TÍTULO: OBESIDADE INDUZIDA PELA DIETA HIPERLIPÍDICA AUMENTA COMPORTAMENTOS ANSIOSOS EM RATAS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): JULIA DO NASCIMENTO PANIZZA
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MIRIAM OLIVEIRA RIBEIRO
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): FERNANDA BERALDO LORENA
1. RESUMO
A obesidade é um distúrbio multifatorial que está diretamente relacionada à Síndrome Metabólica e pode levar ao desenvolvimento de desordens comportamentais, tais como depressão e ansiedade. O presente trabalho tem como objetivo avaliar se a obesidade leva ao desenvolvimento do comportamento ansioso e depressivo em ratas da linhagem Wistar. Para tanto, estudamos dois grupos animais: grupo controle tratado com dieta padrão e grupo experimental tratado com dieta hiperlipídica (40%) ao longo de 34 semanas. Durante esse período foram avaliados parâmetros metabólicos como ganhos de peso corporal, tolerância à glicose e níveis plasmáticos de colesterol e triglicérides. Posteriormente, os animais foram submetidos aos testes do campo aberto e reconhecimento de objetos, para avaliar o desenvolvimento de comportamento ansioso e/ou depressivo. Os animais do grupo experimental apresentaram maior tempo de imobilidade no campo aberto, enquanto que no reconhecimento de objetos eles apresentaram menor tempo de interação com os objetos, indicando desmotivação e desinteresse. Os nossos dados sugerem, portanto, que a obesidade pode levar ao desenvolvimento de quadros depressivos em ratas.
Palavras chave: ansiedade – obesidade – depressão
2. INTRODUÇÃO
A obesidade é definida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como acúmulo excessivo ou anormal de gordura, que pode resultar em danos à saúde do indivíduo, considerada um dos principais problemas de saúde pública da atualidade (SANDE-LEE, VELLOSO, 2012). Além de impor ao indivíduo um forte estigma social, é um fator de risco para doenças, como diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica, doenças respiratórias, alguns tipos de câncer, impactando a qualidade de vida e a longevidade da população (SANDE-LEE, VELLOSO, 2012).
De acordo com o IBGE (2010), 13,9% dos adultos brasileiros são obesos, apresentam IMC maior ou igual a 30 kg/m². O aumento de casos de obesidade pode ser o resultado de mudanças nos hábitos alimentares, com o aumento da ingestão calórica e diminuição da prática de atividades físicas (GOULARTE, et al., 2012).
A síndrome metabólica (SM) representa um grupo de fatores de risco cardiometabólicos: obesidade abdominal, elevação da pressão arterial, glicemia de
jejum e triglicerídeos, redução dos níveis de colesterol HDL, aumentado de eventos cardiovasculares e mortalidade (GUYTON, et al., 2006; MELO, 2011).
Além disso, uma dieta rica em gorduras saturadas e açúcares refinados pode exercer algum tipo de influência nas funções cognitivas do indivíduo (MOLTENI, 2002).
Estudos relacionaram dietas hipercalóricas com perda de memória cognitiva e espacial. Ratos tratados com dieta de cafeteria apresentaram pior desempenho no labirinto radial em comparação aos ratos tratados com dieta convencional. O desempenho dos animais tratados com dieta hipercalórica foi semelhante ao de ratos com danos cerebrais (WINOCUR, GREENWOOD, 2005).
Estudos sócios demográficos apresentam relações entre a obesidade e o desenvolvimento de distúrbios emocionais como depressão e ansiedade (SCOTT et al., 2008). Considerando a importância que tem se atribuído aos distúrbios alimentares e às comorbidades associadas, torna-se extremamente importante avaliar os aspectos fisiológicos envolvidos no desenvolvimento da obesidade e, em diferentes distúrbios associados à mesma.
Uma pesquisa realizada durante seis anos, com 176 pacientes europeus depressivos de uma mesma região, mostrou que 36% desses indivíduos foram diagnosticados com SM. No Brasil, pacientes psiquiátricos, internados em um hospital geral, entre esses depressivos e pacientes com transtorno bipolar, 48,1% foram também diagnosticados com SM (MARAZZITI et al., 2013).
