horário Dia 1 (FSH) (FSH)Dia 2 (FSH/ PGFDia 3 2α) Dias4 (FSH/ PGF2α) 7:00 h 40mg 20mg 20mg 10mg + 500 µg 19:00 h 40mg 20mg 20mg + 500µg 10mg
Aproximadamente 12 horas após o término da SOV, as fêmeas receberam 25mg de LH exógeno (Lutropin-V® Vetrepharm, Beleville, Ontário, Canadá) para causar ovulação e realizar a IA com tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas, sendo que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH, utilizando sêmen congelado da raça nelore em palhetas de 0,5 mL, descongelado de acordo com o critério indicado pelas centrais (36°C por 30’).
No dia da colheita dos embriões as fêmeas foram divididas em seis tratamentos que variaram de acordo com o momento da aplicação de PGF2αapós a colheita de embrião (Dia 0) e a aspiração folicular (OPU2) realizada após a SOV (figura 1). Os tratamentos realizados foram:
T (0-144) – aplicação de PGF2á imediatamente após a colheita de embriões e aspiração 144 horas após a administração de PGF2á;
T (48-120) – aplicação de PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 120 horas após a administração de PGF2á;
T (48-96) – aplicação de PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a administração de PGF2á;
T (72-96) – aplicação de PGF2á 72 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a administração de PGF2á;
T (96-72) – aplicação de PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 72 horas após a administração de PGF2á;
T (96-48) – aplicação de PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 48 horas após a administração de PGF2á
A PGF2α foi administrada em diferentes momentos para avaliar se haveria efeito da fase da primeira onda folicular na segunda aspiração folicular (OPU 2) e avaliar se esta segunda aspiração seria afetada pela prévia superovulação.
Tratamento – T(0-144) (n=4) 144 horas Dia 0 OPU 2 PGF2á Tratamento – T(48-120) (n=5) 48 horas 120 horas
Dia 0 PGF2á OPU 2 Tratamento – T(48-96) (n=4) 48 horas 96 horas Dia 0 PGF2á OPU 2 Tratamento – T(72-96) (n=3) 72 horas 96 horas Dia 0 PGF2á OPU 2 Tratamento – T(96-72) (n=4) 96 horas 72 horas Dia 0 PGF2á OPU 2 Tratamento – T(96-48) (n=3) 96 horas 48 horas Dia 0 PGF2á OPU 2
Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados após a colheita de
embriões em 23 fêmeas nelore.
D 0 – dia da colheita dos embriões/ n – número de animais
Aspiração Folicular
O procedimento de aspiração folicular foi realizado utilizando-se equipamento de ultra-som Aloka SSD-500 com transdutor microconvexo de 5 mHz (UST 974-5) conectado a guia de biópsia adaptado por Chuck Bolland, com agulhas 18 G, (Cook VBOAS 1855) e linha de aspiração (Cook VBOA 18L) em tubos de centrífuga de 50 mL. A pressão de vácuo foi obtida com uma bomba Cook V-MAR 5000, ajustada entre 72 e 78 mmHg.
Para evitar movimentos peristálticos e desconforto ao animal foi feita anestesia epidural com 5 mL de Lidocaína a 2% (Pearson®) e em seguida o transdutor foi inserido até o fundo vaginal e, com o auxílio da manipulação transretal, os ovários foram
posicionados para obtenção de uma boa visualização na tela do ultra-som. Os folículos a serem aspirados foram posicionados no percurso da linha de punção indicada na tela do
xxix ultra-som e quando a agulha se aproximou do folículo a ser aspirado, o pedal da bomba de vácuo foi pressionado e o folículo aspirado (NIBART et al., 1995), o mesmo procedimento foi repetido em todos os folículos visíveis de cada ovário. A lavagem da agulha e o meio de recebimento dos oócitos foi composto de DPBS (Dulbeco Modificado - Nutricell) acrescido de 5,0 UI/mL de heparina sódica (Liquemine) e 50 mg/mL de Gentamicina (Gentocin).
