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CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA
PREPARAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS FLUORADAS PARA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA.
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA
PREPARAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS FLUORADAS PARA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA ÀREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM.
__________________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
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Dedico esse trabalho aos meus pais, Benigno e Terezinha, que muito contribuíram para meu sucesso. Também dedico aos meus irmãos Honorio e Daniel. Por fim, dedico a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para este trabalho.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e aos meus irmãos, pelo apoio e incentivo nessa jornada.
À professora Isabel Jardim, pela paciência dedicação e exemplo de profissional.
À banca, professores: Fabio Augusto, Sônia de Queiroz, Rosely Barboza e Carol Collins.
Aos meus amigos, Jude, Lorruama, Pedro, Gizelle, Camila, Thaty, Marllon, Roberto e Danila, pela imensa amizade.
Aos meus familiares, em especial, Bárbara, Marlene, Márcia, Maria, Marília, Mariana, Ildene, Rosilene, Marilene, pelo apoio e incentivo.
Aos amigos que fiz em Campinas, Luana, Renata, Elisa, Carla, Gisele, Pedro, Ligia, Marcelo, Rômulo, Sol e Marcos.
Aos amigos do LabCrom, Luana, Elisa, Karen, Renata N., Renata M., Karen, Carla, Daniele, Cristiane,Fernanda, Lucília, Marcelo e
Elias.
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CURRICULUM VITAE
FORMAÇÃO ACADÊMICA
2008-2012 – Licenciatura Plena em Química, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina, Petrolina-PE.
ATIVIDADES PROFISSIONAIS
2011 - Monitor de físico-química, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina.
2009 – 2010 - Estágio, Embrapa Semiárido, Petronila-PE.
INDICADORES DE PRODUÇÃO CIENTÍFICA
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Resumo
Preparação de Fases Estacionárias Fluoradas para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa
Neste trabalho, prepararam-se fases estacionárias (FE) fluoradas capeadas para utilização em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (CLAE-FR). A preparação da FE consistiu na sorção do polímero poli(metil-3,3,3-trifluorproprilsiloxano) (PMTFS) sobre sílica, tipo B, com tamanho de partícula de 5 μm, seguido de imobilização térmica a 226 o
C, por 12 horas e extração com diclorometano, a fim de eliminar o polímero não aderido ao suporte. A FE imobilizada, Si(PMTFS), foi submetida à reação de capeamento com trimetilclorossilano e hexametildissilaxano, para a redução dos grupos silanóis que não foram recobertos pelo polímero. Testes físico-químicos e cromatográficos comprovaram a eficiência da imobilização do polímero e do capeamento. O desempenho cromatográfico da FE fluorada capeada, Si(PMTFS)ec, foi superior ao da não capeada e os testes de Tanaka e colaboradores demonstraram que o capeamento diminuiu a atividade silanofílica da FE e aumentou a sua hidrofobicidade. A FE Si(PMTFS)ec apresentou o mecanismo "U-shape", pois se observou o aumento da retenção de compostos básicos e polares em altas porcentagens do modificador orgânico na fase móvel. As FE de Si(PMTFS)ec apresentaram estabilidade química superior às FE não capeadas, porém, elas mostraram-se mais instáveis que as FE C8, C18 preparadas no grupo. Embora a estabilidade química à fase móvel em meio básica seja uma desvantagem, a mesma possui o mecanismo "U-shape" que pode ser utilizado para aumentar a retenção dos compostos básicos, sem o uso de condições drásticas de pH, além de ser uma FE mais apropriada quando se emprega o espectrômetro de massas, pois a alta concentração de solvente orgânico na fase móvel melhora a ionização dos analitos, aumentando as suas detectabilidades. A FE Si(PMTFS)ec constitui em uma alternativa bem sucedida para emprego em CLAE-FR, devido a sua capacidade em separar vários tipos de compostos.
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Abstract
Preparation of a Fluorinated Stationary Phases for Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography
In this work, end-capped fluorinated stationary phases (SP) for use in High-Performance Liquid Chromatography on Reversed Phase (RP-HPLC) were prepared. The preparation of the SP consisted in the sorption of the polymer poly(methyl-3,3,3-trifluorproprilsiloxane) (PMTFS) onto type B silica, with particle size of 5 µm, followed by thermal immobilization at 226 °C for 12 h and extraction with dichloromethane to eliminate the polymer that had not interacted with the support. The immobilized SP, Si (PMTFS), was subjected to an end-capping reaction to reduce the silanol groups that were not covered by the polymer. Physical-chemical and chromatographic tests were conducted to evaluate the efficiency of the immobilization of the polymer and of the end-capping reaction. The chromatographic performance of the end-capped fluorinated SP, Si (PMTFS)ec, was greater than that of the non-end-capped phase. The Tanaka tests showed a decrease in silanophilic activity and an increase in hydrophobicity. The Si (PMTFS)ec SP showed a U-shaped mechanism, because of the observed increase in retention of basic compounds at high percentages of the organic component in the mobile phase. The Si (PMTFS)ec SP showed superior chemical stability to non-end-capped SP, however, less stability than C8 and C-18 SP also prepared by the group. Although chemical stability in alkaline mobile phase is a disadvantage, it has a "U-shape" mechanism that can be used to increase the retention of basic compounds without the use of drastic conditions of pH, and is more appropriate for use with a mass spectrometer. Due to the high concentrations of organic solvent in the mobile phase the ionization of the analytes is better, increasing the detectability. The Si (PMTFS)ec SP can be used in RP-HPLC due to its ability to separate various types of compounds.