3. OBJETIVOS
Avaliar o desenvolvimento do comportamento ansioso e depressivo em ratas obesas da linhagem Wistar.
4. METODOLOGIA
Foram utilizadas fêmeas da linhagem Wistar, N=12, com um mês de vida, separadas em dois grupos de seis mantidas em gaiolas de plástico (35 x 50 x 15 cm) temperatura controlada (22 ± 3°C), período de 12h de claro/escuro. Água e comida
ad libitum durante todo tratamento. Grupo controle exposto à dieta padrão (ração
comum), totalizando 1,8 Cal/g e grupo experimental dieta hiperlipídica 40%, totalizando 7,52 Cal/g.
Estudo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Presbiteriana Mackenzie. Processo CEUA/UPM N° 122/11/2014, em 18 de dezembro de 2014.
5. DESENVOLVIMENTO
O teste de tolerância à glicose foi realizado em animais submetidos a jejum de 12 horas e tratados com uma dose de glicose (2g/Kg) em solução salina (0,9% NaCl), intraperitonealmente. Os níveis glicêmicos foram avaliados por meio de glicosímetro (One touch Ultra, Johnson & Johnson, São Paulo, SP) nos tempos zero (basal), 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção de glicose (ASENSIO et al., 2005). As medidas de colesterol e triglicérides plasmáticos foram determinadas por colorimetria utilizando-se o equipamento NanoDrop e um kit comercial (Enzymatic Cholesterol Human GmbH, Germany), seguindo as instruções do fabricante.
Para a realização dos testes comportamentais, foi necessário determinar a fase do ciclo estral das ratas para obter um grupo mais homogêneo. Animais nas fases de metaestro e diestro foram considerados aptos para realizar os testes.
Para a realização do teste de campo aberto, cada fêmea foi colocada individualmente no centro da arena e gravada por 10 minutos.
Os parâmetros observados para a análise foram: frequência e tempo de locomoção, levantar, imobilidade, self grooming e defecação.
O teste de reconhecimento de objetos foi realizado na arena de campo aberto, divididos em treinamento, teste e reteste e com objetos diferentes (A, B, C e D).No treinamento cada animal foi apresentado aos objetos A e B por 10 minutos.No teste, após 3 horas, o animal foi colocado na arena com os objetos A e C por 3 min. No reteste, após 24 horas, a rata foi colocada na arena com os objetos A e D por 3 min. Os parâmetros analisados foram: frequência e tempo de exploração em cada objeto,
self grooming e defecação.
Para a análise dos resultados foi utilizando o programa estatístico GraphPad Prism 5.00® (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA), com o auxílio do teste T de student, ANOVA de Duas Vias seguida pelo teste de Bonferroni, considerando p<0,05 com média erro padrão.
6. RESULTADOS
No início do tratamento, todos os animais apresentavam peso corporal semelhante, mas ao longo do tempo há um acréscimo no peso corporal do grupo experimental (Fig.1). Peso Corporal 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 Grupo Controle Grupo Experimental Semanas * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * P e s o c or pora l (g )
Figura 1. Determinação do peso corporal dos animais Grupo Controle e animais expostos Grupo Experimental, em gramas, ao longo das semanas de tratamento. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=6 animais nos grupos cotrole e experimental. ANOVA de Duas Vias, seguida pelo teste de Bonferroni (*p<0,0001, em relação ao grupo controle). Sendo *tratamento Df(1/330)=p<0,0001, *semanas Df(33/330)=p<0,0001, *interação Df(33/330)=p<0,0001.
Observa-se uma diferença com relação ao ganho de peso corporal no grupo experimental pela análise do delta (Fig.2).
Delta Peso Corporal
0 100 200 300 Grupo Experimental Grupo Controle *** P e s o Co rp o ra l (g )
Figura 2. Determinação do ganho de peso corporal, em gramas, ao final do tratamento, em animais do grupo controle e animais experimental. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=6 animais nos grupos cotrole e experimental. Teste T. Para grupo experimental *p=0,001 Df(11,8/5)=0,01.