Lavagem, seleção dos oócitos
O material aspirado foi transferido para o filtro de colheita de embriões (EmCom®) e lavado com a mesma solução utilizada na aspiração. O sedimento restante no filtro foi observado em placas dePetri e efetuado a busca e contagem dos oócitos e posterior classificação da qualidade. Os oócitos foram classificados de acordo com sua morfologia (número de camadas de células do cumullus e aspecto do citoplasma) em graus I, II e III (GI, GII e GIII), oócitos sem cumullus (s/c), expandidos (exp), degenerados (deg) e atrésicos (atr), segundo LONERGAN (1992). Os oócitos considerados viáveis foram classificados como GI, GII e GIII, lavados em solução TCM 199 Hepes (Gibco) suplementado com 10% SFB (Gibco), 50 µg de gentamicina, 2,2 µg de piruvato e transportados em criotubos (Corning®) contendo meio de maturação em banho Maria a 35°C.
Transporte dos oócitos
Os oócitos foram transportados em meio de maturação composto por meio TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI de hCG/mL, 0,5µg/mL de FSH, 1µg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL de amicacina em atmosfera de 5% de CO2e 5% de O2. O tempo médio de transporte variou de 6 a
8 horas, não ultrapassando 8 horas do início da aspiração na primeira vaca até a chegada dos oócitos ao laboratório.
Maturação in vitro (MIV)
Chegando no laboratório os oócitos foram lavados três vezes em meio de lavagem TCM-199 Hepes, suplementado com 10% de SFB e 70µg de amicacina. Em seguida, foram transferidos para placas dePetri, em microgotas de 100µL de meio de maturação,
que consistiu de meio TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI de hCG/mL, 0,5µg/mL de FSH, 1µg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL de amicacina. Os oócitos permaneceram incubados por 24 horas a 38,5°C em atmosfera de 5% de CO2em ar.
Fecundação in vitro (FIV)
Os oócitos maturados foram lavados três vezes em meio de fecundação TALP-FIV e transferidos para microgotas de 100µL de meio de fecundação Tyrode modificado (TALP) suplementado com 10µg/mL de heparina e 160 µL da solução PHE. O sêmen congelado foi separado em Gradiente de Percoll 90 e 45%, submetido a uma força de centrifugação de 900g durante 30 minutos. O sedimento foi recuperado e avaliado quanto ao volume, concentração e motilidade espermática. A concentração final foi ajustada para 25 x 106 espermatozóides vivos por mL, de modo que, ao adicionar 4µL do sêmen em cada microgota de 100µL de meio TALP-FIV-Gotas, obteve-se a concentração final de 100x103 espermatozóides vivos por gota. Posteriormente, foram incubados em temperatura de 39°C por 18 a 20 horas, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, para a
fecundação.
Cultivo in vitro (CIV)
Após o tempo de fecundação, os zigotos foram lavados por três vezes em meio SOF e as estruturas transferidas para microgotas com 100 µL de meio de cultivo, recobertas por óleo mineral, permanecendo nestas por um período de 6 a 8 dias até os zigotos atingirem os estádios de mórula (Mo) e blastocisto (Bl). O meio de cultivo foi renovado em cada
microgota no terceiro e quinto dia (feeding) e no 6º e 7º dia foi observado o desenvolvimento embrionário.
Colheita de embriões
Sete dias após a primeira IA, os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgico como descrito por NEWCOMB et al. (1978), utilizando-se Solução Salina Fosfatada Tamponada (DPBS – Dulbecco Modificado-Cutilab), contendo 1% de Soro Fetal Bovino
xxxi (SFB), ou seja, 10 mL de SFB em 1 litro de DPBS, ambos a 37°C e recuperados em filtro próprio (EmCom).
Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE
Os embriões foram rastreados e transferidos para Placa dePetri contendo DPBS enriquecido com 10% de SFB. Posteriormente foi avaliado o estádio de desenvolvimento do embrião (mórula, blastocisto, blastocisto em expansão e balstocisto eclodido)
(LINDNER & WRIGHT-JR, 1983). Quanto ao formato e integridade da zona pelúcida e a morfologia foram classificados em normais, degenerados, não fertilizados e sem zona pelúcida (BOLAND et al., 1978).