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Sumário
Lista de Tabelas ... xxi
Lista de Figuras ... xxiii
1 Introdução ... 1
1.1 Fases Estacionárias para Cromatografia Líquida ... 2
1.2 Sílica ... 2
1.3 Fases Estacionárias Quimicamente Ligadas ... 3
1.3.1 Sílica Híbrida ... 5
1.3.2 Óxidos Mistos ... 6
1.3.3 Capeamento ... 6
1.3.4 Fases Poliméricas ... 6
1.3.5 Fases Estericamente Protegidas ... 7
1.3.6 Fases Estacionárias com Grupos Polares Embutidos ... 8
1.3.7 Fases Estacionárias Bidentadas... 9
1.4 Fases Estacionárias com Polímeros Sorvidos ou Imobilizados ... 10
1.5 Fases Estacionárias Fluoradas ... 11
1.5.1 Cromatografia De Fluido Supercrítico ... 15
1.5.2 Cromatografia Líquida Eletrocinética Micelar ... 15
1.5.3 Cromatografia de Íons ... 16
1.5.4 Cromatografia Líquida Acoplada À Espectrometria De Massas ... 16
1.6 Avaliação Cromatográfica das Colunas ... 18
2 Objetivo ... 19
2.1 Objetivos Específicos: ... 19
3 Parte Experimental ... 21
3.1 Reagentes ... 21
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3.3 Coluna cromatográfica comercial ... 24
3.4 Suporte Cromatográfico ... 24
3.5 Fase Estacionária Líquida ... 25
3.6 Colunas Cromatográficas ... 25
3.7 Polimento das colunas ... 27
3.8 Preparo das Fases Estacionárias ... 27
3.8.1 Sorção da Fase Líquida ao Suporte ... 28
3.8.2 Imobilização por Tratamento Térmico ... 28
3.8.3 Extração do Polímero não Imobilizado ... 29
3.8.4 Capeamento ... 30
3.9 Caracterização Físico-Química das Fases Estacionárias ... 32
3.9.1 Análise Elementar ... 32
3.9.2 Área Superficial Específica, Volume Específico e Diâmetro de Poros 34 3.9.3 Espectrometria de Absorção no Infravermelho ... 34
3.9.4 Ressonância Magnética Nuclear de Silício 29 (29Si) ... 35
3.10 Enchimento da Coluna ... 35
3.10.1 Recheio das colunas com a fase estacionária ... 36
3.11 Preparo das Fases Móveis ... 38
3.12 Condicionamento das colunas ... 39
3.13 Avaliação Cromatográfica das Fases Estacionária ... 40
3.13.1 Mistura teste de Tanaka70 ... 41
3.14 Influência da Concentração do Solvente Orgânico na Fase Móvel ... 44
3.15 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária ... 46
3.15.1 Separação de Composto Fluorados ... 47
3.15.2 Separação de agrotóxicos ... 48
3.15.3 Separação de Fármacos ... 49
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4 Resultados e Discussão ... 53
4.1 Caracterização Físico-Química ... 53
4.1.1 Espectroscopia de absorção no infravermelho ... 53
4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear de Sílicio 29 ... 54
4.1.3 Determinação da área superficial, volume e diâmetro de poros ... 58
4.1.4 Análise Elementar ... 59
4.2 Caracterização Cromatográfica ... 60
4.2.1 Otimização da composição da fase móvel e da vazão de análise. .... 60
4.2.2 Análise da Mistura Teste 1 e 2 ... 62
4.2.3 Misturas teste de Tanaka ... 65
4.3 Influência da Concentração de Solvente Orgânico na Fase móvel ... 71
4.4 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária Fluorada ... 76
4.4.1 Compostos Fluorados ... 76
4.4.2 Separação de Agrotóxicos ... 78
4.4.3 Separação de Fármacos ... 79
4.5 Avaliação da Estabilidade Química da FE Si(PMTFS)ec ... 81
5 Conclusão ... 85
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Lista de Tabelas
Tabela 1 - Algumas fases estacionárias fluoradas comerciais. (Adaptado da
referência 55) ... 13 Tabela 2-Características da sílica nua e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ... 58 Tabela 3- Análise elementar das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec ... 59 Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos obtidos na avaliação da FE Si(PMTFS)ec, utilizando diferentes composições de fase móvel MeOH:H2O. ... 61 Tabela 5 - Parâmetros cromatográficos para os compostos presentes na MT1, usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ... 63 Tabela 6 - Parâmetros cromatográficos para os compostos presentes na MT2, usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ... 64 Tabela 7 - Parâmetros obtidos através do teste Tanaka em diferentes colunas. .. 67 Tabela 8- Características físico-químicos dos fármacos estudados, fonte:
DrugBanK77. ... 72 Tabela 9- Tempo de retenção de alguns fármacos separados usando a FE
Si(PMTFS)ec e variando a porcentagem de acetonitrila de 50 a 90%, em tampão fosfato a pH 2,7 e 7,6 ... 72 Tabela 10 - Parâmetros cromatográficos obtidos na separação de agrotóxicos empregando a FE Si(PMTFS)ec. ... 79
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Lista de Figuras
Figura 1 - Tipos de grupos silanóis e ligações siloxano na superfície da sílica amorfa. ... 3 Figura 2 - Estruturas presentes em uma típica fase estacionária monomérica
ligada C8 e capeada com o grupo trimetilsilano. (Adaptado da referência 5) ... 4 Figura 3 - Ilustração da fase estacionária polimerizada verticalmente (A) e da fase estacionária polimerizada horizontalmente (B). 2 ... 7 Figura 4 - Ilustração da fase estacionária estericamente protegida.2 ... 8 Figura 5 - Ilustração da fase estacionária com grupo polar embutido.2 ... 9 Figura 6 - Ilustração da fase estacionária bidentada.2 ... 9 Figura 7 - Retenção "U-shape" de compostos básicos em fases estacionárias fluoradas. Adaptado da referência 55 *Conteúdo orgânico da FM ... 14 Figura 8 - Estrutura química do polímero poli(metil-3,3,3-trifluropropilsiloxano). .. 25 Figura 9 - Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada no estudo (a) porcas terminais; (b) redutor de volume; (c) manga com filtro; (d) corpo da coluna. ... 26 Figura 10 - Representação esquemática do sistema de polimento desenvolvido no LabCrom... 27 Figura 11 - Representação esquemática do sistema de imobilização térmica para a FE. ... 29 Figura 12- Representação esquemática do sistema de extração do excesso de polímero imobilizado. ... 30 Figura 13 - Sistema para a reação de capeamento da FE Si(PMTFS). ... 31 Figura 15 - Representação esquemática do sistema de enchimento de coluna. .. 36 Figura 16 - Estruturas químicas dos compostos presentes na MT1. ... 40 Figura 17 - Estruturas químicas dos compostos presentes na MT2. ... 41 Figura 18 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura A de Tanaka. ... 42
xxiv
Figura 19 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Misutra B de Tanaka. ... 43 Figura 20 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura teste C e D de Tanaka. ... 44 Figura 21 - Estruturas químicas dos compostos estudados para verificar o
