Bruna Lenfers Turnes
PAPEL DO METABOLISMO DA TETRAIDROBIOPTERINA NA FISIOPATOLOGIA DA DOR INFLAMATÓRIA
Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Alexandra Susana Latini
Coorientador: Dr. Nicholas Arthur Andrews
Florianópolis 2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Turnes, Bruna Lenfers
Papel do metabolismo da tetraidrobiopterina na fisiopatologia da dor inflamatória / Bruna Lenfers
Turnes ; orientadora, Alexandra Susana Latini, coorientador, Nicholas Arthur Andrews, 2019.
134 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de
Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2019. Inclui referências.
1. Bioquímica. 2. Nocicepção. 3. Dor. 4. Tetraidrobiopterina. I. Latini, Alexandra Susana.
II. Andrews, Nicholas Arthur. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e ao Universo pela saúde e dedicação para ir em busca dos meus sonhos e objetivos. Agradeço pela vida e pelas pessoas maravilhosas que fazem parte dela.
À minha família, que sempre esteve ao meu lado me oferecendo amor, apoio e incentivo.
À minha orientadora Profa. Dra. Alexandra Latini, pela oportunidade de poder realizar este trabalho e por todos os ensinamentos ao longo dessa jornada. Obrigada pela paciência, generosidade e incentivo.
Ao meu coorientador Prof. Dr. Nick Andrews, pela paciência e pelo auxílio incondicional em todos os momentos durante minhas atividades durante doutorado sanduíche.
A todos os amigos e colegas do Laboratório de Bioenergética e Estresse Oxidativo (LABOX), pela amizade e incentivo.
Ao Dr. Clifford Woolf do Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School, por ter me recebido em seu laboratório e me permitido fazer parte de sua equipe.
Ao Dr. Michael Costigan, pelo auxílio científico para a elaboração deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
A esta universidade, seu corpo docente, corpo técnico, direção е administração que oportunizaram e colaboraram na realização deste trabalho.
Agradeço pela vida de todos os animais utilizados neste trabalho. A CAPES e CNPq pelo auxílio financeiro.
E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte desta conquista, о meu muito obrigado!
“If your dreams don’t scare you, they are not big enough.”
RESUMO
A dor crônica é considerada uma condição debilitante que apresenta um grande impacto socioeconômico e sobre a qualidade de vida na medida em que interfere na homeostase do indivíduo. Além disso, está diretamente relacionada com a patogênese de uma série de doenças crônicas. A BH4 é um cofator enzimático obrigatório para a produção de aminas biogênicas e óxido nítrico e tem suas concentrações fisiológicos regulados pela ação combinada de três vias metabólicas: a síntese de novo, a de reciclagem e as vias de salvação. A relação entre o metabolismo da BH4 e a indução de hipersensibilidade à dor foi descoberta pela primeira vez em humanos através da identificação de um alelo do haplótipo do gene que codifica para a enzima GCH1, a enzima limitante do fluxo metabólico na biossíntese de BH4, sendo associado positivamente com pronunciada redução nos escores de dor clínica. Além disso, a síntese de BH4 aumenta patologicamente em casos de dor neuropática e inflamatória, sendo associada ao aumento da hipersensibilidade nociceptiva, e a inibição da enzima SPR diminui as concentrações de BH4, diminuindo a dor. Este trabalho investigou o envolvimento do metabolismo da BH4 na fisiopatologia de doenças inflamatórias crônicas e hipersensibilidade à dor. Demonstramos aqui que o metabolismo da BH4 se encontra aumentado em modelos experimentais de colite ulcerativa, sendo associados positivamente com hiperalgesia. Ainda, a inibição do aumento patológico da BH4 pela inibição genética ou farmacológica da enzima SPR foi capaz de diminuir proliferação de células T, a indução de colite e a dor dos animais enquanto aumenta o biomarcador sepiapterina. A inibição da BH4 está relacionada com a redução da dor em modelo experimental de artrite, embora não tenhamos identificado efeito anti-inflamatório na fase aguda. As concentrações urinárias de BH4 aumentam significativamente em pacientes com colite ulcerativa e as concentrações plasmáticas de neopterina aumentam significativamente em pacientes com doença hepática descompensada, permitindo estimar a severidade e a progressão da doença por meio desses biomarcadores. Portanto, foi demonstrado o envolvimento do metabolismo da BH4 em casos de doenças inflamatórias crônicas e que a sua inibição está relacionada com a diminuição da hiperalgesia.
Palavras-chave: Dor. Nocicepção. Inflamação. BH4. Neopterina. Sepiapterina.
ABSTRACT
Chronic pain is considered a debilitating condition that presents a devastating socioeconomic impact and influence in quality of life insofar as it interferes in the homeostasis of the individual. In addition, it is directly related to the pathogenesis of a number of chronic diseases. BH4 is a binding enzyme cofactor for the production of biogenic amines and nitric oxide and has its physiological levels regulated by the combined action of three metabolic pathways: de novo, recycling and salvage pathways. The relationship between BH4 metabolism and the induction of pain hypersensitivity was first discovered in humans by identifying a haplotype allele of the gene encoding the enzyme GCH1, the metabolic-flux-limiting enzyme in BH4 biosynthesis, associated positively with marked reduction in clinical pain scores. In addition, the synthesis of BH4 increases pathologically in cases of neuropathic and inflammatory pain, being associated with increased nociceptive hypersensitivity, and inhibition of the SPR enzyme decreases BH4 levels, decreasing pain. This work investigated the involvement of BH4 metabolism in the pathophysiology of chronic inflammatory diseases and pain hypersensitivity. We demonstrate here that the metabolism of BH4 is increased in experimental models of ulcerative colitis, being positively associated with the increase in pain hypersensitivity. Furthermore, inhibition of pathological BH4 increase by the genetic or pharmacological inhibition of SPR enzyme was able to decrease T cell proliferation, induction of colitis and pain in mice while increasing the biomarker sepiapterin. BH4 Inhibition is related to pain reduction in an arthritis experimental model, although it has not shown an effect on inflammation in the acute phase of the model. Urinary levels of BH4 are significantly increased in patients with ulcerative colitis and neopterin plasma levels are significantly increased in patients with decompensated liver disease, allowing the estimation of disease severity and progression through these biomarkers. Therefore, the involvement of BH4 metabolism in cases of chronic inflammatory diseases has been demonstrated and its inhibition is related to decreased pain hypersensitivity.
Keywords: Pain. Nociception. Inflammation. BH4. Neopterin. Sepiapterin.
