Macro e micropatógenos em mexilhões Perna perna (Linnaeus, 1758) e implicações na mitilicultura catarinense

Texto

(1)Ana Lúcia Carneiro Schaefer. Macro e micropatógenos em mexilhões Perna perna (Linnaeus, 1758) e implicações na mitilicultura catarinense. Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de mestre em Aquicultura.. Orientadora: Dra. Aimê Rachel Magenta Magalhães Co-orientadora: Dra. Simone Sühnel. Florianópolis 2015.

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(5) Dedico este trabalho ao meu companheiro de todos e tantos momentos Antônio Carlos Garcia Sayão..

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(7) AGRADECIM ENTOS Em primeiro lugar agradeço à minha amada mãe, Regina Amélia Greenhalgh Carneiro Schaefer, que tanto me incentivou, vibrou e se emocionou com minhas lutas e conquistas e, que tanto sentiu a minha ausência enquanto trilhei os caminhos desta realização. Agradeço ao meu pai, João Luiz Schaefer que, a sua maneira, muito incentivou a acreditar nas minhas lutas. Agradeço infinitamente ao Sayão, meu Guru, Cúmplice, Amor e Companheiro de todas as horas, que me guiou na realização deste Doutorado. Às minhas irmãs Isabel Cristina e Regina Célia, ao meu irmão Luiz Gustavo, à minha sobrinha Ana Carolina, seu marido Ênio e à pequena Malu que já estava programada em seus corações, por suas contribuições para esta conquista. À Marina, Tim e Cauê que se fizeram presentes em tantos momentos desta caminhada. À Professora, amiga e Orientadora, Draª Aimê Rachel Magenta Magalhães, por ter me confiado tamanha responsabilidade, mas que com suas palavras amorosas e certeiras, lapidaram meus conhecimentos e me conduziram a esta realização. À minha amiga e Co-orientadora, Drª Simone Sühnel, por ter participado dos momentos de angústias e dúvidas, mas principalmente, dos momentos das boas, divertidas e instrutivas conversas. Aos Profs Dr. João Bosco Rozas Rodrigues e Ernesto Tremel que muito me incentivaram para o início desta caminhada. À minha amiga Maya Ribeiro Baggio que com seu carinho e boa energia, sempre se fez presente na caminhada. Aos amigos José Geraldino Valgas (Keka), Anita e Juliano por suas presenças carinhosas. Aos amigos do LAMEX, Sthefanie, Maria, Celene, Thais, Vitor, Marcelo, Rafinha, André (Zé), Ana Carolina, Gabriel, Robert, Rafael (Budha) e a todos que ajudaram na construção desta Tese. Aos amigos do AQUOS, Prof. Dr. Maurício Laterça, Lucas (pelos momentos ao DIC), Patrícia Garcia (pelo empréstimo de equipamentos, bibliografias e por compartilhar conhecimentos), Gabriela Jerônimo, Sheila, Maitê e a todos que contribuíram para esta realização. Aos amigos do LABCAI, Profª Drª Risoleta, Prof. Dr. Afonso, Jacó e a todos que contribuíram para esta pesquisa. Aos amigos do LMM, Prof. Dr. Jaime Fernandes Ferreira, Prof. Dr. Claudio Manoel Rodrigues de Melo, Prof. Dr. Gilberto José Pereira.

(8) Onofre de Andrade, Prof. Dr. Marcos Caivano Pedroso de Albuquerque, Carlos Henqique, Claudio, Francisco (Chico), Itamar, Jaqueline, Marisa, Luiz Ricardo (Rico) e a todos que contribuíram com esta conquista. Aos amigos do LCME, Profª Drª Zenilda Bouzon, Renata, Eliana e a todos que contribuíram com estes resultados. À Profª Drª Florência Cremonte e sua Equipe, com as quais aprendi muito durante o Doutorado Sanduíche no CENPAT, Puerto Madryn, Argentina. Ao Prof. Dr. Francisco Brusa e sua Equipe, pela oportunidade única de trabalhar no Museo de La Plata e pelos ensinamentos sobre Turbelários, durante o período que passei em La Plata, Argentina. A Profª Drª Andrea Santarosa Freire e sua equipe pelo material bibliográfico que auxiliaram na classificação dos Copépodes. A Profª Drª Cristina de Oliveira Dias pelas importantes orientações sobre os Monstrilloida. Ao Prof. Dr. Claudio, do LMM pelo apoio e discussões sobre as análises estatísticas. A Profª Drª Guisla Boehs pelos conhecimentos e bibliografias sobre patologias de moluscos bivalves. Aos amigos da EPAGRI, Fabiano Müller, André Luís Tortato Novaes, Robson Ventura, Alex Alves dos Santos, Everton Della Giustina, Vicente e “Zero”, pelo todo apoio durante as coletas. Ao Prof. Dr. Gilberto Caetano Manzoni, da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), pelo seu apoio durante as coletas na Penha/SC. Ao Prof. Dr. José Guilherme Bersano Filho (Duda), da Universidade Federal do Paraná, Centro de Estudos do Mar (UFPR/CEM), pelos ensinamentos e bibliografias sobre os copépodes. Aos proprietários dos cultivos onde foram realizadas as coletas dos mexilhões, Felipe Maeda (Palhoça), Ozair Olavo Porto (Governador Celso Ramos), Djalma Gentil Serpa (Penha) e UFSC (Florianópolis). A todos os Professores do curso de Pós-Graduação em Aquicultura pelo conhecimento compartilhado. A Serena Sühnel Lagreze e ao Prof. Dr. Francisco José Lagreze Squella (Pancho) por terem me ajudado nas traduções e pelos momentos de tranquilidade e aprendizado em seu lar. Aos colegas de disciplinas que tanto enriqueceram os conteúdos estudados. Ao Departamento de Aquicultura, principalmente ao Carlito que tanto me auxiliou em todas as etapas desta caminhada. A CAPES pelo apoio financeiro para o Doutorado Sanduíche..

(9) O mestre na arte da vida faz pouca distinção entre seu trabalho e seu lazer, entre sua mente e seu corpo, entre sua educação e sua recreação, entre seu amor e sua religião. Ele simplesmente persegue sua visão de excelência em tudo que faz, deixando para os outros a decisão de saber se está trabalhando ou se divertindo. Ele acha que está sempre fazendo as duas coisas simultaneamente. Pensamento zen-budista.

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(11) RESUM O O incremento da mitilicultura catarinense gerou a necessidade da identificação dos patógenos que acometem o cultivo de Perna perna nos municípios de Palhoça, Florianópolis, Governador Celso Ramos e Penha. Durante o período de julho de 2010 a junho de 2011 foram coletados 720 animais em cada local de cultivo, totalizando 2.880 mexilhões. Do total coletado, a metade (1.440) foi observada ao estereomicroscópio onde foram realizadas as coletas do turbelário Urastoma cyprinae e dos copépodes Pseudomyicola spinosus e Monstrilla sp., que após serem tratados através dos protocolos de Microscopia Eletrônica de Varredura e clarificação com PolyvinilLactophenol foram medidos e fotografados ao microscópio de contraste diferencial de fase (DIC) e tratados para histologia de cortes seriados, que auxiliaram nas identificações das espécies e gênero. Os outros mexilhões (1.440) tiveram seus tecidos processados conforme os protocolos de Histologia Clássica e da OIE: Monocamadas de hemócitos, Imprint e Cultivo em Meio de Tioglicolato de Ray. Através das análises dos cortes histológicos foi identificada a presença dos protozoários Ancistrocoma sp. e Nematopsis sp. e dos metazoários Tylocephalum sp., Urastoma cyprinae, Pseudomyicola spinosus, Monstrilla sp. e Bucephalus margaritae, já através dos protocolos da OIE, foi verificado que as doenças de notificação obrigatória não estão presentes nos cultivos de mexilhão de Santa Catarina. Dos patógenos registrados por esta pesquisa, o Cestoda Tylocephalum sp. é responsável pela ocorrência de infiltração hemocitária e o Trematoda Bucephalus margaritae, pelo alto índice de mexilhões de sexo indeterminado e castração parasitária. Palavras chave: 1.Aquicultura; 2. moluscos bivalves; 3.mitilicultura; 4. Perna perna; 5. Patógenos..