Com relação ao consumo alimentar dos grupos, o controle consome uma quantidade de ração maior que o experimental. No entanto, temos um maior consumo calórico por meio dos animais do grupo experimental (Fig. 3).
O GTT apresentou glicemia de jejum similar, sendo que 30 minutos após a aplicação da glicose, o grupo experimental mostrou maior dificuldade em absorvê-la. No momento de 120 minutos os níveis se igualaram (Fig.4). A área sob a curva mostrou diferença mais expressiva nos níveis glicêmicos entre os grupos (Fig. 5).
Por meio da medida do colesterol e dos triglicérides plasmáticos, foi possível observar aumento de triglicerídeos no grupo experimental, o que pode indicar alterações no metabolismo energético, e nos leva a hipótese de que esses animais possam apresentar algum comprometimento hepático (Fig.6).
0 20 40 60 80 100 * Grupo Controle Grupo Experimental Co n s u m o d e Ra ç ã o ( g ) 0 200 400 600 In g e s tã o c a ló ri c a ( C a l)
Figura 3. Determinação da média de consumo alimentar diário e média de ingestão calórica diária, em gramas, em animais do grupo controle, tratados com dieta padrão e animais experimental, tratados com dieta hiperlipídica. Os dados estão representados com média ± erro padrão. N= 6 animais no grupo controle e experimental.Teste T. Para consumo alimentar diário *p=0,01 Df(7,5/5)=0,04. Para ingestão calórica diária p=0,10 Df(2,3/5)=0,37. 0 30 60 90 120 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Dieta Controle Dieta Hipercalórica Curva glicêmica * * * Tempo (minutos) Gl ic e m ia ( m g /d l)
Figura 4. Variação da glicemia em mg/dL, avaliados pelo Teste de Tolerância a glicose, em animais do grupo controle, tratados com dieta padrão e animais experimental, tratados com dieta hiperlipídica. Os dados estão representados com média ± erro padrão. N= 6 animais no grupo controle e experimental. Teste T. Para tempo de 0’ p=0,07 Df(1,97/5)=0,47. Para tempo de 30’ *p=0,0001 Df(1,17/5)=0,85. Para tempo de 60’ *p<0,0001 Df(4,13/5)=0,14. Para tempo de 90’ *p=0,0009 Df(4,09/5)=0,14. Para tempo de 120’ p=0,94 Df(5,68/5)=0,07.
1 0 10000 20000 30000 40000 Grupo Experimental Grupo Controle *** Á re a ( u .a )
Figura 5. Determinação da área sob a curva do gráfico de GTT, de animais do grupo controle, tratados com dieta padrão e animais do grupo experimental, tratados com dieta hiperlipídica. Os dados estão representados com média ± erro padrão. N= 6 animais no grupo controle e experimental. Teste T. Sendo *p<0,0001 Df(3,07/5)=0,24.
Figura 6. Determinação dos níveis do colesterol e triglicérides plasmáticos, em mg/dL, de animais do grupo controle, tratados com dieta controle e animais do grupo experimental, tratados com dieta hiperlipídica. Os dados estão representados com média ± erro padrão. N= 6 animais no grupo controle e experimental. Teste T. Sendo p=0,05 Df(1,21/5)=0,83 para o teste de colesterol e este T, sendo *p=0,02 Df(1,10/5)=0,91 para o teste de triglicérides.
No campo aberto, o grupo experimental apresentou uma tendência menor a explorar a região central do aparato, sugerindo comportamento ansioso ao refugiar-se na periferia (Fig. 7). Os dados obtidos quanto a mobilidade e comportamento de
self grooming confirmam a hipótese de que além de ansiosos esses animais possam
estar deprimidos (Fig. 8 e 9).