LISTA DE ABREVIATURAS 5-HIAA: ácido 5-hidroxiindolacético
AACD: L-Aminoácido aromático descarboxilase
AMPA: alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico AP-1: proteína ativadora-1
AR: aldose redutases BH2: 7,8-diidrobiopetrina BH4: tetraidrobiopterina
CAIA: coquetel de anticorpo de colágeno anti-tipo II CR: carbonil redutases
DAI: Índice de Atividade da Doença
DAMPS: padrões moleculares associados a dano DHFR: diidrofolato redutase
DHPR: diidropteridina redutase DHPR: diidropteridina redutase DRG: gânglio da raiz dorsal DSS: sulfato de sódio de dextrana DTE: ditioeritritol
ELISA: ensaio de imunoabsorção enzimática EUA: Estados Unidos da América
EVA: escala visual analógica FDA: Food and Drug Administration GCH1: GTP ciclohidrolase I
GTP: guanosina trifosfato H2O2: peróxido de hidrogênio HPA: Hiperfenilalaninemia
HPLC: cromatografia líquida de alta resolução HU: Hospital Universitário
HVA: ácido homovanílico
IASP: Associação Internacional para o Estudo da Dor IFN-"γ: " interferon-" γ"
IL-1β: interleucina-1β IL-6: interleucina-6
NGF: fator de crescimento do nervo NLRs: receptores do tipo NOD NMDA: N-metil-D-aspartato NOS: óxido nítrico sintase ON: óxido nítrico
PAMPs: padrões moleculares associados a patógenos PCD: pterina-4α-carbinolamina
PRRs: receptores de reconhecimento de padrões PTP: 6-piruvoil tetraidrobiopterina
PTPS: 6-piruvoil-tetraidropterina sintase qBH2: quinoide diidrobiopterina SNC: sistema nervoso central SNP: sistema nervoso periférico SP: substância P
SPR: sepiapterina redutase SSZ: sulfassalazina TCA: ácido tricloroacético
TCLE: termo de consentimento livre e esclarecido TLRs: receptores do tipo Toll
TNF-α: fator de necrose tumoral-α
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Escore de Índice de Atividade da Doença (DAI) ... 57
Tabela 2. Escore histopatológico da colite ... 59
Tabela 3. Escore de artrite ... 67
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Vias metabólicas envolvidas na síntese de BH4. ... 33 Figura 2. Indução de colite experimental pela administração de sulfato sódico de dextrana (DSS) em camundongos suíços. ... 74 Figura 3. Quantificação de indicadores da ativação da síntese de BH4 e efeito de sulfasalazina (SSZ) na nocicepção abdominal na colite experimental induzida por sulfato sódico de dextrana (DSS) em camundongos suíços. ... 77 Figura 4. Quantificação de indicadores da ativação da síntese de BH4 e de inflamação na colite experimental induzida por sulfato sódico de dextrana (DSS) em camundongos C57BL/6J. ... 81 Figura 5. A inibição da síntese de BH4 melhora os escores clínicos e de necropsia na colite experimental induzida por sulfato sódico de dextrana (DSS) em camundongos C57BL/6J. ... 83 Figura 6. Efeito da inibição da síntese de BH4 sobre a atividade serotoninérgica enteral na colite experimental induzida por sulfato sódico de dextrana (DSS) em camundongos suíços (Webster). ... 85 Figura 7. Efeito da deficiência de BH4 na proliferação de células T. ... 87 Figura 8. Efeito da deficiência de BH4 na indução de colite autoimune. ... 89 Figura 9. Caracterização das fases aguda e crônica do modelo experimental de artrite reumatoide induzido pela administração de um coquetel de anticorpos contra o colágeno tipo II (CAIA) em camundongos Balb/c adultos. ... 92 Figura 10. Efeito da indução de modelo de artrite reumatoide sobre a resposta de nocicepção induzida por estímulos mecânicos e térmicos (calor e frio). ... 94 Figura 11. Efeito da inibição da síntese de BH4 sobre parâmetros inflamatórios clínicos e de nocicepção em modelo experimental de artrite reumatoide induzido pela administração de um coquetel de anticorpos contra o colágeno tipo II (CAIA). ... 96 Figura 12. Sepiapterina urinária após administração de SSZ. ... 98 Figura 13. Biomarcadores de dor em fluídos de pacientes acometidos por colite ulcerativa. ... 100 Figura 14. Relação do aumento de neopterina com severidade de doença hepática. ... 102
LISTA DE PUBLICAÇÕES RELACIONADAS À TESE
CRONIN, S.J.F.; SEEHUS, C.; WEIDINGER, A.; TALBOT, S.; EISSIG, S.; SEIFERT, M.; PIERSON, Y.; MCNEILL, E.; LONGHI, M.S.; TURNES, B.L.; KRESLAVSKY, T.; KOGLER, M.; HOFFMANN, D., TICEVIC, M.; DA LUZ SCHEFFER, D.; TORTOLA, L.; CIKES, D.; JAIS, A.; RANGACHARI, M.; RAO, S.; PAOLINO, M.; NOVATCHKOVA, M.; AICHINGER, M.; BARRETT,
L.; LATREMOLIERE, A.; WIRNSBERGER, G.;
LAMETSCHWANDTNER, G.; BUSSLINGER, M.; ZICHA, S.; LATINI, A.; ROBSON, S.C.; WAISMAN, A.; ANDREWS, N.; COSTIGAN, M.; CHANNON, K.M.; WEISS, G.; KOZLOV, A.V.; TEBBE, M.; JOHNSSON, K.; WOOLF, C.J. & PENNINGER, J.M. The metabolite BH4 controls T-cell proliferation in autoimmunity and cancer. Nature, 563, 564–568, 2018.
FUJITA, M.; DA LUZ SCHEFFER, D.; TURNES, B.L.; LATREMOLIERE, A.; COSTIGAN, M.; WOOLF, C.J.; LATINI, A.; ANDREWS, N. Sepiapterin reductase inhibition reduces rheumatoid pain and increases urinary sepiapterin. Manuscrito em revisão (R1) pela revista Arthritis & Rheumatology.
MATIOLLO, C.; RATEKE, E.; GHISONI, K.; TURNES, B.L.; SILVA, T.; MACCALI, C.; LATINI, A.; NARCISO-SCHIAVON, J.; SCHIAVON, L. Elevated neopterin levels are associated with acute-on- chronic liver failure and mortality in patients with liver cirrhosis. Artigo submetido à revista Liver International.
TURNES, B.L.; PIRES, A.S.; DA LUZ SCHEFFER, D.; COSTIGAN, M.; ANDREWS, A.; WOOLF, C.J.; LATINI, A. The role of tetrahydrobiopterin in the pathophysiology of ulcerative colitis. Artigo em elaboração e será submetido à revista Gastroenterology. TURNES, B.L.; PIRES, A.S.; DA LUZ SCHEFFER, D.; COSTIGAN, M.; ANDREWS, A.; WOOLF, C.J.; LATINI, A. Tetrahydrobiopterin metabolism in Crohn’s Disease. Artigo em elaboração e será submetido à revista Journal of Crohn's and Colitis.
OUTRAS PUBLICAÇÕES DURANTE O PERÍODO DO DOUTORADO
LYRA JUNIOR, H.F.; SCHIAVON, L.; RODRIGUES, I.K.; VIEIRA, D.S.; DE PAULA MARTINS, R.; TURNES, B.L.; LATINI, A.; D'ACÂMPORA, A.J. Effects of Ghrelin on the Oxidative Stress and Healing of the Colonic Anastomosis in Rats. Journal of Surgery Research, 234, 167-177, 2019.
ROSAS, R.F.; EMER, A.A.; BATISTI, A.P.; LUDTKE, D.D.; TURNES, B.L.; BOBINSKI, F.; CIDRAL-FILHO, F.J.; MARTINS, D.F. Far infrared-emitting ceramics decrease Freund's adjuvant-induced inflammatory hyperalgesia in mice through cytokine modulation and activation of peripheral inhibitory neuroreceptors. Journal of Integrative Medicine, 16, 396-403, 2018.
PIOVEZAN, A.P.; BATISTI, A.P.; BENEVIDES, M.L.A.C.S.; TURNES, B.L.; MARTINS, D.F.; KANIS, L.; DUARTE, E.C.W.; CAVALHEIRO, A.J.; BUENO, P.C.P.; SEED, M.P.; NORLING, L.V.; COOPER, D.; HEADLAND, S.; SOUZA, P.R.P.S.; PERRETTI, M. Hydroalcoholic crude extract of Casearia sylvestris Sw. reduces chronic post-ischemic pain by activation of pro-resolving pathways. Journal of Ethnopharmacology, 23, 179-188, 2017.
MARTINS, D.F.; TURNES, B.L.; CIDRAL-FILHO, F.J.; BOBINSKI, F.; ROSAS, R.F.; DANIELSKI, L.G.; PETRONILHO, F.; SANTOS, A.R. Light-emitting diode therapy reduces persistent inflammatory pain: Role of interleukin 10 and antioxidant enzymes. Neuroscience, 2, 485-95, 2016.
