RAONÍ GONÇALVES DE SOUZA
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO A PARTIR DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE COPRODUTOS DE ATUM (Thunnus alalunga).
PIÚMA 2018
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO A PARTIR DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE COPRODUTOS DE ATUM (Thunnus alalunga).
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para aprovação na Disciplina de Projeto de Conclusão de Curso.
Orientador: Prof. Drº Marcelo Giordani Minozzo
PIÚMA 2018
Dados internacionais de catalogação na publicação (CIP) Bibliotecária responsável Ana Muller CRB6/ES 541
S729d Souza, Raoní Gonçalves de, 1989-
Desenvolvimento e Avaliação do hidrolisado proteico a partir da hidrolise enzimática de coprodutos de atum (Thunnus
alalunga) / Raoní Gonçalves de Souza. -- 2018.
56 f. : il. ; 30 cm.
Orientador : Marcelo Giordani Minozzo
Monografia (graduação) - Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, Coordenadoria de Curso Superior de Engenharia de Pesca, 2018.
1. Tecnologia de alimentos. 2. Atum (Peixe) – Subprodutos. 3. Atum (Peixe) - Hidrólise. I. Minozzo, Marcelo Giordani. II. Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma. III. Título.
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO HIDROLISADO PROTEICO A PARTIR DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE COPRODUTOS DE ATUM (Thunnus alalunga).
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, como requisito parcial título Bacharel em Engenharia de Pesca.
Aprovado em 06 de Dezembro de 2018.
Primeiramente a Deus, por ter me concedido a fé de nunca desistir dos meus sonhos, e esperança de seguir essa nova jornada em busca pelo conhecimento.
A minha família: em especial minha mãe, Eliza Venzi, pelo seu carinho, amor, companheirismo, assistencialismo e referência de vida; a meu pai André Luiz P Souza, meus irmãos: Odara G Souza e Rudá G Souza, por sempre acreditarem no meu potencial e pelo apoio incondicional em todas as minhas escolhas.
Ao professor, orientador e grande amigo Dr. Marcelo Giordani Minozzo, por ter aceitado essa jornada, confiando e dando apoio inestimável na realização desse trabalho.
Aos professores do GePP, MSc. Monique Ribeiro e Drª. Dayse Aline Silva Bartolomeu de Oliveira pelos conselhos, ajudas que foram essenciais para elaboração desse trabalho.
Aos parceiros de projeto: Letícia Benevides e João Vitor Castelo, pelo companherismo e apoio total nas análises em laboratórios.
A CLB (Coordenação de Laboratórios), Daniela Alves Sant’ana e Suzana Bianqini Menegrardo, pela paciência e ajuda durante as elaborações dos trabalhos nos laboratórios do Campus.
Aos amigos Diego César Crystello, João Lucas Menezes e Igor José Mota pelos momentos de distrações que fazem aliviar o stresse da jornada acadêmica e momentos difíceis, e por lembrar que a amizade é fundamental.
A professora: Drª. Flavia Spago pelos seus ensinamentos e didática, hoje eu entendo e agradeço o quanto você queria que nós estudássemos; aos professores: Clayton Peronico e Carlos Eduardo Guimarães, pelo pensamento crítico e não acreditar em tudo que dizem antes de pesquisar os dois lados e tirar minhas próprias conclusões. Ao Instituto Federal do Espírito Santo Campus Piúma pela oportunidade que me foi ofertada. E sempre bom aplicar um pouco dos conhecimentos adquiridos na construção de um mundo melhor, que estime os reais valores.
As capturas de atum e afins foram quase 7,5 milhões de toneladas. Atualmente, estima-se que mais de 70% do total de capturas de peixes são processadas, gerando uma grande quantidade de sólidos, resíduos e subprodutos, que frequentemente representam mais de 50% do peso total do peixe. Uma maneira de agregar valor ao resíduo de peixes é convertê-lo em hidrolisado proteico, as enzimas hidrolisam as proteínas, permitindo assim que o azoto seja mais solúvel, libertando os aminoácidos, tornando assim a massa hidrolisada a fonte de aminoácidos mais disponível. O objetivo desse trabalho foi desenvolver a fração protéica do hidrolisado a partir da hidrolização enzimática utilizando Alcalase® 2.4L. As análises foram efetuadas utilizando um planejamento fatorial 22 compostos central com duas variáveis
independentes: tempo entre 70 e 410 (minutos) e concentração de enzima entre (0,03 e 1,17%). Foram calculados a bromatologia da matéria prima, dos hidrolisados e das frações protéicas dos hidrolisados, o rendimento, grau de hidrólise e propriedades funcionais dos hidrolisados e das frações protéicas dos hidrolisados. Os resultados obtidos para a matéria prima foram de: umidade (70,72%), cinzas, (2,12%), lipídeos (3,69%), proteínas (22,81%) e carboidratos (0,66%), os hidrolisados apresentaram uma média de: umidade (77,45%), cinzas (1,05%), lipídeos (3,65%) e proteínas (16,67%). O maior grau de hidrólise foi do tratamento 1 (58,08%). Entre as frações protéicas dos hidrolisados, obtivemos os seguintes resultados para bromatologia: umidade (76,76%), cinzas (1,09%), lipídeos (1,02%) e proteínas (20,36%), um leve aumento em níveis protéicos após a centrifugação e remoção parcial do óleo. Para as propriedades funcionais observou as médias de: solubilidade (90,83%), índice de atividade emulsificante (28,21 m².g-1), índice de estabilidade de emulsão (0,067%),
capacidade de formação de espuma (88%) e estabilidade de espuma (60,83%). Os resultados de bromatologia e propriedades funcionais analisados, são considerados pela literatura, no entanto o coeficiente de regressão (r² = 0,52789) foi insatisfatório, necessitando ajustar o modelo matemático para representar o comportamento do grau de hidrólise frente as variáveis testadas no processo.
Palavra-chave: fração protéica do hidrolisado, hidrólise enzimática, hidrolisado de Thunnus alalunga.
Catches of tuna and the like were almost 7.5 million tonnes. Currently, it is estimated that more than 70% of total fish catches are processed, generating a large amount of solids, residues and by-products, which often represent more than 50% of the total fish weight. One way to add value to the fish residue is to convert it into a protein hydrolyzate, the enzymes hydrolyze the proteins, thus allowing the nitrogen to be more soluble, releasing the amino acids, thus making the hydrolyzed mass the most available source of amino acids. The objective of this work was to develop the protein fraction of the hydrolyzate from enzymatic hydrolysis using Alcalase® 2.4L. The analyzes were performed using a factorial design 22 with two independent variables: time between 70 and 410 (minutes) and enzyme concentration between (0.03 and 1.17%). The bromatology of the raw material, the hydrolysates and the protein fractions of the hydrolysates, the yield, degree of hydrolysis and functional properties of the hydrolysates and the protein fractions of the hydrolysates were calculated. The results obtained for the raw material were: moisture (70.72%), ash (2.12%), lipids (3.69%), proteins (22.81%) and carbohydrates (0.66%) , the hydrolysates had a mean of: moisture (77.45%), ash (1.05%), lipids (3.65%) and proteins (16.67%). The highest degree of hydrolysis was from treatment 1 (58.08%). Among the protein fractions of hydrolysates, we obtained the following results for bromatology: moisture (76.76%), ash (1.09%), lipids (1.02%) and proteins (20.36%), a slight increase in protein levels after centrifugation and partial oil removal. For the functional properties, the mean values of solubility (90.83%), emulsifying activity index (28.21 m².g-1), emulsion stability index (0.067%), foaming capacity (88% ) and foam stability (60.83%). The results of bromatology and functional properties analyzed are considered in the literature, however, the regression coefficient (r2 = 0.52789) was unsatisfactory, and it was necessary to adjust the mathematical model to represent the hydrolysis degree behavior in relation to the variables tested in the process.
Key words: hydrolyzed protein fraction, enzymatic hydrolysis, Thunnus alalunga hydrolyzate.