Frequência na periferia 0 20 40 60 80 Controle Experimental F re q u ê n c ia Frequência no centro 0 2 4 6 8 F re q u ê n c ia
Figura 7. Frequência na periferia e no centro avaliadas em campo aberto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. Teste T. Para frequência na periferia p=0,17 Df(1,63/4)=0,65. Para frequência no centro p=0,59 Df(1,40/5)=0,70.
O teste reconhecimento de objetos há diferença nos parâmetros frequência e tempo nos objetos com relação ao tratamento, mas não houve entre objetos, assim como não houve interação entre os fatores (Fig 10.)
No entanto, no re-teste, o grupo experimental apresentou menor interação com os objetos e uma tendência a permanecer menos tempo imóveis, indo ao encontro com os resultados obtidos no teste de campo aberto, considerando que em ambos os testes os animais apresentaram-se desmotivados e desinteressados, características comuns em quadros ansiosos e depressivos (Fig.11).
Frequencia de levantar 1 0 10 20 30 40 Grupo Controle Grupo Experimental F re q u ê n c ia Tempo de levantar 1 0 50 100 150 S e g u n d o s
Figura 8. Frequência e tempo de levantar avaliada em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. Teste T. Para frequência p=0,13 Df (19,20/4)=0,13, para tempo p=0,10 Df (1,4/4)=0,1. Tempo de imobilidade 0 50 100 150 200 250 Controle Experimental Grupos S e g u n d o s Defecação 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Grupos F re q u ê n c ia Self grooming 0 5 10 15 * Grupos F re q u ê n c ia
Figura 9. Tempo de imobilidade, defecação, self grooming avaliados em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão . São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. Teste T. Para imobilidade p=0,33 Df (1,6/4)=0,66, para defecação p=0,56 Df (5,2/5)=0,56 e para self grooming *p=0,01 Df (11,7/5)=0,01.
Frequência nos objetos no Treinamento Obj eto A Obj eto B Obj eto A Obj eto B 0 5 10 Grupo Controle Grupo Experimental * F re q u ê n c ia
Frequência nos objetos 3 horas depois
Obj eto A Obj eto C Obj eto A Obj eto C 0 5 10 F re q u ê n c ia
Frequência nos objetos 24 horas depois
Obj eto A Obj eto D Obj eto A Obj eto D 0 5 10 * * F re q u ê n c ia
Figura 10. Frequência de reconhecimento de objetos em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão . São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni (*p<0,001, em relação ao grupo controle). Para o treinamento: *tratamento (F(1/18)=72,50, *p<0,0001), objetos (F(1/18)=2,30, p=0,35), interação (F(1/18)=0,10, p=0,84). Para 3 horas depois: tratamento (F(1/18)=0,18, p=0,83), *objetos (F(1/18)=27,78, *p=0,01), interação (F(1/18)=1,12, p=0,59). Para 24 horas depois: *tratamento (F(1/18)=72,50, *p<0,0001), objetos (F(1/18)=0,08, p=0,80), interação (F(1/18)=2,40, p=0,20).
Tempo nos objetos no Treinamento
Obj eto A Obj eto B Obj eto A Obj eto B 0 10 20 30 Grupo Controle Grupo Experimental S e g u n d o s
Tempo nos objetos 3 horas depois
Obj eto A Obj eto C Obj eto A Obj eto C 0 10 20 30 * * S e g u n d o s
Tempo nos objetos 24 horas depois
Obj eto A Obj eto D Obj eto A Obj eto D 0 10 20 30 * * S e g u n d o s
Figura 11. Tempo de reconhecimento de objetos em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni (*p<0,001, em relação ao grupo controle). Para o treinamento: *tratamento (F(1/18)=21,80 *p=0,01), objetos (F(1/18)=13,81, p=0,05), interação (F(1/18)=7,19, p=0,14). Para 3 horas depois: tratamento, *objetos (F(1/18)=51,51, *p<0,0001), *interação (F(1/18)=23,04, *p=0,0008). Para 24 horas depois: *tratamento (F(1/18)=70,78, *p<0,0001), *objetos (F(1/18)=14,30, p=0,0003), interação (F(1/18)=2,42, p=0,07).