mecanismo "U-shape" na FE Si(PMTFS)ec. ... 46 Figura 22- Estrutura química dos compostos fluorados estudados. ... 48 Figura 23 - Estruturas químicas dos agrotóxicos estudados. ... 49 Figura 24 - Estruturas químicas dos fármacos estudados. ... 50 Figura 25 - Espectros de absorção na região do infravermelho da sílica pura (SiO2) e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ... 54 Figura 26 - Nomenclatura e deslocamentos químicos das espécies de silício por RMN de 29Si. ... 55 Figura 27 - Espectros de RMN de 29Si para a sílica pura e para as fases
estacionárias Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ... 57 Figura 28 - Representação da curva de van Deemter, para a fase estacionária Si(PMTFS)ec. ... 62 Figura 29 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste A de Tanaka usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:H2O 80:20 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1 - uracila, 2- o-terfenil, 3 - trifenileno, 4 -butilbenzeno, 5 - pentilbenzeno. ... 66 Figura 30 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste B de Tanaka, usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:H2O 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos : 1 - uracila, 2 - fenol, 3 - cafeína. ... 68 Figura 31 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste C (pH 2,7) de Tanaka, usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mmol L-1 KH2PO4/H3PO4 30:70 (v/v); vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C.
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Figura 32 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste D (pH 7,6) de Tanaka para as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições
Cromatográficas:volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mM
KH2PO4/K2HPO4 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1 - uracila, 2 - fenol, 3 -
benzilamina. ... 70 Figura 33 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos, levofloxacina, bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 2,7 ... 73 Figura 34 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos, levofloxacina, bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 7,6 ... 74 Figura 35 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina, nortriptilina e fluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 2,7 ... 75 Figura 36 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina, nortriptilina e fluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 7,6 ... 76 Figura 37 – Cromatogramas obtidos nas separações de difluorfenóis utilizando colunas diferentes: A) coluna de dimensões (60 mm x 3,1 mm d.i) recheada com a FE Si(PMTFS) adaptado da referência 49; B) coluna de dimensões (60 mm x 3,9 mm d.i) recheada com a FE Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: fase móvel: A) ACN:H2O 20:80 (v/v) B) MeOH:H2O 35:65 (v/v), volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL min-1, temperatura ambiente e detecção UV: 254 nm.
Identificação dos picos: 1 - 2,6-difluorfenol, 2 - 2,4-difluorfenol, 3 - 2,3-difluorfenol, 4 - 3,4-difluorfenol, 5 - 3,5-difluorfenol, *- impureza. ... 77 Figura 38 - Cromatogramas obtidos nas separações de agrotóxicos usando
colunas diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60 mm x 3,9 mm d.i) e B) C18 Nova Pak (150 mm x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas: fase móvel: MeOH:H2O 45:55 v/v, volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura ambiente. Identificação dos picos: 1- imazaquim, 2-carboxim, 3- atrazina, 4-diurom, 5- linurom. ... 78 Figura 39 - Cromatogramas obtidos na separação de uma mistura de fármacos usando colunas diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60 mm x 3,9 mm d.i) e B) C18 Nova Pak (150 mm x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas: fase móvel MeOH:tampão formiato pH=3,0 55:45(v/v), volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300
xxvi
mL min-1 , detecção UV: 254 nm e temperatura ambiente. Identificação dos picos: 1 - bromazepam, 2 - alprozalam, 3 - lorazepam, 4 - diazepam. ... 80 Figura 40 - Variação da porcentagem de eficiência do acenafteno obtida para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1 K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1, temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm. ... 82 Figura 41 - Variação do fator de retenção (k) do acenafteno obtido para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1
K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm. ... 83 Figura 42 - Variação do fator de assimetria (As10%) do acenafteno obtido para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1
K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm. ... 84
1
1 Introdução
As fases estacionárias (FE) para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em sua maioria, consistem de um suporte sólido, no qual se deposita um líquido estacionário. Dependendo da polaridade do líquido estacionário, polar ou apolar, têm-se, respectivamente, as FE normal e reversa. As colunas recheadas com FE reversas são mais vantajosas, pois requerem o uso de fase móvel (FM) menos tóxica e de menor custo, constituídas de uma mistura de solvente orgânico e água, essas FE estabelecem um rápido equilíbrio químico após a mudança de solvente, apresentam boa reprodutibilidade de tempo de retenção, possibilitam o uso de eluição por gradiente, além de oferecerem uma série de colunas com diversas seletividades. 1,2
A cromatografia líquida que utiliza colunas recheadas com fase estacionária reversa é denominada de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) e é considerada, entre as técnicas de separação, uma das mais importantes, principalmente, para identificação e quantificação de compostos em diversos tipos de amostras. A aplicação da CLAE-FR tem crescido de forma contínua, nas seguintes áreas: indústria farmacêutica, medicina, alimentos, polímeros sintéticos, meio ambiente, etc. 1,2
Cerca de 70% dos fármacos disponíveis no mercado apresentam caráter básico e, comumente, são analisados porCLAE-FR. No entanto, alguns problemas ocorrem na separação desses compostos que estão associados com a superfície da FE. Na maioria das vezes, a FE em CLAE-FR é obtida através da modificação da superfície da sílica com moléculas apolares por meio de uma reação química, originando as fases estacionárias quimicamente ligadas (FEQL). No entanto, somente 50% dos grupos reativos da sílica podem ser funcionalizados. Esses grupos apresentam caráter ácido, o que leva os compostosbásicosa interagiremfortemente por forças eletrostáticas, ocasionando picos largos e com
2
cauda. Em casos extremos, essa interação pode ser irreversível, acarretando a deterioração da coluna.1–5
Diante dessa problemática, pesquisas no desenvolvimento de novas FE são impulsionadas para remediar as desvantagens relacionadas às FE para CLAE-FR.
