Estudos preliminares sobre cultivo de microalgas planctônicas, em condições de laboratório

CENTRO DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA

ESTUDOS PRELIMINARES SOBRE CULTIVO DE MICROALGAS PLANCIONICAS, EM coNDIOEs DE LABORATbRIO

Francisco de Assis Nreira. da. Cbsta

Dissertaggo apresentada ao Departamento de Engenharia de Pesca do Cent.ro de Ciancias Agrgrias da Universidade Fede-ral do Cearg, CONO parte das exigancias

para a obtenção do titulo de Engenheiro de Pesca.

Fortaleza- Cear-BRASIL JUNHO/1979

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca Universitária

Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

C872e Costa, Francisco de Assis Pereira da.

Estudos preliminares sobre cultivo de microalgas planctônicas, em condições de laboratório / Francisco de Assis Pereira da Costa. – 1990.

39 f. : il.

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 1990.

Orientação: Profa. Ma. Vera Lucia Mota Klein. 1. Microalgas. I. Título.

CDD 639.2 1979

1979 38

OMISSA0 EXAMINADORA:

MARIA IVONE MOTA ALVES Professor Adjunto

Presidente

FRANCISCA PINHEIRO VERAS JOVENTIVO Professor Assistente

VISTO:

GUSTAVO HITZSCHKY FERNANDES VIEIRA Professor Assistente

Chefe do Departamento de Engenharia de Pesca

MARIA IVONE MOIA ALVES Professor Adjunto

AGRADECIMENTOS

. A mestra VERA LUCIA MOTA KLEIN, meus agradecimentos espe- ciais pela dedicaria orientagao deste trabalho bem Coro pela sincera amizade firmada;

a

Química Industrial NORMA BARRET° PERDIGAO pela disponibi lidade e ajuda na preparagao dos meios de cultivo;

aos meus irmaos ANA EMILIA e MANUEL pelas microfotografias; ao auxiliar de laborat6rio MANOEL ERONES DE SANTIAGO;

ao LaboratOrio de Ci&lcias do Mar, pela utili7.-Igao de seus equipamentos e dependancias;

a todos aqueles que de alguma forma contribiliram para a realizag.ao deste trabaIho.

EM CONDIOES DE LABORATCRIO aenrisco de

Assis Pereira da Costa

Com a crescente cargncia energetica e proteica dos dias atuais, g cada vez major a importancia dos recursos marinhos. Neste con texto, o plancton surge coro uma promissora alternativa para minorar tais problemas; utilizando seu conhecimento como base cientifica e tec noi6gica pare estudos de aquicultura, pois, para que se procedaaexplo raga° racional de um recurso aqugtioo, necessarao se faz o conhecimen-to de conhecimen-todo o desenrolar da cadeia alimentar neste ambiente.

O fitoplancton constitui a base da piramide Lit5fica dos

ambientes aquaticos; sua produtividade guarda estreita ralação corn a produção futura das espgcies de importãncia econOmica. Baseados neste fato, poderiamos obter melhores resultados em aquicultura, se fosse mantida uma alimentagEo abundante e adequada aos organismos, que em tinia anglise dependem do plancton.

Por outro lado, e sabido que a produtividade primgria da plataforma continental brasileira e em geral pobre, em decorrgncia do seu baixo teor de nutrientes, excetuando-se os locals em que ocorre o fen-Oren° da ressurggncia (YONESEIGUE BRAGA, 1971). Deste modo, o cul tivo de algas torna-se mais relevante, considerando a brevidade dos seus ciclos reprodutivos. Estes vegetais são capazes não s6 de uma pro dugao superior

a

maioria dos demais conhecidos, como

tante.mdepermitir,

em condi96es de laboratOrio, manter-se uma biomassa por unidade de volume superior ao que comumente g encontrado na natureza,

em

2. A importancia da obtengao de cultures monoalgais planctani cas, reside na grande variedade de utilizagHo para diversos fins: na genetica, citologia, nrfologia taxonomia e fisiologia vegetal;emes-tudos eoafisiol6gicos do fitoplancton; nas pesquisas de carter expe rimental, como fonte de alimento para organismos aqugticos (com finali dades cientificas ou econtamicas); fonte de proteínas para o consumo human° (VIEIRA, 1977) e, mais recentemente, como fonte alternativa de combustivel, produzindo o ges Hetano, atraves da hidraise ou fermenta gao anaer6bica de sua biomassa.

Em nosso trabalho, testamos diversos meios de cultivo para microalgas, jg referidos na bibliografia existente, algumas vezes com pequenas modificagaes, em diferentes espécies fitoplanctOnicas. Procu ramos o mais adequado as especies nativas e as nossas oondigaes ambien tais.

As microalgas utilizadas em nosso trabalho foram sempre obtidas sob condigOes de rer4 baixa, na praia do Meireles

(Fortaleza-CE-Brasil), em poças de mare do supTalitoral. Estes ambientes possuem populagOes desses microvegetais quase puras, apresentando. grande resis tencia as variagOes de temperatura e salinidade.

As coletas foram procedidas mediante rede de plãncton pa drão, com abertura de malha de 85 um. Simultaneamente, medimos a tempe ratura da -igua, coletamos amostras para determinação da salinidade se-gundo o má-Lodo de Knudsen mcdific,ado por Swingle (1969) e o pH utili zando papel indicador da Carlo Erba.

0 transporte das amostras para laboratOrio foi imediato, transcorrendo em reduzido intervalo de tempo, dado a proximidade des te com o local de coleta.

Uma vez em laboratOrio, as amostras sofreram dois tipos de processamento. A principio deixamo-las precipitando na tentativa de isolar a espécie Skeeetonema coztatum. Posteriormente passamosacentri

fugã-las (450 r.p.m. minuto) para isolamento de todas as especies desejadas.