Tabela 01 - Ocorrência de espécies de atum em diferentes oceanos...16 Tabela 02 - Delineamento experimental do processo de hidrolise com tempo e
concentração de enzima...26
Tabela 03 - Composição centensimal da matéria prima de coprodutos de atum
(Thunnus alalunga)... 32
Tabela 04 - Físico-químicas de coproduto de atum (Thunnus alalunga) dos onze
tratamentos do hidrolisado proteico de pescado...33
Tabela 05 - Percentual de rendimento do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga), em
função do tempo (minutos) e variações de concentração de enzimas...35
Tabela 06 - Resultado do Grau de Hidrólise, dos 11 tratamentos de hidrolisado
protéico de pescado... 36
Tabela 07 - ANOVA; Var.:GH (%); r²=0,52789; Adj:0,05577 (Spreadsheet1) 2 Fatores,
1 Bloco, 11 Corridas; MS Erro Puro = 0,61 DV: Grau de Hidrólise (%)...38
Tabela 08 - Valores Críticos; Variável: GH (%) Valor máximo previsto na solução:
54,33%...40
Tabela 09 - Físico-químicas dos dez tratamentos da fração proteica do hidrolisado de
atum (Thunnus alalunga)...42
Tabela 10 - Resultado de Solubilidade, Índice de Atividade Emulsificante, Estabilidade
da Emulsão, Capacidade de Formação de Espuma e Estabilização de Espuma referente aos tratamentos da fração proteica de hidrolisado de coprodutos (vísceras e cabeças) de atum (Thunnus alalunga) com GH maior que 50%...43
Figura 01 - Esquema geral de processo de hidrólise protéica enzimática...21
Figura 02 - Gráfico de Pareto em função dos valores estatístico de teste T...39
Figura 03 - Relação entre os valores observados e previstos do grau de hidrólise...39
Figura 04 - Gráficos de superfície de resposta (GH %) em dois eixos...40
2 OBJETIVO 14 2.1 Objetivo Geral 14 2.2 Objetivo Específico 14 3 REVISÃO DE LITERATURA 15 3.1 O ATUM 15 3.2 COPRODUTOS 17
3.3 HIDROLISADO PROTEICO DE PESCADO 19
3.4 FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO 22
3.5 PROPRIEDADES FUNCIONAIS 23
4 MATERIAL E MÉTODOS 24
4.1 OBTENÇÃO DA MATÉRIA PRIMA 24
4.2 COMPOSIÇAO CENTESIMAL FÍSICO-QUÍMICA DA MATÉRIA-PRIMA 25
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 25
4.3.1 Produção do hidrolisado proteico de pescado 26 4.3.2 Rendimento dos hidrolisados protéicos desenvolvidos 27 4.4 COMPROSIÇAO CENTESIMAL DO HIDROLISADO PROTÉICO DE
COPRODUTO DE ATUM 27
4.5 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE HIDRÓLISE DOS HIDROLISADOS
PROTÉICOS DE COPRODUTO DE ATUM (Thunnus alalunga) 28 4.6 DESENVOLVIMENTO DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO 29 4.7 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
29 4.8 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS DA FRAÇÃO PROTÉICA DO
HIDROLISADO 29
4.8.1 Solubilidade 30
4.8.2 Atividade Emulsificante e Estabilidade de Emulsão 30
4.8.3 Propriedade de Formação de Espuma 31
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 32
5.3 RENDIMENTO DO HIDROLISADO DE ATUM (Thunnus alalunga) 34
5.4 GRAU DE HIDRÓLISE 35
5.5 ANALISE DA SUPERFÍCIE DE RESPOSTA 37
5.6 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO 41 5.7 PROPRIEDADES FUNCIONAIS DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
43
6 CONCLUSÃO 45
7 SUGESTÕES 46
1 INTRODUÇÃO
De acordo com a Food and Agriculture the United Nations (FAO) (2018), a produção total de captura nas águas marinhas foi de 79,3 milhões de toneladas em 2016. As capturas de atum e afins foram quase 7,5 milhões de toneladas. Os desembarques totais das principais espécies do mercado – atum voador (Thunnus alalunga), patudo (Thunnus obesus), atum rabilho (Thunnus thynnus, Thunnus maccoyii, Thunnus orientalis), gaiado (Katsuwonus pelamis) e albacora (Thunnus albacares) - foram de 4,8 milhões de toneladas. 2015 e demonstraram uma tendência continuamente crescente desde 1950. Em 2015, entre as sete espécies principais de atum, 43% das unidades populacionais foram estimadas em níveis biologicamente insustentáveis, enquanto que 57% foram pescadas em níveis biologicamente sustentáveis (pescado ao máximo subnutridos) (SOFIA, 2018). Uma série de outros países da América Latina e do Sudeste Asiático, particularmente os produtores de atum, também registraram um crescimento significativo no valor total das exportações. Juntamente com a recuperação da demanda do consumidor no Brasil e na Federação Russa, essas macro tendências apontam para o desenvolvimento contínuo de uma matriz cada vez mais diversificada de mercados para exportadores e produtores em todo o mundo (FAO, 2018).
A vasta distribuição destas espécies pelos três oceanos, especialmente por águas temperadas e tropicais, deu suporte a uma atividade de pesca massiva que continua nos dias de hoje (COSTA, 2013). A grande variedade de espécies de tunídeos e a qualidade da parte edível determinam o respetivo valor comercial (SUANZES-CARPEGNA, 2003).
Segundo Shahidi (2007), indústria do pescado é um setor amplo que inclui diversos processos de produção como filetagem, cura, salga, defumação, enlatamento, etc. Atualmente, estima-se que mais de 70% do total de capturas de peixes são processadas, gerando uma grande quantidade de sólidos, resíduos e subprodutos, que frequentemente representam mais de 50% do peso total do peixe. Rustad (2007), em seu trabalho, afirma que a média proporcional dos pescados
corresponde à: 49% porção edível, 6% pele, 7% vísceras, 10% aparas, 18% cabeça 10% espinha dorsal e carcaça.
A Política Nacional de Resíduos Sólidos, lei nº 12.305/2010, diz que é necessário dar uma correta destinação aos resíduos, sendo responsabilidade compartilhada dos geradores dos resíduos, dos fabricantes, importadores, distribuidores, comerciantes, do cidadão, incluído a destinação final ambientalmente adequada com a segurança necessária a minimizar os impactos ambientais adversos (BRASIL, 2010).
As vísceras de peixe são um dos resíduos mais importantes, contêm frações valiosas de proteínas e lipídios, bem como vitaminas e minerais (NGUYEN et al., 2011), mas também são uma importante fonte de contaminação ambiental. As regulamentações ambientais estão se tornando mais rigorosas, exigindo novos métodos para o gerenciamento desses subprodutos do pescado. Há muitas opções para o gerenciamento de resíduos de peixe que poderiam ajudar a resolver esses problemas.
Uma maneira de agregar valor ao resíduo de peixes é convertê-lo em hidrolisado (BHASKAR et al., 2008). As enzimas hidrolisam as proteínas, libertando os aminoácidos, tornando assim a massa hidrolisada a fonte de aminoácidos mais disponível (BENJAKUL & MORRISSEY, 1997). Além disso, os hidrolisados podem ser usados como ingredientes em alimentos na aquicultura e como uma fonte de nitrogênio eficaz em meios de crescimento microbiano (BHASKAR et al., 2008). Esse método pode ser utilizado para desenvolver hidrolisados proteicos de pescado, o
processo de hidrólise quebra as proteínas em cadeias peptídicas menores contendo 2-20 aminoácidos chamados hidrolisados (HALIM; YUSOF & SARBON, 2016).
A metodologia de superfícies de resposta auxilia os pesquisadores a averiguar processos complexos e é aplicada para otimizar as operações de processamento gerando um modelo matemático que descreve com precisão a definir condições de hidrólise otimizadas para a produção de hidrolisado. Ovissipour et al. (2010), dirigiu estudos de condições de hidrólise otimizadas para o grau de hidrólise avaliando as variáveis (tempo, temperatura e atividade enzimática da alcalase) que mostrou um
resultado significativamente influenciado pela enzima alcalase no grau de hidrose em vísceras de atum.
Os hidrolisados mais utilizados em aquicultura são oriundos de resíduos de pescado e podem possuir características nutritivas e funcionais capazes de substituir ou complementar a farinha de peixe nas dietas. Dentre as qualidades atribuídas aos hidrolisados destacam-se as propriedades biológicas, imunológicas e organolépticas tais como: excelente valor nutricional; compostos atóxicos; poder antioxidante, anti-hipertensivo e antimicrobiano; estimulação da imunidade não específica, com melhora na resistência a doenças e consequentemente aumento da sobrevivência; melhora na atividade enzimática intestinas; e alteração da expressão gênica espacial de um possível transportador de "di" e "tri" peptídeos. Em função das variadas qualidades, o uso de hidrolisados na dieta é proposto para diferentes fins, porém, na maioria das vezes tem sido utilizado como suplemento proteico, palatabilizante ou com função atrativa (AGUILA et al., 2007; BAKKE et al., 2010; CAHU et al., 1999; GOOSEN et al., 2014; KLOMPONG et al., 2007; KISTINSSON & RASCO, 2000; NGUYEN et al., 2012).