MADEIRA, F.; BRITO, R.N.; EMER, A.A.; BATISTI, A.P.; TURNES, B.L.; SALGADO, A.S.I.; CIDRAL-FILHO, F.J.; MAZZARDO-MARTINS, L.; MAZZARDO-MARTINS, D.F. The role of the inhibitory neuroreceptors spinal in the antihyperalgesic effect of warm water immersion therapy on persistent inflammatory pain. Artigo submetido à revista Brazilian Journal of Physical Therapy.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 27 2. ESTADO DA ARTE ... 31 2.1. BIOSSÍNTESE DE BH4 ... 31 2.1.1. Biossíntese de novo ... 34 2.1.2. Via de salvação ... 35 2.1.3. Via de reciclagem ... 35 2.2. BH4 E DOR ... 36 2.3. INTRODUÇÃO À DOR ... 38 2.3.1. Dor patológica ... 41 2.3.2. Dor nociceptiva ... 43 2.3.3. Dor inflamatória ... 44 2.4. INFLAMAÇÃO ... 45
2.4.1. Doenças Inflamatórias Intestinais ... 47
2.4.2. Artrite Reumatoide ... 49 2.5. SULFASSALAZINA ... 50 3. HIPÓTESE ... 52 4. OBJETIVOS ... 53 4.1. OBJETIVO GERAL ... 53 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 53 5. MATERIAL E MÉTODOS ... 55
5.1. ESTUDO EM MODELOS PRÉ-CLÍNICOS ... 55
5.2. MODELO EXPERIMENTAL DE COLITE INDUZIDA POR SULFATO DE SÓDIO DE DEXTRANA ... 56
5.4. ATIVIDADE LOCOMOTORA ... 58
5.5. EXTRAÇÃO DE TECIDO E MICRODISSECÇÃO ... 58
5.6. QUANTIFICAÇÃO DE IL-1β ... 58
5.7. ESCORE HISTOPATOLÓGICO DA COLITE ... 59
5.8. QUANTIFICAÇÃO DE GCH1 ... 60
5.9. QUANTIFICAÇÃO DO METABOLISMO DA BH4 ... 60
5.10. PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL (RT-PCR) ... 63
5.11. AVALIAÇÃO DO TRÂNSITO GASTROINTESTINAL . 63 5.12. IMUNOHISTOQUÍMICA ... 64
5.13. MODELO EXPERIMENTAL DE COLITE INDUZIDA POR TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE CÉLULAS T ... 65
5.14. PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T ... 65
5.15. RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL ... 65
5.16. MODELO EXPERIMENTAL DE ARTRITE REUMATOIDE INDUZIDA POR UM COQUETEL DE ANTICORPO ANTI-COLÁGENO TIPO II (CAIA) ... 66
5.17. AVALIAÇÃO DA HIPERALGESIA TÉRMICA AO CALOR...67
5.19. AVALIAÇAO DO EDEMA DA PATA ... 68
5.20. ESCORE HISTOPATOLÓGICO DA ARTRITE ... 68
5.21. ESTUDO CLÍNICO ... 69
5.21.1. Pacientes com colite ulcerativa ... 69
5.21.2. Pacientes com doença hepática ... 69
5.21.3. Voluntários saudáveis ... 70
5.21.4. Critérios de inclusão de pacientes ... 70
5.21.5. Critérios de exclusão de pacientes ... 71
5.21.6. Coleta de dados e amostras de sangue e urina ... 71
5.21.7. Aspectos éticos ... 71
5.22. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 72
6. RESULTADOS... 73
6.1. ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DO METABOLISMO DA BH4 NA FISIOPATOLOGIA DA DOR INFLAMATÓRIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE ULCERATIVA E DE ARTRITE REUMATOIDE ...73
6.2. ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DO METABOLISMO DA BH4 NA FISIOPATOLOGIA DA DOR INFLAMATÓRIA EM PACIENTES ACOMETIDOS POR COLITE ULCERATIVA ... 97
7. DISCUSSÃO ... 103
8. CONCLUSÕES ... 117
1. INTRODUÇÃO
A dor é definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial (IASP, 2017). A sensação de dor é um sistema precoce de alerta que avisa a presença de estímulos nocivos, tendo portanto como função primária a de proteger o organismo através da ativação de mecanismos de retirada que envolvem o reflexo espinal (WOOLF; SALTER, 2000).
A detecção de estímulos nocivos químicos, mecânicos e térmicos é mediada por nociceptores sensoriais, que podem ser também sensibilizados por inflamação prolongada ou lesão nervosa, provocando sensações dolorosas anormais, como hiperalgesia ou alodinia. Hiperalgesia caracteriza-se por sensibilidade aumentada à dor, e alodinia, a dor em resposta a estímulos não dolorosos (IASP, 2017).
A dor pode ser aguda (duração inferior a 30 dias) ou crônica (duração superior a três meses), sendo esta última classificada segundo seu mecanismo fisiopatológico em três tipos: (a) dor nociceptiva, que representa a sensação associada à detecção de estímulos nocivos potencialmente lesivos ao tecido e é protetora, geralmente responde bem ao tratamento sintomático com analgésicos ou anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES). (b) Dor inflamatória, que está associada ao dano tecidual e à infiltração de células imunes e pode promover o reparo, causando hipersensibilidade à dor até que ocorra a cicatrização, e (c) dor patológica, que é um estado de doença causado por danos no sistema nervoso (neuropática) ou pela sua função anormal (nociplástica) (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009; WOOLF, 2010). Contrariamente à dor nociceptiva, a dor neuropática responde
pobremente a analgésicos tais como paracetamol, dipirona, AINES, anestésicos locais ou opioides (WOOLF; SALTER, 2000). Esses apresentam eficácia limitada na maioria dos pacientes e com o uso prolongado ainda produzem muitos efeitos adversos. Ainda, no caso de opioides, como a morfina, apresentam um grande risco de abuso e alto risco de morte por overdose (UNITED NATIONS OFFICE ON DRUGS AND CRIME, 2013). Existe, portanto, uma necessidade urgente do desenvolvimento de novos analgésicos com maior eficácia e sem risco de abuso.
A dor crônica é a causa mais frequente de consultas clínicas, tanto nos Estados Unidos da América (EUA) quanto no Brasil (REUBEN et al., 2015), e é considerada como uma condição debilitante (PIRES, 2007). Estatisticamente, representa mais de um bilhão e meio de indivíduos acometidos por dor crônica no mundo, provocando um custo de mais de 600 bilhões de dólares para os cofres públicos nos EUA, mais do que o custo total do tratamento para diabetes, doenças cardiovasculares e câncer (SIMON, 2012). O percentual de indivíduos acometidos nos EUA supera 30% da população, muito similar à distribuição de doenças crônicas no Brasil (MURRAY; LOPEZ, 2013). No Brasil, estima-se que 40% da população sofra de dor crônica (SOUZA et al., 2017), mas pesquisas regionais demostram taxas ainda maiores, como em estudo realizado na cidade de Pelotas, Rio Grande do Sul, por Ferreira e colaboradores (FERREIRA et al., 2011) onde foi encontrada uma prevalência de dor lombar de 63%, semelhante ao reportado na cidade de Presidente Prudente, São Paulo, (ZANUTO et al., 2015), onde 50,2% dos adultos entrevistados reportaram dor lombar ao menos uma vez no último ano. Almeida e colaboradores (DE
ALMEIDA et al., 2013) também identificaram alta prevalência de dor lombar crônica (14,7%) entre moradores de Salvador, Bahia. Ainda, um estudo recente no Estado de Rio de Janeiro demonstrou que 37% da população do estado é afetada por dor crônica.
Embora a dor possa ser entendida como o sintoma de inúmeras condições patológicas, no momento em que se torna crônica, esse sintoma é “promovido” à doença. Por isso, precisa de tratamento específico, sob pena de incapacitar o paciente para o trabalho ou para realizar tarefas simples do dia a dia. Em 50% dos casos, a dor crônica compromete seriamente a rotina, atingindo um nível de 6 na escala visual analógica (EVA, escore 0 sem dor; escore 10 dor máxima) de dor, representando uma dor forte ou suficiente para atrapalhar as atividades cotidianas (SBED, 2018).
Uma estratégia recentemente empregada para melhorar as chances de sucesso translacional no desenvolvimento de novos fármacos consiste em selecionar um alvo metabólico para o desenvolvimento de medicamentos com forte suporte genético. Neste cenário, foi demonstrado pelo nosso grupo de pesquisa a existência de um haplótipo humano de nucleotídeo único no gene que codifica para a enzima GTP cicloidrolase (GCH1), que compromete a expressão do gene, a tradução proteica e consequentemente a síntese de tetraidrobiopterina (BH4), o metabólito final da via metabólica onde GCH1 é a enzima limitante. Essas consequências bioquímicas apresentaram uma forte associação com a redução de escores de dor clínica em pacientes com discopatia lombar, associando esse haplótipo como protetor do desenvolvimento da dor (TEGEDER et al., 2006; LÖTSCH et al., 2007). A produção de BH4 é essencial para que ocorra a síntese de neurotransmissores e de
óxido nítrico. No entanto, a identificação desse haplótipo foi a primeira evidência que atribuiu à BH4 um novo papel metabólico: participar na indução de dor.
Estudos posteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram um aumento patológico nas concentrações de BH4 em tecidos e fluídos biológicos de modelos animais de dor neuropática crônica. No entanto, a inibição genética ou farmacológica da GCH1, normaliza as concentrações da BH4 e confere analgesia (LATREMOLIERE et al., 2015).
A BH4 é um cofator obrigatório para a produção de aminas biogênicas (WERNER; BLAU; THÖNY, 2013), metabolismo lipídico via alquilglicerol monooxigenase (AGMO) e para todas as isoformas das enzimas óxido nítrico sintase (NOS) (MAYER; JOHN; BÖHME, 1990). A importância relativa da BH4 para a atividade fisiológica normal da grande variedade de processos celulares em que está envolvida é refletida no estrito controle das concentrações de BH4 através da ação combinada de três vias metabólicas: a via de síntese de novo, de reciclagem e vias de salvação (Figura 1).