1.1 Fases Estacionáriaspara Cromatografia Líquida
Durante muitas décadas, a cromatografia líquida foi praticada utilizando fases estacionárias mais polares e fases móveis menos polares, ou seja, a cromatografia líquida por adsorção. Contudo, para separação de compostos de média polaridade a apolares foi necessário o uso de fases estacionárias menos polares e fases móveis mais polares, o que levou ao desenvolvimento da cromatografia líquida de partição (líquido-líquido), na qual a FE é constituída de um suporte sólido recoberto fisicamente com um filme líquido, apolar ou polar originando a FE mecanicamente sorvida.As FE mecanicamente adsorvidas mostraram-se ineficientes para o uso em CLAE, pois a FE sorvida era facilmente lixiviada com a passagem da fase móvel. Esse fato impediu a obtenção de análises reprodutíveis ou a separação de misturas complexas utilizando o modo de eluição por gradiente.Essas restrições levaram ao desenvolvimento de fases estacionárias mais estáveis, em que os grupos funcionais encontravam-se ligados covalentemente sobre o suporte cromatográfico, quegeralmente é a sílica.2,6
1.2 Sílica
A sílica é o suporte cromatográfico mais utilizando em CLAE-FR, devido às suas características favoráveis.Segundo Unger7o suporte cromatográficoideal deve apresentar as seguintes características:as partículas do suporte devem ter uma faixa estreita de distribuição de tamanho e elevada área superficial; os poros
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devem ter tamanhos adequados para o analito e também boa conectividade para permitir uma rápida taxa de transferência de massa; deve resistir termicamente, mecanicamente e quimicamente à degradação, possuir uma superfície que seja tanto energeticamente homogênea quanto quimicamente modificável e exibir o mínimo de inchaço.
A sílica reúne a maioria das características descritas anteriormente, ela é amplamente empregada, principalmente,devido a sua alta reatividade proveniente dos grupos silanóis presentes na sua superfície.8–10
A superfície da sílica consiste de uma rede de grupos silanóis, alguns dos quais podem formar grupos siloxanos ou ligações de hidrogênio entre si ou com a água. A Figura 1 apresenta os grupos funcionais presentes na superfície da sílica.
Si O O O OH Isolado Si O O O OH Si O O O H Vicinal Si O O O O H H Geminal Si O O O O Si O O O Ligação siloxano
Figura 1 - Tipos de grupos silanóis e ligações siloxano na superfície da sílica amorfa.
Existem algumas restrições que a impedem de ser um suporte cromatográfico perfeito, comoa baixa estabilidade química e térmica.
1.3 Fases Estacionárias Quimicamente Ligadas
AsFEQL, geralmente, são obtidas através da reação de silanização, nesse método os reagentes silanos são ligados aos silanóis da superfície da sílica, resultando em FE com ligações do tipo siloxanos(≡Si-O-Si-C≡).11
4
O agente silano pode ser mono, bi ou trifuncional edependendo da sua funcionalidade e do método de preparação são obtidos as FE monoméricas ou poliméricas. As FE clássicas para CLAE-FR geralmente são monoméricas e para adquirir essas FE, os reagentes monofuncionais, bifuncionais ou trifuncionais são utilizados na ausência de água.12
A concentração de silanóis na superfície da sílica nua é relatada em 8,0 µmol m-2.10Durante a modificação do suporte, somente cerca de 4 a 4,5 µmol m-2 dos silanóis reagem com os grupos funcionais.Esse fatoestá associado ao tamanho dos grupos modificadores que sofrem impedimento estérico (Figura2).13
Figura 2-Estruturas presentes em uma típica fase estacionária monomérica ligada C8 e
capeada com o grupo trimetilsilano.(Adaptado da referência 5)
Os grupos silanóis que não reagiram durante a funcionalização do suporte, denominados de silanóis residuais, interagem fortemente com os solutos básicos (atividade silanofílica) devido ao caráter ácido da sílica, segundo a reação química:
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Essa interação interfere na retenção dos compostos básicos, além de gerar picos largos e com caudas.14 Uma forma de impedir a retenção dos compostos básicos (BH+) é através da manipulação de pH do componente aquoso da FM, que controla a ionização da sílica e do analito.
