QUANTA Lite®
β
2
GPI IgG ELISA
708665
Para utilização em diagnóstico In Vitro
Complexidade CLIA: Elevada
Aplicação Diagnóstica
O QUANTA Lite® β2 GPI IgG é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos β2
GPI IgG no soro humano. A presença de anticorpos anti β2 GPI IgG pode ser utilizada em conjunto com a história clínica
do doente e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de determinados distúrbios trombóticos auto-imunes, como os que acompanham o Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) ou outras doenças trombóticas semelhantes ao lúpus.
Resumo e Explicação do teste
Os anticorpos anticardiolipina (ACA) têm sido fortemente associados a tromboses venosas e arteriais.1-5 Estas descobertas foram primeiro observadas durante estudos sobre o Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE), uma doença em que um dos muitos sintomas é a trombose.6,7 Estudos recentes8-12 demonstraram que um cofactor do soro de 50kD é necessário para que os anticorpos cardiolipina, induzidos nos doentes com SLE, liguem à cardiolipina que se encontra a revestir as placas de plástico. Este cofactor foi identificado como sendo β2-glicoproteína I, também designada por
apolipoproteína H.8,12,13,14 Enquanto que o β2 GPI é conhecido como um inibidor in vitro do processo intrínseco da
coagulação do sangue,15 da agregação ADP-dependente,16 e da actividade da protombinase das plaquetas activadas,17 a sua função fisiológica ainda é pouco clara. Demonstrou-se que os anticorpos anticardiolipina de doentes com síndroma anti-fosfolipídico (APS) reconhecem uma estrutura modificada de β2 GPI e não cardiolipina, β2 GPI nativa ou
um epítopo estruturalmente definido por ambos, cardiolipina e β2 GPI.8-12
Galli et al.9 e Viard, et al.18 reportaram individualmente que os anticorpos anticardiolipina obtidos de doentes auto-imunes (p.ex. com SLE e/ou APS) eram direccionados para a molécula β2 GPI que reveste as placas de polistireno.
Koike11 e Matsuura12 demonstraram de forma conclusiva que o β2 GPI é de facto o antigénio ao qual muitos anticorpos
anticardiolipina se ligam realmente e, além disso, demonstraram que o fosfolípido serve apenas para ligar a β2 GPI à
fase sólida.
Existe também um potencial bem conhecido, dos testes tradicionais de anticardiolipina produzirem resultados falsos positivos, devido a reactividade cruzada dos fosfolípidos com determinadas doenças infecciosas, principalmente a sífilis, e também com outros auto-anticorpos, tais como DNA de cadeia dupla.2,3 Ao eliminar os fosfolípidos da fase sólida e utilizando apenas β2 GPI, o teste torna-se ainda mais específico para a detecção de potenciais problemas de
coagulação. Esta especificidade acrescida foi demonstrada de forma conclusiva por vários grupos.11,12,16,17,19,20,21,22 O teste de autoanticorpos β2 GPI é um ensaio útil e mais específico para ser utilizado em conjunto com os testes de
anticorpos anticardiolipina e de anticoagulante lúpico tradicionalmente utilizados para ajudar no diagnóstico de trombose nos doentes de risco.
Foram encontrados anticorpos β2 GPI da classe IgG em 17 de 47 doentes com SLE (36%).18 Nove destes 47 doentes
com SLE tiveram tromboses e 8 deles (89%) tinham anticorpos β2 GPI. Hisham, et al.20 encontraram anticorpos β2 GPI
da classe IgG em todos os 5 doentes (100%), com pelo menos 2 manifestações de APS clinicamente documentadas. Estes 5 doentes apresentavam níveis elevados de anticorpos β2 GPI. Oito de 14 doentes (57%), apresentando níveis
baixos de anticorpos β2 GPI, tinham tido pelo menos 1 episódio trombótico.
Tsutsumi, et al.22 detectaram anticorpos IgG e IgM anti β2 GPI em, respectivamente, 10,1% e 5,8% dos 308 doentes
japoneses com SLE, seleccionados aleatoriamente. Os anticorpos β2 GPI IgG eram mais frequentes nos doentes com
uma história de episódios trombóticos. Este grupo também verificou que, entre 15 doentes com perda fetal repetida, 20% eram β2 GPI IgG positivos. Também demonstraram que os doentes com uma história trombótica eram mais
susceptíveis de serem positivos para β2 GPI IgM, e que os níveis de β2 GPI IgM eram mais elevados no grupo com
tromboses do que no grupo sem tromboses. Dos 15 doentes sem uma história de perda fetal, nenhum apresentava β2
GPI IgM positivo.
