UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CAMPUS FLORIANÓPOLIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO
Madson Silveira de Melo
Toxicidade do herbicida à base de glifosato (Roundup WG®) no hepatopâncreas e sistema endócrino do camarão de água doce Macrobrachium potiuna
FLORIANÓPOLIS 2020
Toxicidade do herbicida à base de glifosato (Roundup WG®) no hepatopâncreas e sistema endócrino do camarão de água doce Macrobrachium potiuna
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do título de doutor em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Orientadora: Profa. Dra. Yara Maria Rauh Müller
Florianópolis 2020
O presente trabalho em nível de doutorado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Carlos Eduardo da Rosa, Dr. Universidade Federal do Rio Grande Profa. Ariane Zamoner Pacheco de Souza, Dra.
Universidade Federal de Santa Catarina Profa. Geison de Souza Izídio, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de doutor em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
____________________________ Profa. Dra. Evelise Maria Nazari
Coordenadora do Programa
____________________________ Profa. Dra. Yara Maria Rauh Müller
Orientadora
Florianópolis, 2020.
Assinado de forma digital por Yara Maria Rauh Muller:24788988968 Dados: 2020.03.03 16:22:02 -03'00'
Documento assinado digitalmente Evelise Maria Nazari
Data: 04/03/2020 10:55:49-0300 CPF: 716.091.489-91
Este trabalho é dedicado aos meus pais, principalmente a minha mãe Edilse da Silveira, por todo o seu amor e apoio durante estes anos longe de casa.
agradecer a todas nessa sessão. Agradeço primeiramente à Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento por toda a infraestrutura e ensino de qualidade, à Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado e de doutorado sanduíche no exterior (CAPES-PDSE – 47/2017) e aos membros da banca avaliadora pelas considerações para a melhoria deste trabalho.
Em especial, agradeço a minha orientadora Profa. Dra. Yara Maria Rauh Müller, pela confiança, por aceitar o desafio de trabalhar com a temática dessa tese e por orientar um aluno oriundo de um PPG em Zoologia, com pouca experiência em laboratório. Seu profissionalismo, competência e dedicação com o ensino superior sempre me inspiraram. Obrigado por me permitir “voar” e me incentivar em todas as etapas deste doutorado, acima de tudo, obrigado por todos os ensinamentos.
Igualmente, não posso deixar de agradecer à Profa. Dra. Evelise Maria Nazari, pelo seu profissionalismo, competência e dedicação com o laboratório e com o ensino superior. Além disso, obrigado por todas as contribuições para as publicações dos artigos oriundos desta tese e pelas prazerosas discussões em seminários de laboratório.
Ao Dr. Eric Gismondi da Universidade de Liège, por aceitar supervisionar o meu doutorado sanduíche, por todo o entusiasmo e ensinamentos durante os meses que lá passei e as imensas contribuições via e-mail após o meu retorno. Obrigado também à Dra. Célia Joaquim-Justo, às Mmes. Mariella Lunetta, Françoise Bruls e Catherine Adam pela calorosa recepção no laboratório, pelas conversas e por me apresentarem o melhor da cultura e culinária belga.
Aos técnicos dos Laboratórios Multiusuários de Estudos em Biologia (LAMEB) e Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME) da Universidade Federal de Santa Catarina pela disponibilidade e auxílio durante as técnicas realizadas nas dependências destes laboratórios.
À toda a equipe do Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal – LRDA (Aline Pereira, Bruno Menna, Carla Davico, Cláudia de Albuquerque, Eliane Zeni, Gabriela Hollmann, Giuliam Strücker, Heloísa Schramm, Henrique Grisard, Jacqueline Pinheiro, Laíse Durante, Luciane Nezzi, Maico Roberto da Silva, Marina de Freitas, Michael Jaramillo, Mirian Spricigo, Nathália Krüger, Sofia Troppmair, Thalia Reis, Thaline de Quadros), por todos os ensinamentos, e auxílios em coletas e bancada. Em especial à Vanessa de Castro pelas coletas e processamento de amostras e por escolher a mesma problemática dos efeitos do herbicida glifosato no mesmo organismo animal.
Aos amigos que fiz no LRDA, Gilian Bourckhardt, Manuela Cecchini e Maria Luísa Hahmeyer, pelos momentos engraçados e gastronômicos compartilhados dentro e fora do laboratório. Em especial, a minha querida amiga, companheira de disciplina, assistente de coletas, Thiciane dos Santos por toda a colaboração, positivismo e por sempre ter um imenso sorriso estampado no rosto.
A minha família, especialmente aos meus pais, Edilse da Silveira e Valdir de Melo, por todo o incentivo e sempre acreditarem em mim. Sei que a parentalidade à distância não foi uma tarefa fácil, sei também que estive ausente em muitos momentos importantes para a nossa família nesses últimos 4 anos, mas sei que acima de tudo vocês compreendem todo o esforço e sacrifício feito para concluir essa etapa, a vocês, a minha imensa gratidão.
Ao meu namorado Carlos Augusto. Nosso tempo de relacionamento é quase equivalente ao tempo de um doutorado, são quase 4 anos de muita compreensão e incentivo. Sobrevivemos
a uma rotina puxada e uma pitada de namoro à distância. Você foi o meu melhor confidente e amigo, obrigado pelo seu positivismo e por sempre acreditar em mim. Agradeço também aos meus sogros Maria Amélia e Sergio Pereira pelo incentivo e auxílio nas inúmeras mudanças em tempos de viagem e retorno, pelos almoços de domingo e por me carregarem nos dias quentes de verão para relaxar na praia.
Por fim, agradeço aos amigos da minha cidade natal (Dourados), de Curitiba e os outros que se aventuraram pelo mundo por sempre me incentivarem a fazer o doutorado e me escutaram quando precisei desabafar.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigado!
A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez. George Bernard Shaw
¹ Quanto mais buscamos responder estes questionamentos, menos respostas tínhamos para as perguntas iniciais. Dessa forma, se você está lendo este trabalho e se interessou por essa problemática, te convido a continuar o que começamos e contribuir com o conhecimento dos efeitos de pesticidas em espécies nativas de crustáceos.
APRESENTAÇÂO
A inspiração para esta tese, não surgiu apenas no ano do meu ingresso no Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento como aluno de doutorado (2016). Minha inspiração foi um compilado dos anos de graduação e mestrado. Durantes os 5 anos de graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul e os dois anos consecutivos de mestrado em Zoologia pela Universidade Federal do Paraná sempre estive rodeado pelos crustáceos dulcícolas, mais precisamente, pelos camarões do gênero
Macrobrachium. Ao longo da minha trajetória acadêmica várias vezes me deparei com
situações no qual diferentes populações de macroinvertebrados aquáticos eram utilizados como sentinelas da saúde de ecossistemas aquáticos. Mas foi durante os anos de mestrado que nasceu em mim a questão que norteou o trabalho que você lerá a seguir. Na realidade, não trabalhei com toxicologia ou ecotoxicologia em minha dissertação. Todavia, em parte dela estudei a distribuição e composição de espécies de camarões dulcícolas no estado do Paraná. Não surpreendentemente, me deparei com a ausência de camarões em áreas próximas de campos de agricultura e grandes cidades, sendo o oposto em áreas de preservação permanentes. Através da observação desse fenômeno, alguns questionamentos começaram a surgir em minha mente: “Crustáceos são sensíveis as perturbações antrópicas?”, “Como pesticidas utilizados na agricultura afetam os crustáceos?”, “Será que o herbicida mais utilizado no mundo (glifosato) causa danos em camarões?”. Ao terminar o mestrado estava decidido a responder essas questões¹. Começava então minha relação de amor e “ódio” pelo glifosato e seus efeitos em organismos não-alvo. Digo amor, pois essa problemática me motivou e encantou por quatro anos. Além disso, me inseriu em um excelente grupo de pesquisa (Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal – LRDA), e me trouxe oportunidades que eu jamais imaginara antes. “Ódio”, pois apesar da imensa quantidade de evidências da toxicidade do glifosato, pouco é feito para mitigar ou minimizar seus efeitos em animais. Dessa forma, para que você melhor compreenda os efeitos de herbicidas à base de glifosato (HBG) no camarão dulcícola
Macrobrachium potiuna, esta tese foi dividida em duas partes. A primeira avalia os efeitos
citotóxicos do HBG (Roundup WG®) no órgão de detoxificação (hepatopâncreas) de M. potiuna e foi realizado majoritariamente no LRDA. Contudo, a segunda parte busca entender como o HBG afeta o sistema endócrino da espécie em questão, avaliando moléculas envolvidas no processo de crescimento e reprodução e foi desenvolvida em parte no LRDA e parte sob supervisão do Dr. Eric Gismondi no Laboratório de Ecologia Animal e de Ecotoxicologia da Universidade de Liège (Bélgica), em período de doutorado sanduíche financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. Dessa forma, embarque comigo no resultado dessa jornada de quatro anos, que busca contribuir com o conhecimento dos efeitos tóxicos de baixas concentrações de HBG em uma espécie de camarão de água doce nativo da fauna brasileira.