Quanto 'as condig6es de cultivo, nosso trabalho dividiu-se essenciaImente em duas etapas distintas:

- primeira etapa: cultivos de microalgas planctOnicas em condigaes ambientais de temperatura e luz solar difusa - sem conLyule asseptico durante o manuseio.

- segunda etapa: cultivos de microalgas planctõniras

a

uma temperatura de 24°C e iluminação continua de 2.700 lux; com todo manuseio em camara asgptica (com contzole).

14,

Durante a primeira etapa do experimento, toda a vidraria utilizada no manuseio do cultivo-incluindo frascos de coleta, erlenme yers, pipetas, tubos de ensaio, capilares e laminas, foi apenas lavado com detergente e virias vezes com ggua, porem, os meios de cultivo fo-ram esterilizados. Na segunda etapa, alem de autoclavados os meios de cultura e equipamentos, estes taMbem foram lavados com solução de goi do nítrico (HNO

3) a 10% (GUIMARAES, 1977) e em seguida, por vgrias ve-zes, com agua clorada a fim de reduzir a contaminação baeteriana.Nesta etapa, somente as placas de Petri e tubos de ensaio para 1n6cu10 em meio sOlido, foram lavadas com detergente e ggua.

Imediatamente apOs as centrifugagEes das amostras, quando necessgrio, filtramos o precipitado em telas de "nylon" com abertura de 300 4m, lavando-o com jatos de ggua do mar - filtrada e envelhecida - proveniente do mesmo local de coleta. Para isso utilizamos seringa hi podermica de 10 cc. Ta) procedimento permitiu-nos minimizar a oontami nação da amostra com resíduos de maior tamanho, tamb6m filtrados por ocasião da coleta.

Logo em seguida o precipitado filtrado foi incubado. mi cialmente utilizamos apenas ggua do mar filtrada (em filtro domgstico) e envelhecida, sob agitação constante. Posteriormente incubando-o com o meio de cultura escolhido (TABELA 1); quando o meio utilizado foi o de End-Schreiber, suplementamos a cada 5 dias, na proporção de 1 ml de ES para cada 1.000 ml de ggua do mar (filtrada e envelhecida) e sob agitação, para a primeira e segunda etapas.

Decorridas no mgximo 24 horas apOs a coleta, e portanto de incubação, procedemos o isolamento das especies desejadas, uma a uma,a partir da preparação e exame, em microscOpio, de laminas escavadas con tendo 0,15 ml do material centrifugado incubado. 0 isolamento das celu las ou cadeias foi feito por intermedio de capilardevidro (PRINGSFITI4 1946).

Os meios de cultivo e as condig6es em que os HRSMOS foram empregados são mostrados na TABELA I e II.

- meio natural: ggua do mar filtrada e envelhecida(lmes), coletada no mesmo local de onde foram procedidas as co letas.

- meio "f" (GUILLARD & RYTHER, 1962 - modificado):

a

agua do mar filtrada, adicionamos metassilicato de sadio (Na2 Si 03 _{. 9 H20)5 autoclavando-se em seguida. 0 fos} fato (Na H2 PO4 . H20) e nitrato (Na NO3) foram autocla vados separadamente para evitar precipitagaes (CAS- TELLVI, 1971). Decorridas 24 horas aproximadamente, em condig6es assepticas, adicionamos o fosfato, o nitrato e os micronutrientes, previamente preparados em solu g5es.

A solução de micronutrientes (solução de vitaminas e me-teis) do meio "f", tambem foi modificada visto não ter constatado a cianocobalamina (TABELA II).

Referida solução obedeceu

a

seguinte composigao e concen tração: Tiamina 200,0 mg aotina 0,001 g Cu SO 4.5 H20 • "1,0.004 19,6 mg Zn SO 4 . 7 H20 44,0 mg Co C12 .6 H20 • Of.000000 20,0 mg Mn Cl2.4 H20 360,0 mg Na_{2 Mo 04.2 H20} 12,6 mg

OS queis foram dissolvidos, assepticamente, em 1.000 ml de ggua bi--destilada e esterilizada. Em seguida, 1 ml dessa solução foi adido nado a lt de água do mar, obtendo-se assim as concentrag6esoriginais dos micconutrientes estabelecidos (TABELA II).

6. No meio "f" o enriquecimento com nutrientes e relativamen te elevado, o que minimiza as possiveis variag6es da composição quImi ca por mineralizagão, quando da estocagem da água do mar. t um meio favorgvel para obtenção de culturas axenicas (VIEIRA, 1977).

- Erd-Schreiber-ES-(GROSS, 1937): adicionamos o nitrato (Na NO3) e o fosfato (Na H2 P0 [20) dissolvidos e autoclavados separadamente, em Lede ggua do mar esteri lizada. Decorridas aproximadamente 24 horas de esteri-lização, acrescentamos 50 ml de estrato de solo (FOYN, 1934, cit. in: GROSS, 1937, ref in: Vieira, 1977). Como o cultivo era de diatomgceas, adicionamos metassilica to de scidio (Na2 Si 03.9 H20) - TABELA II.

O extrato de solo foi preparado segundo VIEIRA, 1977. O meio Erd-Schreiber e bastante econ6mico sendo, portanto, mais indicado para cultivos em escalas maiores (VIEIRA, 1977). t uti lizado na proporção de 1 ml de ES para cada 1.000 ml de ggua do mar (filtrada e envelhecida).

- Meio S6lido para Algas44SA-(CHU, 1947 - modificado): em 750 ml de água do mar filtrada adicionamos 250 ml de ggua destilada, dissolvendo-se 0,100 g de Na2 Si 03 . 9 H20, 0,020 g de 1<2 HPO4 e 10 g de agar-agar, ApOs a esterilização em autoclave acrescentamos 1 ml dA solu gão de micronuLyientes (GUILLARD & RYTHER, 1962). Antes da solidificação do meio, transferiu-se o mesmo para placas de Petri e tubos de ensaio inclinados, em câmara asseptica.