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver a fração protéica do hidrolisado a partir da hidrolise enzimática (utilizando a enzima Alcalase® 2.4L) de resíduos (cabeças e vísceras) do processamento do atum (Thunnus alalunga).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Avaliar a composição físico-química da matéria prima (Thunnus alalunga);
ii. Desenvolver hidrolisado proteico a partir de coprodutos de atum (Thunnus alalunga);
iii. Calcular o rendimento dos hidrolisados proteicos desenvolvidos; iv. Avaliar o grau de hidrólise dos hidrolisados proteicos desenvolvidos;
vi. Avaliar a probabilidade de otimizar o processo via técnica de superfície de resposta;
vii. Extrair a fração lipídica dos tratamentos da hidrólise enzimática (coprodutos) do atum (Thunnus alalunga);
viii. Avaliar a composição físico-química da fração protéica do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga);
ix. Avaliar a fração protéica de hidrólise enzimáticas com graus de hidrólise (GH) acima de 50% quanto às propriedades funcionais: Solubilidade, Índice de Estabilidade de Emulsão (IEE), Índice de atividade emulsificante (IAE),
Capacidade de Formação de Espuma (CFE) e Estabilidade de Espuma (EE).
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 O ATUM
As espécies de atum e afins tem grande importância econômica e são considerado uma fonte significativa de alimentos protéicos (FAO, 2018). Cada oceano tem suas próprias espécies específicas, como o atum rabilho (Thunnus thynnus) do atlântico, o atum rabilho do sul (Thunnus maccoyii) em partes do sul do Atlântico, Índico e Oceano Pacífico (FAO, 2010). Todavia, o atum patudo (Thunnus obesus), atum voador (Thunnus alalunga) podem ser capturados nos oceanos Pacífico, Índico e Atlântico (FAO, 2010).
O atum voador (Thunnus alalunga) é um peixe pelágico migratório da família Scombridae e está distribuído na maioria dos oceanos tropicais e temperados (COLLETTE & NAUEN, 1983). A captura comercial do atum voador é a mais alta globalmente das espécies de atum temperado, contribuindo com cerca de 6% em peso para as capturas globais de atum na última década (ISSF, 2011; FAO, 2012). Em comparação com a maioria das outras espécies de atum, o Thunnus alalunga é relativamente lento, de maturação tardia e tem um tempo de vida prolongado (GILLETT, 2013), o que o torna vulnerável à sobre-exploração (CAILLIET & ANDREWS 2008).
No ano de 2002 o estado do Espírito Santo representou (58%) do desembarque de atum, 24% das embarcações e 41% dos pescadores (MARTINS & DOXSEY, 2004). No município de Itapemirim, distrito de Itaipava, Espirito Santo, está instalado uma das principais empresas exportadoras de produtos pesqueiros do estado, a Atum do Brasil Ltda, que exporta para oito países, entre eles a União Européia, Estados Unidos e Canadá. A empresa processou aproximadamente 250 toneladas/mês de pescado. (VILA DOS PESCADORES, O SUSTENTO QUE VEM DO MAR, 2013).
De acordo com Kristinsson e Rasco (2000), mais de 50% do material restante da captura total de peixes e aquicultura não é utilizado, representando 79 milhões t-1 ano (FAO, 2014). O descarte proposto de resíduos causa uma série de processos biológicos e químicos no meio ambiente com potenciais impactos para os ecossistemas aquáticos e terrestres (LEITE et al., 2016). É exibido a seguir na Tabela 01, as ocorrências de atuns e seus expecíficos oceanos.
Tabela 01 - Ocorrência de espécies de atum em diferentes oceanos.
NOMES COMUNS NOME
CIENTÍFICO ÁREAS DE OCORRÊNCIA ATUNS E AFINS BONITO-LISTRADO Katsuwonus pelamis No mundo todo
GALHA AMARELA Thunnus
albacares
No mundo todo
ATUM PATUDO Thunnus obesus No mundo todo
ATUM VOADOR Thunnus alalunga No mundo todo
ATUM RABILHO DO ATLANTICO
Thunnus thynnus Oceano Atlântico
ATUM RABILHO DO PACÍFICO
Thunnus orientalis Oceano Pacífico
ATUM RABILHO DO SUL Thunnus maccoyii Partes do sul do Atlântico, Índico e Oceano Pacífico
ATUM LONGTAIL Thunnus tonggol Oceano Índico, Oceano Pacífico Ocidental
ATUM PRETO Thunnus
atlanticus
KAWAKAWA Euthynnus affinis Oceanos indianos, ocidentais e do Pacífico central
SALTEADOR PRETO Euthynnus
lineatus
Oceano Pacífico Oriental
BONITO-PINTADO Euthynnus
alleteratus
Oceano Atlântico
ATUM BALA Auxis rochei No mundo todo
FRIGATA DE ATUM Auxis thazard Oceanos Índico e Pacífico
ATUM MAGRO Allothunnus fallai Oceano do Sul
Fonte: (FAO, 2010)
3.2 COPRODUTOS
O uso do termo resíduo relaciona-se a todos os coprodutos e sobras do processamento de alimentos que são de baixo valor comercial. Em caso do pescado, o material residual pode ser composto de aparas do toilete ou limpeza antes do enlatamento, carne escura, peixes fora do tamanho ideal para industrialização, cabeças e carcaças (OETTERER, 1994).
Os coprodutos adquiridos no processamento do pescado em seu descarte têm a seguinte composição de compostos de músculo cortes (15-20%), pele (1-3%), ossos (9-15%), cabeças (9-12%), vísceras (12-18%) e escamas (5%) (MARTÍNEZ-ALVAREZ; CHAMORRO & BRENES, 2015).
Um atum eviscerado com cabeça é composto por 62% de carne comestível e 46% de filé de atum sem pele. As cabeças de peixe contêm relativamente pouca carne e geralmente são descartadas ou utilizadas como alimento para animais (ARASON, 2003). Os lombos e filés de atum normalmente constituem 37,1% e 17,9% de um atum sem cabeça, simultaneamente, as duas são partes principais aproveitadas pela indústria (STONE, 2007).
As vísceras de peixe, um dos coprodutos mais importantes, são uma fonte rica de lipídios poli-insaturados e proteínas, mas com baixa estabilidade de
armazenamento se não congelados ou preservados (RAA & GILDBERG, 1982; OVISSIPOUR & GHOMI, 2009).
Os coprodutos de processamento de pescado são uma ótima fonte de compostos de alta qualidade que podem ser usados para o consumo humano. Esses subprodutos podem ser uma grande fonte de produtos de valor agregado, como proteínas, aminoácidos, colágeno, gelatina, óleos e enzimas (GHALY et al., 2013). Além disso, até 10 - 20% (p / p) do total de proteína de peixe podem ser encontrados em subprodutos de peixe. Além disso, o teor de proteína bruta dos subprodutos de peixe varia de 8 a 35% (SILA & BOUGATEF, 2016). Os aminoácidos essenciais e peptídeos bioativos encontrados em proteínas de peixe têm grande potencial para uso na produção de drogas e alimentos funcionais (SILA & BOUGATEF, 2016). De modo a recuperar proteínas e péptidos de coprodutos de peixe, foram desenvolvidos vários métodos, tais como hidrólise ácida ou alcalina, autólise e hidrólise enzimática. As proteínas de peixes não hidrolisadas não possuem estas propriedades devido à fraca acessibilidade à sequência peptídica funcional (GHALY et al. 2013; KIM & WIJESEKARA, 2010).
Entre outras formas de aproveitamento de coprodutos produzidos estão: os isolados para cosméticos (colágeno) (NAGAI & SUZUKI, 2000), biogás / biodiesel (óleo) (KATO et al.,2004), fertilizantes, aplicações como dietéticos e embalagens alimentícias (gelatina, quitosana) (KUMAR, 2000); (ARVANITOYANNIS; NAKAYAMA & AIBA, 1998), isolamento da enzima (protease) (TAVARES; BAPTISTA & MARCONE, 1997); (ZHANG; YAMASHITA & NOZAKI, 2002) e pigmentos naturais (carotenóides) (SHAHIDI; METUSALACH & BROWN, 1998); (SACHINDRA; BHASKAR & MAHENDRAKAR, 2006).