Considerando que a maioria dos indivíduos acometidos por doenças inflamatórias sofrem de dor crônica, neste trabalho procuramos investigar o envolvimento do metabolismo da BH4 na fisiopatologia da dor induzida por doenças inflamatórias crônicas, como colite ulcerativa e artrite reumatoide, com o intuito de poder ofertar novas possibilidades terapêuticas para essas condições.
2. ESTADO DA ARTE
2.1. BIOSSÍNTESE DE BH4
A BH4 é uma pterina (anel pteridina) natural que atua biologicamente como cofator obrigatório para a atividade das enzimas fenilalanina hidroxilase, tirosina hidroxilase, triptofano hidroxilase e todas as isoformas da óxido nítrico sintase, essencial para o metabolismo da fenilalanina no fígado, assim como para a biossíntese dos neurotransmissores dopamina, serotonina e óxido nítrico (WERNER; BLAU; THÖNY, 2013; WERNER et al., 1990). A importância da BH4 para a atividade normal da grande variedade de processos celulares em que está envolvida, é refletida no estrito controle nas concentrações de BH4 através da ação das vias de síntese de novo, salvação e reciclagem. Perturbações na homeostase do metabolismo da BH4, via mutações genéticas ou aumentos patológicos na produção desse cofator, estão associados à numerosas condições patológicas, incluindo doenças cardiovasculares (BENDALL et al., 2013), depressão (PAN et al., 2011), dor crônica (TEGEDER et al., 2006; LATREMOLIERE et al., 2015) e câncer (CRONIN et al., 2018). Por outro lado, condições inflamatórias modulam positivamente a síntese de BH4, principalmente em células imunes, e em células nervosas (GHISONI et al., 2015; DE PAULA MARTINS et al., 2018a), por participarem na resposta imune produzindo óxido nítrico. Além disso, a BH4 é essencial para o metabolismo lipídico por ser também cofator obrigatório para a enzima AGMO (WATSCHINGER et al., 2009).
A via de novo gera BH4 a partir do GTP através de uma cascata enzimática de três etapas, começando com a enzima limitante
GCH1, seguida pela 6-piruvolil tetraidropterina sintase (PTPS) e SPR (THONY; AUERBACH; BLAU, 2000). Alternativamente à síntese de novo, as concentrações de BH4 intracelular podem ser gerados através da via de salvação usando 7,8-diidrobiopterina (BH2) ou sepiapterina como substratos. Apesar de essa via não ser totalmente compreendida, a SPR e a diidrofolato redutase (DHFR) parecem ser as principais enzimas participantes (HIRAKAWA et al., 2009; WERNER; BLAU; THÖNY, 2013). A via de reciclagem da BH4 é um mecanismo que economiza energia intracelular e sustenta as concentrações apropriadas de BH4 em tecidos com alta exigência desse composto. Depois que a BH4 participa como um cofator enzimático obrigatório, o intermediário 4a-hidroxi-tetraidrobiopterina é formado e passa por um mecanismo clássico de desidratação onde uma molécula de água é liberada e quinonoide diidrobiopterina (qBH2) é formada, que é novamente reduzida para BH4 em uma reação dependente de NADH. A formação de 4a-hidroxi-tetraidrobiopterina também pode ocorrer não enzimaticamente, mas a uma taxa que é, pelo menos no fígado, insuficiente para manter a BH4 no estado reduzido (THONY; AUERBACH; BLAU, 2000; LONGO, 2009).
Figura 1. Vias metabólicas envolvidas na síntese de BH4.
Concentrações intracelulares de BH4 mantidas fisiologicamente através da ação das vias metabólicas de novo, de salvação e de reciclagem. Mediadores inflamatórios, tais como LPS, IFN-α, IL1-β ou TNF-α estimulam a síntese de BH4. Abreviações: BH4 (tetraidrobiopterina); GTP (guanosina trifosfato); GCH1 (guanosina trifosfato cicloidrolase I); PTPS (6-piruvoil tetraidropterina sintase); SPR (sepiapterina redutase); BH2 (7,8-diidrobiopterina); DHFR (diidrofolato redutase); PCD (pterina 4a-carbinolamina dehidratase); qBH2 (q diidrobiopterina); DHPR (diidropteridina redutase). Adaptado de (THONY; AUERBACH; BLAU, 2000).
2.1.1. Biossíntese de novo
A biossíntese de novo da BH4 inicia com a transformação de guanosina trifosfato (GTP) em 7,8-diidroneopterina trifosfato pela catálise da enzima limitante da via, GCH1 (LEVINE et al., 1990). A seguir, a enzima PTPS converte esse intermediário metabólico em 6-piruvoil-tetraidropterina, posteriormente convertido à BH4 pela catálise da enzima SPR (WERNER et al., 1990; WERNER; BLAU; THÖNY, 2013).
A GCH1 é a enzima limitante da via de síntese de novo da BH4 e é controlada transcricionalmente por estímulos inflamatórios, tais como interferon- γ (IFN-γ), interleucina 1-β (IL1-β), TNF-α, fator de crescimento do nervo (NGF) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (D’SA et al., 1996; BAUER et al., 2002; FRANSCINI et al., 2003; TOBE et al., 2005). Enquanto a atividade de GCH1 pode ser estimulada em até 100 vezes durante condições inflamatórias, a atividade das enzimas PTPS e SR encontram-se minimamente aumentada nas mesmas condições (WERNER et al., 1990; KANEKO et al., 2003). Deste modo, durante estados inflamatórios, a PTPS torna-se a enzima limitante na biossíntese de novo de BH4, especialmente em monócitos e macrófagos humanos, visto que essas células possuem baixa expressão de PTPS (WERNER et al., 1990; WERNER-FELMAYER et al., 1993). Portanto, o metabólito intermediário 7,8-diidroneopterina trifosfato será́ desfosforilado por fosfatases alcalinas gerando 7,8- diidroneopterina que, por oxidação não enzimática, originará neopterina, um sensível marcador de ativação do sistema imune (OTA et al., 2007; CHITTIPROL et al., 2010; HAGBERG et al., 2010).
2.1.2. Via de salvação
A enzima SPR presente na via de síntese de novo de BH4, também pode participar na via de salvação, a qual catalisa a conversão de sepiapterina em BH2, que é então convertida à BH4 pela enzima DHFR (WERNER; BLAU; THÖNY, 2013). Embora a enzima SPR seja suficiente para completar a síntese de BH4, outras enzimas inespecíficas denominadas aldose redutases (AR ou AKR1B1) e carbonil redutases (CR ou CBR1) compartilham dos mesmos substratos e são capazes de catalisar as mesmas reações (LEVINE et al., 2004). Assim, nessa via, a 6-piruvoil tetraidrobiopterina (PTP) pode ser convertida em intermediários instáveis pelas AR/CR ou SPR, que favorecem a formação direta de BH4 e/ou a formação não enzimática de sepiapterina, e dessa em BH2, que será́ convertida em BH4 pela DHFR (BLAU; BONAFÉ; THÖNY, 2001; HIRAKAWA et al., 2009; LATREMOLIERE et al., 2015). Portanto, a via de salvação sintetiza BH4 mesmo na ausência de atividade da enzima SPR (BLAU; BONAFÉ; THÖNY, 2001; HIRAKAWA et al., 2009)
2.1.3. Via de reciclagem
A terceira via de síntese que controla as concentrações intracelulares de BH4 é a via de reciclagem, um mecanismo alternativo para economizar energia intracelular e sustentar as concentrações apropriadas de BH4 quando da alta exigência pelos tecidos. A reciclagem enzimática da BH4 é uma parte essencial do sistema de hidroxilação da fenilalanina para garantir um suprimento contínuo de cofator reduzido e evitar o acúmulo de metabólitos nocivos (BRACHER et al., 1998). A molécula de BH4 cede um par de elétrons para a
hidroxilação de fenilalanina, tirosina e triptofano, sendo oxidada à BH2, a qual é reciclada em BH4 a partir da enzima diidropteridina redutase (DHPR) (THONY; AUERBACH; BLAU, 2000; LONGO, 2009; LATREMOLIERE et al., 2015).
2.2. BH4 E DOR
A relação entre o metabolismo da BH4 e a indução de hipersensibilidade à dor foi descoberta pela primeira vez em humanos, através da identificação de um alelo do haplótipo do gene que codifica para a enzima GCH1, a enzima limitante do fluxo metabólico na biossíntese de BH4 (LÖTSCH et al., 2007; COSTIGAN; LATREMOLIERE; WOOLF, 2012). A presença do polimorfismo de nucleotídeo único, dentro ou perto do gene para GCH1 que compromete a expressão dessa, foi associado positivamente com marcada redução nos escores de dor clínica (LÖTSCH et al., 2007). Em humanos, esse haplótipo do gene GCH1 (frequência populacional de 15,4%) foi significativamente associado a menos dor após discectomia por dor lombar radicular persistente. Ainda, indivíduos saudáveis homozigóticos para esse haplótipo apresentaram sensibilidade experimental à dor reduzida (TEGEDER et al., 2006).