O meio s6lido para Algas mais indicado na manutenção de estoques de cultura (VIEIRA, 1977), e foi modificado porque na so-lução de micronutrientes, cianocobalamina não constou (TABELA II).

Cada cglula ou cadeia isolada foi inoculada em tubos de ensaio contendo o meio de cultura, os quais foram tampados com tufos de algodão, sendo deixada uma abertura pela ini_Ludugão, neste, de um pequeno tubo de plgstioo.

Para garantir melhores resultados, procuramos inocular mais de uma cglula ou cadeia por tubo, formando baterias de 5 tubos de ensaio. Ao inves de tubos capilares, nos inOculos em meio

(TABELA II), utilizamos conta-gotas, sendo este portanto, procedido por numero de gotas em places de Petri e tubos de ensaio, contendo o referido meio inclinado. No caso do inOculo partir de culturas densas (TABELA III e IV, inOculo de Nitzschia ctoztekium em meio "f" a 21 de maio de 1979) usamos uma pipeta para retirar determinado volume a ser inoculado.

Seguindo-se aos inOculos, procedemos a incubação defini-tiva das espécies isoladas em tubos de ensaio contendo volumes conhe cidos do meio de cultura escolhido, testando o desenvolvimento para a primeira etapa (TABELA III) e segunda etapa (TABELA IV).

Diariamente, todos os tubos de ensaio e amostras incuba das em erlenmeyers de 500 ml-eram agitadas e verificadas as condig5es de luz e temperatura.

Quando, durante as contagens, verificavamos somente cglu las mortas, abandongvamos o cultivo. Em contrapartida, em casodegran de desenvolvimento da cultura, a ponto desta mudar a coloração do meio de cultivo, procedemos in6culos a partir de tais tubos.

Procuramos fazer um controle do niimerc de cglulas inocula das e respectivas contagens a cada 5 - 10 dias, a partir do inOculo. Porém, em virtude tratar-se de uma primeira tentativa de cultivo de nossa parte, com as implicag6es que isto acarreta, existiram irregula ridades nas contagens e conliole em geral, principalmente na fase mi cial do experimento.

8. Quando um baixo niimero de celulas era verificado, procede mos as contagens em quatro lauinas escavadas -de 0,15 ma cada - e fi zemos o e1 _{cub para o numero de celulas por mililitro. Em caso}

con-trgrio, eram realizadas em camara de Neubauer: quando era contado o niimero de celulas, em cada um dos quatro quadrados, situados nos qua drantes em que o reticulo divide, cada um dos quais contendo dezesseis quadrados menores. Tiramos a media do raero de celulas por unidade de volume daqueles (0,064 mm3) e, a partir de regras de tres, calculi vamos o numero de celulas parmililit/o (GUIMARAES, 1977).

Na primeira etapa realizamos contagens para as especies isoladas (TABELA III), mas nos detivemos em Nitzóchia ctoztehium nos meios ES e "f" (TABELAS V e VI) em vista dos resultados.

Na segunda etapa procedemos contagens para todas as espe-cies isoladas nestas condig6es (TABELA VII).

Entre os inaneros inOculos realizados, nos diferentes meios de cultivo, na primeira e segunda etapa deste trabalho, somente os que obtiveram melhores resultados foram considerados e utilizados na elaboração das tabelas e grgficos.

Em todos nossos cultivos, não nos preocupamos em realizar o con ule bacteriolOgico, tendo em vista tratar-se de um estudo pre liminar, realizado em curto espaço de tempo.

Para a obtenção das microfotografias, utilizamos um mi-crosc6pio da American OptirAl Microstar Series 10, equipado com uma camara 1053 B 35 mm, com aumentos da ordem de 500 e SO vezes.

RESULTADOS E DISCUS SÃO

A temperatura da agua nas poças de mare oscilou entre 31,5 a 32°C; a salinidade variou de 38,8 a 39,9%o e o pH permaneceu em torno da neutralidade na faixa de 6,7 a 7,6. 0 alto Indice de sali

nidade explicado pela grande evaporação nestes ambientes, agáb do vento e temperatura da élgua.

Pelo método de isolamento utilizado, foram cultivadas as seguintes especies de microalgas: (TABELA I).

Sketetonema cortatum (Grey.) Cleve (FIGURA 1).

Nitz4chia aosteAium (Ehr) W. Sm. (FIGURA 2e 3).

Navicaa tanceotata K.

Biddapkia aeteuam (Bailey) Van Heurck.

Das especies isoladas obtivemos culturas monoespecificas de N. ao4tvaltm, em condig6es ambientais e conlzuladas de luz e tem peratura, em meio "f" e ES.

Nos cultivos de Naacuta tanceotata surgiram outras espe cies do genero que no foram identificadas, bem como doeneroAraphota, para os quais n;a• referimos os resultados pela ausncia de contagens neste sentido.

S. coztatum apresentou culturas quase monoesperTficas nos,

cam resíduos contaminantes e presença ocasional de Navicu2a sp. nos tubos 7c e 7d, TABELA IV.

Durante todo o experimento S. coztatum apresentou pequena resistência a organismos contaminantes (protozo5rios e bacterias) bem como reduzido tempo de Cultivo. Navizaa sp. e Nituchia cta6tetZum, por sua vez, mostraram-se mais resistentes, sem requerer maiores cui dados com esterilização do material utilizado nos cultivos.

10.

Na fase de cultivo em tubos de ensaio, mesmo oom agitação diria, as cglulas aderiam as paredes do vidro, tornando-se necessa ria uma perfeita homogeneização antes das contagens ou para proceder novos inOculos ou repicagens.