O pKa médio dos grupos silanóis é ao redor de 7, a supressão iônica dos silanóis e a dissociação deles podem ser controladas utilizando tampões inorgânicos ou orgânicos. A faixa de pH segura para trabalhoé entre 2,5 a 7,5 para colunas típicas de CLAE-FR. Abaixo de pH 2, há a hidrólise da ligação Si-C, ocorrendo a clivagem da fase orgânica ancorada sobre suporte cromatográfico. Acima de pH 8, a dissolução da sílica é acelerada, resultando na perda do suporte. 1,2,6,11
Para contornar o problema dos silanóis residuais e a baixa estabilidade química da sílica, algumas sugestões são apresentadas, como o uso de partículas híbridas e óxidos mistos que conferem ao suporte cromatográfico maior resistência química, o uso de algumas alternativas para preparação de FE a fim de aumentar a estabilidade e/ou reduzir a interação analito-silanol. Essas propostas serão descritas a seguir.
1.3.1 Sílica Híbrida
A sílica híbrida, como próprio nome sugere, reúne em um único material,as características favoráveis de dois materiais. Essa partícula contém grupos metil e etileno incorporados na estrutura da sílica. A presença desses grupos confere maior estabilidade química e redução das interações indesejáveis com os silanóis residuais. No entanto, a diminuição dos grupos silanóis sobre a superfície da sílica indica que há uma menor quantidade de grupos reativos responsáveis pelo ancoramento dos grupos funcionais, resultando em uma menor densidade de grupos orgânicos substituintes. 8,15,16,17
6
1.3.2 Óxidos Mistos
Nesses suportes cromatográficos, tem-se a combinação das propriedades ótimas da sílica, como alta área superficial, faixa estreita de distribuição de partículas e tamanho de poro adequado, com a alta estabilidade química e térmica dos óxidos metálicos. As FE desenvolvidas sobre sílica metalizadas apresentam estabilidade química superior às obtidas sobre sílica nua. No entanto, é valido destacar que a introdução de metais no suporte aumenta seu caráter ácido, promovendo maior interação com compostos básicos.2,18–24
1.3.3 Capeamento
É uma etapa subsequente ao processo de funcionalização da sílica. Consiste na inserção de grupos menores como o trimetilsilano, utilizando reagentes apropriados, como o trimetilclorossilano (TMCS) e/ou o hexametildissilazano (HMDS). Através desse procedimento ocorre a redução dos grupos silanóis residuais, aumentando o tempo de vida da FE e melhorando seu desempenho cromatográfico. No entanto, parte dos silanóis residuais permanece sem reagir.24–26
1.3.4 Fases Poliméricas
Uma alternativa para a preparação das fases estacionárias é a polimerização vertical (Figura 3A), que consiste na ligação química de um agente silano bifuncional (ou trifuncional) com os grupos silanóis na presença de água. Essas FE apresentam alta resistência em meio ácido e básico. Contudo, a presença de água leva a uma reação de entrecruzamento incontrolável, o que
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confere pouca reprodutibilidade no preparo da FE. Para melhorar a reprodutibilidade das fases poliméricas, as fases estacionárias com polimerização horizontal foram desenvolvidas (Figura 3B). O método consiste em ligar sobre as partículas de sílica uma monocamada auto-organizada de agentes silanos trifuncionais de cadeia longas (C8, C18) e curtas (C1). Através desse método se obtem uma FE de alta estabilidade química. No entanto, não há dados na literatura relativos à sua reprodutibilidade. 2,6,27
(A) (B)
Figura 3 - Ilustração da fase estacionária polimerizada verticalmente (A) e da fase
estacionária polimerizada horizontalmente (B). 2
1.3.5 Fases Estericamente Protegidas
Nas fases estacionárias estericamente protegidas (Figura 4), o agente silano contém um grupo alquil de cadeia longa (C8,C18) e dois grupos volumosos (isopropil ou terc-butil). Esses grupos volumososimpedem o acesso de analitos básico aos grupos silanóis. Todavia, a presença de grupos volumosos dos agentes silanos prejudica a formação de uma cobertura densa sobre o suporte, sendo esse recobrimento inferior às FEQL convencionais.28,29
8
Figura 4 - Ilustração da fase estacionária estericamente protegida.2
1.3.6 Fases Estacionárias com Grupos Polares Embutidos
Neste tipo de fase estacionária (Figura 5), o agentealquilsilano apresenta um grupo polar embutido (GPE), como amida, carbamato, uréia, tiocarbamato, inserido no terceiro grupo metila da cadeia alquila.Esse tipo de FE mantém o caráter de FE em modo reverso, mas apresenta seletividade diferenciada àquelas FE puramente alifáticas, além de diminuir a interação analito-silanol.
Basicamente quatro mecanismos são propostos para explicar a baixa interação entre os solutos básicos e os silanóis residuais: há uma interação preferencial dos analitos com os GPE; os silanóis residuais e o GPE interagem por ligação de hidrogênio, bloqueando o acesso do composto aos grupos silanóis residuais; forma-se uma camada de água sobre a superfície do GPE, em que o analito, preferencialmente, interage com “FE encharcada”e, ocorre interação, por ligação de hidrogênio, entre os GPE de cadeias adjacentes, blindando o acessodos analitos aos grupos silanóis.2,26,28
9
Figura 5 - Ilustração da fase estacionária com grupo polar embutido.2
1.3.7 Fases Estacionárias Bidentadas
São usualmente preparadas através de uma reação química em que dois grupos silanóis são ligados a um agente silano que contém dois grupos C18 ligados a dois átomos de silício separados por um grupo propil (Figura 6). Esse tipo de fase restringe o acesso de solutos básicos aos grupos silanóis, além de aumentar sua estabilidade química, permitindo o uso de fase móvel a pH 11. Entretanto, esse tipo de fase ligada com grupos volumosos, apresenta baixo recobrimento da camada orgânica decorrente do impedimento estérico.2,28–30
10
De um modo geral, muitas das propostas apresentadas anteriormente ainda apresentaram baixo recobrimento do silanóis residuais.