O aumento patológico das concentrações de BH4 na dor neuropática foi também descrito por colaboradores do nosso grupo de pesquisa, o qual demonstrou que a administração intratecal de BH4 per se é suficiente para induzir comportamento nociceptivo em animais naïve (TEGEDER et al., 2006). Ainda, demonstrou que a síntese de BH4 aumenta em neurônios periféricos em resposta à lesão neuropática
ou inflamação, decorrência da regulação positiva de enzimas de síntese (TEGEDER et al., 2006). As concentrações excessivas de BH4 são produzidas por neurônios sensoriais axotomizados e por macrófagos que infiltram nos nervos danificados e no tecido inflamado, contribuindo para a indução da hiperalgesia neuropática e inflamatória (LATREMOLIERE et al., 2015).
A fim de estudar o potencial terapêutico da inibição da via da BH4, nosso grupo também demonstrou que ao inibir a enzima SPR, envolvida na biossíntese de BH4, as concentrações intracelulares excessivas de BH4 são normalizadas, sem induzir efeitos adversos como falhas na vasodilatação ou na neurotransmissão que poderiam decorrer da completa inibição da produção de BH4 (LATREMOLIERE et al., 2015). Ainda nosso grupo demonstrou, que a inibição da enzima SPR leva a um acúmulo do precursor metabólico sepiapterina (LATREMOLIERE et al., 2015; CRONIN et al., 2018), fato que ocorre também em pacientes portadores do erro inato do metabolismo onde há deficiência na produção da proteína ou na atividade enzimática de SPR (BLAU; BONAFÉ; THÖNY, 2001). A detecção de sepiapterina nos fluídos biológicos poderia ser empregada para acompanhar o grau de inibição da atividade enzimática, transformando esse metabólito em um biomarcador muito sensível da eficácia de tratamento na prática clínica, principalmente nos pacientes acometidos por dor crônica. A partir disso, está claro que as vias envolvidas no metabolismo da BH4 representam uma excelente oportunidade de uso de biomarcadores para avaliar inibidores de SPR, além de ser um possível alvo terapêutico no desenvolvimento de novas drogas analgésicas.
2.3. INTRODUÇÃO À DOR
A dor é uma das modalidades sensoriais resultante da integração de vários níveis neurais, compreendendo, na maioria dos casos, a detecção do estímulo na periferia e o processamento em áreas superiores do sistema nervoso central (SNC) (JULIUS; BASBAUM, 2001). É uma experiência consciente que demanda participação cortical e a informação aversiva da nocicepção, a qual compreende os mecanismos pelos quais estímulos nocivos, ou reconhecidos como tal, são detectados pelo sistema nervoso periférico (SNP), codificados, transmitidos e inconscientemente modulados pelo sistema nervoso. Ou seja, é uma experiência complexa e subjetiva, a qual possui um componente afetivo, acompanhado por elementos sensorial-discriminativo, autonômico e cognitivo (WOOLF CJ; MA Q, 2007).
Por definição, segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, do inglês International Association for the Study of Pain), a dor é “uma experiência sensorial e emocional desagradável associada à dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal dano”, enquanto a nocicepção é definida como “o processo neural de codificação e processamento do estímulo nocivo”. Essa definição fundamenta a dor como sendo uma percepção e não apenas uma modalidade puramente sensorial e considera a necessidade de processamento cognitivo para que a dor seja conscientemente experimentada (LUMLEY et al., 2011).
Ainda, a dor pode ser alternativamente dividida em três classes. (A) Dor nociceptiva, que representa a sensação associada à detecção de estímulos nocivos potencialmente lesivos do tecido e é protetora. (B)
Dor inflamatória, que está associada ao dano tecidual e à infiltração de células imunes e pode promover o reparo, causando hipersensibilidade à dor até que ocorra a cicatrização. (C) Dor patológica, que é um estado de doença causado por danos no sistema nervoso (neuropática) ou pela sua função anormal (nociplástica) (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009; WOOLF, 2010).
Um estado de dor aguda é uma resposta fisiológica protetora normal a um estímulo nocivo que o sistema nervoso detecta, adapta e responde adequadamente, classificada como um sintoma subjacente ao dano tecidual que a desencadeou. A dor aguda pode ser de leve a grave, com duração de um momento, semanas ou alguns meses até que a causa da dor seja resolvida (COSTIGAN; WOOLF, 2000). No estado crônico, a dor perde a função protetora e torna-se fisicamente debilitante, comprometendo funções básicas como a mobilidade e o sono, além de provocar sobrecarga emocional, podendo levar à ansiedade, depressão, irritabilidade e raiva (BRENNAN; CARR; COUSINS, 2007). A dor é considerada crônica quando persiste ou se repete por mais de 3 a 6 meses apesar da presença ou ausência de um estímulo nocivo (HARVEY, 2006; TREEDE et al., 2015), ou seja, quando alterações patofisiológicas propagam a dor de forma independente do estímulo deflagrador (LEE, 2013).
A dor crônica é caracterizada por sensibilidade anormal à dor gerada por alteração no processamento sensorial no sistema somatossensorial em resposta a sensibilização de fibras nociceptivas periféricas, hiperexcitabilidade dos neurônios da medula espinhal, diminuição da inibição descendente e reorganização estrutural de vias responsáveis pelo processamento nociceptivo. Essas alterações podem
contribuir, de forma independente ou em conjunto, para uma ampla gama de distúrbios crônicos, alterando a relação entre um estímulo aplicado e a resposta percebida, levando a estados de dor persistentes (WOOLF, 2018).
A dor crônica é uma condição debilitante que afeta bilhões de indivíduos todos os anos e apresenta um grande impacto socioeconômico e sobre a qualidade de vida. Um dos problemas de saúde mais comuns no mundo e com uma prevalência crescente que afeta em torno de 100 milhões de americanos, dos quais 8% sofrem de dor crônica de alto impacto (DAHLHAMER et al., 2018). No Brasil, a estimativa é de que em torno de 40% da população sofra de dor crônica (SOUZA et al., 2017). Essa condição apresenta um alto impacto socioeconômico, gerando gastos de cerca de 600 bilhões de dólares por ano devido à perda de produtividade e custos médicos, mais do que o custo total com o tratamento de diabetes, doenças cardíacas e câncer (SIMON, 2012).
Embora existam muitas opções de tratamento disponíveis, nenhuma é universalmente endossada, e muitas delas apresentam efeitos adversos contraproducentes (DALE; STACEY, 2016). Os opioides constituem a terapia farmacológica mais utilizadas no tratamento da dor crônica, embora apresentem uma eficácia apenas moderada (30% de melhoria, em média), com numerosos efeitos secundários (principalmente devido a perturbações no SNC) (COSTANTINO et al., 2012). Além disso, apresentam forte tolerância e risco de dependência, uma preocupação particular no controle da dor crônica (CORDER et al., 2017).
A falha no tratamento da dor crônica ou sua persistência podem desencadear a uma série de alterações físicas e psicossociais, como incapacidade (DUEÑAS et al., 2016), ansiedade (KATZ; ROSENBLOOM; FASHLER, 2015), depressão (MARGARETTEN et al., 2011) e distúrbios do sono (ALEXANDRE et al., 2017).
Há, portanto, uma necessidade iminente de identificar novos alvos biológicos que possibilitem o desenvolvimento de novas medidas terapêuticas mais eficazes para o manejo e tratamento da dor crônica.
2.3.1. Dor patológica
A dor patológica é um quadro onde a função principal não é protetora, e sim, mal adaptativa, resultante do funcionamento anormal do sistema nervoso. Essa dor patológica, que não é um sintoma de algum distúrbio, mas sim um estado de doença do sistema nervoso, pode ocorrer após danos ao sistema nervoso (dor neuropática), mas também em condições nas quais não existe dano ou inflamação (dor nociplástica) (WOOLF, 2010).