Para melhor compreensão dos resultados, agruparemos nos sos dados de acordo com as etapas do experimento, cujas condig6es de cultivo jg foram referidas anteriormente.

PRIMEIRA ETAPA - (sem controle) as especies cultivadas fo ram as quaLvu jg referidas, para as quais testamos apenas os meios de cultura "f" e ES (TABELA I). Os rendimentos não foram satisfatOriospa ra a maioria das esp-gcies (TABELA III e FIGURAS 7 e 8). Apenas Nitz6chia ceaótelLium apresentou um pequeno desenvolvimento em meio ES, com um breve period° da fase exponencial (32 cel/m1) chegando a zero cel/ml aos 19 dias apOs o inioculo. Em meio "f" N. ceoteltium foi in-vigvel (TABELA VI e FIGURA 8) tendo o numero de caulas, decrescido desde o dia do in6cu1o.

A especie B. atanam apresentou um resultado negativo, porem não podemos considerg-lo relevante pelo fato de termos feito apenas um 1n6cu10 em meio ES.

As culturas de microalgas da primeira etapa apresentaram

alto índice de contaminação, principalmente constituído por bactérias. Acreditamos que esta tenha sido uma das causas de seu baixo rendimen to, uma vez que al4m desses microvegetais disporem de luz difusa, são capazes de resistir a grandes variag6es de temperatura.

De um modo geral, observou-se pouca movimentação nas eau las de Witz6chia aozttAium nos cultivos sem conLiole,

a

proporção que se passavam os dias havendo um crescente aumento de celulas debi litadas enquanto decrescia o numero de celulas vivas.

Em Sketetonema co4tatum,

uma maior incidencia de bacterias foi observada primo cadeias de celulas, as quais possuiam poucas ou nenhuma celula sadia (FIGURA 1).

Na SEGUNDA ETAPA (cam controle) foram cativadas tres esp4

cies: Skeeetonema eastatam, Nituchia

eta6tetium

e Naviewea

tanceotata,

sendo testados os meios de cultura "f", ES, "natural" e NSA (TABELA I).

As

especies que

obtiveram melhores resultados no meio ES,

em ordem decrescente foram

ULtz6ehia

ceaóteAium

e

Skeeetonema eo4tatum.

Contudo, se levarmos em consideração apenas as primeiras contagens, observamos que S. eoztatum superou N. ctoztetium (TABELA IV, tubos 7a,

7c e 7d) com 105, 473 e 1.753

cel/ml

da primeira, contra 13, 83 e 20 c&/ml da segunda especie (TABELA IV, tubos 15a, 15b e 15c). Por ou

Loo lado, se observarmos a FIGURA 4,

verews que, no câmputo

geral, N. ceoztetaum alcançou uma maior biomassa por mililitro (82.031 c1/ml) e que sua fase de crescimento logaritimo foi mais longa,

(ate o 129 dia

de cultivo), em comparação com apenas 5 dias para S. coAstatum e que

nesta, decorridos 35 dias de cultivo a contagem foi nula.

No meio "f", as especies que obtiverem resultados mais sa-tisfatOrios, foram

Nituehia cto6tetium

e

Naviewea

taneeotata. Mésmo

levando-se em consideração a primeira contagem, observamos que N.

ceozte,Aium apresentou un melhor desenvolvimento (TABELA IV, tubo9ccom

242 c61/m1) do que Nawizwea Zaneeotata (TABELA IV, tubo 16a com140c.41/

m1).

Verificamos que todas as

contagens

de N. ctoztvaum, subse quentes ao inciculo, superaram as de S. cota-tun e Navicuta tanceatata, chegando a 4.718.750 cl/ml, 34 dias apOs

o in5culo

(FIGURA 6, TABELA

VII).

A segunda melhor performance foi para Naviewea taneeatata, Chegando a 39.062 cl/m1, 19 dias decorridos do 1n6cu10 (FIGURA 6 e TA BELA VII). A partir dal as contagens foram abandonadas em virtude dos meihores resultados de N. ct04tv4ium.

12.

SizaetoKema

cutatum

em meio "f", apesar de ter apresenta do algum desenvolvimento, teve um período muito curto de cultivo: em 10 dias a contagem dhegou a zero (FIGURA 6, TABELA VII).

Quanto ao meio "natural", que foi testado apenas para Sketetonema c04tatum, não se mostrou vigvel (TABELA VII e FIGURA 5) com

mgximo de 3 c&/ml.

0 meio s61ido para algas-MSA-mostrou-se satisfatOrio pa ra manutenção de estoque de culturas de

Nitz6chia ce04teAium

cam

os se

guintes resultados: na primeira verificação apOs o inOculo (TABELA IV, 13b placa de Petri-observou-se celulas de N. ctioztestium em bom esta do fisiolOgico, inclusive movimentando-se 4 dias apOs o inOculo. Decor ridos 35 dias do inOculo em M.S.A. ainda foram verificadas cglulas sa-dias porem com pouca movimentação e um certo raper° de celulas mortas; contaminagão das placas por fungos e bactgrias e aparentemente ausente nos tubos.

De todas as especies testadas para os diferentes meios de cultura, Nitz6chia ctoisteAium foi a espgcie que apresentou resultados

mais satisfatOrios, especialmente para o meio "f". Se fizermos uma ang use comparativa do cultivo de H. ctoztvtium em meio ES, com e sem con Lcole (EIGURA 7, TABELA V) atraves do grgfico vemos o acrescimo no de-senvolvimento do cultivo, se este 6' realizado com o controle de luz e temperatura. Neste caso, a fase logarítimica de crescimento chega at o 129 dia de cultivo enquanto o cultivo sem conLpole tem a referida fa se reduzida at o 69 dia apOs o inOcuio. Acrescente-se a isso, o maior Iiimero de cgl/m1 alcançado para o cultivo com controle- 82.031 cgl/m1 contra 32 eel/mi.-al-6n deste alcançar uma certa estabilidade aos 22 dias de cultivo e o outro chegar a zero cl/m1 no 199 apOs o 1n6cu10.