1.4 Fases Estacionárias com Polímeros Sorvidos ou Imobilizados
Uma alternativa para se obterfases estacionárias para CLAE-FR é através do recobrimento da superfície da sílica com polímeros orgânicos pré-sintetizados sobre a superfície da sílica.31–33Esse método demonstra-se atrativo, devido à suas inúmeras vantagens em relação as FE convencionais, como:2,34
Melhora a proteção dos silanóis residuais ou sítios ácidos de Lewis (presentes em suportes baseados em sílica, zircônia, titânia ou alumina); Minimização das interações por troca iônica com alguns solutos;
Proteção mais eficiente do suporte frente à fase móvel em meio básico; Fácil preparação;
Há uma variedade de polímeros com distintas seletividades para as diversas modalidades da cromatografia (fase reversa, troca iônica, quiral,fase normal, exclusão por tamanho, afinidade e cromatografia de interação hidrofílica).
As FE com determinado polímero imobilizado sobre um suporte cromatográfico são, normalmente, preparadas de duas formas: através da sorção/imobilização do polímero pré-sintetizado ou pela polimerização in situ do monômero sobre o suporte.35
Como resultado desses métodos, o polímero depositado sobre a superfície da sílica pode formar uma fina camada ou/e preencher completamente o volume dos poros. Em ambos os casos, o polímero pode estar recobrindo as paredes dos
11
poros (por adsorção) sem entrecruzamento entre as cadeias do polímero ou, em condições apropriadas, a cadeia polimérica pode também formar umacamada grossa entrecruzada sem ligação química. As cadeias do polímero ainda podem se ligar quimicamente às paredes dos poros.2
O grupo de pesquisa do LabCrom, (Laboratório de Pesquisas em Cromatografia Líquida) do Instituto de Química da Unicamp, vem, há mais de 25anos,dando atenção às FE recobertas com polissiloxanos, sendo que já foram estudados vários métodos de imobilização, bem como polímeros de seletividadedistintas. Dentre os métodos de imobilização estudados têm-se: a imobilização por tratamento térmico (TT)21,24,36–38, por radiação micro-ondas (RM)37,39–41 e por radiação gama(RG)32,42–44.
Entre os polímeros estudados, têm-se o poli(metiloctilsiloxano) (PMOS)36,37,43, poli(dimetilsiloxano)(PDMS)45,46, poli(metiloctadecilsiloxano) (PMODS)45, poli(metiltetradecilsiloxano) (PMTDS)47, poli(metilfenilsiloxano) (PMPS)48,o copolímero dimetil-(48-52%)fenilmetil(52-48%)siloxano49, o poli(3,3,3-metiltrifluorpropilsiloxano) (PMTFS)50,51 e o polibutadieno (PBD)44.
Neste trabalho estudou-se a fase estacionária fluorada(PMTFS) devido às suas propriedades únicas conforme descrito a seguir. O intuito desse estudo foi aprimorar o desempenho cromatográfico da FE, bem como sua estabilidade química.
1.5 Fases Estacionárias Fluoradas
Os compostos organofluorados apresentam propriedades únicas, em virtude da presença dos átomos de flúor. Suas propriedades são governadas pela alta eletronegatividade e baixa polarizabilidade do flúor, o que confere um caráter mais iônico na ligação C-F, em baixo conteúdo de flúor na cadeia. Dessa maneira, os compostos organofluorados oferecem maior estabilidade térmica
12
equímica, além de elevada lipo e hidrofobicidade. Algumas dessas propriedades são exploradas no desenvolvimento de fases estacionárias fluoradas, uma vez que oferecem muitas vantagens comparadas às FE convencionais C8 e C18.52–54
Desde a sua introdução na década de 1980, as pesquisas com fases fluoradas foram direcionadas como alternativas de seletividade e retenção na modalidade da cromatografia em fase reversa. No mercado, já existe um número significativo de FE fluoradas disponíveis(Tabela 1).Essas fases, geralmente, contém um grupo pentafluorfenil ou uma cadeia alquila fluorada de tamanhos diferentes.55 Algumas das principais diferenças entre as fases fluoradas e não fluoradas foram observadas, como:55–63:
1. Os hidrocarbonetos apresentam baixa retenção em FE fluoradas;
2. Compostos fluorados exibem maior retenção em FE fluoradas do que em FE não fluoradas;
3. Uma mistura de compostos fluorados pode ser separada em uma fase fluorada, de acordo com o conteúdo de flúor da FE;
4. Misturas contendo compostos fluorados e não fluorados podem ser resolvidas em fase fluorada;
5. Alto conteúdo de solvente orgânico na fase móvel pode aumentar a retenção de muitos compostos polares e básicos;
6. Fases fluoradas melhoram o desempenho de muitas técnicas cromatográficas incluindo a Cromatografia de Convergência, Cromatografia Líquida Micelar, Cromatografia de Íons, Eletrocromatografia e Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas;
13
Tabela 1- Algumas fases estacionárias fluoradas comerciais. (Adaptado da referência 55)
Marca Fornecedor Fase Ligada Tamanho de Partícula
Fluorflash FTI C8F17 5
FluorSep-RP Octyl ES C8F17 5
Fluofix Wako C6F13-ramificada 5
Thermo 5 Fluophase RP/WP Thermo C6F13 5 Tridecafluoro Silicycle C6F5 3,5 FluorSep-RP Phenyl ES 3,5 Fluophase PFP Thermo 5 Discovery F5 HS Supelco 3,5 PentaFluorphenyl Silicycle FluoroSep-RP Propyl ES C3F7 5
Fluorchrom Silicycle Não especificado 3,5
As diferenças entre as FE fluoradas e não fluoradas indicam que o mecanismo de separação para as FE fluoradas não ocorre por interação simples como na modalidade em fase reversa.55Os mecanismos que regem as separações nas FE fluoradas ainda não foram claramente definidos, entretanto, muitos deles têm sido propostos e alguns serão descritos a seguir.26