A expansão do processamento de peixe está criando quantidades crescentes de coprodutos, que podem constituir até 70% dos peixes usados no processamento industrial. Os subprodutos de peixe, especialmente quando contêm vísceras, deterioram-se muito rapidamente e, por isso, é importante que sejam preservados o mais rapidamente possível após terem sido produzidos. Isto nem sempre é possível devido, por exemplo, a instalações de processamento inadequadas ou a volumes limitados, tornando a recuperação dos coprodutos não lucrativa. O processamento industrial moderno é geralmente realizado de forma gradual, criando fluxos separados
de coprodutos que podem ser atendidos e diversificados em diferentes produtos finais. (OLSEN, TOPPE & KARUNASAGAR, 2014).
Os coprodutos de peixe podem servir a uma ampla gama de propósitos. Cabeças, molduras e cortes de filé e pele podem ser usados diretamente como alimento ou processados em salsichas de peixe, bolos, lanches (salgadinhos crocantes, nuggets, biscoitos, tortas), gelatina, molhos e outros produtos para consumo humano. Pequenos ossos de peixe, com uma quantidade mínima de carne, são consumidos como salgadinhos em alguns países asiáticos. Os subprodutos são também utilizados na produção de alimentos para animais (não apenas sob a forma de farinha de peixe e óleo de peixe), biodiesel e biogás, produtos dietéticos (quitosana), produtos farmacêuticos (incluindo óleos), pigmentos naturais, cosméticos e constituintes noutros processos industriais. . Alguns subprodutos, em particular vísceras, são altamente perecíveis e devem, portanto, ser processados enquanto ainda frescos. Vísceras de peixe e quadros são uma fonte de potencial produtos de valor agregado, como peptídeos bioativos para uso em suplementos alimentares e nas indústrias biomédica e nutracêutica (SENEVIRATHNE & KIM, 2012).
3.3 HIDROLISADO PROTEICO DE PESCADO
O Fish Protein Hydrolysated (FPH), conforme denominado pela FAO (Food and Agriculture Organization), pode atingir a uma concentração de proteína de 90%, além de proporcionar propriedades funcionais benéficas para a indústria alimentícia (OETTERER, 2001).
A produção de hidrolisados de proteína é maciça em todo o mundo. Os métodos mais amplamente utilizados para a produção de hidrolisados proteicos em práticas industriais são métodos químicos e biológicos. Métodos químicos envolvem hidrólise ácida e alcalina. Uma vez que estes são métodos relativamente baratos e fáceis de operar, eles têm sido as práticas preferidas para produzir hidrolisados de proteína em escala industrial. No entanto, a hidrólise química é difícil de controlar devido à sua reação severa e clivagem de ligações peptídicas inespecíficas, dando um rendimento
heterogêneo de peptídeos e reduz a qualidade nutricional dos produtos (CELUS et al., 2007). Por outro lado, os métodos bioquímicos incluem autólise e hidrólise enzimática.
O processo de autólise envolve a ação de enzimas proteolíticas endógenas (endo- e exo-proteases) nas proteínas animais. A principal limitação da produção de peptídeos bioativos ou produtos de valor agregado pela hidrólise autolítica é a funcionalidade reduzida e a dificuldade de se obter um hidrolisado homogêneo. No entanto, alguns autores também produziram hidrolisados protéicos via hidrólise térmica ao replicar a matéria-prima em autoclave a 121 ° C (WANG et al., 2013) ou por fermentação bacteriana (JEMIL et al., 2014).
A hidrólise enzimática é um processo realizado sob condições moderadas de pH e temperatura. Além disso, é um processo específico com um fácil controle do grau de hidrólise, bem como permite reter o valor nutricional da proteína fonte. Neste processo, várias enzimas proteolíticas são comumente usadas para hidrolisar as proteínas e convertê-las em produtos de alto valor agregado com propriedades funcionais, biológicas e nutricionais (KRISTINSSON & RASCO, 2000; SHAHIDI et al., 1995). Os hidrolisados protéicos são proteínas divididas em peptídeos que contêm entre 2 e 20 aminoácidos. Nesse processo, a fonte não só mantém um alto teor de aminoácidos essenciais como também gera outras atividades com potencial uso como aditivos alimentares (GARCÍA-MORENO et al., 2014; PASUPULETI & BRAUN, 2010) como antioxidante, anti-hipertensivo, antitrombótico, imunomodulador, antimicrobiano, entre outros (KIM & WIJESEKARA, 2010).
Várias enzimas proteolíticas são comumente usadas para hidrolisar proteínas subprodutos que incluem Alcalase, papaína, pepsina, tripsina, alfa-quimotripsina, pancreatina, flavourzima, pronase, Neutrase, Protamex, bromelina, criotina F, protease N, protease A, Orientase, termolisina e Validase (HSU, 2010; JE et al., 2007; NGO et al., 2010; RAGHAVAN & KRISTINSSON, 2008). A fim de obter peptídeos bioativos com propriedades funcionais, é essencial controlar o tempo de hidrólise e estabelecer valores ideais de pH e temperatura para otimizar a atividade enzimática.
O processo de preparação de FPH (Figura 01) abrange uma moagem da matéria-prima, ocasionando em adição e homogeneização com volume de água destilada até obtenção de uma massa viscosa (GONÇALVES, 2011). A seguir é checado o grau de
hidrólise pretendido, a reação enzimática tem que ser parada para que a enzima não continue a hidrolisar as proteínas e os peptídeos. Essa desativação é obtida por meios térmicos ou químicos. Na desativação térmica, a mistura racional é aquecida a temperaturas entre 75 e 100º C durante 5 a 30 minutos, variando da enzima enquanto que na inativação química, é conseguida também por meio do aumento ou da diminuição do pH do meio reacional para valores nos quais a enzima é inativada (GONÇALVES, 2011).
Fonte: (GONÇALVES, 2011).
Figura 01 - Esquema geral de processo de hidrólise protéica enzimática. Hidrolisado seco
Moagem Matéria prima (Peixe inteiro, subprodutos)
Homogeneização Adição de água
Controle de PH e temperatura (De acordo da enzima)
Hidrólise
Centrifugação/filtração
Inativação de enzima na temperatura 80 º por30 minutos
Fração solúvel
Adição de enzima
Óleo Fração insolúvel
3.4 FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
A FPH pode ser purificada por vários métodos, dependendo do uso final dos hidrolisados, que são a centrifugação (extração do óleo), a nanofiltração, a ultrafiltração, a microfiltração e a cromatografia de troca iônica (PASUPULETI & BRAUN, 2010). A centrifugação tem sido a mais utilizada das anteriores, a partir das quais quatro fases são obtidas: fração de óleo e camada de emulsão (RAMAKRISHNAN et al., 2013; ŠLIŽYTĖ et al., 2005).
Todos os tipos de hidrolisados devem ser armazenados levando em conta parâmetros como umidade e temperatura de transição vítrea, que geralmente tendem a diminuir enquanto o grau de hidrólise está aumentando (RAO; KLAASSEN KAMDAR & LABUZA, 2016). Portanto, a FPH é comumente armazenada abaixo de 0° C para garantir a estabilidade ao longo do tempo (AMBIGAIPALAN & SHAHIDI, 2008; DONG et al., 2008).
É digno de nota que têm sido propostos processos subsequentes escala de laboratório para separar fracções de péptidos diferentes de acordo com o peso molecular, porque a relação entre o tamanho do péptido e determinado bioactivo e propriedades antioxidantes tem sido demonstrada em vários estudos. No entanto, existem dificuldades para a escala industrial no momento (ROBERT et al., 2015).
Os aminoácidos têm um papel importante na síntese protéica como compostos transportadores de hidrogênio, vitaminas, dióxido de carbono, enzimas e proteínas estruturais (CHALAMAIAH; HEMALATHA & JYOTHIRMAYI, 2012) e também influenciam as propriedades bioativas e funcionais. FPH tem todos os aminoácidos essenciais e não essenciais, razão pela qual eles são considerados fontes nutricionais elevadas.