Procedendo a mesma analise para a mesma espécie em meio com e sem cont.role (FIGURA 8, TABELA VI) temos que: a partir do segundo dia do inOculo (1.674.395 cl/m1) começou a fase logaritimica de cresci mento, estabilizando no quarto dia. Iniciou-se uma fase estacioneria de 3 dias e logo ap6s alcançou sua densidade mexima (9.054.687 cel/mi) ao nono dia alp& o inOculo. Desse ponto em diante a cultura tendeu

a

esta-bilidade com pequena flutuageo.

Todas células de 1, caztenium da cultura controlada em meio "f", apresentaram maior movimentageo quando comparadas e mesma cul tura sem conLyule. No primeiro caso a cultura apresentou celulas disper sas isoladamente com amontoados esparsos, talvez pela agitação deficien te atribuída es mesmas (FIGURA 3).

A partir do nono dia desse cultivo, iniciou-se o aparecimen to crescente de celulas em estado fisiolOgico deficiente (poucamovimen tageo, colorag5o clara e presença de celulas transparentes). 0 aumento do numero de celulas proporcional '5_ quantidade de nutrientes presen tee nos meios de cultivo. Os novos individuos cue surgem na cultura, com petem cada vez mais por uma quantidade minima de nutrientes para garan tir-lhes a vida e desenvolvimento. 0 resultado, o surgimento de cultu ras invieveis e reinoculag6es, visto o estado fisiolOgico deficiente das celulas. Uma vez suplementada com novas porç5es do meio a cultura neo apresenta esses problemas.

Mesmo durante a segunda etapa, constatamos contaminageo bac teriana nas cultures, embora em baixos indices. Este fato foi mais evi-dente em culturas de Sketetonema cozta,tum, estando as celulasdealgunas

14. Analisando somente a especie S. co4tatum, submetida aos meios "f", "natural" e ES (TABELA VII) constatamos ser o meio ES o que prowrcionou meihores resultados, seguindo-se do meio "f" e o meiolatu rala mos LLuu-se invigvel (FIGURA 5) .

Al gumas culturas em tubos de ensaio denunciaram um maior crescimento das microalgas pela turbidez, durante a segunda etapa do ex perimento, como foi verificado no tubo 7d (TABELA IV) -turvo 5 dias as o 1n6cu1o: 1.753 cgl/ml.

Observemos que, se o cultivo g iniciado de um inOculo, em que as celulas isoladas ainda no sofreram condig6es de luz e temperatu ra conLvuladas, ha' um acré:scimo de populaga:o (ainda que pequeno), Entre tanto, se partimos de uma repicagem, am que o inOculo, oriundo da con centragk de células de um cultivo sob o canLvole de luz e temperatura, hg um decrgscimo nesta populagao, no se verificando nenhum desenvolvi-mento.

CONCLUSOES:

'De acordo com os resultados obtidos, concluimos que:

1. Das especies testadas, as que se apresentaram mais vig veis para cultivos em laboratOrio, foram latz6chia

cto4teAium,

(Ehr.) W. Sm., Skaetonema co4tatwn(Grev.) Cleve e Havimea tanceotata K.

2. A

especie ULtuchia caztettium

foi a que obteve o me- Thor desenvolvimento em condig6es de laborat6rio,

a

uma temperatura de 24°C e i1uminag5o continua de 2.700 lux. Esta espécie, foi taMbem a que demons L.wu maior resitEncia

a

contaminag'5o.

3. 0 cultivo de Sketetollema

coistatum,

requer maiores cui dados no que diz respeito

a

esterilizaggo da vidraria a ser utilizada, isto porque esta especie delioreIlou grande sensibilidade -a contaminação por parte de bact6 rias

4. PLespécie Navictlea tanceatata, em condig6es controla-das de luz (2.700 lux) e temperatura (24°C), em meio "f", apresentou resultados satisfatOrios.

5. Os meios de cultivo testados foram, "natural" (ggua do mar envelhecida e filtrada), Erd- Schreiber (Gross) meio "f" (Guillard & Ryther, 1962) e NSA (Chu, 1947). 6. 0 meio "natural" no apresentou resultados

satisfat6-rios.

7. Os meios de Erd- Schreiber e "f", deram excelentes re sultados para Nitnehia

ceoztelaum.

16. 08. Para Sketetoxema mstatum o melhor meio de cultura tes

tado foi o de Erd -Schreiber.

9. 0 M.S.A. (meio sOlido para algas), foi utilizado somen te para manter os cultivos em estoque, mantendo celulas vivas por mais de 35 dias (51tima observação).

10. Para obter-se uma cultura sempre com celulas em bom es tado fisiol6gico, deve-se suplementa-la com o meio de

ontivo

em questão, fazendo frequentes diluig6es.

11. Cultivos iniciados cam celulas que não tenhoda sido sub metidos

a

contzole de luz e temperatura, conseguem de-senvolver-se em condig6es ambientais. Entretanto as que são obtidas de inOculos, provenientes de cultures sob condig6es controladas, de luz e temperatura, não prospe ram e morrem.

SUMARIO

Neste trabalho, apresentamos os resultados preliminares so-bre testes de cultivo de microalgas planctOnicas, em condig6es de lato ratOrio.

Foran isoladas as espécies Sketetonema costa-tam (Grey.) Cleve, ULtz6chia

cto4tettium (Ehr.) W. Sm.,

New-Lulea tanceotata K. e

Biddaphia

a-etc./ma/A (Bailey) Van Beurck, coletadas em poças de mare': na praia do Meireles (Cearé-Brasil), Bestas, a que apresentou melhores re-sultados foi Uauchia ceo4teitium, atingindo 9.054.687 c&/ml, em9 dias

a

partir da repicagem (1.674.395 cl/ml) em meio "f".