Cabiedes, et al.23 estudaram 94 doentes com SLE, dos quais 39 apresentaram manifestações clínicas de APS. A associação das manifestações clínicas de APS, estava mais fortemente ligada aos anticorpos β2 GPI do que ao
resultado positivo dos testes ACA convencionais. Os anticorpos β2 GPI IgG estavam presentes no soro de 16 de 18
doentes (89%) com APS. De 22 doentes com ACA positivo, no entanto sem manifestação clínica de APS, nenhum era positivo para o β2 GPI.
Cerrato, et al.24 encontraram IgG anti-β2 GPI em 87,5% de um grupo de 32 doentes com episódios trombóticos (APS).
Foram encontradas IgM Anti-β2 GPI em 71,9% do mesmo grupo de 32 doentes.
Sebastiani, et al.25 detectaram IgG anti-β2 GPI em 110 doentes (20,3%) e IgM em 109 doentes (20,1%) de um total de
542 doentes com SLE. A presença de anti-β2 GPI estava fortemente associada aos ACA (p < 10-5). Além disso,
também demonstraram que os anticorpos β2 GPI IgG e IgM estavam associados tanto a tromboses arteriais como
venosas.
Princípio do Método
Os poços da microplaca de polistireno são revestidos com antigénio β2 GPI purificado, sob condições que vão preservar
o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos β2 GPI IgG presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não
ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços dos doentes com a curva de calibração com cinco pontos de referência. O padrão utilizado para construir esta curva baseia-se nos calibradores de referência para a IgG β2-glicoproteína I, disponíveis através do Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's
Hospital and Medical Center.26 Os resultados são apresentados semi-quantitativamente em unidades padrão IgG anti-β2
Reagentes
1. Placa ELISA de micropoços de polistireno revestidos com antigénios purificados de β2 GPI (12-1 x 8 poços)
com suporte em embalagem de protecção com dessecantes
2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem IgG anticorpos humanos anti β2 GPI, pré-diluído, 1,2 ml
3. Controlo β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com anticorpos
anti β2 GPI, pré-diluído, 1,2 ml
4. Calibrador A - β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com
anticorpos anti β2, pré-diluído, 1,2 ml
5. Calibrador B - β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com
anticorpos anti β2, pré-diluído, 1,2 ml
6. Calibrador C - β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com
anticorpos anti β2, pré-diluído, 1,2 ml
7. Calibrador D - β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com
anticorpos anti β2, pré-diluído, 1,2 ml
8. Calibrador E - β2 GPI IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano IgG com
anticorpos anti β2, pré-diluído, 1,2 ml
9. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml
10. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método.
11. Conjugado β2 HRP IgG, (de cabra), anti-humano, 1 frasco – de cor azul com solução tampão, estabilizadores
proteicos e conservante, 10 ml
12. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml
13. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344M, 1 frasco – incolor
Advertências
1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia.
2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo β2 GPI IgG ELISA, os Calibradores β2 GPI IgG ELISA e o Controlo negativo
ELISA devem ser manipulados como sendo material potencialmente infeccioso.27
3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em
grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas.
5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. De modo a evitar lesões, evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos.
6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas.
7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes.
8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos.
Precauções
1. Utilizar somente para diagnóstico “In Vitro”.
2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes.
3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a remoção insuficiente dos líquidos nos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo.
4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis.
5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis.
6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado.
7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados.
8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências.
Precauções particulares de conservação
1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo.
2. As tiras dos micropoços que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora com dessecante e conservadas a 2-8º C.
3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C.
Colheita da amostra
Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados.
Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da CLSI (Previamente NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8 ºC. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a –20 ºC ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas.