Análise Estatística
Os dados referentes à aspiração folicular realizada após a superovulação (OPU 2) foram avaliados pelo teste do Qui-Quadrado. Para verificar se houve diferença com relação aos resultados da OPU 2 quando comparamos com os resultados da OPU 1 (referência), utilizou-se um delineamento inteiramente casualizado
utilizando o procedimento GLM (General Linear Model) no software Statystical Analysis System (SAS), seguido pelo teste de Duncan para estabelecer a comparação entre médias. Neste caso, as variáveis analisadas (percentual de oócitos viáveis e a taxa de blastocistos) foram obtidas a partir das diferenças com relação aos resultados da OPU 2 quando comparados com os resultados da OPU 1 (referência).
IV. RESULTADOS
A aspiração folicular referência (OPU 1), em 23 vacas da raça Nelore, foi realizada em 6 sessões de aspiração resultando na recuperação de 299 oócitos (média de 13 por animal), dos quais 223 (74,5%), uma média de 9,6 por animal, foram submetidos a maturação e fecundação in vitro produzindo 44 blastocistos (19,7%), uma média de 1,9 por animal. Embora a OPU 1 tenha sido realizada em fase aleatória do CE os dados foram agrupados por tratamento, pois a aspiração referência (OPU 1) e OPU 2 foi realizada nos mesmos animais para avaliar a resposta destes mesmos indivéduos aspirados em fase aleatória e posteriormente em tempo determinado. Portanto quando os animais foram agrupados por tratamentos, o percentual de oócitos viáveis variou de 61,5 a 88,9%, sendo em média 74,5%, enquanto o desenvolvimento dos oócitos maturados até blastocisto variou de 1,9 a 54,2%, sendo em média 19,7% (Tabela 1).
Tabela 1. Número de animais aspirados, total de oócitos recuperados, número e
percentual de oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos em fase aleatória do ciclo estral na aspiração referência (OPU 1) de 23 vacas da raça nelore agrupadas em 6 sessões de acordo com o tratamento da OPU 2.
Número de oócitos Blastocistos Sessões OPU n ode animais Total Viáveis (%) no % 1ª T (0 – 144) 4 38 29 (76,3) 9 31,0 2ª T (48 – 120) 5 61 53 (86,9) 1 1,9 3ª T (48 – 96) 4 52 32 (61,5) 6 18,8 4ª T (72 – 96) 3 34 23 (67,6) 4 17,4 5ª T (97 – 72) 4 87 62 (71,3) 11 17,7 6ª T (96 – 48) 3 27 24 (88,9) 13 54,2 Total 23 299 223 (74,5) 44 19,7%
Resultados da produçãoin vitro das sessões de aspiração folicular realizadas em fase aleatória do ciclo estral na aspiração referência (OPU 1), agrupadas conforme os tratamentos da OPU 2: T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-96), T (96-72), T (96-48).
xxxiii Após a aspiração folicular referência (OPU 1) as mesmas fêmeas foram superovuladas para colheita in vivo de embriões e aspiradas novamente (OPU 2) em diferentes momentos da 1º onda folicular após a superovulação (Tabela 2). Do total de 252 oócitos recuperados (média de 10,9 por animal), 73,8% ou 186 (média de 8,1 por animal) foram classificados morfologicamente como viáveis e submetidos à maturação e fecundação in vitro, resultando em 17,2% ou 32 blastocistos (média de 1,4 por animal).
O número de oócitos recuperados e produção de blastocistos (total e percentual) foram afetados (P<0,05) pelo momento da aplicação de PGF2α e a segunda aspiração folicular (OPU 2) e podem ser observados na tabela 2.