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(13) AB STRACT The increment of mytiliculture in the municipalities of Santa Catarina, Palhoça, Florianópolis, Governador Celso Ramos e Penha, generated the demand for pathogens identification in Perna perna. During the period July 2010 to June 2011 were collected 720 animals in each studied local, totaling 2,880 mussels. From the total collected, half (1,440) was observed under a microscope stereoscope, where was collected the tuberllary Urastoma cyprinae and the copepods Pseudomyicola spinosus and Monstrilla sp.. After sampling, the parasites were analyzed by scanning electron microscopy differential contrast microscope (DIC), and processed for histological serial sections for species identification. Other mussels (1,440) had their tissues processed according to classical histology protocols and OIE: Monolayers of hemocytes, Imprint and Cultivation Ray's Fluid Thioglycollate Medium. Through the analysis of histological sections showed the presence of protozoa Ancistrocoma sp. and Nematopsis sp. and metazoan Tylocephalum sp., Urastoma cyprinae, Pseudomyicola spinosus, Monstrilla sp. and Bucephalus margaritae, already through the OIE protocols, it was found that the notifiable diseases are not present in mussel cultivated in the studied location of Santa Catarina. Pathogens recorded by this survey, the Cestoda Tylocephalum sp. is responsible for the occurrence of hemocyte infiltration and the Trematoda Bucephalus margaritae, the high rate of indeterminate sex and parasitic castration mussels. Keywords: 1.Aquaculture; 2. bivalve mollusc; 3.mytiliculture; 4. Perna perna; 5. pathogens..

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(15) LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO II Figura 1. (A) Locais de coleta de Perna perna no estado de Santa Catarina, sul do Brasil e (B) esquema de um cultivo de mexilhões indicando a disposição das cordas (quadrados pretos) de onde foram coletados os animais. ............................................................................. 39 Figura 2. Temperatura (ºC) e salinidade (‰) nos locais de coleta, durante o período da pesquisa. .............................................................. 43 Figura 3. Sexo dos mexilhões (%), por local de coleta, analisados através do estereomicroscópio............................................................... 44 Figura 4. Sexo dos mexilhões (%), por local de coleta, analisados através da histologia. ............................................................................. 44 Figura 5 a 10. Cortes histológicos (coloração HHE) de Perna perna coletados em Santa Catarina, Brasil. Fig. 5, esporos da Gregarina Nematopsis sp. nas brânquias; Fig. 6, larva em encapsulamento do Cestoda Tylocephalum sp. no tecido conjuntivo da glândula digestiva; Fig. 7, Trematoda Digenea, Bucephalus margaritae no tecido gonádico (ES – esporocisto e CE – cercaria); Fig. 8, Turbelário Urastoma sp. nas brânquias; Fig. 9, náuplio do Copepoda Pseudomyicola sp. no trato digestório e Fig. 10, copepodito do Copepoda Monstrilla sp. no tecido conjuntivo da borda do manto. Barras: 10µm (Figs. 7, 8 e 10) e 40µm (Figs. 5, 6 e 9). ........................ 50 Figura 11 a 13. Parasitas observados e coletados com o auxílio do estereomicroscópio nos mexilhões Perna perna em Santa Catarina, Brasil. Fig. 11, o Turbelário Urastoma sp. nas brânquias dos mexilhões; Fig. 12, fase adulta (fêmea) do Copepoda Pseudomyicola sp. na cavidade do manto (SO – sacos ovígeros); e Fig. 13, fase de copepodito do Copepoda Monstrilla sp. no tecido conjuntivo da borda do manto. Barras: 40µm. ...................................... 51 CAPÍTULO III Figura 1 a 7. Espécimens de Pseudomyicola spinosus, coletada em mexilhões Perna perna cultivados em Santa Catarina, Brasil, utilizando técnica Polyvinil-Lactofenol e fotografia ao microscópio de contraste diferencial de fase. Fig 1. Vista dorsal de fêmea de copépode (seta: sacos ovígeros) (Barra: 200 µm). Fig 2. Detalhe da antena 1 (setas indicando os 5 segmentos) (Barra: 32 µm). Fig 3. Detalhe da antena 2 (setas indicando os 3 segmentos) (Barra: 32.

(16) µm). Fig 4. Detalhe do rostro (Barra: 20µm). Fig 5. Detalhe da região oral (Barra: 20 µm). Fig 6. Detalhe do urossoma (seta) (Barra: 130 µm). Fig 7. Detalhe dos ramos caudais e segmento anal (Barra: 32 µm)....................................................................................... 67 Figura 8. Representação esquemática de fêmea de Pseudomyicola spinosus, em vista ventral, com detalhes das antenas 1 e 2 e dos apêndices 1, 2, 3, 4 e 5 e do ramo caudal que são estruturas que caracterizam esta espécie de copépode ..................................................68 Figura 9. Fêmea de Pseudomyicola spinosus sem sacos ovígeros coletados em mexilhões Perna perna cultivados em Santa Catarina, Brasil. Técnica Microscopia Eletrônica de Varredura. Vista ventral com setas indicando as principais estruturas ..........................................69 Figura 10 a 13. Náuplios de Pseudomyicola spinosus registrados através das análises das lâminas histológicas nos mexilhões Perna perna cultivados em Santa Catarina, Brasil. Fig 10. Náuplio no lúmem do estômago (comprimento = 94,40 µm). Fig 11. Náuplio entre os filamentos branquiais (comprimento = 87,56 µm). Fig 12. Náuplio no tecido gonádico de um mexilhão macho (comprimento = 88,04 µm). Fig 13. Último estádio de copepodito no tecido da glândula digestiva (comprimento = 170,18 µm). Coloração: HHE. Barras: 40µm (Figs. 10 a 12); 100 µm (Fig. 13) ....................................70 CAPÍTULO IV Figura 1 e 2. Estruturas de Urastoma cyprinae coletados em Perna perna, corados com corante vital vermelho neutro. Fig. 1 – cílios (C), olhos (O) e pênis (P); Fig. 2 – faringe (F). Barras = 100 µm (Fig. 1) e 40 µm (Fig. 2)........................................................................92 Figura 3. Esquema das estruturas internas que caracterizam a espécie Urastoma cyprinae, elaborado com base nos cortes histológicos seriados dos turbelários coletados nos mexilhões Perna perna. A- átrio; C- cílios; CGM- canal genital masculino; Eepiderme; F- faringe; GF- glândulas da faringe; GFR- glândulas frontais; GC- glândulas cutâneas; ID- intestino difuso; O- olhos; OV- ovócitos; P- pênis; PP- papila peniana; T- testículos; Vvitelário; VS- vesícula seminal; VSF- vesícula seminal fina; VSGvesícula seminal granulosa; SM- septo muscular. .................................93 Figura 4. Corte histológico de Urastoma cyprinae coletado em Perna perna. A- átrio; CSP- colunas secretoras do pênis; ID – intestino difuso; PP- papila peniana; VSF- vesícula seminal fina; VSG- vesícula seminal granulosa. Barra: 40µm. ...................................94.

(17) Figura 5 e 6. Visão geral de Urastoma cyprinae preparado através do protocolo de Microscopia Eletrônica de Varredura. Fig. 6detalhe dos cílios (C) que recobrem o corpo do animal. ....................... 95 Figura 7 a 10. Cortes histológicos mostrando a presença do turbelário Urastoma cyprinae nos tecidos do Perna perna. Fig. 7Corte longitudinal de U. cyprinae no tecido gonádico masculino (Barra: 100 µm); Fig. 8- Corte longitudinal de U. cyprinae sobre o tecido branquial; Figs. 9 e 10- Corte transversal anterior de U. cyprinae entre as lamelas do tecido branquial (Barras: 40µm). Onde: BR = brânquia; C = cílios; GD = glândula digestiva; O = olho; TGM = tecido gonadal masculino. .................................................................. 96 CAPÍTULO V Figura 1 a 6. Espécimes do copepodito do gênero Monstrilla (fêmea) encontrados no mexilhão Perna perna. Figs. 1 e 2. Copepodito de Monstrilla sp., em vistas latero-dorsal e dorsal, observados com o auxílio do estereomicroscópio, retirados de mexilhões P. perna cultivados, na Palhoça/SC. Detalhes dos ocelos frontais, grandes e pigmentados. Figs. 3 a 6. Copepodito de Monstrilla sp. tratados com Polyvinyl-Lactofenol e fotografados ao DIC. Fig. 3. Copepodito em vista lateral. Detalhe dos tubos de alimentação frontais. Fig. 4. Copepodito em vista lateral. Corpo dividido em cefalossoma (CF), metassoma (MT) e urossoma (UR). Destaque para o par de antênulas frontais. Fig. 5. Vista lateral do metassoma e urossoma de copepodito. Detalhe dos quatro pares de apêndices (P1, P2, P3 e P4) e do somito genital duplo com o par de espinhos ovígeros do copepodito. Fig. 6. Vista dorsal do urossoma de copepodito. Detalhe do 5° par de apêndices (seta) e do ramo caudal com 5 cerdas. Barras = 200 µm (Figs. 1 a 4) e 40 µm (Figs. 5 e 6) ....................................................................................................... 113 Figura 7. Representação esquemática dos pares de apêndices e urossoma de copepodito de Monstrilla sp.: (A) 1º par de apêndices; (B) 2º par de apêndices; (C) 3º par de apêndices; (D) 4º par de apêndices; (E) vista ventral do urossoma com indicação do 5º par de apêndices, somito genital duplo (SGD) e ramo da furca (RF); (F) vista lateral do urossoma. Barras: 40 µm (A, B, C e D); 100 µm (E e F).. ....................................................................................................... 114 Figura 8 a 13. Copepodito de Monstrilla sp. preparado através do protocolo de Microscopia Eletrônica de Varredura em fases distintas. Figs. 8 e 9 – Vista ventral de copepoditos com os pares de.