Os meios de cultura utilizados foram : meio "natural" (ggua do mar envelhecida e filtrada), meio de Erd- Schreiber (Gross, 1937), meio "f" (Guillard & Ryther, 1962) e meio said° para algas (M.S.A. - Chu, 1947), os dois ltis ccuLmodificag6es. 0 meio que apresentou re sultados mais satisfatOrios foi o

De acordo com as condig6es de temperatura e luminosidade, dividimos nosso experimento em duas etapas: a primeira etapa constou de cultivos em temperatura ambiente e luz solar difusa; a segunda etapa, cam os cultivos submetidos a uma temperatura de 24°C e uma luminosidade constante de 20700 lux. Esta ultima foi a que ofereceu melhores condi gOes de desenvolvimento dos cultivos, apresentando os mais altos indi

,

18. BIBLIOGRAFIA:

ANÔNIMO - 1975 - Algal Culture; development of a Working system. Fish Farming International, 2 (4) 28-31, 5 figs.

BATES, S. S. & J. S. CRAIZIE - 1978 - Chloroplast pigments of a green phytoplankter from the Hudson Estuary, U.S.A. Phycologia, Halifax, 17 (1) : 79-84, 3 figs.

CASTELLVI, J. - 1971 - ContribuciOn a la biologia de Sketetonema &W.:a turn (Grey.) Cleve. Inv. Pesq., Barcelona, 35 (2) 365-520, 1 fig. FOGG, G. E. - 1963 - Algas Cultures and Phytoplankton Ecology. The The University of Wisconsin Press, 126 pp., 31 figs., 3 pls., Lon-dres.

GUIMARAES, J. I. - 1977 - Cultivos de larvas de Penaeus aztecus Ives , e algas microscOpicas. Sociedade Civil de Desenvolvimento e Pesqui sas Projeto Camaro, 131 pp., 2 figs. Natal.

MIN, J. M. & G. E. FOGG - 1960 - Studies on the growth of marine phytoplankton. J. mar. biol. Ass. U. K., Grã-Bretanha, 39 : 33-50, 7 figs.

LATEUR, L. - 1963 - Une technique de culture pour l'Acetabularia medi-terranea. Revue Algologique, Paris, Nlle, Ser. 7 (1) :26-37, 3 figs. PANT, A. & G. E. FOGG -1976 - Uptake of glycollate by Sketetonema c04

tatum (Grey.) Cleve in bacterized culture. J. exp. mar. Biol. Ecol.,

Anglesey, 22 : 227-234, 3 figs.

PRINGSHEIM, E. C. - 1964 - Pure Cultures of Algae. Hafner Publishing Campany, 119 pp., 8 figs., Londres.

SWINGLE, H. S. -

1969 -

Methods

of

analysis

for

Waters, organic matter and pond botton soils used in Fisheries Research. Auburn Universi ty (ed), 106 pp., Auburn.

UMEBAYASHI, O. - 1972 - Preservation of some Cultured Diatorms. Bull. Tbkai Reg. Fish. Res, Lab., Tokyo,

69 : 55-61, 4 figs.

VIEIRA, A. A. H. - 1977 - Maodos de cultura de algas do plancton marl nho: estudos realizados nas regiaes de Cananaa e de Ubatuba, S. P. Bolm. Inst. oceanogr., Sao Paulo, 26 : 303-338, 2

figs.

YONESHIGUE BRAGA, Y. - 1971 - Estudo experimental de cultura em labo ratOrio de Chtamydomonaz sp. Inst. Pesq. da Marinha, Rio de Janeiro,

56 : 1-9, 3 figs.

ZOBETL, C. E. & J. H. LONG -1938 - Studies on the isolation of bacte ria - free cultures of marine phytoplankton. Journ. Mar. Res., Cali fornia, 1 (4) : 328-334.

sem con- trole com con - trole sem con- trole MEIOS DE CULTIVO ESPfCIES CULTIVADAS

Sizaetonema

C04 taturn

flitzis

&La

c.e.Dzte/ticon

Navicwea tanceoZata

Eiddaphia

atteitnanz

"NATURAL" (1)

com t sem com sem con- con- con- con- LioleILLole Lvole Llole

ERD-SCELREIBER M.S .A. com con- LL X X TABELA I

Meios de cultura e condig5es de cultivo empregados, nas diferentes es •

pecies Isoladas.

Meios de Cultivo (1) Componentes

modif. (2) I Erd- Schreiber

IM.S.A.

modif. (2) composigEo e concentraçOes dos diferentes meios de cultivo utilizados,

segundo a bibliografia NaNO 3 150 mg 100 mg 100 mg NaH 2 PO Ji4 2 0 10 mg 20 mg - Na 2SiO3.9H20 30 mg 30 mg (3) 30 mg K₂HPO₄ - - 20 mg ZnSO₄.7H 20 0,044 mg 0,044 mg MnC12.4H20 09360 mg - 0,360 mg CoC1₂.6H₂0 0,020 mg - 0,020 mg CuSO₄.5H₂0 0,0196mg ... 0,0196 mg Na₂ MOO. .2H 2 0 0,0126mg 0,0126 mg 4 Tiamina 0,200 mg - 0,200 mg Biotina 1,0 pg 1,0 pg Extrato de solo - 50 ml - II_:20 domar 1.000 ml 1.000 ml 750 n1 H_{20 bi-destilada} - - 250 ml Agar _ - 10 _g

(1) alem dos referidos, foi empLgado o meio natural (ggua do mar enve lhecida).

(2) modificado por Klein & Pereira da Costa (MS). (3) no consta na f6rmula original.