Tabela 2. Número de animais, total de oócitos aspirados, número e percentual de
oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos de vacas da raça nelore aspiradas em diferentes momentos da 1ª onda folicular após a superovulação (OPU 2) nos tratamentos T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-96), T (96-72) e T (96-48).
Número de oócitos Blastocistos Tratamento no de animais Total Viáveis (%) no % T (0 – 144) 4 41 29 (70,7) b 14 48,3 a T (48 – 120) 5 58 52 (89,7) a 6 11,5 b T (48 – 96) 4 61 41 (67,2) bc 6 14,6 b T (72 – 96) 3 21 17 (81,0) ab 2 11,8 b T (96 – 72) 3 56 42 (75,0) ab 3 7,1 b T (96 – 48) 4 15 05 (33,3) c 1 20,0 ab Total 23 252 186 (73,8%) 32 17,2%
Letras diferentes diferem entre si dentro da coluna (p<0,05). Tratamentos:
T (0-144) – PGF2á imediatamente após a colheita de embriões, aspiração 144 horas após a injeção de PGF2á T (48-120) – PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 120 horas após a injeção de PGF2á T (48-96) – PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a injeção de PGF2á T (72-96) – PGF2á 72 horas após a colheita de embriões e aspiração 96 horas após a injeção de PGF2á T (96-72) – PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 72 horas após a injeção de PGF2á T (96-48) - PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 48 horas após a injeção de PGF2á
O percentual de oócitos viáveis foi menor (P<0,05) no T (96-48) (33,3%), quando a PGF2α foi aplicada 96 horas depois da colheita de embriões e 48 horas após foi realizada a OPU 2, comparando aos demais tratamentos. No tratamento T (48-120), a PGF2á foi administrada 48 horas após a colheita de embriões e 120 horas após foi realizada a OPU 2 e obteve-se o maior percentual de oócitos viáveis entre os tratamentos (89,7%), diferindo dos tratamentos T (0-144), T (48-96) e T (96-48) que obtiveram 70,7%, 67,2% e 33,3%, respectivamente. Os tratamentos T (72-96) e T (96-72) não diferiram entre si (P<0,05) do tratamento T (48-120) quanto ao número de oócitos viáveis.
Com relação à taxa de embriões produzidos in vitro, o melhor tratamento observado foi o T (0-144) com 48,3% de blastocisto, que diferiu dos tratamentos T (48-120), T (48-96), T (72-96) e T (96-72) e não diferiu (P<0,05) do T (96-48). (Tabela 2)
Uma vez que os animais foram submetidos a duas aspirações foliculares com um tratamento superovulatório intermediário foi estabelecida uma comparação da produção in vitro entre a OPU 1 (referência) e OPU 2 como demonstra a tabela 3, onde observa-se que a produção de embriões no T (96-48) foi significativamente menor (p<0,05) quando comparada aos demais tratamentos, os quais não deferiram entre si (p>0,05).
xxxv
Tabela 3. Comparação entre médias dos resultados de número de oócitos viáveis
e taxa de blastocisto obtidos na OPU 2 e comparadas aos resultados da OPU 1 (referência) em 23 vacas da raça nelore aspiradas em fase aleatória do ciclo estral ou agrupadas em diferentes tratamentos.
Diferenças entre OPU 1 e OPU 2* Tratamentos Oócitos viáveis
Diferença (%) BlastocistosNS Diferença (%) T (0-144) -6,08 a 17,42 T (48-120) 8,34 a 0,66 T (48-96) -4,93 a 12,13 T (72-96) 8,77 a 6,3 T (96-72) -11,98 a -10,63 T (96-48) -61,1b -34,97
Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Duncan (p<0,05).
NS –não significativo (p>0,05). * diferenças entre os resultados (percentual de oócitos viáveis e a taxa de blastocistos) da OPU 2 comparada a OPU 1 (referência) para estabelecer a comparação entre médias.
O gráfico 1 demonstra o percentual de oócitos viáveis e balstocistos obtidos na aspiração referência (OPU 1) e na aspiração folicular realizada em diferentes momentos da primeira onda folicular após a superovulação.