(18) tubos alimentares frontais. Fig. 10 – Vista lateral de copepodito com parte da membrana que o envolve dentro do hospedeiro. Fig. 11 – Vista latero-dorsal de copepodito. Fig. 12 – Vista dorsal de copepodito com detalhe da região entre cefalossoma e metassoma, mostrando pares de filamentos utilizados para alimentação. Fig. 13 – Vista lateral de copepodito com detalhe do tubo oral fechado e das antênulas, na parte frontal do cefalossoma...........................................116 Figura 14 a 17. Copepodito de Monstrilla sp. preparado para Histologia. Fig. 14 – Corte transversal do copepodito no tecido conjuntivo da borda do manto (BM). Fig. 15 – Detalhe dos apêndices do copepodito em corte transversal. Fig. 16 - Corte longitudinal de copepodito no tecido conjuntivo da borda do manto. Fig. 17 – Corte longitudinal de copepodito com indicação do tubo alimentar no tecido conjuntivo da borda do manto. Barras: Figs. 14 e 17 (200 µm) e Figs. 15 e 16 (40 µm). ..................................................117.

(19) LISTA DE TAB ELAS CAPÍTULO I Tabela 1. Estudos realizados com patógenos registrados em Perna perna de diferentes localidades do Brasil. ............................................. 28 CAPÍTULO II Tabela 1. Caracterização quanto ao sistema de produção e dados ambientais dos locais de coleta. ............................................................ 38 Tabela 2. Comprimento médio ± desvio padrão (mm) dos mexilhões estudados (n=2.880), avaliados por locais, estações e meses e coordenadas geográficas dos locais de coleta. ......................... 42 Tabela 3. Prevalência (%) e taxa de infestação da gregarina Nematopsis sp. nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. ................................................................... 45 Tabela 4. Prevalência (%) e taxa de infestação do metacestóide Tylocephalum sp. nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. .......................................................................................... 46 Tabela 5. Prevalência (%) e taxa de infestação do trematoda Bucephalus margaritae nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), por locais e prevalências por estações e meses. .................................................................................................... 47 Tabela 6. Grau de infestação por Bucephalus margaritae nos mexilhões analisados através da gratícula de Weibel (n=360/local). .... 48 Tabela 7. Prevalência (%) do trematoda Bucephalus margaritae nos mexilhões analisados ao estereomicroscópio (n=360/local), por locais, estações e meses. ........................................................................ 49 CAPÍTULO III Tabela 1. Estudos realizados com mitilídeos, relatando a ocorrência do copépode Pseudomyicola spinosus................................................... 63 Tabela 2. Prevalência (%) e taxa de infestação do copépode Pseudomyicola spinosus, em sua fase adulta, nos mexilhões analisados através do estereomicroscópio (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. .... 71.

(20) Tabela 3. Prevalência (%) e taxa de infestação do copépode Pseudomyicola spinosus, em suas fases naupliares, nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. ......................72 Tabela 4. Pares de apêndices e ornamentações dos endo e exopoditos. Numerais romanos indicam o número de espinhos e arábicos o número de cerdas, de acordo com Humes (1968). ................73 CAPÍTULO IV Tabela 1. Estudos realizados com mitilídeos, relatando a ocorrência do turbelário Urastoma cyprinae. ..........................................................85 Tabela 2. Temperatura e salinidade média (± desvio padrão) da água do mar e comprimento médio (± DP) dos mexilhões Perna perna amostrados nos locais de coleta durante o período de julho de 2010 e junho de 2011. ............................................................................89 Tabela 3. Prevalência (%) e taxa de infestação do turbelário Urastoma cyprinae nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. ....................................................................90 Tabela 4. Prevalência (%) e taxa de infestação do turbelário Urastoma cyprinae nos mexilhões analisados através do estereomicroscópio (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. .......................................91 CAPÍTULO V Tabela 1. Síntese de pesquisas realizadas com copépodes Monstrilloida. .......................................................................................108 Tabela 2. Número de espécies de Monstrilloida descritas e suas regiões de ocorrência (adaptado de Suárez-Morales, 2011).................109 Tabela 3. Ornamentações dos endo e exopoditos dos pares de apêndices natatórios do copepodito de Monstrilla sp. Numerais romanos indicam o número de espinhos e arábicos o número de cerdas, de acordo com Suárez-Morales & Dias (2000).. ......................115.

(21) SUM ÁRIO Proposta da Tese ......................................................... 23 CAPÍTULO I .............................................................. 25 1. INTRO DUÇÃO GER AL ......................................... 25 Prob lemát ica e j ust ifica t i va ......................................... 25 CAPÍTULO II ............................................................. 33 PATÓGENOS ENCONTR ADOS EM ME XILHÕE S Perna perna E IMP LIC AÇÕES NA M ITILIC ULTUR A CATAR INENSE 1. INTRODUÇÃO ..................................................... 36 2. MATER IAIS E MÉ TODOS .................................... 37 Anális e a o es ter e omi croscó pi o ..................................... 39 Anális es a o mi cr oscó pi o de l uz .................................... 40 Monoca ma da s de he móci t os ......................................... 40 Culti vo em mei o de ti ogl ic ola t o de Ray ( RF TM ) ............ 40 Impri nt s de te ci dos e ór gã os ........................................ 40 Hist opat ol ogia ............................................................ 41 Anális e esta tís ti ca ...................................................... 41 3. RESULTADOS ..................................................... 41 4. DISC USSÃO ........................................................ 51 5. CONCLUSÕES ..................................................... 54 6. AGR ADECIMEN TOS ............................................ 54 7. REFERÊNC IAS B IB LIOGRÁF IC AS ....................... 54 CAPÍTULO III ........................................................... 59 PR IMEIRO REGIS TRO DO COPÉPODE Pseud omyicola spinosus EM MEX ILHÕES PERNA PER NA DE CULTIVO 1. INTRODUÇÃO ..................................................... 62 2. MATER IAL E MÉ TODO ....................................... 64 Locais de c ol eta s ........................................................ 64 Avaliação a o es ter e omi cr oscó pi o .................................. 64 Hist opat ol ogia ............................................................ 65 Anális e esta tís ti ca ...................................................... 65 3. RESULTADOS ..................................................... 66 4. DISC USSÃO ........................................................ 72 5. CONCLUSÕES ..................................................... 75 6. AGR ADECIMEN TOS ............................................ 75.

(22) 7. REFERÊNC IAS B IB LIOGRÁF IC AS ....................... 76 CAPÍTULO IV ........................................................... 81 TURBE LÁR IO Urastoma c y prinae EM MEXILHÕE S Perna perna C ULTIVADOS NO S UL B R AS IL 1. INTRODUÇÃO ..................................................... 84 2. MATER IA IS E MÉ TODOS .................................... 86 Locais de a mos tra ge ns ................................................ 86 Avaliação a o es ter e omi cr oscó pi o ................................. 87 Observações em vi vo .................................................. 87 Cort es s eria dos ........................................................... 87 Micr os copia el etrô nica de va rre dura ............................. 87 Hist opat ol ogia ............................................................ 88 Anális e estatís ti ca ...................................................... 88 3. RESULTADOS ..................................................... 88 4. DISC USSÃO ........................................................ 96 5. CONCLUSÕES ..................................................... 99 6. AGR ADECIMEN TOS ............................................ 99 7. REFERÊNC IAS B IB LIOGRÁF IC AS ..................... 100 CAPÍTULO V ........................................................... 104 PR IMEIRO REGIS TRO DA OCORRÊNC IA DO COPÉPODE Monstril la s p. EM MEXI LHÕES Pern a perna DE CULTIVO, NO M UN ICÍP IO DE P ALHOÇA, SAN TA C ATAR INA, BR AS IL 1. INTRODUÇÃO .. ..... .............. .......... .......... .......... 107 2. MATER IAIS E M É TODOS .................................. 109 Locais de col etas e a mostra ge ns ................................. 109 Coleta de t eci do do hos pe deir o e de copépodes a o est ereomi cr os có pi o ................................................... 110 Anális e estatís ti ca .................................................... 111 3. RESULTADOS.. ................................................. 111 4. DISC USSÃO ....... ............................................... 117 5. CONCLUSÕES .. ................................................. 118 6. AGR ADECIMEN TOS .......................................... 119 7. REFERÊNC IAS B IB LIOGRÁF IC AS ..................... 119 Res umo da Tese ........................................................ 123 Consi derações fi na i s da Tes e ..................................... 123.