Segundo Samardi & Ismail (2010), os peptídeos bioativos devido a seus papéis biológicos que são benéficos para a saúde humana são úteis para a indústria de alimentos (WU et al., 2015). Cadeias curtas de aminoácidos que são inativas dentro da proteína precursora. (HAYES & FLOWER, 2013). O desempenho de hidrolisados de várias fontes de proteína de peixe como agentes antioxidantes, anti-hipertensivos
e antimicrobianos tem sido relatado (RYAN et al., 2011). Souissi et al. (2007) avaliaram hidrolisados obtidos de cabeças e vísceras de sardinha Sardinella auritaem com a eliminação do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH) e na inibição da auto-oxidação do ácido linoleico, os resultados indicam que os péptidos acima mencionados exibiram mais de 50% de inibição da peroxidação do ácido linoleico e uma atividade antioxidante de cerca de 41%. Kumar, Nazeer e Jaiganesh (2011), purificaram e caracterizaram um peptídeo antioxidante da proteína Magalaspis cordyla, viscera de carapau, cuja seqüência foi determinada como Ala-Cys-Phe-Leu (518,5 Da), apresentando 59,1 e 89,2% de eliminação de radicais hidroxila e DPPH, respectivamente. Também foi encontrado para ser melhor do que α-tocoferol em termos de inibição da peroxidação lipídica. Nazeer e Kumar (2011), evidenciaram que os hidrolisados proteicos de vísceras de peixe obtidos de Parastromateus niger têm um efeito protector no ADN contra os danos causados pelos radicais hidroxilo.
3.5 PROPRIEDADE FUNCIONAIS
As propriedades funcionais da proteína podem ser melhoradas pela hidrólise enzimática sob condições controladas (QUAGLIA & ORBAN, 1990). A hidrólise pode influenciar o tamanho molecular, a hidrofobicidade e os grupos polares do hidrolisado (KRISTINSSON & RASCO, 2000). As características do hidrolisado afetam diretamente as propriedades funcionais e os usos como ingredientes alimentares (KRISTINSSON & RASCO, 2000). O hidrolisado possui uma excelente solubilidade em alto grau de hidrólise (GBOGOURI et al., 2004; QUAGLIA & ORBAN, 1990; SHAHIDI et al., 1995). A alta solubilidade do hidrolisado de proteína de peixe numa larga gama de pH é uma característica substancialmente útil para muitas aplicações alimentares. Além disso, influencia as outras propriedades funcionais, como as propriedades emulsificantes e espumantes (GBOGOURI et al., 2004; KRISTINSSON & RASCO, 2000). No entanto, um grau muito alto de hidrólise pode ter efeitos extremamente negativos nas propriedades funcionais (KRISTINSSON & RASCO, 2000). Maior capacidade de emulsificação e estabilidade da emulsão foram notáveis quando o grau de hidrólise foi baixo para o hidrolisado de subproduto de salmão
(GBOGOURI et al., 2004) e hidrolisado de sardinha (QUAGLIA & ORBAN, 1990). Shahidi et al. (1995) também relataram boas propriedades de formação de espuma para hidrolisados de proteína capelina preparados pela Alcalase em baixo grau de hidrólise.
Além de suas funcionalidades, proteínas hidrolisadas de diferentes fontes, como soro, proteína de soja (PENA-RAMOS & XIONG, 2003), gema de ovo (SAKANAKA et al., 2004), camarão (SUETSUNA, 2000), suco de cozimento de atum (JAO & KO, 2002), quadro de albarda (JUN; PARK; JUNG, & KIM, 2004), arenque (SATHIVEL et al., 2005) , cavala (WU, CHEN, & SHIAU, 2003) e capelim (AMAROWICZ & SHAHIDI, 1997), foram encontrados para possuir atividade antioxidante.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA
Os coprodutos (vísceras, nadadeira e cabeça) do atum Thunnus alalunga, foram obtidos em doação pela empresa Estrela do Mar, situada no bairro Monte Aghá I no município de Piúma/ES. O pescado doado foi identificado pelo técnico de controle de qualidade como sendo proveniente do município Prado/BA.
As amostras recém selecionadas após o processamento, foram transportadas sem separação em caixas isotérmicas contendo gelo até o Laboratório de Alimentos do Instituto Federal do Espírito Santo Campus Piúma onde foram trituradas por um multiprocessador Becker GO (modelo Prab 200) em uma granulometria de cinco milímetros, apresentando aparência de carne moída. Posterior ao processo de moagem, a matéria-prima foi estocada e acondicionada em sacos assépticos com 1kg de amostra sendo devidamente identificadas e armazenadas em freezer à -20ºC até o início dos testes.
A Alcalase 2.4L® foi obtida da Novozymes Latino Americana Ltda (Paraná, Brasil). Os reagentes de grau analítico foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA).
4.2 COMPOSIÇAO CENTESIMAL FÍSICO-QUÍMICA DA MATÉRIA-PRIMA
As análises físico-químicas foram feitas para a matéria prima de coproduto de atum (Thunnus alalunga). Os presentes testes resume-se em, análise de umidade (950.46), proteína (94025), cinzas (920.153), seguinto a metodologia oficial definidas pela AOAC (2010). A metodologia para definição de liípeos foi de acordo com o método mais usado, Bligh e Dyer (1959). Todos os testes foram feitos em triplicatas, sendo a média dos resultados obtidos expressos em g/100g de matéria prima.
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O método definido por Pearce Kinsella (2017) que define o tempo de reação e concentração de enzima, são imprescindíveis no desenvolvimento de hidrolisados protéicos, uma vez que estes fatores (tempo x concentração de enzima) estão absolutamente relacionados às características do hidrolisado protéico de pescado.
Esse estudo posteriormente vai gerar uma variável dependente que é o grau de hidrólise, onde o processo de hidrólise enzimática de coprodutos de atum (Thunnus alalunga) foi governado por um planejamento fatorial com duas variáveis independentes – Tempo de processo X1 (em minutos) e concentração de enzima X2
(% p/v), compostos por três partes, obtidos e auxiliados pelo software Statistica®. O delineamento experimental foi composto por três partes: ensaio fatorial, contendo quatro pontos (22); pontos axiais, e analise do central com pontos. Os
resultados em pseudocomponentes e os pontos e tratamentos do processo estão definidas na Tabela 02.
Tabela 02 - Delineamento experimental do processo de hidrolise com tempo e concentração de enzima.
Variáveis codificadas
Tempo (min) Concentração.
de enzima (%) Tratamento X1 X2 1,00000 1,00000 360 1,00 T-1 -1,00000 -1,00000 120 0,20 T-2 -1,00000 1,00000 120 1,00 T-3 -1,41421 0,00000 70 0,60 T-4 0,00000 (c) 0,00000 (c) 240 0,60 T-5 0,00000 1,41421 240 1,17 T-6 1,00000 -1,00000 360 0,20 T-7 1,41421 0,00000 410 0,60 T-8 0,00000 (c) 0,00000 (c) 240 0,60 T-9 0,0000 (c) 0,00000 (c) 240 0,60 T-10 0,00000 -1,41421 240 0,03 T-11 Fonte: Autor.
NOTA: X1 = Tempo, X2 = Concentração de Enzima correspondentes a pseudocomponentes, C = central.
4.3.1 Produção do hidrolisado proteico de pescado
O hidrolisado protéico de coproduto de atum (Thunnus alalunga) (FPH) foi obtido de acordo com a metodologia descrita por Dieterich et al., (2014).
Os coprodutos de atum (Thunnus alalunga), foram previamente descongelados em temperatura de refrigeração (5 – 10º C), inseridos no reator de parede dupla (modelo MSM 502 / 5000 / ESP), encamisado, com capacidade máxima de 5kg e aquecido em banho ultratermostático (modelo SOLAB SL 152) com regulagem de temperatura. A temperatura média do hidrolisado variou entre 61 – 65º C, e o pH entre 6,2 à 6,5.
Os onze tratamentos de hidrolisado de pescado foram previamente pesados, diluiu-se o coproduto de atum (Thunnus alalunga) em água destilada numa proporção de 30% do peso total das amostras, a enzima Alcalase® 2.4L foi adicionada à diluição após as amostras atingirem a temperatura ótima de atuação (60 – 65º C) em proporção descritas na Tabela 2 e agitação em centrífuga a 200 rpm constante. O
tempo de reação variou entre 70 e 410 min. Durante o processo foram feitas aferições de pH e temperatura, sendo que a temperatura foi mantida entre entre a faixa de ótima atuação para a enzima. O encerramento do processo foi feita por inativação enzimática através da desnaturação térmica (80 – 85º C) durante 30 minutos.
4.3.2 Rendimento dos hidrolisados protéicos desenvolvidos
Após a hidrolise, o produto foi filtrado por peneira de inox (1.0 mm) para a separação dos ossos e posterior cálculo de rendimento conforme a Equação 1. Finalizando as etapas, o produto obtido foi submetido ao congelamento a -20º C, até o momento das próximas etapas.