A dor nociplástica ocorre em situações em que não há estímulo nocivo identificável nem qualquer inflamação ou dano detectável no sistema nervoso. Não está claro na maioria dos casos o que causa a manifestação ou persistência da dor nociplástica (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009). Porém, em condições como fibromialgia, síndrome do intestino irritável e cistite intersticial, a dor parece resultar de uma amplificação autônoma de sinais nociceptivos dentro do SNC (STAUD; RODRIGUEZ, 2006; NIELSEN et al., 2008) com um equilíbrio perturbado de excitação e inibição em circuitos centrais (JULIEN et al., 2005) e processamento sensorial alterado que pode ser
detectado por imagens funcionais (STAUD et al., 2008). As síndromes dolorosas nociplásticas compartilham algumas características da dor neuropática: somação temporal com acúmulo progressivo de dor em resposta a estímulos repetidos (windup), difusão espacial e limiares de dor reduzidos (STAUD; ROBINSON; PRICE, 2007). A eritromelalgia primária e o transtorno da dor extrema paroxística, que são causados por mutações em canais de sódio ativados por voltagem Nav1.7 (DRENTH; WAXMAN, 2007), podem ser consideradas dor nociplástica mediada perifericamente, porém, com as causas moleculares conhecidas. Essas mutações são canalopatias hereditárias do SNP, que causam dor por atividade ectópica de neurônios sensoriais primários devido ao aumento da excitabilidade da membrana na ausência de lesões axonais ou desmielinização (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009).
A dor neuropática periférica resulta de lesões no SNP causadas por trauma mecânico, doenças metabólicas, substâncias químicas neurotóxicas, infecção ou invasão tumoral e envolve múltiplas alterações fisiopatológicas tanto no SNP quanto no SNC (DWORKIN et al., 2003). Quanto a dor neuropática central, os casos mais comuns resultam de lesão medular, acidente vascular encefálico ou esclerose múltipla (DUCREUX et al., 2006). A doença primária e o dano neural são apenas os iniciadores de uma cascata de mudanças que levam à dor neuropática e a sustentam. Múltiplos mecanismos são responsáveis pela dor neuropática, dentre eles, alteração na expressão gênica e mudanças em canais iônicos, que levam à atividade ectópica; facilitação sináptica e a perda de inibição em múltiplos níveis do neuroeixo, que produzem amplificação central; além de morte celular neuronal e a conectividade sináptica disfuncional, que fornecem a base estrutural para o
processamento persistentemente alterado das entradas aferentes nociceptiva e inócua (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009).
2.3.2. Dor nociceptiva
A dor nociceptiva é um sistema de proteção fisiológica de alerta precoce, essencial para detectar e minimizar o contato com estímulos prejudiciais ou nocivos. Seu papel protetor exige atenção e ação imediatas, que ocorrem pela ativação de reflexo de retirada. É mediada por neurônios sensoriais primários, em particular fibras C amielínicas ou fibras Aδ pouco mielinizadas, transmitindo o estímulo nociceptivo ao SNC (WOOLF; MA, 2007). Esses neurônios nociceptivos expressam receptores especializados, principalmente receptores de potencial transiente (TRP), sintonizados para responder a estímulos térmicos ou mecânicos intensos, bem como a mediadores químicos exógenos e endógenos (DHAKA; VISWANATH; PATAPOUTIAN, 2006). Para que a dor nociceptiva conserve sua função protetora, a sensação deve ser tão desagradável que não possa ser ignorada, ocorre em resposta a estímulos nocivos e continua apenas na manutenção da presença desses estímulos (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009; WOOLF, 2010).
A falta de nocicepção pode ser observada em casos de distúrbios hereditários associados à insensibilidade congênita à dor (INDO, 2001; COX et al., 2006), que levam a lesões repetidas e automutilação inadvertida, ilustrando a função altamente adaptativa da dor nociceptiva.
2.3.3. Dor inflamatória
Esse tipo de dor ocorre em resposta à lesão tecidual e à subsequente resposta inflamatória. Aqui, o imperativo muda de proteger o corpo contra um estímulo nocivo potencialmente prejudicial para lidar com as consequências do dano. Para iniciar o reparo da área lesada, o sistema nervoso sensorial sofre uma profunda mudança em sua capacidade de resposta, onde estímulos normalmente inócuos passam a produzir dor (alodinia) e respostas a estímulos nocivos são exageradas e prolongadas (hiperalgesia) (JUHL et al., 2008).
Ou seja, durante o processo inflamatório, a dor é tipicamente aguda e adaptativa. No entanto, se a inflamação continuar por longos períodos sem resolução, essa dor pode se tornar patológica, com poucos ou nenhum efeito fisiológico (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009). Ou seja, alterações na via da dor podem levar à hipersensibilidade à dor, fazendo com que seu caráter frequentemente protetor seja perdido, tornando-se crônica e debilitante (JULIUS; BASBAUM, 2001).
A dor inflamatória é desencadeada por impulsos de pequena intensidade gerados por atividade neural anormal (MELZACK; WALL, 2006; HUDSPITH, 2016). Nessas ocasiões, comumente ocorre um quadro de hipersensibilidade à dor ocasionada pela ativação e sensibilização de nociceptores periféricos por mediadores químicos produzidos pela lesão tecidual e pela inflamação (DRAY; URBAN; DICKENSON, 1994; RADU et al., 2013), consequência comum de todos os tipos de dor inflamatória (GARRY; JONES; FLEETWOOD-WALKER, 2004; SCHAIBLE, 2007; CUNHA et al., 2008).
Esse quadro leva à diminuição do limiar da resposta dos nociceptores que inervam o tecido inflamado (sensibilização periférica).
Além dessas alterações periféricas, pode também ocorrer uma resposta aumentada dos neurônios nociceptivos no SNC por estímulos aferentes normais ou subliminares (sensibilização central) (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al., 2008; RADU et al., 2013).
2.4. INFLAMAÇÃO
A inflamação é uma resposta adaptativa que pode ser desencadeada por lesão tecidual devido à invasão microbiana, compostos nocivos, infecção viral, trauma ou reações de hipersensibilidade à dor e pode se manifestar em formas agudas ou crônicas (MOILANEN, 2014). Consiste na resposta orgânica diante de uma lesão tecidual ou infecção e esse processo fisiológico envolve uma ação coordenada entre o sistema imunológico e o tecido no qual ocorreu a lesão (NATHAN; DING, 2010). Portanto, a resposta inflamatória é a ativação coordenada de vias de sinalização que regulam as concentrações de mediadores inflamatórios em células de tecidos residentes e células inflamatórias recrutadas do sangue, que em situações normais, é um mecanismo de proteção dos tecidos contra danos endógenos e exógenos (TRACEY, 2002; TAKEUCHI; AKIRA, 2010).
Em nível tecidual, a inflamação é caracterizada por rubor, edema, calor, dor e perda da função tecidual, que resultam de respostas celulares imunes, vasculares e inflamatórias locais à infecção ou lesão (NATHAN, 2002; LIBBY, 2007; CHEN et al., 2018). Embora os processos de resposta inflamatória dependam da natureza precisa do estímulo inicial e de sua localização, mecanismos comuns frente ao
agente nocivo são compartilhados, onde há o reconhecimento de estímulos prejudiciais, ativação de vias inflamatórias específicas, liberação de marcadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias (CHEN et al., 2018). De maneira geral, estruturas microbianas conhecidas como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e sinais endógenos ativados durante o dano tecidual ou celular, conhecidos padrões moleculares associados a dano (DAMPs), podem desencadear a resposta inflamatória através da ativação de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) expressos em células imunes e não imunes (TRINCHIERI; SHER, 2007; MOGENSEN, 2009). Classes de famílias de PRR incluem, por exemplo, os receptores do tipo Toll (TLRs) e receptores do tipo NOD (NLRs). A sinalização através de TLRs ativa uma cascata de sinalização intracelular que leva à translocação nuclear de fatores de transcrição, tais como proteína ativadora-1 (AP-1) e NF-κB (XU; LIU; LI, 2019), resultando na síntese de mediadores que levam à manifestação de respostas inflamatórias, possibilitando o reparo tecidual e restauração da homeostase (MOHAN; GUPTA, 2018).
Portanto, a inflamação aguda é um processo finito que resulta no retorno da homeostase tecidual. No entanto, se as respostas inflamatórias forem persistentes ou se houver falha na resolução da inflamação aguda, o processo torna-se crônico. A forma crônica ou a falha na resolução da inflamação está diretamente relacionada com a patogênese de uma série de doenças crônicas como aterosclerose, obesidade, câncer, artrite reumatoide, doenças neurodegenerativas e doenças inflamatórias intestinais (LIBBY, 2007; NATHAN; DING, 2010).