(23) 23. Proposta da Te se Esta Tese foi motivada pela ocorrência de mortalidades em cultivos de mexilhões Perna perna nos municípios catarinenses de Penha e Governador Celso Ramos nos anos de 2007 e 2009. Tendo em vista que o estado de Santa Catarina possui grande importância na mitilicultura nacional, a pesquisa também incluiu os municípios de Palhoça e Florianópolis. Desta maneira as análises foram realizadas nos quatro principais municípios produtores de mexilhões do País. As revisões bibliográficas foram feitas com foco nas patologias que acometem os moluscos bivalves e que poderiam estar envolvidas nas mortalidades relatadas. Os protocolos de detecção e identificação da Organização Mundial da Saúde Animal – OIE foram aplicados com a intenção de detectar protozoários causadores de doenças de notificação obrigatória. Para a identificação dos metazoários de distintos Filos, foram utilizados protocolos de histologia, estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura. Para relatar o desenvolvimento e os resultados do presente estudo, este foi dividido nas seguintes partes: Introdução Geral – Apresentação e problemática. Capítulo I – Conhecimento dos patógenos que podem estar afetando a saúde dos mexilhões cultivados nos quatro municípios de Santa Catarina, através de análises realizadas durante um ano, com a utilização de protocolos específicos da OIE, de histologia e de estereomicroscopia. Os resultados geraram dados distintos de prevalência e infestação. Foram encontradas novas ocorrências, que levaram à redação dos 3 capítulos abaixo. Capítulo II – Primeiro registro de copépodes da espécie Pseudomyicola spinosus em mexilhões Perna perna. Os tecidos do hospedeiro foram analisados através de histologia e os copépodes através de estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura. Capítulo III – Registro da ocorrência de turbelários da espécie Urastoma cyprinae em mexilhões Perna perna, através das análises histológicas dos tecidos do hospedeiro e de estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura dos turbelários. Capítulo IV – Ocorrência de copépodes do gênero Monstrilla em mexilhões Perna perna. Os tecidos do hospedeiro contendo os copépodes foram analisados através de histologia. Alguns copépodes coletados ao estereomicroscópio foram clarificados e fotografados e outros processados para microscopia eletrônica de varredura..

(24) 24. Produção bibliográfica gerada pela pesquisa Resumos publicados em Anais de Congressos 1.Schaefer, A. L. C.; Alves, R.; Fortunato, M. V.; Rios, C.; Sühnel, S.; Magalhães, A. R. M. Ocorrência de patógenos em mexilhões Perna perna cultivados na Enseada da Armação do Itapocoroy, Penha/SC. In: XXII Encontro Brasileiro de Malacologia, 2011, Fortaleza/CE. 2.Schaefer, A. L. C.; Fortunato, M.; Rios, C.; Sühnel, S.; Magalhães, A. R. M. Ocorrência de patógenos em mexilhões Perna perna cultivados em Florianópolis e Palhoça/SC. In: 5° Congresso da Sociedade Brasileira de Aquicultura e Biologia Aquática, 2012, Palmas/TO. 3.Schaefer, A. L. C.; Fortunato, M. V.; Rios, C.; Sühnel, S.; Magalhães, A. R. M. Ocorrência do Trematoda Bucephalus margaritae em mexilhões Perna perna cultivados em Florianópolis e Palhoça/SC. In: XII Encontro Brasileiro de Patologistas de Organismos Aquáticos, 2012, Bonito/MS. 4.Schaefer, A. L. C.; Sühnel, S.; Magalhães, A. R. M. Mexilhões Perna perna cultivados em Santa Catarina, livres de patógenos de notificação obrigatória para a Organização Mundial de Saúde Animal – OIE. In: XXIII Encontro Brasileiro de Malacologia e I Simpósio Latino-Americano de Jovens Taxonomistas, 2013, Rio de Janeiro/RJ. 5.Schaefer, A. L. C.; Sühnel, S.; Magalhães, A. R. M. Ocorrência de copépode da Família Myicolidae, do Gênero Pseudomyicola em mexilhões Perna perna cultivados em Santa Catarina. In: XIII Encontro Brasileiro de Patologistas de Organismos Aquáticos, 2014, Aracaju/SE..

(25) 25. CAPÍTULO I 1.INTRODUÇÃO GERAL Proble mátic a e jus tif ic ativ a A aquicultura é uma atividade praticada tanto por pequenos produtores como por empresas multinacionais que cultivam 567 espécies aquáticas sendo responsáveis por quase 50% dos pescados utilizados para alimento como fonte de proteínas, ácidos graxos, vitaminas, minerais e micronutrientes essenciais. As estatísticas mostram que a produção aquícola mundial no ano de 2012 foi de 90,43 milhões toneladas, sendo 66,63 milhões de pescados, 23,78 milhões de algas e 22,4 mil toneladas de produtos como pérolas e conchas (FAO, 2015). A mitilicultura, que é o cultivo de mexilhões, teve início em 1235 com o irlandês Patrick Walton que, após naufragar na Baía de Aiguilon (França), fixou redes para capturar aves marinhas em estacas de madeira nas quais se fixaram mexilhões que lhe serviram de alimento (Dore, 1991). De acordo com a FAO (2015), a espécie Mytilus galloprovincialis é a mais cultivada na Espanha, países do Mediterrâneo, Rússia, Ucrânia, África do Sul e China e Mytilus edulis nas águas européias, desde o Mar Branco na Rússia até o sul da França, além do Canadá e Estados Unidos da América, com produção referente a 2013 de 116.574 e de 197.831 toneladas, respectivamente. Os primeiros registros sobre a malacocultura brasileira datam de 1934, numa publicação intitulada “O futuro industrial da ostreicultura no país” (Ferreira e Oliveira Neto, 2006), mas as primeiras tentativas de cultivo de Crassostrea rhizophorae ocorreram no litoral dos estados da Bahia e Santa Catarina, em 1971 (Littlepage e Poli, 1999). No ano de 1983 o projeto “Viabilidade do cultivo de ostras consorciado com o cultivo de camarões” foi iniciado em Santa Catarina e em 1988, implantado o cultivo de mexilhões Perna perna em parceria com os pescadores artesanais catarinenses (Ferreira e Oliveira Neto, 2006). A partir destas iniciativas, em 1990 a produção comercial de mexilhões em Santa Catarina atingiu a marca inicial de 190 toneladas (EPAGRI, 2014). No Brasil o cultivo do Perna perna é feito em sistema suspenso fixo em ambientes com até 4 metros de profundidade mas o mais utilizado é o de espinhéis flutuantes em locais abrigados onde a.

(26) 26. profundidade varia entre 4 e 40 metros, podendo ser usados em cultivos de mar aberto (Ferreira & Magalhães, 2003). De acordo com o IBGE (2015), no ano de 2013, Santa Catarina foi responsável por 97,2% da produção nacional de ostras, vieiras e mexilhões, sendo o município de Palhoça responsável por 55,7% da produção estadual e de 54,1% da produção nacional de moluscos bivalves. Esta mesma fonte divulgou que, em 2013, a produção de sementes de ostras, vieiras e mexilhões ficou concentrada em Florianópolis com 92,5% da produção nacional. No ano de 2013 a malacocultura catarinense contou com 589 maricultores que comercializaram 19.079 toneladas de moluscos, sendo 16.147 toneladas de mexilhões Perna perna, 2.932 toneladas de ostras Crassostrea gigas e 28,6 toneladas de vieira Nodipecten nodosus (EPAGRI, 2014). Os principais desafios da malacocultura mundial estão relacionados com a prevenção e o controle das doenças tanto nos cultivos com menores densidades como nos intensivos. As patologias podem causar perdas sazonais devidas às mudanças ambientais ou ao limite de suporte do hospedeiro. Desta maneira a identificação e estudo do desenvolvimento das doenças podem ajudar no controle da sua propagação e redução das perdas relacionadas à mortalidade ou morbidade, tendo em vista que nem todas as doenças matam seu hospedeiro (Figueras, 2011). Por causa do processo de globalização, medidas sanitárias são cada vez mais importantes no sentido de facilitar o comércio nacional e internacional seguro de animais e produtos de origem animal. O acordo sobre a Aplicação de Medidas Sanitárias e Fitossanitárias incentiva os membros da Organização Mundial do Comércio a basearem suas medidas sanitárias em padrões internacionais inspecionados pela Organização Internacional de Epizotias (OIE, 2014). Grande parte das enfermidades descritas para moluscos causam problemas em sistemas de cultivo e poderiam ser evitadas se fossem respeitadas as regras de controle de transferências e introdução de organismos. A maioria das enfermidades de notificação obrigatória que acometem os moluscos refere-se às ostras e é causada pelos protozoários Marteilia refringens, Bonamia ostrea, Bonamia exitiosa, Perkinsus olseni, Perkinsus marinus e Mikrocytos machini, que em muitos casos possuem um ciclo de vida complexo com vários hospedeiros intermediários para completar seu desenvolvimento ou como reservatório (Figueras, 2011)..