OPU1 e OPU2 - % oócitos e Bl 76,3 86,9 61,5 67,6 88,9 71,3 70,7 89,7 67,2 81 33,3 75 31 1,9 18,8 17,4 54,2 17,7 48,3 11,5 14,6 11,8 20 7,1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 - 144 48 - 120 48 - 96 72 - 96 96 - 48 96 - 72 Tratamentos % oó ci to s vi áv ie s/ % B l
% oócitos viáveis - OPU 1 % oócitos viáveis - OPU 2 % Bl viáveis - OPU 1 % Bl viáveis - OPU 2
Gráfico1. Resultado da % média de oócitos viáveis recuperados e taxa de
blastocistos obtidos de oócitos aspirados em fase aleatória do ciclo estral na aspiração referência (OPU 1) e em diferentes momentos da primeira onda folicular após o tratamento superovulatório (OPU 2), realizado em 23 fêmeas da raça nelore, agrupadas nos tratamentos T(0-144), T (48-120), T(48-96), T(72-96), T(96-72) e T (96-48), de acordo com o tempo de administração de PGF2á após a colheita de embriões e o momento da segunda aspiração após a SOV (OPU 2).
A produção in vivo de embriões (TE) nas 23 vacas da raça Nelore resultou em 72 embriões (3,1 por animal), dos quais 73,6% ou 53 (2,3 por animal) foram
xxxvii classificados morfologicamente como viáveis e 26,3% ou 19 (3,1 por animal) foram classificados como não viáveis (Tabela 4).
Tabela 4. Número de animais, número e média total de embriões recuperados,
número de embriões não viáveis, número, média e percentual de embriões viáveis produzidosin vivo.
Produção de embriões in vivo Sessões n Total e
média viáveisNão e médiaViáveis % Viáveis
1ª T (0 – 144) 4 17 (4,2) 1 16 (4,0) 94,1 2ª T ( 48 – 120) 5 7 (1,4) 6 1 (0,2) 14,3 3ª T (48 – 96) 4 12 (3,0) 1 11 (2,7) 91,7 4ª T (72 – 96) 3 1 (0,3) 1 0 (0,0) 0,0 5ª T 96 – 72) 4 19 (4,7) 7 12 (3,0) 63,2 6ª T (96 – 48) 3 16 (5,3) 3 13 (4,3) 81,3 Total 23 72 (3,1) 19 (26,3%) 53 (2,3) 73,6%
Produçãoin vivo de embriões realizada após a aspiração referência (OPU 1) e que precedeu a OPU 2.
V. DISCUSSÃO
No presente estudo com vacas da raça nelore a aspiração referência (OPU 1) realizada em fase aleatória do CE resultou em uma média 9,6 oócitos viáveis e na OPU 2 a média, independente do tratamento, foi de 8,1 oócitos. Quando os
animais foram agrupados por tratamentos o percentual de oócitos viáveis variou de 33,3% no T (96-48) a 89,7% no T (48-120).
Essas médias obtidas são semelhantes as taxas de recuperação de oócitos observadas por CASTILHO, (2003), SENEDA, et al., (2001) e DAYAN et al., (2000), 9,0, 9,2 e 9,7, respectivamente.
Com relação à taxa de blastocistos, na OPU 2, embora não houve diferença significativa, os tratamentos que resultaram em maior taxa de desenvolvimento embrionária foram o T (0 – 144) com 48,3% e T (48-120) com 11,5 % dos oócitos maturados e fecundados atingindo o estágio de blastocisto. O desenvolvimento embrionário em todos os tratamentos da OPU 2 variou de 7,1% a 48,3% e na OPU 1, excluindo o valor de 1,9%, variou de 17,4% a 54,2% e ampla variação também foi observada por KRUIP et al. (1994), 9 a 26% e HASLER et al. (1995), 4% a 33% e DAYAN et al. (2000a), 14 e 54%.