Equação 1.
Rendimento (%) = HIdrolisado filtrado sem osso
Hidrolisado com osso *100
4.4 COMPROSIÇAO CENTESIMAL DO HIDROLISADO PROTÉICO DE COPRODUTO DE ATUM
O processo de composição centesimal foram realizados para o hidrolisado protéico de atum (Thunnus alalunga). Os testes consistiram em, análises de umidade (950.46), proteína (94025), cinzas (920.153), de acordo com os métodos oficiais da AOAC (2010). Foram realizadas essas análises citadas para os onze tratamentos, a metodologia utilizada para a análise de lipídeos foi usado o método mais tradicional, Bligh e Dyer (1959). As análises foram realizadas em triplicata, sendo a média dos resultados expressas em g/100g de matéria úmida.
4.5 DETERMINAÇÃO DO GRAU DE HIDRÓLISE DOS HIDROLISADOS PROTÉICOS DE COPRODUTO DE ATUM (Thunnus alalunga)
A determinação do Grau de Hidrólise (GH) foi testado para os onze formulações de hidrolisado protéico de pescado desenvolvidas. Para tanto, utilizou-se o método sugerido por Church et al. (1983) e modificado por Nielsen et al. (2001), método conhecido pelo uso do OPA (o-ftaldeído). Este método baseia-se na reação de grupos amino primários com OPA, sendo esta monitorada a 340nm em espectrofotômetro (Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis), utilizando Serina como padrão.
O padrão usando 3 mL de solução O-ftaldialdeído (OPA) foram adicionados a 400 µL (40mg/mL) de serina, na amostra foram utilizados 3 mL de solução O-ftaldialdeído e posteriormente mais 400 µL (40mg/mL) de amostra, foram submetidos à agitação em agitador vortex (Phoenix Luterco AP56), após dois minutos, foi efetuado a leitura em espectrofotômetro a 340nm em espectro (modelo Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis), utilizando a L-SERINA como padrão. O grau de hidrolise foi então calculado de acordo com a seguinte equação: Onde: W é o peso em gramas do hidrolisado e N é o total de nitrogênio da amostra.
Equação 2. GH =[Abs amostra − Abs branco]
[Abs padrão − Abs branco] ∗
[0,9516×10]
[𝑊×𝑁×6,5] − 0,4 × 100
8,6 Fonte: Church et al., (1983).
a. DESENVOLVIMENTO DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
A fração protéica do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga) foi obtido a partir de centrifugação utilizando centrífuga (modelo Avanti J-30 I) à 15000 rpm durante 20 minutos. O óleo foi removido da porção superior, deixando nas partes inferiores a proteína insolúvel seguindo da proteína solúvel configurando a fração protéica do hidrolisado.
4.7 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
As análises físico-químicas para a composição centesimal foram feitas para as frações protéicas dos hidrolisados de atum (Thunnus alalunga). Os presentes testes resume-se em, análise de umidade (950.46), proteína (94025), cinzas (920.153), seguinto a metodologia oficial definidas pela AOAC (2010). A metodologia para definição de lipídeos foi de acordo com o método mais usado, Bligh e Dyer (1959). Todos os testes foram feitos em triplicatas, sendo a média dos resultados obtidos expressos em g/100g de matéria prima.
4.8 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
Às propriedades funcionais das frações protéicas do hidrolisados de atum (Thunnus alalunga), foram realizados testes a partir das amostras que apresentaram Grau de hidrólise (GH) maior que 50%, visto que a viabilidade funcional de sua produção se dá para hidrolisados com mais de 45% de suas proteínas clivadas, seja ela por meio químico ou enzimático (KLOMKLAO; BENJAKUL, 2016).
4.8.1 Solubilidade
A solubilidade das frações protéicas dos hidrolisados de atum (Thunnus alalunga) foram determinadas de acordo com a metodologia proposta por Lowry, Rosebrough e Farr (1951), utilizando a dispersão em água destilada com ajuste de pH e posterior centrifugação à 3000 rpm por 10 minutos em centrífuga (modelo Shimatzu 5RTX). A solubilidade foi calculada de acordo com a Equação 3.
Equação 3.
Solubilidade (%) =
Fonte: Lowry, Rosebrough & Farr (1951).
4.8.2 Atividade Emulsificante e Estabilidade de Emulsão
As propriedades emulsificantes das frações protéicas dos hidrolisados (Thunnus alalunga), sendo estas, Índice de atividade emulsificante (IAE) e Índice de estabilidade da emulsão (IEE), foram determinadas de acordo com o método definido por Pearce e Kinsella (2017), com leitura da solução diluída em espectrofotômetro a 500 nm, e cálculo mostrados nas equações 4 e 5 respectivamente:
Equação 4:
Fonte: Pearce & Kinsella (2017).
Sendo:
A = absorvância a 500 nm;
c = concentração de proteína (g/mL)
Conteúdo de proteína no sobrenadante x 100 Conteúdo total de proteína na amostra
IAE (m2 / g) = (2 x 2.303 x 100 x A) (c x 0,25 x 10000)
Equação 5.
Fonte: Pearce & Kinsella (2017).
Sendo:
A0 = absorvância inicial
A10 = absorvância após 10 minutos.
4.8.3 Propriedade de Formação de Espuma
A propriedade de formação de espuma das frações protéicas dos hidrolisados de atum (Thunnus alalunga) foram definidas a partir do método proposto por Sathe e Salunkhe (1981), onde ocorre a homogeneização de 20 ml de amostra a 16.000 rpm, usando um homogenizador (IKA T 50 digital ULTRA-TURRAX) para incorporar o ar por 2 min em temperatura ambiente. As amostras batidas foram imediatamente transferidas para um cilindro de 25 ml e o volume total foi lido após 30 s, os cálculos foram demonstrados nas equações 6 e 7.
Equação 6.
Sendo:
A = Volume após a agitação B = Volume antes da agitação
Equação 7.
Fonte: Sathe e Salunkhe (1981).
IEE (min) = (A0 x 10)
(A0 – A10)
Capacidade de Formação de Espuma (%) = (A – B) B
x 100
Estabilidade de Espuma (%) = (A – B)
B
Sendo:
A = Volume após estabilização B = Volume antes da agitação
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram tratados em média, o desvio padrão. A análise de variância ANOVA e teste de Turkey ao nível de 5%, e o gráfico de superfície de resposta foram realizados com o software STATISTICA® 10 (Statsoft, Tulsa, USA).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 COMPOSIÇÃO CEMTENSIMAL DA MATÉRIA PRIMA UTILIZADA
Os resultados das análises físico-químicas, de matéria prima utilizada (Thunnus alalunga) de pescado estão apresentados na Tabela 03.
Tabela 03 - Composição centensimal da matéria prima de coprodutos de atum (Thunnus alalunga). ANÁLISES RESULTADOS (%)¹ UMIDADE 70,72 ± 0,70 CINZAS 2,12 ± 0,06 LIPÍDEOS 3,69 ± 0,37 PROTEÍNAS 22,81 ± 0,14 CARBOIDRATOS 0,66 Fonte: Autor.
¹ Os resultados são valores médios de três determinações ± desvio padrão com excessão dos carboidratos.
Segundo os resultados obtidos por Ovissipour et al. (2010) que trabalharam com otimização (atividade de enzima, temperatura e tempo de reação) da hidrólise enzimátiva de resíduos viscerais de atum (Thunnus albacares), utilizando a enzima Alcalase® 2.4L, a composição físico-químico da matéria prima obteve um resultado
de: 21,5% de proteína, 5,08% de lipídio, 69,66% de umidade e 4,46% de cinzas. Esses resultados corroboram com os determinados nesse trabalho, com uma pequena variação nos níveis de lipídeos (3,69%) e cinzas (2,12%), possivelmente essa variação pode ter ocorrido devido ao diferente tipo de coproduto (vísceras e cabeças) utilizado no presente estudo.
Nguyen et al. (2011) citam em sua pesquisa, que os coprodutos (vísceras, cabeças e nadadeiras caudais) de atum apresentam nas composições físicos-químicas uma variação de umidade entre (58 - 77%) e níveis de proteína médio entre (15 - 17%) diferindo principalmente em seus conteúdos de lipídeos (3,3 - 13%) e cinzas (1,9 - 20,5%).