(27) 27. Com a consolidação da malacocultura brasileira, estudos vêm registrando a presença de enfermidades causadas por bactérias, fungos, protozoários e metazoários (Magalhães e Ferreira, 2006). Pesquisas realizadas com mitilídeos registraram a presença do trematódeo Bucephalus margaritae, do poliqueto perfurador Polydora websteri e do caranguejo Pinnotheres maculatus em Perna perna e de organismos semelhantes a Rickettsia, Nematopsis sp., Bucephalus sp., Tylocephalum sp. e turbelários, digeneos e metacercária não identificados em Mytella guyanensis (Boehs et al., 2012). A Tabela 1 apresenta um resumo dos estudos com patologias de Perna perna, apontando os autores e locais de ocorrências no litoral brasileiro..

(28) Filo Platyhelmintes Classe Cestoda Filo Platyhelmintes Classe Turbellaria Filo Annelida Classe Polychaeta Familia Spionidae Subfilo Crustacea Classe Maxilipoda Subclasse Copepoda Subfilo Urochordata (Tunicata) Classe Ascidiacea. Filo Platyhelminthes Classe Trematoda Ordem Digenea. Grupo taxonômico Filo Apicomplexa Grupo Gregarina. Suárez-Morales et al. (2010). Didemnum psammathodes. Monstrilla sp.. Santa Catarina. Santa Catarina. Costa (2007) Suárez-Morales et al. (2010) Da Silva et al. (2012). Suárez-Morales et al. (2010). Santa Catarina. Suárez-Morales et al. (2010). Urastoma cyprinae. Polydora sp.. Santa Catarina. Da Silva et al. (2012). Santa Catarina. Santa Catarina. Rio de Janeiro. Santa Catarina. São Paulo. Local de estudo (litoral) Rio de Janeiro Santa Catarina. Tylocephalun sp.. Parasito ou Comensal/Estado clínico Autor Lima et al. (2001) Nematopsis sp. Da Silva et al. (2012) Umiji et al. (1976) Galvão et al. (2006) Magalhães et al. (2008) Da Silva et al. (2002) Bucephalus sp. Costa (2007) Suárez-Morales et al. (2010) Da Silva et al. (2012) Lima et al. (2001) Marchiori et al. (2010) Bucephalus margaritae Medeiros (2013). Tabela 1. Estudos realizados com patógenos registrados em Perna perna de diferentes localidades do Brasil.. 28.

(29) 29. No Brasil, os estudos realizados com o trematódeo Bucephalus sp. foram iniciados por Umiji et al. (1976) que registraram a presença do parasita formando estruturas filamentosas de coloração laranja no tecido gonádico dos mexilhões Perna perna. Posteriormente Magalhães et al. (2008) identificaram que este parasitismo afeta a composição bioquímica do mexilhão e inviabiliza a reprodução. Nas pesquisas realizadas por Lima et al. (2001); Da Silva et al. (2002 e 2012); Galvão et al. (2006); Costa (2007); Suárez-Morales et al. (2010) e Medeiros (2013) este trematódeo foi registrado em diferentes hospedeiros. A pesquisa realizada por Marchiori et al. (2010) identificou o ciclo de vida do trematódeo e seus hospedeiros intermediários e definitivos, conseguindo realizar a identificação da espécie Bucephalus margaritae. A ocorrência de larvas do cestódeo Tylocephalum sp. foi registrada no tecido conjuntivo do manto do marisco-do-mangue Mytella guyanensis por Ceuta & Boehs (2012) e em P. perna e Crassostrea gigas por Da Silva et al. (2012), formando encapsulamento e provocando infiltração hemocitária em ambos hospedeiros. Na pesquisa realizada por Suárez-Morales et al. (2010) com mexilhões P. perna, também foram registradas as presenças do copépode Monstrilla sp. formando nódulos e infiltração hemocitária no tecido conjuntivo do manto e do turbelário Urastoma cyprinae movendo-se pelas brânquias, aparentemente sem provocar reações do hospedeiro. A polidiariose, doença causada pelo anelídeo poliqueta Polydora sp. que perfura as conchas e forma tubos e bolhas de lodo, foi registrada no berbigão Anomalocardia brasiliana por Boehs & Magalhães (2004); em ostras Crassostrea gigas e C. rhizophorae por Sabry & Magalhães (2005), Sabry et al. (2011) e Da Silva (2012); em Crassostrea gigas por Maciel et al. (2010) e em Perna perna por Costa (2007), SuárezMorales et al. (2010) e Da Silva et al. (2012), sem provocar danos aos tecidos moles dos hospedeiros mas sim às suas valvas. Considerando a necessidade da constante atualização do inventário de parasitos e patologias de mitilídeos cultivados no Brasil, mexilhões no Estado de Santa Catarina foram estudados, durante o período de um ano, através dos protocolos específicos da OIE e de histologia clássica, estereomicroscopia e microscopia eletrônica de varredura..

(30) 30. Referências bi bli ogr áfic as da i ntr od uç ão BOEHS, G.; MAGALHÃES, A. R. M. Simbiontes associados com Anomalocardia brasiliana (Gmelin) (Mollusca, Bivalvia, Veneridae) da Ilha de Santa Catarina e região continental adjacente, Santa Catarina, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 21, n. 4, p. 865-869, 2004. BOEHS, G. et al. Parasitos e patologias de bivalves marinhos de importância econômica da costa brasileira. In: SOUZA, A. T. S; DE LOS ANGELES, M.; TAKEMOTO, R. M. Patologia e sanidade de organismos aquáticos. ABRAPOA, 2012. p. 165-193. CEUTA, L. O.; BOEHS, G. Parasites of mangrove mussel Mytella guyanensis (Bivalvia: Mytilidae) in Camamu Bay, Bahia, Brazil. Brazilian Journal of Biology, v. 72, n. 3, p. 421-427, 2012. COSTA, R. L. Prevalência de enfermidades e histopatologia de Perna perna (Mollusca) em Florianópolis/SC, Brasil. 2007. 31p. Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2007. DA SILVA, P. M.; MAGALHÃES A. R. M.; BARRACCO; M. A. Effects of Bucephalus sp. (Trematoda: Bucephalidae) on Perna perna mussels from a culture station in Ratones Grande Island, Brazil. Journal of Invertebrate Pathology, v.79, n. 3, p. 154-162, 2002. DA SILVA, P. M.; MAGALHÃES, A. R. M.; BARRACCO, M. A. Pathologies in commercial bivalve species from Santa Catarina State, southern Brazil. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, v. 92, p. 571–579, 2012. DORE, I. Shellfish: a guide to oyster, mussels, scallops, clams and similar products for the commercial user. New York: Springer, 1991. EPAGRI – Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina. Síntese Informativa da Maricultura 2012. Disponível em: <http://www.epagri.sc.gov.br/wp-content/uploads/2013/08 /Sintese_informativa_da_maricultura_2013.pdf>. Acesso em: 23 set. 2014..