Na produção in vivo de embriões, iniciada 48 a 60 horas após a OPU em fase aleatória do CE, obtivemos uma média de 2,3 embriões por animal, que não diferiu da média nacional nas doadoras zebuínas observada por BECKER et al. e RODRIGUES et al., (1988), ALVIM et al., 2000; ANDRADE et al., 2000; FONSECA et al., 2000; NOGUEIRA et al., 2000; PENNA et al., 2000; PINTO et al., 2000) que variou de 2,4 a 9,9 embriões. GRADELA et al. (2000), também não observaram aumento de estruturas quando realizaram a SOV na ausência do FD, embora houve melhora na viabilidade embrionária.
Quando analisamos por tratamentos obtivemos as melhores médias de embriões produzidos in vivo nos tratamentos T (0-144) e T (96-48), 4,0 e 4,3, as taxas intermediárias nos tratamentos T (48-96) e T (96-72), 2,7 e 3,0 e ausência de produção nos tratamentos T (48-120) e T (72-96) que de acordo com GALLI (2003) confirmam a baixa consistência na produção in vivo de embriões, sendo que um terço das doadoras tratadas não respondem a SOV, um terço produz em média 3 embriões e somente o terço restante resulta em grande número de embriões transferidos.
Quando comparamos os tratamentos realizados na OPU 2, observou-se que a recuperação no T(96-48), 5 oócitos (33,3%), foi significativamente menor
xxxix que os demais tratamentos, demonstrando que o momento da aspiração folicular muito próxima a administração de PGF2α apenas 48 horas prejudicou a recuperação dos oócitos. È importante ressaltar que a resposta a superovulação desses animais foi boa e a presença de muitos CLs nos ovários pode ter dificultado a recuperação dos oócitos na OPU 2, reforçando o fato que a aspiração realizada muito próxima a administração de PGF2α pode prejudicar a posterior recuperação de oócitos. Por outro lado podemos observar que nos tratamentos em que a aspiração folicular foi realizada a partir de 96 horas da aplicação de PGF2á as taxas de oócitos não variaram, demonstrando que a recuperação e a produçãoin vitro após a SOV é possível sem prejudicar os índices de produção.
Além da possibilidade da diminuição da recuperação dos oócitos em função da presença de vários CLs nos ovários , outro fator que pode ter afetado diretamente essa recuperação é a ausência da emergência da onda folicular até 48 horas após a colheita de embriões. Segundo ADAMS et. al (1992), FORTUNE et al. (1993), GIBONS, GINTHER (1999), em torno de 24 a 36 horas após a ovulação ocorre o crescimento de um grupo de folículos que é caracterizado como a emergência da onda folicular no CE normal. No entanto, não existe na literatura trabalhos que demonstrem o tempo de emergência da onda folicular após superovulação, mas no presente trabalho podemos afirmar que até 48 horas após a PGF2á não houve emergência da onda folicular e esta provavelmente ocorre mais tarde em animais superovulados, pois acima de 72 horas observamos aumento no percentual de oócitos recuperados e acima de 96 horas não houve comprometimento da taxa de oócitos recuperados e produção de blastocistos.
É importante ressaltar que assim como no T (0-144) obteve-se a maior taxa de blastocistos produzidosin vitro, também observou-se maior taxa de blastocistos produzidos in vivo, demonstrando que a SOV além de não ter prejudicado a recuperação na OPU 2, ainda gerou bom índice na produção de embriõesin vivo.
Os resultados de recuperação de oócitos e taxa de balstocistos das aspirações não variaram significativamente entre a OPU 1 e OPU 2, concluindo que é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar os índices
de produção, desde que a OPU ocorra após a lise dos CLs presentes nos ovários após a superestimulação.
VI. CONCLUSÃO
- a aspiração folicular realizada muito próxima à colheita de embriões diminui significativamente a recuperação de oócitos;
- a superovulação realizada a partir de 96 horas após a aplicação de PGF2α em animais previamente superovulados para colheita de embriõesin vivo não afeta a recuperação de oócitos e a produçãoin vitro de blasctocistos;
- é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar significativamente os índices de produção.
xli
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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