5.2 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DO HIDROLISADO
Os resultados das análises físico-químicas de coprodutos de atum (Thunnus alalunga) dos onze tratamentos desenvolvidos de hidrolisado protéico de pescado estão apresentados na Tabela 04.
Tabela 04 - Físico-químicas de coproduto de atum (Thunnus alalunga) dos onze tratamentos do hidrolisado proteico de pescado.
Amostras Análises¹
Umidade (%) Proteína (%) Lipídeo (%) Cinza (%) T-1 75,34 d ± 0,30 18,34 a ± 0,07 3,96 b ± 0,07 1,15 ab ± 0,04 T-2 72,52 e ± 0,37 18,34 a ± 0,48 5,57 a ± 0,21 1,26 a ± 0,53 T-3 72,93 e ± 0,33 18,37 a ± 0,09 5,71 a ± 0,21 1,22 a ± 0,00 T-4 77,20 c ± 0,18 16,93 b ± 0,20 3,56 b ± 0,41 0,91 bc ± 0,02 T-5 80,34 ab ± 0,11 14,24 d ± 0,30 3,57 b ± 0,33 0,91 bc ± 0,05 T-6 81,46 a ± 0,20 18,42 a ± 0,43 0,13 d ± 0,06 0,83 c ± 0,02 T-7 79,37 b ± 0,33 15,92 c ± 0,06 2,51 c ± 0,16 1,24 a ± 0,00 T-8 77,31 c ± 0,61 17,31 b ± 0,30 3,47 b ± 0,11 1,31 a ± 0,01 T-9 81,61 ab ± 0,63 14,13 d ± 0,29 2,62 c ± 0,33 0,81 c ± 0,05 T-10 80,16 ab ± 0,13 14,41 d ± 0,49 3,66 b ± 0,18 0,83 c ± 0,01 T -11 74,63 d ± 0,13 16,97 b ± 0,20 5,36 a ± 0,39 1,14 ab ± 0,03
¹ Os resultados são valores médios de três determinações ± desvio padrão.
Segundo os estudos de Oliveira et al. (2017), com produção de peptídeos antioxidantes de atum (Thunnus albacares) via hidrólise enzimática, apresentaram os seguintes resultados das análises físico-químicas do hidrolisado: 71,57% de umidade, 10,39% de proteínas, 2,55% de lipídeos e 7,93% de cinzas, esses são valores aproximados obitidos no projeto exposto.
Analisando os valores obtidos das análises físico-químicas, foi possível perceber que houve diferenças significativas (p < 0,05) entre a composição centesimal dos tratamentos de analisados. Os valores de umidade e cinzas obtido no presente estudo variaram entre (72,52 - 81,61%) e (0,81 - 1,31%) respectivamente (Tabela 04). Possivelmente os resultados inferiores de umidade T-2 e T-3 (72,52 - 72,93%), influenciaram no baixo valor de GH (42,31 - 43,52%), mostrado a seguir (Tabela 05). Os tratamentos T-6, T-3, T-2 e T-1, obtiveram os maiores resultados para proteína, variando entre (18,34 - 18,71%), enquanto o T-5, T-9 e T-10 obtiveram os níveis mais baixos (Tabela 04). Os estudos de Oetterer, Spoto e Darce (2006) observaram um alto teor protéico em hidrolisados de pescado (15 - 25%) corroborando com o presente estudo, segundo os autores, esse nível de proteína torna o produto mais nutritivo.
Em relação aos valores de lipídeos, obteve valores estatisticamente semelhantes entre si, nos tratamentos T-1, T-4, T-5, T-8 e T-10 variando entre (3,47 - 3,96%), os que obtiveram maior teor de lipídeos foram os T-2, T-3 e T-11 (5,36 - 5,71%), no T-6 pode-se observar um menor valor 0,13% (Tabela 04). Supostamente pode ter calhado a absorção de gordura, resultando principalmente no aprisionamento dos ácidos graxos, sendo assim, uma maior densidade protéica em massa, equivale a uma maior absorção de gordura (TANUJA et al. 2012).
5.3 RENDIMENTO DO HIDROLISADO DE ATUM (Thunnus alalunga)
O rendimento dos onze tratamentos desenvolvidas para o hidrolisado de atum (Thunnus alalunga) são expressos em porcentagem (%) e encontra-se evidenciado na Tabela 05.
Tabela 05 - Percentual de rendimento do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga), em função do tempo (minutos) e variações de concentração de enzimas.
TRATAMENTOS CONCENTRAÇÃO DE
ENZIMA TEMPO (MIN) RENDIMENTO (%)
1 1,00 360 90,41 2 0,20 120 84,21 3 1,00 120 85,51 4 0,60 70 90,81 5 0,60 240 89,15 6 1,17 240 81,22 7 0,20 360 87,23 8 0,60 410 87,66 9 0,60 240 89,05 10 0,60 240 89,15 11 0,03 240 80,95 Fonte: Autor.
Após a realização dos experimentos, foi calculado o rendimento entre os onze tratamentos de hidrolisado protéico de coprodutos (cabeças e vísceras) de atum (Thunnus alalunga) de acordo com a equação 1, demonstrada no item 4.3.2. Obteve-se o valor máximo de 90,81% (Tratamento 4) e mínimo de 81,22% (Tratamento 6) (Tabela 5).
Após a filtragem e separação do hidrolisado, foram gerados resíduos, como ossos, que estavam presentes na matéria prima, antes do processo de hidrólise enzimática. A remoção desses ossos é necessária para facilitar a utilização do produto. Segundo Nagai e Suzuki (2000), esses resíduos podem ser empregados na extração de colágeno de alta qualidade e rendimento (de 36 - 54% de colágeno). Que pode ser usado como suplemento alimentar, aplicando para o equilíbrio do cálcio e do fósforo.
5.4 GRAU DE HIDRÓLISE
Os valores dos graus de hidrólise estão expressos na Tabela 06, apresentando suas variações entre as os tratamentos
Tabela 06 - Resultado do Grau de Hidrólise, dos 11 tratamentos de hidrolisado protéico de pescado.
Tratamendo Tempo (min)
Concentração. da
enzima (%) Grau de hidrolisado (%)
1 360 1 58,08 2 120 0,2 42,31 3 120 1 43,52 4 70 0,6 51,13 5 240 0,6 52,23 6 240 1,17 51,76 7 360 0,2 47,46 8 410 0,6 43,12 9 240 0,6 52,60 10 240 0,6 53,60 11 240 0,03 45,86 Fonte: Autor.
Posterior aos experimentos realizados, verificou-se que o grau de hidrólise (GH %) dos tratamentos realizados, apresentaram o valor máximo de 58,08% (Tratamento 1) que utilizou 1% de enzima (Alcalase® 2.4L) em um período de 360 minutos (Tabela 6) e a mínima de 42,31% (Tratamento 4) com uma concentração de enzima de 0,6% e 70 minutos de tempo de reação.
Os estudos feitos por Guérard et al. (2001), que trabalharam com o atum (Thunnus albacares) obteveram um GH máximo de 21,12% com uma concentração de enzima (Alcalase® 2.4L) variando entre 0,2 - 3%, em um período de 6 horas, a temperatura e o pH foram ajustados à (50º C e 8) respectivamente, valores inferiores no GH apresentados, ocorreu, possívelmente pela diferença na temperatura de reação (65º C) e pH (6) utilizados no presente estudo. Batista (2011) cita que o grau de hidrólise (GH %), está associado com o número de ligaçãos peptídicas clivadas, valores diferentes de GH podem ser observados, como resultado do pH, tempo de reação e proporção de substrato/enzima utilizado durante a hidrólise e a composição de aminoácidos da proteína, que pode fornecer diferentes quantidades de sítios de ação de clivagem da enzima.
Ovissipour et al. (2010) que também trabalharam com resíduos viscerais de Thunnus albacares, testando concentração de enzima Alcalase, variando de 10 a 100% em um tempo de 1 hora com um pH de 8,5, constataram uma faixa de grau de
hidrólise de 31 a 53,75%, valores estes semelhantes aos encontrados no presente trabalho.
Já Schmidt & Salas-Mellado (2009), mostram que o pescado com alto teor de lipídeos, quando submetidos à processo de hidrólise, apresentam baixos níveis de GH quando comparados com pescados caracterizados como magros. Enquanto Batista et al. (2014) definiu que um incremento na concentração de enzima, embora cause um aumento no GH, também resulta em uma hidrólise reduzida.