Os compostos fluorados são preferencialmente retidos em colunas fluoradas, em comparação com as colunas alquila. Esse comportamento é muitas vezes atribuído à intensidade do momento dipolo da ligação C-F ou/e à baixa polarizabilidade do átomo de flúor. A seletividade das colunas fluoradas comparada com a das colunas alquila pode ser explicada, pelo menos em parte, como consequência da baixa polarizabilidade do ligante flúor. Menor polarizabilidade indica interações via forças dispersivas reduzidas, que mostra como consequênciaa baixa retenção de composto apolares e maior retenção de compostos fluorados.64
As fases fluoradas têm um perfil de retenção denominado “U-shape” (Figura 7). Na parte esquerda do gráfico os solutos básicos decrescem sua retenção como
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o aumento do conteúdo orgânico (metanol ou acetonitrila) na fase móvel, segundo comportamento típico em fase reversa. Contudo, depois do ponto mínimo do gráfico, os compostosbásicosaumentam a sua retenção com o aumento do conteúdo de solvente (80-90%) na fase móvel, fazendo com quea retenção na parte direita do gráfico seja similar a de fase normal. Esse mecanismo ainda está sob investigação. Uma possível explicação é que, quando a fase móvelpossui alta concentração de solvente orgânico, a fase estacionária fluorada torna-sesolvatada e os silanóis residuais ficam mais disponíveis para interagirem com os compostos básicos por troca iônica. Esse mecanismo mostra-se favorável quando se empregam detectores como espectrômetros de massas, pois o aumento da porcentagem de solvente orgânico na fase móvel facilita a ionização dos compostos.26
Figura 7 - Retenção "U-shape" de compostos básicos em fases estacionárias fluoradas.
Adaptado da referência 55 *Conteúdo orgânico da FM
Essa nova classe de fases estacionárias permite aplicações em outros modos da cromatografia líquida (CL), como cromatografia de fluido supercrítico, CL micelar, cromatografia de íons e CL acoplada à espectrometria de massa.
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1.5.1 Cromatografia De Fluido Supercrítico
É uma boa substituição à cromatografia líquida em fase normal, especialmente para separação de compostos polares. Essa modalidade apresenta várias vantagens em comparação ao modo normal, como, não utiliza solventes de alta toxicidade (hexano, clorofórmio, etc.), proporciona separação rápida com alta eficiência e tempo de reequilíbrio curto. O solvente usado nessa modalidade é diferente do da CL, no qual se utiliza o fluido supercrítico, um fluido denso que se situa acima da temperatura e pressão crítica e apresenta caraterísticas intermediárias entre a fase líquida e gasosa.65
Um trabalho publicado pelo grupo de Lee66demostrou a eficiência das colunas fluoradas, pois a mesma foi capaz de separar 80 componentes de uma mistura em comparação a coluna C18.
1.5.2 Cromatografia Líquida Eletrocinética Micelar
É uma excelente alternativa para cromatografia de par iônico e para solutos iônicos.67 Essa modalidade apresenta várias vantagens, incluindo separação simultânea de compostos iônicos e não iônicos com retenções reprodutíveis e previsíveis. No entanto, quando comparado com cromatográfica líquida em modo reverso, existem algumas desvantagens: (1) os compostos hidrofóbicos apresentam retenção excessiva devido ao poder de eluição fraco da fase móvel micelar quando se usam fases estacionárias com poros convencionais; (2) eficiências reduzidas, devido a baixa transferência de massa ou ao fluxo anisotrópico.
Com o usou de fases estacionárias fluoradas nesse modo, foi observado a redução do tempo de retenção de aminoácidos e de pequenos peptídeos e maior retenção de sulfonamidas.68
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1.5.3 Cromatografia de Íons
Essa técnica é utilizada para análise de componentes aniônicos e catiônicos.Ela é especialmente empregada na análise de amostras ambientais de água para determinar íons comuns como F-, Cl-, Br-, I-, NO3-, SO42- e HPO42-. Colunas C18 de modo reverso e carbono grafitizado recoberto com cetiltrimetilamônio são as principais colunas usadas para cromatografia de íons. Para análise desses ânions, muitas vezes, se utiliza um surfactante catiônico. Dessa forma, o grupo de pesquisa de Helaleh desenvolveu um método que emprega coluna C18 recoberta com um surfactante aniônico com conteúdo fluorado. Como resultado, obtive-se boa reprodutibilidade e bons limites de detecção.55
1.5.4 Cromatografia Líquida Acoplada À Espectrometria De
Massas
Nas últimas décadas, essa técnica se tornou uma ferramenta importante na análise de rotina em laboratórios de diversos campos da ciência. Na análise de compostos farmacêuticos, em que 70% dos mesmos são básicos, utilizando CL em modo reverso, ocorrem interações indesejáveis com os silanóis residuais. Para solucionar tal problema, emprega-se a supressão iônica, utilizando tampões ou aumentando o conteúdo aquoso da fase móvel para aumentar a retenção dos compostos básicos. Esses métodos nãos são compatíveis com um espectrômetro de massas, podendo danificá-lo ou diminuir o limite de detecção do mesmo. 69
A descoberta da retenção “U-shape” para compostos polares e básicos em fases estacionárias fluoradas tem sido uma solução ideal, pois a alta concentração de solvente orgânico na fase móvel, aumenta a retenção desses compostos, além de facilitar na ionização dos mesmos.55
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O grupo de pesquisa de cromatografia líquida do LabCrom, desenvolveu FE baseadas em polímeros de diferentes seletividades, inclusive polímeros fluorados, estudados por Maldaner e Jardim50,51.