Procedimento
Material fornecido
1 Placa de micropoços β2 GPI ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte
1 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Controlo β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Calibrador A - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Calibrador B - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Calibrador C - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Calibrador D - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Calibrador E - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído
1 50 ml Diluente da amostra HRP
1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40 x concentrado
1 10 ml Conjugado β2 HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana
1 10 ml Cromogénio TMB
1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M
Material adicional necessário mas não fornecido
Micropipetas de 5, 100, 200-300 e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas
Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada
Recipiente de 1 l para solução de lavagem HRP diluída
Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda)
Método
Antes de iniciar
1.
Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26º C) e ser bem
misturados.
2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C.
3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO
DILUIR os Calibradores β2 GPI IgG ELISA, o Controlo β2 GPI IgG ELISA ou o Controlo negativo ELISA.
4.
A determinação da presença ou ausência de anticorpos β2 requer o uso de dois poços para cada um doscalibradores e controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado.
5.
Preparação da curva padrão: Para os pontos A a E da curva padrão de 5 pontos, utilizar os calibradorespré-diluídos β2 GPI IgG ELISA de A a E directamente do frasco. A curva padrão de 5 pontos apresenta os
seguintes valores:
Ponto Unidades padrão IgG β2 GPI (SGU)
A Calibrador A - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído 150,0
B Calibrador B - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído 75,0
C Calibrador C - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído 37,5
D Calibrador D - β2 GPI IgG ELISA, pré-diluído 18,8 ou 18,75
Técnica
1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água.
2. Adicione 100 µl de cada um dos cinco Calibradores, as amostras de doentes diluídas, o Controlo Negativo ELISA e o Controlo β2 GPI IgG ELISA aos poços.
NOTA: Tanto o controlo β2 GPI IgG ELISA como o controlo negativo ELISA estão pré-diluídos e prontos a usar.
O valor e o intervalo aceitável do Controlo β2 GPI IgG ELISA estão impressos no rótulo do frasco. Se o valor
obtido para o Controlo se encontrar fora do intervalo aceitável impresso no rótulo, repita o ensaio.
3. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra.
4. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione 200-300 µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras.
5. Adicione 100 μL do Conjugado β2 HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando
condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA
DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços
durante 30 minutos, como descrito no ponto 3. 6. Lavagem: Repita o ponto 4.
7. Adicione 100 µL do Cromogénio TMB em cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente.
8. Adicione 100 µL de Solução de paragem HRP em cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços.
9. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm.
Controlo de qualidade
1. Os Calibradores β2 GPI IgG ELISA, o Controlo β2 GPI IgG ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser
processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuaram correctamente.
2. Uma vez que os Calibradores β2 GPI IgG ELISA, o Controlo β2 GPI IgG ELISA e o Controlo Negativo ELISA se
encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras.
3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros soros de controlo adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20º C.
4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Calibrador A β2 GPI IgG ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do
Controlo β2 GPI IgG ELISA pré-diluído que, por sua vez, deve ser superior à absorvância do Controlo
Negativo ELISA pré-diluído.
b. O Calibrador A β2 GPI IgG ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto a
absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ser superior a 0,2.
c. A absorvância do Controlo β2 GPI IgG ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo
Negativo ELISA, ou superior a 0,25.
d. A concentração do Controlo β2 GPI IgG ELISA tem de se encontrar dentro do intervalo de valores
definido no respectivo rótulo.
e. O utilizador deve recorrer ao Documento C24-A2 da CSLI (Previamente NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas.
Cálculo dos resultados
1. Determine o valor médio das leituras efectuadas em duplicado.
2. Faça a curva de calibração, coloque a absorvância média dos calibradores do ensaio IgG contra o log das respectivas concentrações. Desenhe a melhor linha entre os pontos. Pode utilizar, em alternativa, um gráfico log/log. As unidades SGU dos calibradores encontram-se no rótulo do frasco dos calibradores.
3. Determine as concentrações β2 GPI IgG desconhecidas em unidades padrão β2 GPI IgG (SGU) no eixo “X” por
leitura da absorvância correspondente no eixo “Y”. O Calibrador e o Controlo deste dispositivo são referenciados pelos padrões de referência do IgG β2 Glycoprotein I.
4. Valores negativos variam entre 0 e 20 unidades. Os valores positivos são superiores a 20 SGU. Em seguida encontra-se um exemplo de uma curva padrão típica.