(31) 31. FAO - Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura. Acuicultura. Disponível em: <http://www.fao.org/fishery/aquaculture/es>. Acesso em: 12 jan. 2015. FERREIRA, J.F e MAGALHÃES, A.R.M. Cultivo de mexilhões – Instruções e Ajuda. Manual do Laboratório de Cultivo de Moluscos Marinhos. Universidade Federal de Santa Catarina, 2003. FERREIRA, J. F.; OLIVEIRA NETO, F. M. Cultivo de moluscos em Santa Catarina. Infopesca Internacional, Montevideo, p. 34-41, 2006. FIGUERAS, A. Introducción a las enfermidades de moluscos bivalvos. In: FIGUERAS, A.; NOVOA, B. Enfermedades de moluscos bivalvos de interés en acuicultura. Madrid: Fundación OESA, 2011. p. 15-31. GALVÃO, M. S. N. et al. Ciclo reprodutivo e infestação parasitária de mexilhões Perna perna (LINNAEUS, 1758). Boletim do Instituto de Pesca, v. 32, n. 1, p. 59–71, 2006. IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Disponível em: < http://www.ibge.gov.br>. Acesso em: 02 fev. 2015. LIMA, F. C.; ABREU, M. G.; MESQUITA, E. F. M. Monitoramento histopatológico de mexilhão Perna perna da Lagoa de Itaipu, Niterói, RJ. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 53, p. 203-206, 2001. LITTLEPAGE, J. L.; POLI, C. R. Oyster culture in the state of Santa Catarina, Brazil. Final report of the shellfish technology transfer program (STTP). Blue Water Aquaculture Ltda, Florianópolis, 1999. Disponível em: <http://www.bwaaquaculture.com>. Acesso em 12 jan. 2015. MACIEL, M. L. T.; IBBOTSON, D. P.; MAGALHÃES, A. R. M. Polidiariose em ostras Crassostrea gigas cultivadas na praia da Ponta do Sambaqui, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 47, n. 5, p. 337-345, 2010. MAGALHÃES, A. R. M.; FERREIRA, J. F. Patologias e manejo em malacocultura. In: SILVA-SOUZA, A. Sanidade de Organismos Aquáticos no Brasil. Maringá: ABRAPOA, 2006. p.79-94..

(32) 32. MAGALHÃES, A. R. M.; FERREIRA, J. F.; FERREIRA, F. M. Composição química. In: RESGALLA JR., C.; WEBER, L. I.; CONCEIÇÃO, M. B. (eds.). O mexilhão Perna perna (L.). Biologia, ecologia e aplicações. Rio de Janeiro: Interciência, 2008. p. 69-83. MARCHIORI, N. C.; MAGALHÃES, A. R. M.; PEREIRA JR., J. The life cycle of Bucephalus margaritae Ozaki&Ishibashi, 1934 (Digenea, Bucephalidae) from the coast of Santa Catarina State, Brazil. Acta Scientiarum Biological Sciences, v. 32, p. 71-78, 2010. MEDEIROS, S. C. Bucefalose no cultivo de mexilhões: relação do parasita com os hospedeiros iniciais. 2013. 68p. Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2013. OIE - Organização Internacional de Epizootias – Código Sanitário para Animais Aquáticos. Disponível em: <http://www.oie.int/esp/OIE/es_about.htm>. Acesso em: 05 nov. 2014. SABRY, R. C.; MAGALHÃES, A. R. M. Parasitas em ostras de cultivo (Crassostrea rhizophorae e Crassostrea gigas) da Ponta do Sambaqui, Florianópolis, SC. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 27, p. 194-202, 2005. SABRY, R. C. et al. Pathological study of oyster Crassostrea gigas from culture and C. rhizophorae from natural stock of Santa Catarina Island, SC, Brazil. Aquaculture, v. 60, p. 43–50, 2011. SUÁREZ-MORALES, E.; SCARDUA, M. P.; DA SILVA, P. M. Occurrence and histopathological effects of Monstrilla sp. (Copepoda:Monstrilloida) and other parasites in the brown mussel Perna perna from Brazil. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, v. 90, p. 953–958, 2010. UMIJI, S.; LUNETTA, J. E.; LEONEL, R. M. V. Infestation of the mussel Perna perna by digenetic trematodes of the bucephalidae family genus Bucephalus. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 47 (Suppl.), p. 115-117, 1976..

(33) 33. CAPÍTULO II. PATÓG ENOS ENCONTRADOS EM MEXILHÕES Pern a perna E IM PLICAÇÕES NA M ITIL ICULTU RA CATARINENSE.. O artigo será enviado para publicação e foi redigido segundo as normas do Boletim do Instituto de Pesca..

(34) 34. PATÓG ENOS ENCONTRADO S EM M EXIL HÕES Per na perna E IM PLICAÇÕES NA MIT IL ICULTURA CATARINENSE. Ana Lúcia CARNEIRO-SCHAEFER, Simone SÜHNEL e Aimê Rachel Magenta MAGALHÃES Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Aquicultura, Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola. Rodovia Admar Gonzaga, 1346 – CEP: 88034-001 – Itacorubi – Florianópolis – SC – Brasil. e-mail: ana.carneiro@ufsc.br (autor correspondente) RESUMO Mexilhões Perna perna foram coletados nos principais municípios produtores deste bivalve em Santa Catarina, sul do Brasil. Durante o período de julho de 2010 a junho de 2011 foram analisados 2.880 mexilhões com o auxílio de estereomicroscopia, microscopia de luz, incluindo histopatologia, monocamadas de hemócitos, imprint de tecidos e cultivo em meio tioglicolato, para verificar a presença de patógenos. Os resultados das análises mostraram ausência das enfermidades de notificação obrigatória. Contudo, foi registrada a presença de patógenos do Filo Platyhelmintes: o Trematoda Bucephalus margaritae, o Cestoda Tylocephalum sp. e um Turbelário do gênero Urastoma. Também foi registrada a ocorrência de copépodes da Classe Maxillopoda, gêneros Pseudomyicola e Monstrilla. Além destes, foram encontrados protozoários do Filo Ciliophora, Ancistrocoma sp. e do Filo Apicomplexa, Nematopsis sp. Os patógenos encontrados não sugerem causar mortalidade ou trazer danos aos mexilhões, com exceção de Bucephalus margaritae, que causa castração parasitária, o que afeta a mitilicultura, pela diminuição no número de larvas e de jovens mexilhões. Palavras-chave: Histopatologia, prevalência, infestação, molusco bivalve..

(35) 35. AB STRACT Perna perna mussels were collected in the main municipalities producers of this bivalve in Santa Catarina, southern Brazil. During the period of July 2010 to June 2011 were analyzed 2,880 mussels with the aid of stereomicroscopy, light microscopy, including histopathology, monolayers of hemocytes, imprint and incubation of tissues in Ray's Fluid Thioglycollate Medium, for the presence of pathogens. The results of the analysis showed absence of notifiable diseases. However, it was registered the presence of Filo Platyhelmintes pathogens: the Trematoda Bucephalus margaritae, the Cestoda Tylocephalum sp. and a gender Turbelário Urastoma. It was also registered the occurrence of copepods class Maxillopoda, Pseudomyicola and Monstrilla genres. In addition, protozoa found the Filo Ciliophora, Ancistrocoma sp. and Filo Apicomplexa, Nematopsis sp.. Pathogens found not suggest cause mortality or bring harm to mussels, except for B. margaritae, which causes parasitic castration, which affects the mussel, the decrease in the number of larvae and young mussels. Keywords: Histopathology, prevalence, infestation, bivalve mollusc..

(36) 36. 1.INTRODUÇÃO Mexilhões são moluscos bivalves da família Mytilidae (Rafinesque, 1815), com 26 gêneros distribuídos ao longo dos oceanos no planeta (ITIS, 2014). No litoral brasileiro a família Mytilidae está representada por 13 gêneros e 22 espécies (RIOS, 2009), sendo cinco utilizadas na alimentação: Aulacomya ater (Molina, 1782), Mytella charruana (Orbigny, 1842), Mytella guyanensis (Lamark, 1819), Mytilus edulis platensis (Orbigny, 1846) e Perna perna (Linnaeus, 1758), a espécie de maior valor comercial. Estudos sobre a perspectiva da mitilicultura no Brasil e sobre a fisiologia da reprodução do mexilhão Mytilus perna (=Perna perna) foram realizados por LUNETTA (1969). Neste mesmo ano, UMIJI (1969) realizou pesquisas sobre a neurossecreção nesta espécie de mitilídeo. No ano de 1990 tem início o cultivo comercial do mexilhão Perna perna em Santa Catarina, com produção de 190 toneladas. Segundo a EPAGRI (2015), no ano de 2013 a malacocultura catarinense contou com 589 maricultores que foram responsáveis por 95% da produção nacional de moluscos bivalves como ostras, mexilhões, berbigões e vieiras. No ano de 2012 foram comercializadas 23.495 toneladas de moluscos, sendo 21.027 toneladas de mexilhões Perna perna, produzidas principalmente nos municípios de Penha, Governador Celso Ramos, Florianópolis e Palhoça e 2.468 toneladas de ostras Crassostrea gigas (DOS SANTOS et al., 2012). Isto significa que os mexilhões foram responsáveis por 89,5% do total de moluscos marinhos cultivados no Estado. Estudos sobre patologias em mexilhões Perna perna vem sendo realizados desde 1976 e a partir dos últimos anos os trabalhos tem focado na avaliação do estado de saúde dos moluscos, como registraram MAGALHÃES e FERREIRA (2006) e BOEHS et al. (2012) e nos agentes patogênicos. O Trematoda Digenea Bucephalus sp., que causa castração parasitária, foi estudado no litoral dos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Santa Catarina, por UMIJI et al. (1976); MAGALHÃES (1998); LIMA et al. (2001); DA SILVA et al. (2002); GALVÃO et al. (2006); COSTA (2007). O ciclo de vida da espécie Bucephalus margaritae da costa do Estadeo de Santa Catarina, foi identificado por MARCHIORI et al. (2010) e a partir desta pesquisa, SUÁREZ-MORALES et al..