de glifosato vem sendo detectados em ecossistemas aquáticos, alimentos e fluídos humanos. Dessa forma, o estudo dos efeitos tóxicos de HBG em diferentes organismos tem crescido nos últimos 30 anos. Contudo, a toxicidade de HBG é estudada principalmente em vertebrados, no qual diferentes formulações causaram estresse oxidativo, genotoxicidade, citotoxicidade, teratogenicidade, além de serem apontados como compostos desreguladores endócrinos (CDE). Apesar de representarem mais de 90% da fauna, estudos sobre os efeitos de HBG em invertebrados, particularmente espécies de crustáceos nativos da fauna brasileira são escassos. Dessa forma, o objetivo dessa tese foi identificar a toxicidade aguda de Roundup WG®, bem como investigar os efeitos citotóxicos no hepatopâncreas, órgão de detoxificação e potencial desregulador endócrino de concentrações ambientalmente relevantes de Roundup WG® no camarão dulcícola Macrobrachium potiuna. Machos e fêmeas foram coletados na Cachoeira do Poção, Florianópolis, transportados para o Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal, aclimatados por sete dias e destinados para os bioensaios de toxicidade aguda (determinação da Concentração Letal 50% em 96h) e a toxicidade subaguda de baixas concentrações (0,0065, 0,065 e 0,28 mg L-1) em camarões expostos por sete e 14 dias. Os bioensaios subagudos foram divididos em duas partes, na parte 1 se avaliou a citotoxicidade das baixas concentrações na morfologia e morfometria do hepatopâncreas, nos compartimentos subcelulares das células R, na fragmentação do DNA e na peroxidação lipídica do hepatopâncreas. A parte 2 consistiu da avaliação do perfil transcricional (hormônio inibidor da muda – HIM, receptor de ecdisteróide – REc e vitelogenina – Vg), hormonal (20-hidroxiecdisona – 20-HE) e enzimático (quitobiase) de moléculas envolvidas nos processos de ecdise, crescimento e reprodução dos crustáceos, além de identificar os biomarcadores que melhor responderam a exposição ao herbicida. Camarões expostos apresentaram alterações histopatológicas como vacuolização das células hepatopancreáticas, agregado de hemócitos, morte celular, hiperplasia e hipertrofia bem como alterações nos compartimentos subcelulares das células R (vacuolização, dilatação do espaço perinuclear, dilatação do retículo endoplasmático rugoso e corpos de Golgi, perda de membrana mitocondrial e formação de membranas concêntricas), em animais expostos por sete e 14 dias e fragmentação do DNA do hepatopâncreas em animais expostos por 14 dias. Além disso, foram observadas alterações nos níveis de transcritos do REc, HIM e Vg, principalmente em camarões machos. Por outro lado, machos e fêmeas, apresentaram uma diminuição na concentração de 20-HE e atividade da quitobiase. Nossos resultados indicam que as concentrações estudadas foram citotóxicas para
M. potiuna. Além disso, o herbicida Roundup WG® atuou como um CDE. As alterações
morfológicas e ultraestruturais no hepatopâncreas, bem como a fragmentação do DNA para animais expostos por 14 dias foram os biomarcadores mais responsivos a exposição ao Roundup WG®, em contrapartida, os melhores biomarcadores para camarões da parte 2 variaram de acordo com o sexo dos camarões e do tempo de exposição. Este estudo contribuiu ainda para a padronização dos índices de alterações histopatológicas e ultraestruturais para avaliações dos efeitos de HBG em crustáceos ou outras espécies que possuem hepatopâncreas. Nossos resultados sugerem uma redução de moléculas que estimulam o processo de ecdise nos camarões expostos, além de indicar que as concentrações consideradas seguras pelas agências reguladoras, devem ser revisadas, de forma que os efeitos adversos em organismos não-alvo sejam minimizados.
Palavras-chave: Crustacea. Desregulador endócrino. Biomarcadores. Citotoxicidade. Órgão de detoxificação.
ABSTRACT
Glyphosate-based herbicides (GBH), including Roundup® formulations, are the most widely used herbicides in the world. Although they are mostly used in agriculture and urban gardening, glyphosate residues are being more and more detected in aquatic ecosystems, food and human fluids. Thus, the study of the toxic effects of these formulations on different organisms has grown in the last 30 years. However, the toxicity of GBH is mainly focused on vertebrates, in which different GBH caused oxidative stress, genotoxicity, cytotoxicity, teratogenicity, as well as, being considered as an endocrine disrupting compound (EDC). Although representing over 90% of the fauna, studies on the GBH effects on invertebrates, particularly native crustacean species of the Brazilian fauna are scarce. Thus, the aim of this thesis was to identify the acute toxicity of Roundup WG®, as well as to investigate the cytotoxic effects on the hepatopancreas, the detoxification organ and the potential endocrine disruptor of environmentally relevant Roundup WG® concentrations in the freshwater prawn Macrobrachium potiuna. Males and females were collected at Cachoeira do Poção, Florianópolis, transported to the Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal, acclimated for seven days and used for acute toxicity bioassays (determination of Lethal Concentration 50% in 96h) and subacute toxicity of low concentrations (0.0065, 0.065 and 0.28 mg L-1) in animals exposed for seven and 14 days. Subacute bioassays were divided into two sets; Set 1 evaluated the cytotoxicity effect of low concentrations in hepatopancreas morphology and morphometry, R cells subcellular compartments integrity, DNA fragmentation, and hepatopancreas lipid peroxidation. Set 2 consisted of evaluating the transcript levels (molt-inhibiting hormone - MIH, ecdysteroid receptor - EcR and vitelogenin - Vg), hormonal (20-hydroxyecdsone - 20-HE) and enzymatic (chitobiase) of molecules involved in ecdysis, growth and reproduction processes of crustaceans, and to identify the biomarkers that best responded to the herbicide exposure. Prawns exposed in Set 1 showed histopathological alterations such as hepatopancreatic cell vacuolation, hemocyte aggregation, cell death, hyperplasia and hypertrophy as well as alterations in R cell subcellular compartments (vacuolization, perinuclear space dilatation, rough endoplasmic reticulum and Golgi bodies dilation, mitochondrial membrane loss and concentric membrane formation) in animals exposed for seven and 14 days and hepatopancreas DNA fragmentation in animals exposed for 14 days. In addition, alterations in EcR, MIH and Vg transcript levels were observed in Set 2, mainly for male prawns. On the other hand, males and females showed a decrease in 20-HE concentration and chitobiase activity. Our results indicated that the concentrations studied were cytotoxic to M. potiuna. In addition, the Roundup WG® herbicide acted as an EDC. Hepatopancreas morphological and ultrastructural alterations, as well as DNA fragmentation for 14-day exposed animals, were the most responsive biomarkers after exposure to Roundup WG®, in contrast, the best biomarkers in Set 2 were dependent on prawn gender and time of exposure. This study also contributed to the standardization of histopathological and ultrastructural alteration indices for evaluations of GBH effects on crustaceans or other species with hepatopancreas. Our results suggest a decrease in the molecules used for the ecdysis in exposed prawns, and indicate that concentrations considered safe by regulatory agencies should be reviewed in order to minimized adverse effects on non-target organisms.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Molécula do herbicida glifosato... 28 Figura 2 – Principais formas de contaminação dos ambientes aquáticos por agrotóxicos. ... 31 Figura 3 - Macrobrachium potiuna. Imagem de exemplar fêmea e macho. Mapa da distribuição da espécie no Brasil. ... 37 Figura 4 – Principais moléculas do sistema endócrino em Decapoda. ... 38 Figura 5 - Esquema do hepatopâncreas em crustáceos decápodes. ... 43 Figura 6 – Mapa da Cachoeira do Poção, localizada na Área de Preservação Permanente Parque Municipal do Maciço da Costeira, Florianópolis, Ilha de Santa Catarina, local de coleta dos camarões Macrobrachium potiuna. ... 49 Figura 7 – Desenho experimental do ensaio de toxicidade aguda ao HBG Roundup WG® em