Padrão DO média CV Concentração
A 1,620 0,2% 150 SGU
B 0,998 0,3% 75 SGU
C 0,504 3,1% 37,5 SGU
D 0,250 4,8% 18,75 SGU
Interpretação dos resultados
O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência com base nas suas técnicas, controlos, equipamento e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos anti β2 GPI IgG e sugere a possibilidade de
determinados distúrbios trombóticos auto-imunes, como os associados ao Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) ou outras doenças trombóticas semelhantes ao lúpus.
2. Um resultado negativo indica ausência de anticorpos β2 GPI IgG ou níveis abaixo do limite de detecção do
ponto de decisão do teste.
3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: “Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite® β2 GPI IgG ELISA. Os valores β2 GPI IgG
obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final”.
Limitações do método
1. O significado clínico dos anticorpos β2 GPI noutras doenças além do SLE encontra-se em investigação.
2. Quando são encontrados títulos anti-β2 GPI negativos em presença de sinais clínicos indicadores de doença,
devemos efectuar outros testes adicionais, como o anticoagulante lúpico ou anticardiolopina.
3. O diagnóstico não pode ser efectuado apenas com base no valor dos resultados anti-β2 GPI. Estes resultados
devem ser interpretados em conjunto com os sinais clínicos.
4. O tratamento não deve ser iniciado apenas com base num valor positivo de anti-β2 GPI. Indicações clínicas de
suporte devem estar também presentes.
5. É de esperar que algumas amostras possam ser positivas para as anticardiolipinas e, no entanto, negativas para o anti-β2 GPI. O teste anti-β2 GPI é um marcador mais específico de risco trombótico. O teste
anticardiopilina pode produzir resultados falsos positivos devido a reactividade cruzada com dsDNA ou com determinados anticorpos de doenças infecciosas.
6. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro.
Valores esperados
Amostras do grupo de trabalho - 7º Simpósio Internacional sobre Anticorpos Anti-Fosfolípidos –
Nova Orleans
Integrado no 7º encontro sobre anti-fosfolípidos, realizado de 9 a 13 de Outrubro de 1996, foi criado um grupo de trabalho para avaliar o desempenho de diversas pesquisas baseadas em testes anticardiolipina comerciais. O dispositivo QUANTA Lite® β2 GPI IgG ELISA foi testado com estas amostras. O painel incluiu 10 amostras de doentes
com síndroma anti-fosfolípido (APS) documentado, 7 amostras de doentes com doenças infecciosas, tais como sífilis e febre Q, 2 amostras de doentes com doenças reumáticas auto-imunes e 11 amostras normais. As amostras também foram testadas com um ensaio anticardiolipina tradicional. Os resultados encontram-se resumidos em baixo:
Grupo No. No. + No.+
de amostras β2GPI Cardiolipina
APS 10 10 10
Infeccioso 7 0 4
Reumático 2 1 2
Normais 11 0 1
Todos os 10 doentes com APS foram positivos em ambos os ensaios de anticorpos anti cardiolipina e β2 GPI. Dos
outros três grupos de doentes, todas as amostras foram negativas no teste β2 GPI, à excepção de 1 amostra de doença
reumática. Quatro das doenças infecciosas, ambas as doenças reumáticas e 1 das onze normais foram positivas no teste de anticorpos anticardiolipina tradicional.