(37) 37. (2010), DA SILVA et al. (2012) e MEDEIROS (2013) citam esta espécie em suas pesquisas. A gregarina apicomplexa Nematopsis sp. foi registrada por LIMA et al. (2001) e DA SILVA et al. (2012). A ascidia colonial Didemnum psammathodes, o copépode Monstrilla sp., o poliqueto perfurador Polydora sp. e o turbelário Urastoma cyprinae foram registrados por SUÁREZ-MORALES et al. (2010), em mexilhões cultivados em Penha, SC, Brasil. A pesquisa realizada por DA SILVA et al. (2012), registrou a ocorrência do protozoário Nematopsis sp., do cestoda Tylocephalum sp., do poliqueto Polydora sp., de esporocistos de Trematódeos e ciliados não identificados, em mexilhões cultivados em São José, SC, Brasil. Nos últimos anos os mitilicultores tem relatado a ocorrência de mortalidades nos cultivos nos municípios de Penha e Governador Celso Ramos, no litoral catarinense (comunicação pessoal). Neste estudo foi analisada a saúde dos mexilhões Perna perna procedentes dos quatro principais municípios produtores do Estado de Santa Catarina, visando contribuir com a consolidação da mitilicultura. 2.MATERIAIS E M ÉTODO S Durante o período de julho de 2010 a junho de 2011, foram amostrados mensalmente 240 mexilhões ao longo da costa do estado de Santa Catarina, sul do Brasil (Figura 1A). As amostragens (n=60 por local) foram realizadas em cultivos comerciais localizados nos municípios de Palhoça, Governador Celso Ramos e Penha e em cultivo experimental (UFSC) no município de Florianópolis, totalizando 2.880 animais. Nos dias das coletas dos mexilhões também foram aferidos os dados de salinidade, através da média de 3 amostras de água do mar, com o auxílio de salinômetro Alfakit. A temperatura foi registrada ao final de cada coleta com o auxílio de um termômetro de mercúrio que permaneceu submerso a uma profundidade de 1m. O sistema de cultivo nos locais de coleta é flutuante com espinhel de superfície. Cada local foi caracterizado em relação ao sistema de produção, tipo de substrato, profundidade e aporte de efluentes (Tabela 1)..

(38) 38. Tabela 1. Caracterização quanto ao sistema de produção e dados ambientais dos locais de coleta. Características do Palhoça Florianópolis Governador Penha cultivo Celso Ramos Número de áreas de 3 1 1 1 cultivo Tamanho total do cultivo 10 1 5 0,7 - 0,8 (hectares) Número de espinhéis 56 3 24 7 por área Tamanho de cada espinhel 75 50 150 100 (m) Espaçamento entre espinhéis 5 9 10 10 (m) Número de cordas 1 de mexilhão por 100 240 140 espinhel Tamanho da corda 600 0,80 a 1 1,60 2,50 (m) (sistema contínuo) Espaçamento entre cordas 0,50 0,50 0,70 (m) Quantidade de 600 a 700/m 600/corda 700/corda 800/corda mexilhões Peso 20/m 12/corda 17 a 20/corda 20/corda (kg) 2 vezes ao Tempo entre ano sem sem sem desdobres (março e outubro) Quantidade de mexilhões na área 60.480.000 18.000 4.032.000 784.000 de cultivo Profundidade 4a8 4 5a6 7 (m) Tipo de fundo Lodoso/arenoso Lodoso Lodoso Rochoso.

(39) 39. As coletas foram realizadas em 05 cordas pré-determinadas (Figura 1B), sendo os animais transportados em caixas de isopor até o Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola (NEPAQ), do Departamento de Aquicultura, da Universidade Federal de Santa Catarina. Do total de mexilhões coletados, 1.440 mexilhões (n=30, por mês) foram analisados ao estereomicroscópio, com a finalidade de coletar macropatógenos e os outros 1.440 mexilhões (n=30, por mês), destinados aos protocolos de análises microscópicas, para avaliação da presença de micropatógenos.. Figura 1.(A) Locais de coleta de Perna perna no estado de Santa Catarina, sul do Brasil e (B) esquema de um cultivo de mexilhões indicando a disposição das cordas (quadrados pretos) de onde foram coletados os animais.. Análise ao e ste re omic rosc ópio Os mexilhões destinados às análises de macropatógenos foram abertos com um objeto perfurocortante inserido entre as valvas após o deslocamento do bisso, com a finalidade de cortar o músculo adutor. Após sua abertura, foram levados ao estereomicroscópio para identificação do sexo, registro de anomalias na carne do animal (pústulas e abscessos) e coleta de parasitas..

(40) 40. Análises ao mic rosc ópio de luz Os mexilhões destinados às análises microscópicas foram medidos e após a avaliação das partes moles como descrito anteriormente, foi realizada a coleta de tecidos para as técnicas específicas descritas a seguir. Monocamadas de he móc itos Após ser feita uma pequena abertura na concha dos mexilhões a hemolinfa foi retirada do músculo adutor, com o auxílio de uma seringa de 1 mL, contendo solução fixadora de formol-MAS (modified Alsèver’s solution) (BACHÉRE et al., 1988), na proporção de 2:1 (Formol MAS: Hemolinfa). Para avaliar a presença de Bonamia sp. e Perkinsus sp., 50 µL da mistura de hemolinfa e Formol MAS foram colocados sobre uma lâmina que, após seca, foi corada com Giemsa, coberta com lamínula e avaliada ao microscópio de luz. Cultivo em me io de tioglic ola to de Ray (RFTM ) Para esta técnica, realizada com base em RAY (1966) e no Manual Aquático da OIE (2014), foi retirado de cada mexilhão, um par de lamelas branquiais e o reto que foram colocados juntos em um tubo falcon contendo meio tioglicolato. Após a amostragem de tecido, foi adicionado o antifúngico Nistatina (10.000 U/mL) e incubado por 5 dias ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. Após este período, os tecidos foram macerados sobre uma lâmina, corados com Lugol, cobertos com lamínula e observados ao microscópio de luz. Esta técnica é utilizada para detectar a presença do protozoário Perkinsus sp. e também é útil para a detecção da gregarina Nematopsis sp.. Imprints de te c idos e órgãos De acordo com o Manual Aquático da OIE (2014), para esta técnica são utilizadas amostras (de 3 a 5 mm) de glândula digestiva, mas neste trabalho utilizaram-se também amostras de brânquia, coração e tecido gonádico, que foram levemente pressionadas sobre uma lâmina de vidro. As preparações foram secas ao ar, fixadas em Metanol, coradas com Giemsa e lavadas em água destilada. Após secagem foram cobertas por lamínula e observadas ao microscópio de luz para verificar a presença dos protozoários Marteilia sp. e Bonamia sp..