Macrobrachium potiuna. ... 50
Figura 8 – Desenho experimental dos ensaios subagudos (Parte 1). ... 51 Figura 9 – Desenho experimental dos ensaios subagudos (Parte 2). ... 52 Figura 10 – Concentração letal média 50% (CL50 96h) (A) e curva de sobrevivência Kaplan-Meier (B) para Macrobrachium potiuna após exposição ao HBG Roundup WG® em 96h de exposição com sistema semi-estático. ... 66 Figura 11 – Índice hepatossomático (IHS) de Macrobrachium potiuna após exposição a diferentes concentrações do HBG Roundup WG® em sete e 14 dias. ... 67 Figura 12 - Índice do órgão (Iorg) e densidade de vacúolos por mm² do hepatopâncreas de
Macrobrachium potiuna após eposição ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias... 69
Figura 13 – Hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna exposto ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 70 Figura 14 – Caracterização das células R do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna do grupo controle. ... 71 Figura 15 – Índice da célula (Icell) para células R do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna após eposição ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 74 Figura 16 -Células R do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 75 Figura 17 – Fragmentação do DNA em células do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete dias. ... 76 Figura 18 – Fragmentação do DNA em células do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna exposto ao HBG Roundup WG® por 14 dias. ... 77
Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias... 80 Figura 21 – Níveis de expressão relativa de Vg (média ± EPM) em machos e fêmeas de
Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias... 81
Figura 22 – Concentração de 20-HE (pg g−1; média ± EPM) no músculo de machos e fêmeas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 82 Figura 23 – Atividade da enzima quitobiase (μmol h−1; média ± EPM) no músculo de machos e fêmeas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. .. 83 Figura 24 – Correlação de Pearson entre os valores da concentração de 20-HE e a atividade da quitobiase no músculo de machos e fêmeas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 84 Figura 25 – Gráficos do tipo radar com os valores de RIB para cada biomarcador em
Macrobrachium potiuna expostos a diferentes concentrações do HBG Roundup WG® por sete
e 14 dias nos bioensaios subagudos Parte 1. ... 85 Figura 26 – Gráficos do tipo radar com os valores de RIB para cada biomarcador em machos e fêmeas do camarão Macrobrachium potiuna exposto a diferentes concentrações do HBG Roundup WG® por sete e 14 dias nos bioensaios subagudos Parte 2. ... 87 Figura 27 - Resumo gráfico dos efeitos do HBG Roundup WG® no camarão de água doce
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Alterações histopatológicas para hepatopâncreas do camarão Macrobrachium
potiuna exposto ao HBG Roundup WG® pelo período de sete e 14
dias...55 Quadro 2 - Alterações para os compartimentos subcelulares das células R do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias...55 Quadro 3 - Iniciadores utilizados nas reações de qPCR para as análises dos transcritos dos genes de referência e de interesse envolvidos nos processos de ecdise, crescimento e reprodução de crustáceos...59 Quadro 4 - Frequência de ocorrência das alterações nos compartimentos subcelulares das células R do hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias...73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores do teste t-Student para análise de diferenças sexuais nas respostas de
Macrobrachium potiuna nas diferentes análises realizadas. ... 66
Tabela 2 – Resultados da ANOVA de duas vias para o Índice hepatossomático (IHS) do camarão Macrobrachium potiuna exposto ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 67 Tabela 3 - Peroxidação lipídica (níveis de MDA) no hepatopâncreas de Macrobrachium potiuna machos e fêmeas expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 78 Tabela 4 - Valores da Resposta Integrada de Biomarcadores (RIB) para camarões
Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias nos bioensaios
subagudos Parte 1. Para os grupos controle o valor de RIB = 0... 84 Tabela 5 - Valores da Resposta Integrada de Biomarcadores (RIB) para machos e fêmeas do camarão Macrobrachium potiuna expostos ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias nos bioensaios subagudos Parte 2. Para os grupos controle o valor de RIB = 0. ... 86
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 20-HE – 20-hidroxiecdisona
7-dc – 7-dehidrocolesterol AChE - acetilcolinesterase Act – actina
AMPA – ácido aminometilfosfônico
AMPc – 3´5´-adenosina-monofosfato-cíclico ou do inglês cyclic Adenosine Monophosphate –
cAMP
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP – adenosina trifosfato
BlastX – do inglês Basic Local Alignment Search Tool cd – dilatação das cisternas
CDE – composto desregulador endócrino
cDNA – DNA complementar ou do inglês complementary DNA CL50 – concentração letal 50%
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente DDT – diclorodifeniltricloroetano
dp – dilatação do espaço perinuclear DPM – desvio padrão da média ea – epitélio atrofiado
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético ou do inglês ethylenediamine tetraacetic acid EEC – Comunidade Econômica Europeia ou do inglês European Economic Community EF1α – do inglês eukaryotic translation elongation factor 1 alpha
EFSA – Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar ou do inglês European Food Safety
Authority
EPM – erro padrão da média
EPSPS – enzima 5-enolpiruvilshiquimato 3-fosfato sintase
FAO – Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura ou do inglês Food and
Agriculture Organization
G – corpos de Golgi gl – gotas lipídicas Gl – grau de liberdade
HBG – herbicida à base de glifosato HE – Hematoxilina e Eosina
HHC – hormônio hiperglicêmico de crustáceos ou do inglês crustacean hyperglycemic
hormone – CHH
HIG – hormônio inibidor da gônada ou do inglês gonad-inhibiting hormone - GIH HIM – hormônio inibidor da muda ou do inglês molt-inhibiting hormone - MIH
HIOM – hormônio inibidor do órgão mandibular ou do inglês mandibular organ inhibiting
hormone – MOIH
HJ – hormônio juvenil hp – hiperplasia ht – hipertrofia
IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer ou do inglês International Agency for
Research on Cancer
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Icell – índice da célula
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MDA – malondialdeído MF – metil farnesoato MUF – 4-metilumbeliferona MUFNAG – 4-metilumbeliferil-N-acetil-ß-D-glucosaminida N – núcleo
NA – densidade numérica por mm² NAG – N-acetil-β-D-glicosaminidase
NCBI – do inglês National Center for Biotechnology Information OM – órgão mandibular
OX – órgão X
OX/GS – órgão X/glândula do seio OY – órgão Y
pa – perfil apoptótico Pb – pares de bases
PMSF – fluoreto de fenilmetilsulfonil ou do inglês phenylmethanesulfonyl fluoride pn – perfil necrótico
POEA – polioxietilenamida
REc – receptor de ecdisteróide ou do inglês Ecdysteroid receptor – EcR RER – retículo endoplasmático rugoso
RIB – Resposta integrada de biomarcadores RPL8 – do inglês Ribosomal Protein L8 rt – regressão tubular
RXR – receptor de retinóide X ou do inglês retinoid X receptor – RXR SDS – dodecil sulfato de sódio
t – túbulos
TBARS – do inglês thiobarbituric acid reactive substances
US EPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos ou do inglês United States
Environmental Protection Agency
v – vacuolização Vg – vitelogenina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 27
1.1 AGROTÓXICOS ... 27
1.2 HERBICIDA À BASE DE GLIFOSATO ... 28
1.3 EFEITO DE HBG NO AMBIENTE ... 30