Características Específicas
Resumo dos Estudos Clínicos
O desempenho do teste QUANTA Lite® β2 GPI IgG ELISA foi avaliado em 1 estudo clínico interno e em 4 estudos
clínicos externos. Os resultados encontram-se listados em baixo:
Grupo de doentes Nº Nº positivo (%)
APS* secundário ao SLE 37 36 (97,2)
APS primário 15 14 (93,3) SLE 34 2 (5,8) Artrite reumatóide 17 0 (0) Polihipergamaglobulinemia 7 0 (0) Infecciosos** 81 0 (0) Normais 256 1 (0,4) *
APS = Síndroma antifosfolípido
**
A maioria destes apresentavam uma serologia de sífilis positiva
Baseado nos resultados dos testes acima indicados, o teste β2 GPI apresenta uma sensibilidade clínica de 96,2% e uma
Sensibilidade e Especificidade Relativa
Concordância com o Ensaio Anticardiolipina
40 soros escolhidos aleatoriamente de amostras submetidas a um importante laboratório de referência para
testes de anticorpos anticardiolipina, foram testados em relação aos anticorpos IgG, tanto para cardiolipina
como para o β
2GPI. Os resultados encontram-se resumidos em baixo:
β
2GPI
+
-
+
5
19
Sensibilidade relativa
20,8%
Cardiolipina
Especificidade
relativa
100,0%
-
0
16
Eficiência relativa
52,5%
Cinco amostras foram positivas e 16 amostras foram negativas em ambos os ensaios. Não houve nenhuma
amostra positiva para o β
2GPI e negativa para os anticorpos cardiolipina. Dezanove amostras foram
positivas para a anticardiolipina e negativas para os anticorpos IgG anti β
2GPI. Neste pequeno estudo de
comparação envolvendo amostras aleatoriamente seleccionadas sem história clínica, a sensibilidade relativa
dos resultados IgG β
2GPI parecem baixos em comparação aos do ensaio IgG anticardiolipina. Isto não é
inesperado. Os ensaios tradicionais anticardiolipina detectam tanto anticorpos anti β
2GPI como anticorpos
que reagem com o próprio fosfolípido. Conforme demonstrado nos dados do grupo de trabalho de Nova
Orleans, acima referido, e também no Resumo dos Estudos Clínicos, o ensaio β
2GPI exibe uma
sensibilidade comparável e uma especificidade mais elevada em comparação com os resultados
anticardiolipina nos doentes com APS documentado.
Precisão e Reprodutibilidade
Os dados da Precisão e Reprodutibilidade foram calculados testando seis vezes, uma amostra negativa, uma amostra fortemente positiva e uma moderadamente positiva, em ensaios realizados de manhã e de tarde em três dias consecutivos. A média da amostra negativa foi de 18,9, da moderadamente positiva foi de 44,3 e da fortemente positiva foi de 82,4. Os resultados dentro do teste e entre testes encontram-se resumidos na tabela em baixo.
Negativa Moderadamente positiva Fortemente positiva
DP CV DP CV DP CV
Total 0,86 4,5% 2,48 5,6% 2,79 3,4%
Dentro do teste 0,75 4,0% 2,34 5,3% 2,66 3,2%
Entre testes 0,82 4,3% 2,41 5,4% 2,87 3,5%
QUANTA Lite® é uma marca registada da
INOVA Diagnostics, Inc.
Referências
1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: 1211-1214, 1983.
2. Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: 193-199, 1984.
3. Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: 1081-1087, 1986.
4. Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: 152-156, 1985.
5. McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: 193-280, 1991.
6. Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: 591-609, 1985.
7. Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: 486-489, 1986. 8. McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc
Natl Acad Sci USA, 87: 4120-4124, 1990.
9. Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma
11. Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: 671-672, 1991. 12. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike.
Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: 3885-3891, 1992.
13. Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β2-glycoprotein I (β2-GPI) by cDNA cloning and inter-species differences of β2-GPI in alternation of
anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: 1217-1221, 1991.
14. Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β2-glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell
system. Clin Exp Immunol, In press.
15. Schousboe, I. β2-glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation
pathway. Blood, 66: 1086-1091, 1985.
16. Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β2-glycoprotein I (apo-H) inhibits the release reaction of human platelets
during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: 109-114, 1987.
17. Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β2-glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: 142-149, 1986.
18. Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β2-glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating
anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: 181-186, 1992.
19. Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β2-glycoprotein I to activated
polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: 305-313, 1995. 20. Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to
β2-glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: 2233-2237, 1995.
21. Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: 1444-1454, 1996. 22. Tsutsumi A, et al. Antibodies to β2-Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus
Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: 1466-1474, 1996.
23. Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol,
22: 1899, 1995.
24. Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516,
1996.
25. Sebastiani, G.D., et al. Anti β2 GPI and aCL in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5:
519, 1996.
26. Erickson, E., S. Najmey, L. Keil, H. EL-Kadi, and V. DeBari. Reference calibrators for IgG antibodies to β2
-glycoprotein I: preparation, properties and availability to investigators. Clinical Chemistry, 42: 1116-1117, 1996. 27. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National
Institute of Health, 2007, Fifth Edition.