(41) 41. Histopatolog ia Após ser retirado da concha, o mexilhão foi seccionado transversalmente e retirada uma fatia (com aproximadamente 2 mm de espessura) contendo manto, brânquia, tecido gonádico e glândula digestiva. Esta amostra foi colocada em cassete e fixada em Solução de Davidson marinho (BELL e LIGHTNER, 1988 e HOWARD et al., 2004). A inclusão em parafina foi realizada conforme PAULETEVANRELL (1967) e o material biológico foi cortado a uma espessura de 5 µm em micrótomo com navalhas descartáveis. Os cortes foram colocados em lâminas de vidro, corados com Hematoxilina de Harris e Eosina (HOWARD et al., 2004) e, após receberem lamínulas, observados ao microscópio de luz para identificação do sexo, avaliação dos tecidos e análises patológicas. Análise e statís tic a A prevalência foi calculada de acordo com BUSH et al. (1997) dividindo o total de hospedeiros com determinado patógeno pelo total de hospedeiros estudados em cada local de coleta e a infestação mensal foi calculada dividindo a quantidade de patógenos pelo número de hospedeiros. A avaliação da infestação do trematoda Bucephalus margaritae foi calculada por estereologia, através do uso da gratícula de Weibel, classificando-se o grau de parasitismo em grau leve, (<5%), moderado (5-50%) e pesado (>50%), segundo a relação entre a quantidade de tecidos do parasita nos tecidos do hospedeiro, de acordo com MAGALHÃES (1998). Os dados de prevalência e infestação foram analisados através de teste t com permutação (não paramétrico) usando multitest proc no SAS® (WESTFALL et al., 1999), para avaliar diferenças entre locais, estações, meses, temperatura e salinidade. 3.RESULTADOS As medidas de comprimento dos mexilhões, coletados no período de julho/2010 e junho/2011, apresentaram diferenças significativas (p<0,05) entre locais, estações e meses (Tabela 2). O tamanho dos mexilhões de Florianópolis e da Palhoça apresentou diferença significativa (p<0,05) dos de Governador Celso Ramos, assim como o tamanho dos mexilhões de Florianópolis apresentaram diferença significativa dos da Penha. Agrupando os dados por estação foi registrada diferença significativa no tamanho dos mexilhões coletados.

(42) 42. no verão em relação aos coletados no outono e inverno, sem diferença significativa entre si, e entre os coletados no outono e inverno em relação aos da primavera. Na avaliação mensal independente do local, o maior tamanho dos animais foi registrado em janeiro, diferente significativamente dos demais meses, com exceção de novembro e dezembro. O menor tamanho foi registrado no mês de julho, diferente significativamente de outubro, novembro, dezembro, janeiro, fevereiro e março. Tabela 2. Comprimento médio ± desvio padrão (mm) dos mexilhões estudados (n=2.880), avaliados por locais, estações e meses. Local de coleta Palhoça Florianópolis Governador Celso Ramos Penha Estação do ano Inverno Primavera Verão Outono Ano 2010 2011. Jul 71 ± 6 Jan 100 ± 9. Ago 83 ± 12 Fev 86 ± 17. Comprimento 85,69 ± 11,74 88,88 ± 13,96 76,29 ± 18,54 80,06 ± 49,68 76,55 ± 11,63 84,37 ± 11,71 91,98 ± 51,50 78,48 ± 13,20 Mês do ano Comprimento Set Out 80 ± 14 84 ± 9 Mar Abr 83 ± 14 79 ± 12. Nov 89 ± 10 Mai 74 ± 12. Dez 89 ± 87 Jun 76 ± 12. A temperatura e a salinidade da água do mar (Figura 2) (n=12) não apresentaram diferenças significativas entre os locais, estações do ano e meses. A temperatura (ºC) e a salinidade (‰) médias na Palhoça foram de 20,6 ± 3,4 e 32,0 ± 3,0; em Florianópolis foram de 20,5 ± 3,45 e 33 ± 3; em Governador Celso Ramos foram de 20,6 ± 4,22 e 33 ± 4 e, na Penha, foram de 21,3 ± 3,79 e 33 ± 3..

(43) 43. Figura 2. Temperatura (ºC) e salinidade (‰) nos locais de coleta, durante o período da pesquisa.. Através das análises ao estereomicroscópio foram analisados 1320 mexilhões onde foram registradas 559 fêmeas, 754 machos e 7 indivíduos de sexo indeterminado (Figura 3). Para esta técnica o sexo dos mexilhões não foi registrado, no mês de julho de 2010, nos 4 locais de coleta. Nas análises histológicas dos 1440 mexilhões foram registradas 662 fêmeas, 658 machos e 120 de sexo indeterminado (Figura 4). As avaliações estatísticas mostraram que não houve diferença significativa na taxa entre machos e fêmeas do total de animais coletados..

(44) 44. Figura 3. Sexo dos mexilhões (%), por local de coleta, analisados através do estereomicroscópio.. Figura 4. Sexo dos mexilhões (%), por local de coleta, analisados através da histologia..

(45) 45. Através das técnicas de cultivo em meio de tioglicolato de Ray, monocamadas de hemócitos e Imprints de tecidos e órgãos não foram observados os protozoários de notificação obrigatória Perkinsus sp., Bonamia sp. e Marteilia sp. nos mexilhões cultivados nas localidades e período estudado. O Ciliophora do gênero Ancistrocoma (Chatton e Lwoff, 1926) foi registrado através das análises histológicas na glândula digestiva de um único mexilhão da Penha, na primavera no mês de setembro. Oócitos de gregarinas do gênero Nematopsis (Schneider, 1892) (Apicomplexa: Eugregarina) contendo um esporozoíto (Figura 5) foram observados através das análises histológicas nas brânquias de mexilhões (Tabela 3). As análises sobre prevalência deste patógeno não apresentaram diferenças significativas entre locais e estações, mas mostraram diferenças significativas (p<0,05) entre o mês de julho e os meses de fevereiro, março, abril, maio, junho, agosto, setembro, outubro e dezembro. A ocorrência deste parasita foi registrada em 4 mexilhões da Penha e em 1 mexilhão de Governador Celso Ramos. Tabela 3. Prevalência (%) e taxa de infestação médias ± desvios padrões da gregarina Nematopsis sp. nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), avaliados por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. Local de coleta Palhoça Florianópolis Governador Celso Ramos Penha Estação do ano Inverno Primavera Verão Outono Ano 2010. Jul P 2,50. 2011. I 23,67 Jan P I 0,83 17. Prevalência média(%) ± DP 0±0 0±0 0,28 ± 0,96 1,11 ± 2,17. Infestação média ± DP 0±0 0±0 2,67 ± 9,23 3,63 ± 7,13. 0,83 ± 1,06 12,88 ± 15,71 0,28 ± 0,56 1,75 ± 3,50 0,28 ± 0,56 4,25 ± 8,50 0±0 0±0 Mês do ano Prevalência (%) / Infestação Ago Set Out Nov Dez P I P I P I P I P I 0 0 0 0 0 0 0,83 7 0 0 Fev Mar Abr Mai Jun P I P I P I P I P I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.

(46) 46. Metacestóides do gênero Tylocephalum (Linton, 1890) (Tetragonocephalidae) (Figura 6) foram registrados através das análises histológicas no tecido conjuntivo dos mexilhões (Tabela 4). A prevalência deste patógeno, durante o período do estudo, foi maior na Penha sendo significativamente diferente (p<0,05) de Governador Celso Ramos, Florianópolis e Palhoça, sem diferença significativa entre estações, mas com diferença significativa (p<0,05) entre o mês de outubro e os outros meses estudados. A taxa de infestação não apresentou diferença significativa entre os locais, estações e meses. Tabela 4. Prevalência (%) e taxa de infestação médias ± desvios padrões do metacestóide Tylocephalum sp. nos mexilhões analisados através da histologia (n=360/local), por locais, estações e meses. Onde: P = Prevalência; I = Infestação. Local de coleta Palhoça Florianópolis Governador Celso Ramos Penha Estação do ano Inverno Primavera Verão Outono Ano 2010. Jul P. I. 7,50. 1,11. 2011. Jan. Prevalência média(%) ± DP 0,28 ± 0,96 1,11 ± 1,64 3,33 ± 3,48 15,00 ± 6,89. Infestação média ± DP 0,88 ± 0,28 0,42 ± 0,66 0,63 ± 0,56 1,34 ± 0,47. 5,58 ± 7,61 1,07 ± 0,82 2,78 ± 4,11 0,88 ± 0,62 5,56 ± 6,29 1,17 ± 0,21 5,56 ± 9,64 0,86 ± 0,61 Mês do ano Prevalência (%) / Infestação Ago Set Out Nov Dez P I P I P I P I P I. 4,17 1,40. 5,83. 1,29. P. I. Fev P I. P. Mar I. 7,50. 1,22. 3,33 1,75. 5,83. 1,29. 0,83. 1,00 5,00. Abr P I 6,67. 1,33. Mai P I. 1,38 5,83. 1,29. 2,50. 1,67. Jun P. I. 4,17. 1,60. Esporocistos contendo cercárias em diferentes estágios de desenvolvimento do Trematoda Bucephalus margaritae (Ozaki e Ishibashi, 1934) (Digenea, Bucephalidae) (Figura 7) foram observados nos cortes histológicos no tecido gonádico dos mexilhões. A prevalência deste patógeno, durante o período do estudo, foi maior nos mexilhões de Florianópolis e da Palhoça sem diferença significativa entre si, mas ambos locais, significativamente diferentes (p<0,05) da Penha e de Governador Celso Ramos. Em relação às estações, o outono foi.