5.5 ANALISE DA SUPERFÍCIE DE RESPOSTA
A influência de X Tempo de processo (em minutos), Y concentração de enzima alcalase, o processo de hidrólise para determinar Z (GH) utilizando o desenho fatorial e foi avaliado atraveis de superfície de respota do software STATISTIC . Este resultado gerou uma melhor equação do modelo explicativo para o valor Z (GH) e buscou um ajuste a modelo matemático quadrático e linear, obtido a partir de dados codificados de hidrólise de Alcalase é descrita na equação 8 abaixo.
Equação 8:
Fonte: Autor.
Onde Z é o grau de hidrolise (%), ou seja, a resposta prevista em valor real, X é o valor codificado da variável Tempo (min) e Y o valor codificado da variável concentração da enzima (%). A Tabela 07 mostra o resultado do teste da ANOVApara a resposta de grau de hidrólise (%) em relação a variável X e Y.
Z = 37,906265561751 + 0,075795784186311 * X - 0,00020105457006608 * X² + 9,7473034385662 * Y - 12,694697159161 * Y² + 0,049010416666667 * X * Y + 0
Tabela 07 - ANOVA; Var.:GH (%); r²=0,52789; Adj:0,05577 (Spreadsheet1) 2 Fatores, 1 Bloco, 11 Corridas; MS Erro Puro =0,6106333 DV: Grau de Hidrólise (%). Fator SS df MS F p (1) Enzima (%)(L) 50,8055706 1 50,8055706 83,2014367 0,0118065891 Enzima (%)(Q) 23,8254589 1 23,8254589 39,0176193 0,0246844275 (2) Tempo (min)(L) 8,7263 1 8,72628 14,29053 0,063395 Tempo (min) (Q) 47,4754594 1 47,4754594 77,7479 0,0126191364 1L by 2L 22,137025 1 22,137025 36,2525656 0,0264929763 Falta de ajuste 122,116673 3 40,7055578 66,6612116 0,0148158605 Erro puro 1,22126667 2 0,610633333 Total SS 261,246073 10 Fonte: Autor.
Nota-se que para os sítios abrangidos pelo estudo de acordo com os níveis de observação, os fatores foram relevantes e tiveram influências significativas, visto que o valor de da ajuste p foi acima de 5%, conforme a (Tabela 07).
Quanto mais próximo a 1 for o valor de r² para unidade, melhor os modelos empíricos se encaixam nos dados reais. De acordo com a ANOVA relacionada na (Tabela 07), o coeficiente de regressão do grau de hidrólise (GH %) nesse estudo (r² = 0,52789) foi parcialmente satisfatório, uma vez que para o resultado ser satisfatório, o r² tende a ser mais próximo de 1, e o valor de p abaixo de 5%. Por outro lado, quanto menor o valor de r², menor será a relevância que as variáveis dependentes do modelo têm para explicar o comportamento das variações (LITTLE & HILLS, 1978).
O diagrama de Pareto (Figura 02) pode ser uma forma rápida de demonstrar os efeitos estatísticos imprescindíveis. O efeito cujo a figura do retângulo estiver a direita da linha provisória (p ≤ 0,05) devem ser considerados no modelo matemático. O tempo (min) e a Concentração de Enzima (%), bem como a interação entre ele apresentam um efeito significativo no parâmetro Grau de Hidrólise (%), representado pelas barras que estão a direita da linha provisória. Apenas o fator tempo (no modelo quadrático) não apresentou efeito significativo. Portanto, a equação gerada no modelo explicativo para definir o grau de hidrólise (GH), pode ser usada como modelo.
Fonte: Autor.
Figura 2 - Gráfico de Pareto em função dos valores estatístico de teste T.
A Figura 03 mostra a comparação entre os valores observados para o grau de hidrólise (Y0) com os valores previstos (Y). Além disso, o coeficiente (r² = 0,52789)
revela uma descrição matemática insatisfatória do processo para o modelo de grau de hidrólise.
Fonte: Autor.
O gráfico de superfície de resposta (Figura 04 e 05) foi gerado pelo modelo preditivo para prever os pontos críticos e a influência de cada fator. Os efeitos ajustados de cada par de variáveis indicam que, na hidrólise da proteína do atum (Thunnus alalunga), um aumento do GH é obtido por níveis de concentração de enzima (%) em relação ao tempo de reação, onde a cor vermelha do gráfico (Figura 04 e 05) apresenta a região em que se alcança o maior grau de hidrólise.
No entanto, avaliando os gráficos (Figura 04 e 05), constata-se que é possível obter o mesmo percentual de GH com valores inferiores de tempo e concentração de enzima, esses resultados definidos como valores críticos (Tabela 08), podem ser aplicados para tornar o processo mais rápido e econômico, o que pode sujerir diferentes estudos e que sejam avaliado diferentes parâmetros, como o perfil de aminoácidos, a fim de buscar essa a otimização.
Tabela 08 - Valores Críticos; Variável: GH (%) Valor máximo previsto na solução: 54,33%.
Fonte: Autor.
Fonte: Autor.
Figura 4 - Gráficos de superfície de resposta (GH %) em dois eixos.
Fatores Mínimo Observado Valores críticos Máximo Observado
Tempo (min) 70 307,6778 410
Fonte: Autor.
Figura 5 - Gráfico de superfície de resposta (GH %) em três eixos.
Nos estudos feitos por Bhaskar et al. (2008), Nilsang et al. (2005) e You, Regenstein & Liu (2010), dependência semelhantes foram observadas, entre a atividade enzimática, temperatura e o tempo de reação, para as reações hidrolíticas de proteínas alimentares utilizando enzimas de origem microbiana.
5.6 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DA FRAÇÃO PROTÉICA DO HIDROLISADO
O desenvolvimento da fração protéica do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga) é feito através da centrifugação da matéria prima, para remoção do e a obtenção do produto com baixo teor de lipídeo e maior concentração de proteínas. Os
resultados de composição centesimal mostrados na Tabela 09 são referentes a etapa antes da secagem do produto.
Tabela 09 - Físico-químicas dos dez tratamentos da fração protéica do hidrolisado de atum (Thunnus alalunga)
Amostras Análises¹
Umidade (%) Proteína (%) Lipídeo (%) Cinza (%) T-1 74,70 bc ± 1,63 21,64 ab ± 1,00 0,91 a ± 0,05 1,10 abc ± 0,04 T-2 78,71 a ± 1,21 19,20 b ± 0,13 0,83 a ± 0,13 0,84 c ± 0,53 T-3 73,71 c ± 0,51 22,44 a ± 0,83 1,02 a ± 0,26 1,26 ab ± 0,00 T-4 76,70 ab ± 0,96 20,54 ab ± 0,37 1,04 a ± 0,15 0,89 bc ± 0,02 T-5 77,34 ab ± 0,96 19,81 ab ± 0,44 1,39 a ± 0,17 1,02 abc ± 0,05 T-7 77,43 ab ± 0,51 19,99 ab ± 0,96 1,01 a ± 0,17 1,28 a ± 0,00 T-8 76,33 abc ± 0,80 20,09 ab ± 0,98 0,96 a ± 0,08 1,23 ab ± 0,01 T-9 78,23 a ± 0,87 19,09 b ± 1,22 1,05 a ± 0,58 0,97 bc ± 0,05 T-10 77,98 a ± 1,26 19,85 ab ± 0,62 0,77 a ± 0,49 1,03 abc ± 0,01 T -11 76,50 abc ± 0,04 20,93 ab ± 1,73 1,10 a ± 0,25 1,28 a ± 0,03
¹ Os resultados são valores médios de três determinações ± desvio padrão.
² Médias seguidas de letras minúsculas distintas nas linhas diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade.
Segundo Ovissipour et al. (2010) que trabalharam com a otimização concentrado solúvel do hidrolisado protéico de vísceras de Thunnus albacares, apresentou resultados semelhantes da composição centesimal no que se refere a proteína e umidade, 21,5% e 69,66% respectivamente, com uma variação maior no nível de lipídeos (5,08%) e cinzas (4,46%).
Os níveis de proteína avaliados após a centrifugação do óleo, teve um aumento significativo em relação a análise bromatológica da Tabela 04, o nível máximo da secção anterior foi de 18,37%, enquanto a máxima encontrada após a centrifugação foi de 22,44% (Tabela 09). Analisando as diferenças significativas (p < 0,05) percebe-se que os tratamentos T-9 e T-2 tiveram os menores índices (19,09 - 19,20%) diferenciando apenas do T-3 (22,44%), porém, semelhantes entre todos os outros resultados.