1.4 ESTUDOS EM TOXICOLOGIA, BIOMARCADORES E BIOINDICADORES ... 34
1.5 GÊNERO MACROBRACHIUM – M. POTIUNA (MÜLLER, 1880) ... 36
1.6 SISTEMA ENDÓCRINO DE CRUSTÁCEOS ... 38
1.7 HEPATOPÂNCREAS COMO ÓRGÃO ALVO DA TOXICIDADE AO HBG ... 41
1.8 OBJETIVOS ... 47
1.8.1 Objetivo Geral ... 47
1.8.2 Objetivos Específicos ... 47
2 MATERIAL E MÉTODOS ... 49
2.1 COLETA E MANUTENÇÃO DOS ORGANISMOS ... 49
2.2 HERBICIDA À BASE DE GLIFOSATO ... 49
2.3 TOXICIDADE AGUDA – DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO LETAL 50% 96H (CL50 96H) ... 50
2.4 TOXICIDADE SUBAGUDA ... 50
2.5 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE HEPATOSSOMÁTICO (IHS) ... 52
2.6 ANÁLISES MICROSCÓPICAS ... 53
2.7 ÍNDICES DO ÓRGÃO E DA CÉLULA ... 54
2.8 TESTE DE FRAGMENTAÇÃO DO DNA ... 55
2.9 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ... 56
2.10 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS DE TRANSCRITOS POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE VIA PCR EM TEMPO REAL (qPCR) ... 57
2.10.1 Extração do RNA e síntese de cDNA ... 57
2.10.2 Desenho dos iniciadores e análise das sequências ... 58
2.10.3 PCR em tempo real (qPCR) ... 60
2.11 QUANTIFICAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DO HORMÔNIO 20-HIDROXIECDiSONA (20-HE) ... 61
2.12 QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA QUITOBIASE ... 61
2.13 RESPOSTA INTEGRADA DE BIOMARCADORES (RIB) ... 62
2.14 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 63
3 RESULTADOS ... 65
3.1 TOXICIDADE AGUDA DO HERBICIDA ROUNDUP WG® – DETERMINAÇÃO DA CL50 96H ... 66
3.2 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG® SOBRE O ÍNDICE HEPATOSSOMÁTICO (IHS) DE M. POTIUNA EXPOSTOS POR SETE E 14 DIAS ... 67
3.4 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG NA ULTRAESTRURA DOS COMPARTIMENTOS SUBCELULARES DAS CÉLULAS R DO HEPATOPÂNCREAS DE M. POTIUNA EXPOSTOS POR SETE E 14 DIAS – ÍNDICE DA CÉLULA (ICELL) ... 71 3.5 AVALIAÇÃO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG® NA FRAGMENTAÇÃO DO DNA DAS CÉLULAS DO HEPATOPÂNCREAS DE M. POTIUNA EXPOSTOS POR SETE E 14 DIAS ... 76 3.6 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG® NA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA DAS CÉLULAS DO HEPATOPÂNCREAS ... 78 3.7 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG® NO SISTEMA ENDÓCRINO DE M. POTIUNA ... 78 3.8 EFEITO DA EXPOSIÇÃO AO HERBICIDA ROUNDUP WG® NA RESPOSTA INTEGRADA DE BIOMARCADORES – RIB ... 84 4 DISCUSSÃO ... 88 5 CONCLUSÕES ... 102
REFERÊNCIAS ... 104
APÊNDICE A – Glifosato encontrado em diferentes compartimentos ambientais pelo mundo ... 127 APÊNDICE B – Valores de Ct e coeficiente de variação (%) para expressão relativa dos níveis de transcritos dos genes de referência (ACT, EF1α e RPL8) para normalização da expressão relativa nos níveis de transcritos dos genes de interesse em Macrobrachium potiuna exposto ao HBG Roundup WG® por sete e 14 dias. ... 129
1 INTRODUÇÃO 1.1 AGROTÓXICOS
De acordo com a legislação brasileira (Lei Federal Nº 7.802 de 11/07/89, Art. 1) agrotóxicos são definidos:
como os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, podendo ser empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (BRASIL, 1989).
Os agrotóxicos, também conhecidos como pesticidas, praguicidas ou defensivos agrícolas, podem ser subdivididos de acordo com a espécie alvo que se pretende eliminar ou controlar. Os mais conhecidos são os inseticidas (controle de insetos), fungicidas (controle de fungos), herbicidas (controle de ervas daninhas), rodenticidas (controle de roedores), moluscicidas (controle de moluscos), e acaricidas (controle de ácaros) (ABRASCO, 2015). Podem ainda ser classificados de acordo com a sua estrutura química em organoclorados (e.g. DDT – autorização para uso agrícola cancelada no Brasil no ano de 1985 devido a sua alta toxicidade e longevidade no meio ambiente), organofosforados (e.g. Glifosato), carbamatos (e.g. Carbofuran) e piretróides (e.g. Cipermetrina) (STINE; BROWN, 2006).
A utilização de agrotóxicos na agricultura proporciona benefícios como, aumento na produção agrícola, diminuição na perda de colheita, melhoria da qualidade dos produtos, gerando um aumento no lucro dos agricultores (COUTINHO et al., 2005). Contudo, o seu uso também acarreta em problemas ambientais, como a contaminação de solos, águas superficiais e subterrâneas e, também dos organismos que habitam estes ambientes (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014; MENSAH; PALMER; MULLER, 2014).
Nesta perspectiva, no ano de 2008, o Brasil se tornou o maior consumidor mundial de agrotóxicos, quando seu uso foi superior a 496.000 toneladas de ingredientes ativos, com cerca de 1.670 formulações disponíveis no mercado (KAYSER et al., 2013), sendo os herbicidas (60%), inseticidas (23%) e os fungicidas (14%) os mais utilizados (SINDIVEG, 2015). Na classe dos herbicidas, destaca-se o glifosato, o ingrediente ativo mais utilizado no mundo
(MENSAH; PALMER; MULLER, 2014). No Brasil, nos anos de 2009 a 2012 o glifosato representou cerca de 54% de todo o mercado (para revisão, BARBOSA; SOLANO; UMBUZEIRO, 2015).
1.2 HERBICIDA À BASE DE GLIFOSATO
O herbicida glifosato (N-(fosfonometil)glicina) é um organofosforado, não seletivo para as plantas, de ação sistêmica, pós emergente e de amplo espectro (MENSAH; PALMER; MULLER, 2014). Possui fórmula molecular C3H6NO5P (Figura 1), com um grupamento amina, carboxila e um átomo de fósforo ligado a três oxigênios. Pode se apresentar em forma de sal de potássio, sal de isopropilamina ou sal de amônio, possui alta solubilidade em água, além de apresentar capacidade de se ligar fortemente a partículas do solo (KOMIVES; SCHRÖDER, 2016). No Brasil, o glifosato é principalmente utilizado nas culturas de algodão, fumo, arroz irrigado, soja, milho, ameixa, banana, cacau, café, cana-de-açúcar, citros, maçã, pêra, pêssego e uva (AMARANTE JUNIOR et al., 2002).
Figura 1 – Molécula do herbicida glifosato.
Cores diferentes indicam átomos diferentes que compõem a molécula de glifosato. “estrela”: Grupamento fosfato; “triângulo”: grupamento amina; “losango”: grupamento carboxila. Fonte: Adaptado de ZHANG et al. (2017).
A molécula de glifosato foi descoberta em 1950 pelo químico suíço Henri Martin, o qual trabalhava para uma companhia farmacêutica. Pelo fato da molécula não apresentar propriedades farmacêuticas, ela foi vendida para outras companhias (BENBROOK, 2016). No ano de 1970 o químico da empresa Monsanto, John Franz identificou as propriedades herbicidas do glifosato e em 1974, a empresa lançou a primeira formulação comercial à base de glifosato (RoundUp®) (KOMIVES; SCHRÖDER, 2016).
Apesar de seu surgimento nos anos de 1970, apenas em 1996 com o advento dos organismos geneticamente modificados (OGM) tolerantes ao herbicida, que o glifosato atingiu um aumento de comercialização (BENBROOK, 2016, 2019; VAN BRUGGEN et al., 2018). Ainda no ano de 1996 começaram a surgir os primeiros registros de plantas daninhas resistentes ao herbicida na Austrália. Juntamente com esses registros e o vencimento da patente pela Monsanto por volta do ano 2000, várias empresas começaram a comercializar formulações com princípio ativo à base de glifosato (BENBROOK, 2016), forçando a diminuição dos preços das formulações, contribuindo dessa forma com o aumento da sua utilização nos últimos 20 anos.
O modo de ação do glifosato em plantas consiste na inibição da síntese dos aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina e triptofano), através da inibição da enzima 5-enolpiruvilshiquimato 3-fosfato sintase (do inglês 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate
synthase - EPSPS) presente em plantas, fungos e bactérias, mas não em animais (ANNETT;
HABIBI; HONTELA, 2014). O herbicida possui um elevado coeficiente de adsorção no solo (Kd = 61 g cm³), apresentando baixa mobilidade e um baixo coeficiente de partição octanol-água (log Kow = - 2,8), indicando baixa tendência de bioacumulação (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014).