2.4.1. Doenças Inflamatórias Intestinais
As doenças inflamatórias intestinais são doenças idiopáticas crônicas que causam inflamação do trato gastrointestinal, que durante a última década emergiram como um desafio de saúde pública em todo o mundo (KAPLAN, 2015). Na América do Norte e na Europa, estima-se que 1,5 milhões e 2 milhões de pessoas sofram da doença, respectivamente (BURISCH et al., 2013). Fora de países ocidentais o número de indivíduos acometidos pelas doenças inflamatórias intestinais permanece incerto. Entretanto, com a chegada do século 21 as doenças inflamatórias intestinais tornaram-se uma epidemia global, com incidência acelerada em países recentemente industrializados cujas sociedades se tornaram mais “ocidentalizadas” (KAPLAN; NG, 2017; NG et al., 2017).
A colite ulcerativa e a doença de Crohn são os tipos mais entendidos e estudados de doenças inflamatórias intestinais, possuindo maior prevalência na população mundial (MOLODECKY et al., 2012; GEREMIA et al., 2014). A doença de Crohn é caracterizada por inflamação transmural que pode envolver todo o trato gastrointestinal, enquanto na colite ulcerativa o processo inflamatório é limitado ao cólon (HANAUER, 2006).
O diagnóstico da colite ulcerativa baseia-se na história clínica, exames radiológicos, endoscópicos e histológicos (NIKOLAUS; SCHREIBER, 2007). Embora os mecanismos patofisiológicos das doenças inflamatórias intestinais não sejam completamente compreendidos, inúmeros estudos, nas últimas décadas, têm sugerido que a etiologia envolva uma resposta imune desregulada à microbiota comensal em indivíduos geneticamente suscetíveis, influenciados por
fatores ambientais, genéticos e/ou psicológicos, bem como infecções microbianas ou comprometimento do sistema imunológico (SHIH; TARGAN, 2008; DANESE, 2011; DE SOUZA; FIOCCHI, 2016; YADAV et al., 2016; KAPLAN; NG, 2017).
A colite ulcerativa é clinicamente caracterizada por perda de peso, diarreia, hematoquezia e dor abdominal (KIM; CHEON, 2017). Estima-se que 50% a 70% dos pacientes apresentem a dor como sintoma inicial, ou como um sintoma prevalente durante o desenvolvimento da doença (BIELEFELDT; DAVIS; BINION, 2009). O fato de a dor abdominal ainda estar presente em 20% dos pacientes com doenças inflamatórias intestinais com lesões endoscópicas e marcadores de inflamação negativos sugere que outros fatores também possam contribuir para a sintomatologia da dor (MINDERHOUD et al., 2004; FARROKHYAR et al., 2006; SIEGEL; MACDERMOTT, 2009; COATES et al., 2013), tais como sensibilização central e periférica (PRICE et al., 2006).
A dor visceral é caracterizada por uma percepção subjetiva dolorosa localizada na região abdominal ou torácica, podendo ser referida em estruturas somáticas (AUSTIN; HENDERSON, 2011).
A dor proveniente do sistema gastrointestinal ascende ao cérebro através das mesmas vias neuronais que transmitem estímulos somáticos nocivos. Os nociceptores inervam todas as camadas do trato gastrointestinal; terminações nervosas na mucosa podem ser ativadas pelo conteúdo luminal (materiais digestivos, bactérias ou produtos metabólicos bacterianos), ou por sinalização de células enterocromafins; as terminações nervosas na submucosa ou no plexo mioentérico são tipicamente ativadas pela liberação local de neurotransmissores e
neuromoduladores por nervos intrínsecos ou por células imunes residentes; terminações nervosas dentro das camadas musculares ou vasos sanguíneos são tipicamente ativadas por estiramento nocivo (BROOKES et al., 2013; BARBARA et al., 2016; VANNER et al., 2016).
2.4.2. Artrite Reumatoide
A artrite reumatoide é uma doença autoimune inflamatória crônica e progressiva, associada a efeitos articulares, extra articulares e sistêmicos, levando a incapacidade progressiva, morte prematura e altos custos econômicos (FIRESTEIN; MCINNES, 2017). Afeta aproximadamente 1% da população mundial, com a incidência anual de cerca de 40 em 100.000 habitantes em todo o mundo (SILMAN; PEARSON, 2002; SMOLEN; ALETAHA; MCINNES, 2016).
Embora os mecanismos etiológicos não sejam totalmente compreendidos, complexas interações de fatores genéticos e ambientais contribuem para a patogênese da doença (CHOY, 2012). A artrite reumatoide apresenta características patológicas proeminentes, como inflamação e hiperplasia sinovial, produção de auto-anticorpos, destruição da cartilagem e osso, além de características sistêmicas, incluindo distúrbios cardiovasculares, pulmonares, psicológicos e esqueléticos (PLENGE, 2009). Células T, células B e a interação orquestrada de citocinas pró-inflamatórias desempenham papéis-chave na fisiopatologia da artrite reumatoide, levando a inflamação sinovial, destruição óssea e degradação da cartilagem (CHOY, 2012). As citocinas mais diretamente implicadas nesse processo são o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 6 6) e interleucina 1β
(IL-1β), as quais são responsáveis pela inflamação sinovial e por efeitos sistêmicos, encontradas em grande quantidade local e sistemicamente (SMOLEN; STEINER, 2003; SMOLEN et al., 2007).
A dor é um dos sintomas mais prevalentes e incapacitantes dos pacientes com artrite reumatoide, reduz ainda mais a qualidade de vida, podendo causar sofrimento psicológico, fadiga e depressão (POLLARD et al., 2006; MARGARETTEN et al., 2011; WALSH; MCWILLIAMS, 2014). A dor é um problema característico durante a fase aguda da artrite reumatoide e é geralmente atribuída à inflamação periférica (STRAND et al., 2012). Entretanto, muitos dos pacientes em remissão clínica continuam a apresentar dor moderada (LEE et al., 2011), sugerindo que outros fatores, incluindo mecanismos centrais não inflamatórios da dor, também podem contribuir para a persistência da dor na artrite reumatoide (LEE, 2013).
A dor somática é sentida com alto grau de discriminação, sendo amplamente representada na área somatossensorial. É transmitida de acordo com a distribuição anatômica das vias nociceptivas e pode ser superficial cutânea e profunda de acordo com a estrutura envolvida na lesão (RAJA; MEYER; CAMPBELL, 1988).
2.5. SULFASSALAZINA
A sulfassalazina (SSZ) é um composto com propriedades anti-inflamatórias aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), amplamente utilizado em casos de doenças inflamatórias intestinais, bem como no tratamento da artrite reumatoide (HUBER et al., 1984). A SSZ é incompletamente absorvida a partir do intestino delgado e
transportada para o cólon onde é reduzida por bactérias à sufapiridina e mesalazina (ou ácido 5-aminosalicílico) (CAPRILLI et al., 2009). Inicialmente, os efeitos anti-inflamatórios da SSZ foram atribuídos a inibição da ativação de NF-kB (WAHL et al., 1998). Embora seja utilizada há mais de 6 décadas no tratamento de doenças inflamatórias, a SSZ tem biodisponibilidade limitada, baixa potência e um metabolismo complexo, exigindo altas doses diárias para atingir um efeito que persiste por poucas horas (SANDBORN; HANAUER, 2002).
Apesar da sua relevância clínica, o mecanismo molecular de ação da SSZ foi só elucidado após 5 décadas de uso contínuo na prática clínica como fármaco modificador de doença. Foi assim demonstrado que a SSZ e seus metabólitos, sulfapiridina e mesalazina, são potentes inibidores da enzima sepiapterina redutase (SPR), enzima catalítica da etapa final da biossíntese do cofator enzimático BH4 (CHIDLEY et al., 2011; HARUKI et al., 2013).
3. HIPÓTESE
Com base nos achados previamente expostos, hipotetizamos que: i) o metabolismo da BH4 está envolvido na fisiopatologia de doenças inflamatórias crônicas, como a colite ulcerativa e artrite reumatóide; ii) a inibição da enzima SPR e consequente redução nas concentrações de BH4 nos tecidos envolvidos com o processo nociceptivo proporcionará analgesia; iii) a inibição da enzima SPR será acompanhada do acúmulo de sepiapterina, sugerindo que esse metabólito possa ser utilizado como biomarcador de efetividade do tratamento e do grau de analgesia alcançada nas dores inflamatórias crônicas; e que iv) o aumento das concentrações de neopterina nos fluidos biológicos correlacione-se positivamente com severidade e sobrevida de pacientes acometidos por doenças inflamatórias crônicas.