MEIO ESPtCIE DE CULTIVADA CUL- TIVO INOCULAÇÃO 1. CONTAGEM DATA rE COLETA De Tubos Inocu

lados

De Ordem De Cglu- las Vol. do Meio emml NOMERO Data 1979 1979 Cl/m1 Data N9 de TABELA III

Dados referentes

a

1, etapa dos cultivos de microalgas em condigaes am-bientais de temperatura e luz solar difusa.

PRIMEIRA ETAPA

13.03.79 Sketetonema sem sem sem

co4trbtum ES 13.03 1 1 cont. 3,5 cont. cont.

20.03 6 2 a 9 10 30.03 0 2b 8 10 30.03 0 2c 17 10 30.03 0 2d 12 5 30.03 0 2e 10 5 30.03 0 2f 6 5 30.03 0 26.03.79 26.03 1 3 226 10 06.04 0 14.03.79

Biddaphia

ate/mom

ES 21.03 1 4 1 10 30.03 0 23.03.79 Witz6ehia ce04.tehium ES 26.03 if 5 a 5 10 05.04 0 5b 5 10 05.04 0 Sc 5 10 05.04 0 5 d 5 10 05.04 0 05.04.79 "f" 21.05 1 6 2,761) 5 22.05105Q781 ES 24.05 2 7 a 40 10 30.05 32 7b 30 10 30.05 2 (1) volume em mi equivalente a aproximadamente 12.976.562 cglulas.

Dedos referentes

a

2? etapa, dos cultivos de nicrcalgas em condigaes con-troladas de luz e temperatura.

SEGUNDA ETAPA DkTA DE COLETA MEIO LE CUL- TIVO INOCULAÇÃO 1. CONTAGEM Data 1979 AMERO Vol. do Melo em mil Data 1979 C61/m1 N9 de ESPECiE CULTIVADA Pe Tubos Inocu lado

s

Ordem De C61u- las 05.04.79 Sketetonemcv Ca&WIAM "f" 06.04 11 6 a 17 10 16.04 0 Sb 8 10 16.04 0 6c 16 10 16.04 3 6 d 11 10 16.04 0 6e 16 10 16.04 0 6 f 14 10 16.04 0 6g 19 10 16.04 0 6h 15 10 16.04 0 6± 11 10 16.04 0 6j 22 10 16.04 0 6k 43 10 16.04 0 ES 11.04 4 7 a 11 10 24.04 105 7b 19 10 24.04 0 7 c 15 10 24.04 473 7 d 90 10 16.04 1.753 NATU RAC 17.04 5 8 a 39 10 23.04 0 Sb 26 10 23.04 0 8 c 44 10 23.04 0 8d 25 10 23.04 3 Be 29 10 23.04 0

TABELA IV (Continuagao) SEGUNDA ETAPA Mitz6 chia cto4 teititen "f" 17.04 5 9 a 3 10 23.04 52 9b 3 10 23.04 67 9 c 3 10 23.04 242 9d 3 10 23.04 42 9e 3 10 23.04 32 24.04 1 10 100 10 30.04 122 25.04 5 11 a 5 10 30.04 35 11 b 40 10 30.04 5 11 c 30 10 30.04 3 11 d 20 10 30.04 57 11 e 11 10 30.04 8 05.04.79 Nituchia ctastmium ES 04.05 5 12 a 20 10 09.05 0 12 b 15 10 09.05 0 12 c 23 10 09.05 0 12 d 20 10 09.05 0 12 e 15 10 09.05 FBA

14.05

/ 13 a 0,03

0)

30 18.05 s/ contr. 13 b 0,142) 30 18.05 s/ contr. 13 c 0,012)„1 10 18.05 s/ contr. 13 d 0,012)o 10 18.05 s/ contr. 13 e 0,042) 10 18.05 s/ contr. 13 f 0,012)o 10 18.05 s/ contr. 12) 13 g 0,0d 10 18.05 s/ contr.

(Continuação) SEGUNDA ETAPA DATA DE COLETA ESPrCIE CULTIVADA MEIO DE CUL

-

TIVO INOCULAÇÃO CONTAGEM Data 1979 NUMERO Vol. do emml Data 1979 N9 de Cl/m1 De Tubos Inocu lado

s

De Orden De C61u- las (S) "f" 21.05 1 14 a 2,75 5 22.05 1.750.000 ES 24.05 3 15 a 40 10 30.05 13 15 b 40 10 30.05 83 15 c 40 10 30.05 20 Navicuta tanceotata "f" 27.04 5 16 a 4 10 02.05 40 16 b 4 10 02.05 8 16 c 4 10 02.05 10 16d 4 10 02.05 3 16 e 4 10 02.05 7

(1) in6culo em 5 tubos e 2 placas de Petri (13 a e 13 b),

(2) volume em ml, sem conLrole do niimero de c4lu1as - teste de manuteng"ab de estoques de cultura.

CONDIÇÕES DE CULTIVO COM CONTROLE SEM CONTROLE TABELA V

Dados referentes ao desenvolvimento do cultivo de Wtz-schia ctozteitium em meio ES, com oonLrule de luz e temperatura e em condig6ps aMbien-

tais, por contagem de niimero de cglulas/ml.