Uma vez no ambiente ele pode ser degradado por microorganismos em sarcosina, ácido glioxílico e também em seu metabólito primário, o ácido aminometilfosfônico (do inglês
aminomethyl phosphonic acid - AMPA) (MENSAH; PALMER; MULLER, 2014). Para
aumentar a eficácia da penetração do glifosato nas plantas, ele é formulado com compostos chamados “ingredientes inertes” ou adjuvantes. Apesar de as bulas não especificarem quais os ingredientes utilizados, hoje se sabe que um dos mais comuns é o surfactante polioxietilenamida (do inglês polyoxyethylene amine - POEA) (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014).
A presença de surfactantes nas formulações tem sido levantada como a principal causa da toxicidade do herbicida, principalmente para organismos aquáticos. Neste sentido, FOLMAR; SANDERS; JULIN (1979) foram pioneiros na comparação da toxicidade da molécula pura de glifosato, do sal de isopropilamina de glifosato, do surfactante POEA e da formulação comercial à base de glifosato em organismos aquáticos, chegando a conclusão de que o surfactante é um ingrediente chave na toxicidade de herbicidas à base de glifosato (HBG). Desde então, outros estudos têm sido realizados para elucidar a toxicidade do glifosato e suas formulações em organismos aquáticos e não-aquáticos (CONTARDO-JARA; KLINGELMANN; WIEGAND, 2009; JANSSENS; STOKS, 2017; MESNAGE et al., 2015; MORENO; PERMANYER; MARTINEZ, 2011; POCHRON et al., 2020; RODRIGUES et al., 2019).
Nessa perspectiva, o glifosato é utilizado em mais de 750 formulações diferentes, produzidas por pelo menos 91 fabricantes em 20 países (GUYTON et al., 2015). A concentração do princípio ativo glifosato, bem como a natureza e concentração dos “ingredientes inertes” dependem da formulação comercial. As formulações Roundup® estão entre as mais utilizadas (BØHN et al., 2014) e apresentam diferentes concentrações de ingrediente ativo e inertes. A formulação Roundup WG®, por exemplo, apresenta 79% de sal de amônio glifosato, 72% de equivalente de ácido de N-(fosfonometil)glicina (Glifosato) e 20% de “ingredientes inertes” (MONSANTO, 2013). Dessa forma, o estudo toxicológico dos efeitos das formulações é ecologicamente relevante, uma vez que as formulações (HBG) são mais utilizadas do que o glifosato puro.
No Brasil, as concentrações de glifosato permitidas no ambiente são regulamentadas pela resolução N° 357 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA, 2005). Esta resolução estabelece os limites máximos de glifosato permitidos em ecossistemas de água doce. Para águas das classes 1 e 2 o limite é de 0,065 mg L-1. Águas da classe 3, o valor máximo permitido é de 0,28 mg L-1. Vale ressaltar, que todas as classes de água supracitadas podem ser utilizadas para consumo humano e animal, bem como para atividades recreativas.
Além disso, a resolução N° 396 do CONAMA (2008) e a portaria do Ministério da Saúde N° 2914 de 12 de dezembro de 2011 (BRASIL, 2011) que dispõem sobre a classificação para o enquadramento das águas subterrâneas e sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e padrão de potabilidade, estabelecem o limite máximo de 0,5 mg L-1 de glifosato e do seu metabólito AMPA em água para consumo humano. Já em âmbito internacional, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA, 2009) estabelece limite de 0,7 mg L-1 para glifosato em água potável. Por sua vez, a Comunidade Econômica Europeia (EEC) estabelece limite máximo individual de pesticidas 0,0001 mg L-1, desde que a concentração total destas substâncias não ultrapasse 0,0005 mg L-1 (AMARANTE JUNIOR et al., 2002), sendo a legislação mais cautelosa em relação aos limites máximos de pesticidas em ambientes aquáticos.
1.3 EFEITO DE HBG NO AMBIENTE
O HBG utilizado na agricultura pode alcançar o ambiente aquático por aplicação direta, próximo a ecossistemas aquáticos ou até mesmo para controlar o crescimento de plantas aquáticas, escoamento superficial de áreas cultivadas, deriva pelo vento, drenagem e percolação
pelo solo alcançando águas superficiais e subterrâneas (Figura 2). As chuvas são responsáveis por grande parte do transporte do herbicida das áreas de aplicação até águas superficiais (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014). Uma vez no ambiente, a meia-vida do glifosato varia de dois a 197 dias no solo e de sete a 21 dias na água, dependendo dos teores de argila, matéria orgânica e nível de atividade microbiana (GIESY; DOBSON; SOLOMON, 2000).
Figura 2 – Principais formas de contaminação dos ambientes aquáticos por agrotóxicos.
As ações de aplicação direta, escoamento superficial, deriva provocada pelo vento e percolação para águas subterrâneas são as principais fontes de contaminação dos ambientes aquáticos. Fonte: do próprio autor (2019).
Estudos têm detectado a presença do glifosato em águas superficiais, subterrâneas, sedimento, matéria em suspensão e solo em diferentes locais do planeta (Apêndice A). No Brasil, apesar de existirem poucos trabalhos dessa natureza, o herbicida já foi detectado em águas superficiais, tendo valores de 0,00002 até 2,0 mg L-1 (FREIRE et al., 2012; SILVA; PERALBA; MATTOS, 2003), em biofilmes aquáticos com valores de 0,01 – 0,35 mg kg-1 (FERNANDES et al., 2019) e no ar atmosférico com valores entre 0,002 até 2,94 μg m-³ (SOUSA et al., 2019). Muitos dos valores encontrados em águas superficiais estão acima dos permitidos no Brasil pela resolução N° 357/05 do CONAMA.
Devido ao seu baixo coeficiente de partição octanol-água (log Kow), não é esperado que o glifosato bioacumule em tecidos biológicos (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014), sendo improvável a contaminação pela cadeia trófica causada pela sua biomagnificação. Contudo, a presença do herbicida em concentrações elevadas no meio ambiente e sua disponibilidade têm levantado questionamentos sobre o assunto, o que já levou a constatação da bioacumulação do glifosato em diferentes organismos (CONTARDO-JARA; KLINGELMANN; WIEGAND, 2009; DRUART et al., 2011; FERNANDES et al., 2019; WANG; JAW; CHEN, 1994).
O estudo de WANG; JAW; CHEN (1994) relataram a assimilação de glifosato na carpa
Cyprinus carpio, e na tilápia-de-moçambique Oreochromis mossambicus.
CONTARDO-JARA; KLINGELMANN; WIEGAND (2009) também observaram a bioacumulação do glifosato no anelídeo Lumbriculus variegatus. Similarmente, DRUART et al. (2011) encontraram evidências de acumulação de resíduos de glifosato no gastrópode terrestre Helix
aspersa. Sua presença no ambiente é preocupante, uma vez que esses resultados apontam uma
assimilação do herbicida, que pode indicar uma bioacumulação, uma vez que o herbicida bioacumule, é possível a sua biomagnificação até níveis tróficos de consumidores quaternários, como os seres humanos, contrariando as baixas probabilidades de bioacumulação devido ao seu baixo coeficiente de partição octanol-água.
Adicionalmente, TAKAHASHI; HORIE; AOBA (2001) detectaram glifosato em produtos agrícolas destinados para o consumo humano. Da mesma forma, BØHN et al. (2014) investigando a composição química de grãos de soja geneticamente modificados (Roundup Ready), encontraram resíduos de glifosato presentes nos grãos (em média 3,3 mg kg-1). Os grãos ainda apresentaram menores teores de proteínas, minerais e açucares quando comparados com grãos não-transgênicos. Resíduos de glifosato (0,03 – 1,08 mg kg-1) ainda foram encontrados em fórmulas infantis à base de soja (RODRIGUES; DE SOUZA, 2018). Essa problemática alcança um novo nível, quando levamos em consideração a detecção do glifosato também em amostras de urina, sangue e leite materno (BOLOGNESI et al., 2009; CONRAD et al., 2017; MILLS et al., 2017; OSTEN; DZUL-CAAMAL, 2017; ZOUAOUI et al., 2013).