De acordo com os resultados obtidos no treinamento, não houve diferenças entres os grupos, mas 3 horas depois, o grupo experimental mostrou uma tendência de explorar verticalmente o ambiente. Porém, 24 horas depois tal comportamento não se manteve (Fig. 12).
Podemos notar que ao longo dos dias, o grupo experimental diminuiu seu tempo de imobilidade gradualmente. Para a frequência de defecação houve diferença estatística significante com relação ao tratamento, mas não houve diferença estatística entre os dias. Para a frequência de self grooming, houve diferença estatística significante com relação ao tratamento, mas não houve diferença estatística entre os dias, assim como não houve interação entre os fatores (Fig.13).
Frequência de levantar Treinamento 3 horas24 horas Treinamento 3 horas24 horas 0 5 10 15 20 25 Grupo Controle Grupo Experimental * Fr e q u ê n c ia Tempo de levantar Tre inam ent o 3 horas24 horas Tre inam ent o 3 horas24 horas 0 20 40 60 80 * * S e g u n d o s
Figura 12. Levantar avaliado em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão . São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni (*P<0,001, em relação ao grupo controle). Para frequência: tratamento (F(1/27)=5,43, *p=0,02), dias (F(2/27)=28,34, *p<0,0001), *interação (F(2/27)=39,83, *p<0,0001). Para tempo: tratamento (F(1/27)= 0,37, *dias (F(2/27)= 0,02, *interação (F(2/27)= 0,022.
Tempo de Imobilidade Trein amen to 3 hor as 24 h oras Trein amen to 3 hor as 24 h oras 0 20 40 60 80 100 Grupo Controle Grupo Experimental * * S e g u n d o s Defecação Trein am ento 3 h oras 24 h oras Trein am ento 3 h oras 24 h oras 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 F re q u ê n c ia Self grooming Trei nament o 3 hora s 24 ho ras Trei nament o 3 hora s 24 ho ras 0 1 2 3 4 F re q u ê n c ia
Figura 13. Imobilidade, defecação e Self grooming avaliados em campo aberto, para ratas tratadas com dieta hiperlipídica ou dieta padrão. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão, N=5 animais grupo no controle e N=6 animais no grupo experimental. ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni (*p<0,001, em relação ao grupo controle). Para a imobilidade: *tratamento (F(1/27)=9,14 *p=0,004), *dias (F(2/27)=41,44, *p<0,0001), *interação (F(2/27)=24,27, *p=0,0001). Para defecação: *tratamento (F(1/27)=12,40, *p=0,04), dias (F(2/27)=4,93, p=0,43), interação (F(2/27)=4,93, p=0,43). Para Self grooming: *tratamento (F(1/27)=13,80, *p=0,04), dias (F(2/27)=3,48, p=0,56), interação (F(2/27)=1,17, p=0,82).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Além das alterações metabólicas a obesidade está associada com estados cognitivos e emocionais adversos, sendo que no presente estudo, a realização do teste de campo aberto mostrou que os animais tratados com dieta hipercalórica apresentam maior tempo de imobilidade, aparentando ter menor interesse na exploração do ambiente, o que pode indicar, de modo geral, que esses animais tenham desenvolvido um quadro ansioso associado à obesidade.
No entanto, não é possível concluir se ratas obesas são necessariamente ansiosas, pois apesar de possuírem comportamento ansioso em algumas situações, divergem tal comportamento em outros aspectos, como o exemplo clássico de defecação ser um indicativo de estresse e ansiedade.
Desse modo, considera-se necessário realizar mais testes comportamentais, assim como análise biomolecular e histológica, com o intuito de determinar com maior precisão as condições comportamentais e fisiológicas desses animais.
8. FONTES CONSULTADAS
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GOULARTE, F. J., FERREIRA, M. B. C., SANVITTO, G. L. Effects of food pattern change and physical exercise on cafeteria diet-induced obesity in female rats. British
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Arquivos brasileiros de Endocrinologia e Metabologia. 56/6. p. 341-350. 2012.
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