InOculo flta _{24.05.79 24.05.79} M.-hero de cglu ias/mi 4 4 1. _Contagem Data 30.05.79 30.05.79 Nero de cglu ias /mi — 83 32

2?" Contagem Data _{Numero de cglu} 05.06.79 05.06.79

ias/mi 82.031 3

,a _{d. Contagem} Data 12.06.79 12.06.79

Namero de celu

las/ml 62.500 0 (zero)

4'?," Contagem _{Namero de cglu} Data 13.06.79 13.06.79

ias /mi — 27.344 0 (zero)

5?" Contagem Data

15.06.79 15.06.79 Namero de cglu

Dados referentes ao desenvolvimento do cultivo de Nitzschia ctozteitium

em meio ”4.11 a. 9 com conaule de luz e temperatura e em condigOes tais, por contagem do nikero de caulas/ml.

antien

OONDIQOES DE CULTIVO COM CONTROLE I SEM CONTEOLE

In6culo Data 21.05.79 21.05.79 Numero de cdlu ?as/El — 1.674.395 1.674.395 a 1. Contagem Data 22.05.79 22.05.79 NUmero de cdlu las/m1 1.750.000 1.050.781 2T Contagem Data 23.05.79 23.05.79 Miner° de cdlu _{2.101.562 1_046.875}

3T Contagem Data _{Nero de cdlu} 24.05.79 24.05.79 ias /mi 3.960.937 714.844 4T Contagem Data 25.05.79 25.05.79 NUmero de cdlu las/u1 6.566.406 328.125 5T- Contagem Data 28.05.79 28.05.79 NUmero de cdlu las/ml 6.812.500 164.062 a 6. Contagem Data 29.05.79 29.05.79 Miner° de cdlu las /m1 — 7.632.812 164.062 7T: Contagem Data 30.05.79 30.05.79 NUmero de cdlu las/mi 9.054.687 144.531 8T Contagem Data 31.05.79 31.05.79 Numero de cell las/ml 8.164.062 152.344

CONDIOES DE CULTIVO COM CONTROLE SEM CONTROLE

TABELA VI

(Continuação)

9?: Contagem

Data

_{NImero de cglu} 01.06.79 01.06.79

las/ml 7.667.969 42.969 10,' Contagem

Data

05.06.79 05.06.79 NIMero de cglu 1as/a -- 8.660.156 46.875 11?" Contagem

Data

06.06.79 06.06.79 NtImero de cglu las/ml 8.492.187 50.781 a 12. Contagem

Data

07.06.79 07.06.79 Nilmero de cglu las/m1 8.238.281 15.625

Desenvolvimento em niimero de cg1ulas por mililitro, do cultivo de algas planct6nicas, sob contlnua iluminagao de 2.700 lux

a

24°C de temperatura. ESPtCIES CULTIVADAS MEIOS DE CUL TIV-0

INOCULO l'?- CONTAGEM 2" CONTAGEM 3?- CONTAGEM 4 CONTAGEM 5. CONTAGEM Data

1979 N9 de Cel. 1979 Data N9 de Cal, por mi 1979 Data N9deCgl. por ml Data

1979 N9deCgl. por ml Data

1979 N9deCgl. por ml 1979 Data N9 de por ml

ca.

Sketetonema co6tatum "f" 06.04 22 11.04 48 16.04 0 (zero) - ES 11.04 90 16.04 1.753 24.04 17 16.05 0 (zero) NATU-RAL 17.04 25 23.04 3 IWO Nitz6chia cto/stmium "f" 17.04 3 23.04 67 21.05 4.718.750 24.04 100 30.04 122 16.05 1.414.062 25.04 40 30.04 5 16.05 1.554.687 21.05 2,722.05 1.750.000 23.05 2.101.562 24.05 3.960.937 25.05 6.566.406 28.05 6.812.500 ES 24.05 40 30.05 83 05.06 82.031 12.06 62.500 13.06 27.344 15.06 27.344 Navicaa

lanceoata "f" 27.04 4 02.05 10 16.05 39.062 - moo mow

FIGURA 1 - Aspecto de uma colOnia de Se-toma. coztatum (Greve) Cleve - aumento de 500 vezes.

FIGURA 2 - tatu chia ctatsteAium (Ehr.) W. Sm em meio "f" - aumento de 500 vezes.

LEGENDA Nilzschia closeriura

e

skelekonema cosia 82030 - 62600- 27350-27340- 1760- 20- 10 - 5 10

NÚMERO DE DIAS DECORRIDOS

35

20

DO I 1\16CULO

MTRA 4 - Desenvolvimento dal3 espci Sketetonema cootatum e Nita6chia

O MEIO ES °MELD "f ONIEIO NATURAL

1)

P ) la 15 35 DECORRIDOS DO LNI5CULO 5 NÚMERO DE DIAS

FIGORPs. Desenvolvimento da espE-;cie Sketetoneina doStatum, em condi_ . gEies de luz e temperatura controladas, em diferentes mai.67,3

MMNOWMMWeilWINeevtl,m,vmmwmm 4.

o

_

5 10 20 35

NUMERO DE DIAS DECORRIDOS DO INOCULO

_ LEGENDA 0_1\171-Cz—s—c-hia„ ,losLeriurn SkeleWnerna cosakum 0 Navicula lanceola6a, 5x10 AtX 4 x10 40000 - U1 30 000 — tx.

FIGURA 6 - D2senvo1vimento cta esp5cies Nitzóchia cta6tVaum, SIzetetorwma

,costatwn e Navicuta tmIcentata, em meio "f" com condig6es de

$2040 ent > 82030 • 62900- tr) 27350- j 27340- -i Lti 90- C.) 80 - Li o 40- o 30- 20-- 2 10-- LEGENDA COM CONTROLE .---A-SEM CONTROLE 5 10 Vi 20

NUMERO DE DIAS DECORRIDOS DO INOCULO

FLORA 7 Desenvolvimento da esp6cie Nitzschia cfcmtetalm, em meio ES em condi7 Oes controladas de luze temperatura e em Oondig6es ambientais.

•

LEGENDA

COM CONTROLE -SEM CONTROLE

FITT4', RA 8 - D--senvolvin-pnto ,da esTDe-rie NitZ6C1141.a clest tiurn em meio "f" win condic.aes controladas de luz e temoeratura e em condli.c-C,NeE ambientais.