Além das evidências de bioacumulação, o glifosato pode ainda causar estresse oxidativo, genotoxicidade (fragmentação de DNA), neurotoxicidade, teratogenicidade, citotoxicidade (alteração de proteínas do ciclo celular e ativação de caspases), redução de fertilidade e até mortalidade em diferentes animais, como observado em sua maioria em vertebrados, e em cultura celular humana (ANNETT; HABIBI; HONTELA, 2014; BONFANTI et al., 2018; KAŠUBA et al., 2017; MARC; MULNER-LORILLON; BELLÉ, 2004; ZEBRAL et al., 2018)
Além disso, para vertebrados e cultura celular humana, o glifosato também é considerado um composto desregulador endócrino (CDE), mimetizando o efeito de hormônios de crescimento e reprodução (GASNIER et al., 2009; MYERS et al., 2016; SOSO et al., 2007), podendo afetar o crescimento populacional de espécies expostas ao HBG, que sejam sensíveis a estas formulações. Desta forma, moléculas como aromatase, fator esteroidogênico 1 (SF-1) e vitelogenina vêm sendo utilizadas para investigar os efeitos de HBG no sistema endócrino de vertebrados (ARMILIATO et al., 2014; RICHARD et al., 2005; XIA et al., 2013). Contudo,
apesar de representar quase 95% da fauna (DEPLEDGE; BILLINGHURST, 1999), estudos sobre os efeitos de HBG no sistema endócrino de invertebrados são escassos.
Apesar de todos os efeitos adversos que a literatura reporta para o glifosato, as agências reguladoras nacionais e internacionais o classificam como de baixa toxicidade (ANVISA, 2015; USEPA, 1993). Entretanto, após o encontro da Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (do inglês International Agency for Research on Cancer – IARC) realizar uma série de revisões de publicações científicas, o glifosato foi classificado como “provavelmente carcinogênico para humanos” (IARC, 2015; PORTIER et al., 2016). Em contrapartida, após a classificação do glifosato pela IARC, a Autoridade Europeia para Segurança dos Alimentos (do inglês European Food Safety Authority – EFSA) também liberou uma avaliação concluindo que seria “pouco provável que o glifosato seja carcinogênico para os seres humanos” (EFSA, 2015).
No ano seguinte, a Organização de Alimentos e Agricultura (do inglês Food and
Agriculture Organization – FAO) e a Organização Mundial da Saúde (do inglês Worl Health Organization – WHO), após avaliação do potencial carcinogênico do glifosato presente nos
alimentos, concluíram que este “não apresenta risco carcinogênico via alimentação” (FAO; WHO, 2016). As avaliações liberadas pelas agências reguladoras são pouco conclusivas, deixando evidente a falta de consenso sobre os efeitos adversos do glifosato como potencial agente carcinogênico em humanos e, também seus efeitos no ecossistema e em organismos não-alvo.
BENBROOK (2019) aponta que em sua maioria, os estudos realizados pela IARC levaram em consideração dados de publicações que passaram por revisão de pares, além de serem estudos sobre os efeitos de HBG e seus surfactantes, ainda levando em consideração riscos ocupacionais e cenários extremos de exposição direta e indireta. Enquanto as outras agências consideraram em sua maioria estudos apenas com o ingrediente ativo (glifosato), de dados que não foram publicados (em sua maioria com efeitos negativos), além de apenas considerarem exposições sem risco ocupacional.
Diante desse panorama, estudos toxicológicos agudos, subagudos e crônicos vêm sendo realizados para identificar efeitos adversos de HBG em diferentes organismos, visando estabelecer biomarcadores e também organismos bioindicadores frente à exposição a HBG (DEEPANANDA et al., 2011; MENSAH; MULLER; PALMER, 2012a, 2012b; SÁNCHEZ et al., 2017; TSUI; CHU, 2003).
1.4 ESTUDOS EM TOXICOLOGIA, BIOMARCADORES E BIOINDICADORES
Os estudos toxicológicos clássicos podem ser agudos, subagudos ou até mesmo crônicos, e podem variar de acordo com o ciclo de vida do organismo estudado. Os ensaios agudos, compreendem a toxicidade resultante de uma única exposição a determinada substância, no qual os organismos são expostos pelo período de 96 horas, podem ser estáticos, sem a renovação da solução dos aquários ou até mesmo semi-estático com renovação da solução (STINE; BROWN, 2006). A toxicidade aguda é importante para se determinar a concentração que causa mortalidade (pelo menos 50%) na população amostrada, parâmetro definido como Concentração Letal Média 50% 96h (CL50 96h). Em contrapartida, estudos subagudos avaliam as respostas para substâncias que são aplicadas repetida ou continuamente por um período que não exceda 14 dias e os estudos crônicos compreendem os ensaios com aplicações repetidas ou continuamente da substância, que excedam o período de 90 dias (STINE; BROWN, 2006).
As respostas dos estudos subagudos e crônicos podem ser relacionadas a crescimento, alterações comportamentais, de aspectos reprodutivos, morfológicas, histopatológicas, fisiológicas, bioquímicas, celulares e moleculares (MENSAH; PALMER; MULLER, 2014). Estas respostas biológicas provocadas pelo estresse da exposição a diferentes estressores podem ser consideradas biomarcadores e podem se manifestar em formas e níveis de organização diferentes, desde respostas moleculares até níveis ecossistêmicos (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Desta forma, biomarcadores são excelentes ferramentas para monitorar a qualidade de ecossistemas aquáticos, além de fazerem parte de programas modernos de monitoramento ambiental.
Biomarcadores histopatológicos por exemplo têm sido utilizados para avaliar o efeito tóxico de diferentes substâncias em animais, refletindo dessa forma alterações prévias nas funções fisiológicas, bioquímicas, celulares e moleculares (BERNET et al., 1999; CHIODI BOUDET et al., 2015; COSTA et al., 2013). Através de análises histopatológicas é possível identificar de forma rápida e com relativo baixo custo os efeitos subagudos e crônicos de diferentes poluentes. Do mesmo modo, mesmo em baixas concentrações, análises histopatológicas podem responder as interferências do meio e indicar precocemente contaminações ou situações de estresse (BERNET et al., 1999).
Por sua vez, as alterações moleculares e celulares são as primeiras respostas a serem identificadas, representando os efeitos iniciais da exposição aos contaminantes e fornecem resultados sobre a ação tóxica dos estressores, sendo importantes nas análises toxicológicas com curtos períodos de exposição (THOMPSON et al., 2012). Nesse sentido, LE et al. (2010)
avaliaram o efeito do glifosato na expressão de genes (Arnt – proteína translocadora nuclear do receptor de aril hidrocarboneto, Dhb - hemoglobina, Vg - vitelogenina, citocromo CYP4 e
citocromo CYP314) em Daphnia magna e observaram uma diminuição na expressão relativa de Arnt, CYP4 e Dhb, indicando que estudos moleculares também são sensíveis à exposição ao herbicida.
Apesar de serem ferramentas uteis em avaliações toxicológicas, o uso de apenas um biomarcador para se avaliar a toxicidade de uma determinada substância deve ser evitado. Nessa perspectiva, ao se utilizar diferentes biomarcadores, é necessário verificar quais respondem melhor para cada organismo e substância estudada. Nesta perspectiva, BELIAEFF; BURGEOT, (2002) e SANCHEZ; BURGEOT; PORCHER, (2013) desenvolveram e adaptaram o índice Reposta Integrada de Biomarcadores (RIB). Este índice foi descrito para estudos toxicológicos ambientais, porém cada vez mais vem sendo utilizado em ensaios laboratoriais (HONG et al., 2018; KIM; WOO-KEUN, 2016; SOBJAK et al., 2017). A RIB indica a modulação dos biomarcadores após a exposição a determinada substância, assim, quanto maior o valor de RIB, maior a capacidade dessa substância em inibir ou induzir os diferentes biomarcadores, sendo uma ferramenta valiosa em avaliações toxicológicas de diferentes contaminantes e em avaliações de riscos ambientais (BERTRAND et al., 2016; HONG et al., 2018).
Além do estabelecimento de biomarcadores de exposição a diferentes estressores, existe uma crescente preocupação em definir organismos que possam ser bioindicadores dos efeitos adversos de tais agentes estressores. Bioindicadores, por sua vez, são organismos ou comunidade de organismos que refletem as alterações ambientais do meio onde vivem, indicando impactos positivos ou negativos (PARMAR; RAWTANI; AGRAWAL, 2016). Os organismos mais clássicos utilizados como bioindicadores são os peixes e macroinvertebrados. Dentre os macroinvertebrados, trabalhos têm caracterizado os crustáceos como bons bioindicadores (DUARTE et al., 2016; GALVÃO et al., 2018; WEBB, 2011). A crescente utilização dos crustáceos se deve em parte ao fato deles serem mais sensíveis a pesticidas do que peixes e moluscos, dessa forma, eles vêm sendo amplamente utilizados como indicadores da qualidade de ambientes aquáticos (GARCÍA-DE LA PARRA et al., 2006).