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Investigar o envolvimento do metabolismo da BH4 na fisiopatologia da dor em doenças inflamatórias crônicas.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Induzir e caracterizar bioquímica, clínica e histopatologicamente dois modelos experimentais de doenças que cursam com inflamação crônica: colite experimental induzida por sulfato sódico de dextrana (DSS) e, artrite reumatoide induzida por coquetel de anticorpo anti-colágeno tipo II (CAIA) em roedores.
2) Quantificar nesses modelos experimentais a hiperalgesia mecânica por meio do teste de von Frey, hiperalgesia térmica por meio do teste de Hargreaves e a alodinia ao frio por meio do teste da acetona;
3) Determinar o metabolismo da BH4 em tecidos e fluídos biológicos em modelos experimentais por ELISA, HPLC e qRT-PCR;
4) Determinar o impacto da modulação genética (nocaute para GCH1) e farmacológica (inibidores da SPR) na síntese de BH4
sobre a nocicepção e infiltração de células imunes em modelos experimentais;
5) Determinar o impacto da modulação farmacológica da síntese de BH4 sobre a atividade serotoninérgica enteral em modelos experimentais por imunohistoquímica;
6) Quantificar o metabolismo da BH4 em plasma e urina em pacientes acometidos por colite ulcerativa por HPLC
7) Quantificar a dor abdominal em pacientes acometidos por colite ulcerativa por meio de escala visual analógica;
8) Quantificar o metabolismo da BH4 em plasma de pacientes acometidos por doença hepática por HPLC.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. ESTUDO EM MODELOS PRÉ-CLÍNICOS
Camundongos suíços machos (60 dias de idade) foram obtidos do Biotério Central da UFSC e mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas da UFSC (Florianópolis, Santa Catarina). Camundongos C57BL/6J e Balb/c machos (60 dias de idade) foram obtidos da Jackson Laboratory (Maine, Estados Unidos), Camundongos eGFP-GCH1 suíços Webster foram desenvolvidos pelo Woolf Lab (LATREMOLIERE et al., 2015) e alojados no ARCH, Karp Building, Boston Children’s Hospital da Harvard Medical School (Boston, Estados Unidos). Camundongos Rag-/-, GCH1; Lck-/- e GCH1;RORc machos (60 dias de idade) foram desenvolvidos pelo Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (Vienna, Áustria) e alojados alojados no ARCH, Karp Building, Boston Children’s Hospital da Harvard Medical School (Boston, Estados Unidos). Todos os animais foram mantidos sob condições laboratoriais padrão (ciclo de 12 horas claro-escuro, luzes acesas às 07:00 horas, temperatura 22 ± 1ºC) com acesso livre a comida e água, alojado em gaiolas padrão com um espaço físico de pelo menos 100 cm2 por animal. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEUA, PP00425) da UFSC e pela Comissão do Uso e Cuidado com Animais (16-01-3082 e 18-04-3681R) do Boston Children’s Hospital. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes atuais para o atendimento de animais de laboratório e as diretrizes éticas para
investigações de dor experimental em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983).
5.2. MODELO EXPERIMENTAL DE COLITE INDUZIDA POR SULFATO DE SÓDIO DE DEXTRANA
A colite foi induzida pela adição de 2% de sulfato sódico de dextrana (DSS, 36-50 kDa, MP Biomedicals, Illkirch, França) em água potável autoclavada ad libitum, durante 6 dias. Os animais do grupo controle receberam água autoclavada ad libitum, sem DSS. Após a indução da colite, os camundongos receberam alimentos e água disponíveis ad libitum até o final do protocolo experimental, que aconteceu no dia 7 ou 9 após a administração do DSS, quando os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.
A severidade da colite foi medida por escore de atividade clínica da doença pela observação diária da perda de peso, consistência das fezes e hematoquezia de acordo com a Tabela 1. O Índice de Atividade da Doença (DAI) foi calculado com base nos escores combinados de perda de peso, consistência e sangramento nas fezes, com escore variando de 0 a 12 (adaptado de SHON et al., 2015). Para a coleta dos dados do DAI, os animais foram pesados diariamente após os testes comportamentais, o material fecal foi coletado para detecção de sangue oculto nas fezes e a consistência fecal avaliada até o dia 7 e/ou 9. A detecção de sangue oculto nas fezes foi determinada pela reação de Meyer-Johannessen (Biotec Reagentes Analíticos, Paraná, Brasil) ou por kit comercial (Hemoccult SENSA, Beckman Coulter, Inc, Estados Unidos). O peso do cólon foi determinado em gramas (g) e o
comprimento do cólon foi determinado em centímetros (cm) na necropsia no dia 7 e/ou 9.
Tabela 1. Escore de Índice de Atividade da Doença (DAI)
Nota: O valor de DAI foi calculado como as somas dos escores de perda de peso, consistência das fezes e presença de sangue nas fezes.
5.3. AVALIAÇÃO DA HIPERALGESIA MECÂNICA
A hiperalgesia mecânica foi avaliada utilizando o teste de von Frey. Nesse teste os animais permanecem isolados individualmente em um dispositivo de acrílico (7,5x7,5x15 cm) disposto sob uma plataforma de arame elevada para permitir o acesso a superfície ventral das patas traseiras e/ou abdômen. Em seguida, a hiperalgesia mecânica foi determinada pela aplicação de uma série graduada de filamento com gramatura que varia de 0,008; 0,02; 0,07; 0,16; 0,4; 1,4; e 2 g. Cada filamento foi testado 10 vezes em ordem crescente. O filamento de menor força para qual os animais apresentavam mais de 6 reações de retirada e lambida da pata e/ou abdômen foi contabilizado e considerado como limiar nociceptivo (adaptado de LATREMOLIERE et al., 2015). Antes do teste os animais foram habituados ao aparato por pelo menos 30 min.
Escore Perda de peso
Consistência das fezes Hematoquezia
0 0 Normal e bem
formadas Ausente
1 1 – 5%
2 6 –10% Mole e disforme Sangue oculto
3 11 – 15%
5.4. ATIVIDADE LOCOMOTORA
A locomoção espontânea foi avaliada por meio do teste de campo aberto. Após uma sessão de habituação com o aparato os animais foram colocados no centro do aparelho de campo aberto (40x60), com o piso dividido em 12 quadrados iguais. Os animais exploraram a arena durante 5 min, a atividade locomotora foi registrada usando uma câmera digital e calculada pelo número de quadrados cruzados com todas as patas (número de cruzamentos) (adaptado de AGUIAR et al., 2013).
5.5. EXTRAÇÃO DE TECIDO E MICRODISSECÇÃO
Para a coleta de amostras biológicas, ao final dos protocolos experimentais os animais foram privados de água e comida durante 4 h e depois eutanasiados por deslocamento cervical seguido de decapitação para coleta de sangue e amostras de cólon e pata. Amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo heparina e os leucócitos foram determinados em um contador hematológico (ABX Micros 60-OT, Horiba Instruments, Califórnia).
5.6. QUANTIFICAÇÃO DE IL-1β
O conteúdo de IL-1β foi determinado por ELISA em amostras de cólon (R&D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram pesadas e homogeneizadas (1:10, p/v), em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) contendo Tween-20 (0,05%), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 mM EDTA, 2 ng/mL de
aprotinina e 0,1 mM cloreto de benzemetônio, centrifugadas (3000 x g; 10 min; 4 ° C), e o sobrenadante obtido foi utilizado para a análise e a quantidade de proteína foi determinada (LOWRY et al., 1951). As concentrações de IL-1β foram estimadas por interpolação a partir de uma curva padrão por medidas colorimétricas a 450 nm (comprimento de onda de correção de 540 nm) em um leitor de placas ELISA (SprectaMax®). Os ensaios foram sensíveis a 1,5 pg/mL de IL-1β. Os resultados foram expressos em pg por mg de proteína (pg/mg de proteína).
5.7. ESCORE HISTOPATOLÓGICO DA COLITE
Amostras de cólon foram dissecadas e lavadas com solução salina. Pequenos pedaços de cólon foram fixados em solução tampão de formalina a 10%, desidratados em etanol e embebidos em parafina. Secções transversais de tecido (5 μm) foram desparafinizadas com xileno, coradas com hematoxilina e eosina e examinadas ao microscópio de luz. O escore histopatológico foi calculado com base nos sinais de perda epitelial, integridade da cripta e infiltrado inflamatório com escore variando de 0 a 9, conforme a Tabela 2 (adaptada de Akgun et al. 2005).
Tabela 2. Escore histopatológico da colite
Escore Perda epitelial Integridade das
criptas inflamatório Infiltrado
0 Ausente Intacta Ausente
1 Perda < 5% Perda < 10% Suave
2 Perda 5 - 10% Perda 10 - 20% Médio