Os camarões Macrobrachium por exemplo, são conhecidos por responder às alterações do físico-químicas do ambiente em que vivem. GALVÃO et al. (2018) estudando as concentrações do metal mercúrio nas espécies Macrobrachium depressimanum e
Macrobrachium jelskii na Bacia do Rio Madeira, concluíram que as espécies de ambientes com
tecidos (hepatopâncreas, músculo e exoesqueleto), podendo ser consideradas espécies bioindicadoras da exposição ao metal. Similarmente, BARBIERI et al. (2013) e SOARES et al. (2016) analisaram em laboratório as respostas dos camarões dulcícolas Macrobrachium olfersii e Macrobrachium pantanalense, expostos a diferentes agrotóxicos e concluíram que os organismos são ótimas espécies-teste para exposição aos poluentes estudados, apresentando maior sensibilidade aos agrotóxicos, apresentado uma diminuição no consumo de oxigênio para
M. olfersii e uma menor sobrevivência para M. pantanalense, além de serem representantes dos
ecossistemas tropicais. Devido a facilidade de manutenção em laboratório, aliado ao fato de responderem as alterações ambientais, a utilização de espécies do gênero Macrobrachium como organismos bioindicadores em estudos toxicológicos tem se tornado uma realidade cada vez mais comum.
1.5 GÊNERO MACROBRACHIUM – M. POTIUNA (MÜLLER, 1880)
Camarões do gênero Macrobrachium possuem uma ampla distribuição geográfica no mundo, suas populações são numerosas e são de fácil manutenção em laboratório (FOSSI et al., 2000; JALIHAL; SANKOLLI; SHEOY, 2013), além de já terem se mostrado bons organismos para estudos de toxicidade (BARBIERI et al., 2013; GALVÃO et al., 2018; SOARES et al., 2016). Além disso, possuem importância ecológica, pois participam de vários níveis tróficos, auxiliando na manutenção e equilíbrio de ecossistemas aquáticos, na ciclagem de energia e no fluxo de nutrientes (MACIEL; VALENTI, 2009). Por habitarem rios e riachos, assim como outros organismos, estão susceptíveis a ação de poluentes (e.g. HBG).
M. potiuna é um palemonídeo de pequeno porte, não ultrapassando 52 mm de
comprimento total (MÜLLER, 1982) (Figura 3). Esta espécie desenvolve todo o seu ciclo de vida em ambientes de água doce, e podem ser encontrados no Brasil, do Estado da Bahia até o Rio Grande do Sul (BOND-BUCKUP; BUCKUP, 1989; CARVALHO; PILEGGI; MANTELATTO, 2013). M. potiuna é encontrado em rios e riachos com águas transparentes, fundo rochoso, com corredeiras e rios costeiros com água escura e vegetação marginal (BOND-BUCKUP; BUCKUP, 1989). Em condições de laboratório os machos podem viver por 330,8±24,31 dias, enquanto que as fêmeas vivem por 337,5±19,71 dias. Na natureza a sobrevivência de machos pode ser de até 398,67±22,21 dias, enquanto que para fêmeas seria de 369,4±24,35 dias (BOND; BUCKUP, 1983). Além disso, o período entre uma ecdise e outra, ou seja, o período de intermuda de M. potiuna é de aproximadamente 23,42 dias para machos e 25,02 dias para fêmeas (BOND; BUCKUP, 1983).
Figura 3 - Macrobrachium potiuna. Imagem de exemplar fêmea e macho. Mapa da distribuição da espécie no Brasil.
Barra de escala nas imagens dos camarões = 5 mm. Fonte: do próprio autor (2019).
Assim como outras espécies do gênero, M. potiuna apresenta variação morfológica, tanto em tamanho e massa, quanto na forma da carapaça, o que pode dificultar a sua diagnose em animais jovens (CARVALHO; PILEGGI; MANTELATTO, 2013; DE MELO; MASUNARI, 2017). Os principais estudos presentes na literatura sobre a espécie têm focado na biologia populacional, distribuição, crescimento, reprodução, razão sexual e desenvolvimento embrionário (para revisão: DE MELO, 2016). Todavia, apesar da sua relevância ecológica e ampla distribuição nacional, inexistem trabalhos que foquem nos efeitos de agrotóxicos em M. potiuna, tampouco nos efeitos agudos e subagudos de baixas concentrações de HBG.
Apesar de inexistirem estudos em espécies tropicais e subtropicais nativas de camarões dulcícolas, a ação aguda e subaguda de HBG já foi estudada em outros Pancrustacea (Maxillopoda, Branchiopoda e Malacostraca) (AVIGLIANO et al., 2018; AVIGLIANO; FASSIANO; MEDESANI, 2014; CANOSA et al., 2018; DEEPANANDA et al., 2011; MENSAH; MULLER; PALMER, 2012a, 2012b; MENSAH; PALMER; MULLER, 2014; TSUI; CHU, 2003). Os resultados de tais estudos mostram um comprometimento ovariano em caranguejos Neohelice granulata (AVIGLIANO et al., 2018; AVIGLIANO; FASSIANO; MEDESANI, 2014; CANOSA et al., 2018) e um efeito estimulatório do sistema neuroendócrino em camarões Caridina nilotica expostos ao HBG (MENSAH; MULLER; PALMER, 2012b). Dessa forma, podemos sugerir que as exposições a formulações de glifosato
comprometeram o sistema endócrino das espécies estudadas, provocando alterações nos processos fisiológicos como a reprodução e o crescimento.
1.6 SISTEMA ENDÓCRINO DE CRUSTÁCEOS
O sistema endócrino de protostômios, mais precisamente de crustáceos é menos conhecido quando comparado com representantes dos deuterostômios (e.g. Chordata). Todavia, as primeiras evidências de hormônios em crustáceos surgiram durante a década de 1920, principalmente com os estudos das moléculas liberadas pelo pedúnculo ocular e suas ações no crescimento destes organismos (para revisão: RODRÍGUEZ; MEDESANI; FINGERMAN, 2007). Basicamente, o sistema endócrino controla os processos de muda/ecdise, crescimento, reprodução e metabolismo.
Similarmente, como em cordados, os hormônios exercem um papel fundamental na regulação de vários processos fisiológicos dos crustáceos e são sintetizados e liberados de tecidos específicos frente a estímulos neurológicos (LEBLANC, 2007). Após sua síntese e liberação, os hormônios são transportados pelo sistema circulatório para os tecidos-alvo, no qual se ligam a receptores de membrana específicos, estimulando cascatas de sinais intracelulares que levam a liberação de novos hormônios ou a regulação direta de processos fisiológicos (Figura 4) (MAZUROVÁ et al., 2008).
Figura 4 – Principais moléculas do sistema endócrino em Decapoda.
20-HE – 20-hidroxiecdisona; OX – órgão X/glândula do seio; OY – órgão Y; OM – órgão mandibular; Vg – vitelogenina; REc – receptor de ecdisteróide; HIM – hormônio inibidor da muda; HIG – hormônio inibidor da gônada; HIOM – hormônio inibidor do órgão mandibular; G – gônada; H – Hepatopâncreas; Qb – quitobiase; MF – metil farnesoato. Fonte: do próprio autor (2019).
Um dos principais órgãos neuroendócrinos dos crustáceos é o complexo órgão X/glândula do seio (OX/GS) (Figura 4). Em Decapoda mais derivados (Dendrobranchiata e Pleocyemata) o OX está localizado no pedúnculo ocular e projeta seus axônios para o órgão neurohemal, conhecido como GS, também localizado no pedúnculo ocular (RODRÍGUEZ; MEDESANI; FINGERMAN, 2007). Os principais hormônios sintetizados e liberados pelo OX/GS são o hormônio inibidor da muda (HIM) (do inglês molt inhibiting hormone - MIH), o hormônio inibidor da gônada (HIG) (do inglês gonad inhibiting hormone – GIH), o hormônio inibidor do órgão mandibular (HIOM) (do inglês mandibular organ inhibiting hormone – MOIH) e o hormônio hiperglicêmico de crustáceos (HHC) (do inglês crustacean hyperglycemic hormone
CHH), além destes, ainda são liberados pelo OX/GS vários hormônios de alteração de cor
(LEBLANC, 2007).
O HIM controla negativamente a síntese de ecdisteróides provocando no órgão Y (OY) a redução intracelular dos níveis de 3´5´-adenosina-monofosfato-cíclico (AMPc) (do inglês cyclic Adenosine Monophosphate - cAMP), mantendo os níveis circulantes de ecdisteróides baixos durante os períodos entre uma ecdise e outra. Por outro lado, a queda dos níveis do HIM antes da ecdise resulta em um aumento abrupto nos ecdisteróides circulantes, estimulando dessa forma a ecdise (MATTSON; SPAZIANI, 1986; RODRÍGUEZ; MEDESANI; FINGERMAN, 2007).
O OX/GS também controla o processo de reprodução, sendo responsável pela liberação de HIG controlando negativamente a maturação ovariana e o crescimento dos testículos (AGUILAR et al., 1992; CHANG, 1993). Em fêmeas, o HIG inibe diretamente os ovócitos, regulando a absorção da vitelogenina (Vg) da hemolinfa durante a vitelogênese (RODRÍGUEZ; MEDESANI; FINGERMAN, 2007). Em Pleocyemata fêmeas (Caridea e Brachyura), a Vg é sintetizada no hepatopâncreas ou no ovário, ou ainda em ambos, liberada na circulação e então depositada nos ovócitos no qual é incorporada por endocitose mediada por receptores de vitelogenina (FANG-YI LEE; CHING-FONG CHANG, 1997; MAK et al., 2005; SUBRAMONIAM, 2011). Em Macrobrachium rosenbergii foi identificado que o hepatopâncreas é o único local de síntese de Vg (FANG-YI LEE; CHING-FONG CHANG, 1997).
Além dos HIM e HIG, o complexo OX/GS também é responsável pela síntese e liberação do HIOM, que regula negativamente o órgão mandibular (OM). O OM em Decapoda é localizado anteriormente e abaixo ao órgão Y (OY), mais especificamente, na base do tendão da mandíbula e é associado ao músculo abdutor das mandíbulas. É um órgão par, foliáceo e multilobado (BORST et al., 2001; SAGI; HOMOLA; LAUFER, 1991). Este órgão é
responsável pela síntese e liberação do hormônio metil farnesoato (MF), que por sua vez é a forma inepoxidada do hormônio juvenil (HJ) dos insetos (HJ III). Em insetos, o HJ exerce várias funções regulatórias na morfogênese e reprodução (BORST et al., 2001; RODRÍGUEZ; MEDESANI; FINGERMAN, 2007; SAGI; HOMOLA; LAUFER, 1991).
A similaridade estrutural do MF com o HJ III sugere que o MF possui funções muito similares com as exercidas pelo HJ em insetos. Em crustáceos, o MF estimula a metamorfose larval, o crescimento, a reprodução e até mesmo o comportamento (MAK et al., 2005; MU; LEBLANC, 2002a; OKUMURA; HARA, 2004; SOROKA et al., 2000). Já foi observado também em crustáceos uma correlação positiva entre os níveis de MF e ecdisteróides (MAZUROVÁ et al., 2008), reforçando o papel do MF no processo de ecdise, crescimento e reprodução.
Adicionalmente, os crustáceos também possuem o OY, que se localiza no cefalotórax, próximo a base das antênulas (MAZUROVÁ et al., 2008). A principal função do OY é a liberação de esteroides, que são requeridos principalmente no processo de ecdise. O esteroide mais comum e importante para os crustáceos é o hormônio 20-hidroxiecdisona (20-HE). A síntese de ecdisteróides no OY utiliza como precursor o colesterol, que basicamente é convertido em 7-dehidrocolesterol (7-dc), seguido da conversão para 5β-cetodiol, resultando em alguns passos mais tarde na conversão para ecdisona que finalmente é convertida para a forma ativa 20-HE nos tecidos periféricos, como hepatopâncreas, gônadas e epiderme (MYKLES, 2011; SPAZIANI et al., 1999). Além da sua importância para o processo de ecdise, 20-HE é necessário para a reprodução e desenvolvimento embrionário (MU; LEBLANC, 2002b). Evidências em camarões palemonídeos (Macrobrachium) sugerem que os ecdisteróides também estimulam a vitelogênese durante a maturação ovariana, induzindo a síntese da proteína vitelogenina (Vg) (SUBRAMONIAM, 2011).
Todavia, a ação dos ecdisteróides nas células alvo é exercida através de um membro da superfamília de receptores nucleares, o receptor intracelular de ecdisteróides (REc) (do inglês
Ecdysteroid Receptor - EcR) (MAZUROVÁ et al., 2008). No núcleo das células alvo, o REc
hibridiza com outro receptor nuclear, o receptor de retinóide X (do inglês retinoid X receptor–
RXR) formando o complexo EcR/RXR. Quando hibridizados, o complexo EcR/RXR recruta
co-ativadores que estimulam a transcrição gênica (LEBLANC, 2007) levando à ecdise. Por outro lado, como mencionado anteriormente, a síntese de ecdisteróides pelo OY é negativamente controlada pelo HIM, liberado pelo OX (LEBLANC, 2007; MAZUROVÁ et al., 2008).
Dessa forma, o aumento dos hormônios esteroides na hemolinfa, liberados pelo OY estimulam o processo de ecdise, culminando com desencadeamento da separação da epiderme do exoesqueleto, processo conhecido como apólise (ZOU; FINGERMAN, 1999a). O exoesqueleto se desprende parcialmente da epiderme, formando um espaço que fica preenchido pelo fluído da ecdise. Este fluído é secretado pela epiderme e é um conjunto de íons inorgânicos, proteases e duas enzimas quitinolíticas, as quitinases e a quitobiase (N-acetil-β-D-glicosaminidase – NAG) (ESPIE; ROFF, 1995; SAMUELS; REYNOLDS, 1993).
As quitinases hidrolisam a cutícula para trímeros e oligômeros de NAG, que são posteriormente hidrolisados pela quitobiase para monômeros de NAG, que por sua vez são catabolizados em peptídeos e aminoácidos por proteases, sendo responsáveis pela degradação da quitina do exoesqueleto antigo (REYNOLDS; SAMUEL, 1996; SONG et al., 2017). A expressão da quitobiase é positivamente regulada pelo hormônio 20-HE, através da ativação transcricional dos REc (ZHENG et al., 2008; ZOU; FINGERMAN, 1999b, 1999a).
O processo de ecdise é uma importante sinapomorfia dos Ecdysozoa (AGUINALDO et al., 1997; BUDD; TELFORD, 2009), garantindo que o animal continue crescendo, mesmo possuindo uma carapaça externa rígida. O processo de ecdise, juntamente com o processo de reprodução pode ser perturbado por uma gama de poluentes, através de vários mecanismos. Substâncias como os inseticidas endosulfan, clordecona, heptacloro, o fungicida fenarimol e CDE (etinilestradiol, acetato de ciproterona, metiltestosterona e 4-hidroxitamoxifeno) provocaram perturbação no processo de ecdise em diferentes espécies de crustáceos (GISMONDI, 2018; GISMONDI; THOMÉ, 2014; LAFONTAINE et al., 2016a; MU; LEBLANC, 2002b; SNYDER; MULDER, 2001; ZOU; FINGERMAN, 1997). Contudo, apesar de alguns estudos observarem distúrbios na ecdise após exposição à CDE, pouca informação sobre a ação no sistema endócrino de crustáceos está disponível. Especificamente sobre HBG, apenas se sabe que estas formulações foram responsáveis por aumentar o número cumulativo de ecdises no camarão C. nilotica (MENSAH; MULLER; PALMER, 2012b), sugerindo um efeito estimulatório do sistema neuroendócrino. No entanto, os autores incentivam novas investigações sobre os efeitos de HBG nos receptores de ecdisteróides em níveis celulares e bioquímicos.
1.7 HEPATOPÂNCREAS COMO ÓRGÃO ALVO DA TOXICIDADE AO HBG
O sistema digestório dos crustáceos é composto por uma estrutura tubular que se estende por todo o corpo do animal. Esta estrutura pode ser dividida em três regiões, o intestino anterior,