O polímero utilizado no presente estudo foi o poli(metil-3,3,3-trifluorproprilsiloxano) (PMTFS), o mesmo usado no trabalho deMaldaner e Jardim50,51que empregaram o tratamento térmico (TT) e a radiação micro-ondas (RM) como procedimentos de imobilização. Para a FE Si-(PMTFS)TTas condições de imobilização otimizadas foram de 10 horas a 220 °C, enquanto que para Si(PMTFS)RM foram 50 min a 126 °C, 91,7% mais rápido. Contudo, quando se usa a potência RM, para a imobilização, é necessária uma etapa adicional de seis dias para descanso da FE pós-imobilização. Os dois modos de preparo apresentaram boas eficiências e fatores de assimetria adequados para o naftaleno, acetonafteno e N,N-dimetilanilina.
Testes cromatográficos, como o de Tanaka e colaboradores70 são usados para avaliar a hidrofobicidade da FE, a capacidade de diferenciar compostos apenas pelo seu grupo metila e sua configuração espacial, sua disposição de interagir por ligação de hidrogênio e capacidade de fazer troca iônica em pH ácido ou alcalino. As FE Si(PMTFS)TT e Si(PMTFS)RM se mostraram capazes de separar alquilbenzenosque se diferenciavam entre eles apenas pelo grupo metila e pela sua configuração espacial, mas evidenciou interações de hidrogênio e troca iônica em pH básico. Esses resultados comprovam que não houve um recobrimento adequado do suporte cromatográfico, isto é, os grupos silanóis residuais interagiram fortemente durante a avaliação destes testes. Outro problema que a FE apresentou foi a sua baixa resistência química frente a FM com pH acima de 8. Uma boa alternativa para remediar esses problemas é fazer a reação de capeamento.
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1.6 Avaliação Cromatográfica das Colunas
Com a quantidade expressiva de colunas cromatográficas com seletividades e tamanho de partículas diferentes, há dificuldade na escolha de uma coluna ideal para determinada aplicação. Dessa forma, utiliza-se um conjunto de artifícios para caracterizar ascolunas, a fim de obtereminformações mais apuradas sobre o comportamento cromatográfico da mesma frente a diversas condições e classes de analitos.
Segundo Neue et al.60, existem, no mínimo, 3 atributos das FE para CLAE-FR que são relevantes para as propriedades de retenção: a hidrofobicidade, a seletividade estérica e a atividade silanofílica. Através da caracterização cromatográfica é possível adquirir informações sobre as interações físico-químicas discretas entre os compostos em análise e a FE. A caracterização cromatográfica pode ser obtida a partir da avaliação de parâmetros cromatográficos como71: fator de retenção (k), eficiência da coluna (Pratos/metros), fator de assimetria a 10% da altura do pico (As) e resolução (Rs), calculados após a análise cromatográfica dediversos tipos de misturas teste como a de Tanaka e colaboradores70.
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2 Objetivo
O objetivo desse trabalho foi preparar fases estacionárias fluoradas com bom desempenho cromatográfico e estabilidade química. Para atingir este objetivo após o preparo da fase Si(PMTFS) imobilizadas por tratamento térmico submeteu-aà reação de capeamento, obtendo a FE Si(PMTFS)ec.
2.1 Objetivos Específicos:
Caracterizar físico e quimicamente as FE para comprovar a eficiência da imobilização e da reação de capeamento;
Caracterizar cromatograficamente as FE capeadas e não capeadas, a fim de obterem dados relativos aos benefícios do capeamento;
Verificar a presença do mecanismo U-shape na FE Si(PMTFS)ec;
Avaliar a aplicabilidade da FE Si(PMTFS)ec em separar classes distintas de compostos, como fluorados, agrotóxicos e fármacos;
Avaliar a estabilidade química da FE Si(PMTFS)ec frente a FM em meio básico.
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3 Parte Experimental
3.1 Reagentes
2,3-difluorfenol, 95%, Aldrich 2,4-difluorfenol, 98%, Aldrich 2,6-difluorfenol , 95%, Aldrich 3,4-difluorfenol, 99%, Aldrich 3,5-difluorfenol, 99%, Aldrich Acenafteno, 99%, Aldrich Acetofenona, 99%, Vetec Acetonitrila, grau HPLC, Tedia Ácido fosfórico, 85%, Nuclear Ácido nítrico p.a., Synth Água deionizada, Mili-Q, Milipore Alprazolam, adquirido da Medley Amitriptilina 99%, Aldrich
Atrazina, 97,7% adquirido da Novartis Benzeno p.a., Synth
Benzilamina, 99%, Merck Benzonitrila, Riedel-de Haen Bicarbonato de sódio, 99%, Ecibra Bromazepam, adquirido da Medley Butilbenzeno, 98%, Merck
22 Carboxim, 99,0% adquirido da BASF Cianazina,98%, adquirido da Cyanamid Diazepam, adquirido da Medley
Diclorometano p.a., Tedia
Diurom, 99,3%, adquirido da Du Pont Etilbenzeno, Merck
Fenol, 99%, Aldrich
Fluoxetina, adquirido da Medley
Fosfato de dipotássio dibásico anidro, 99%, Synth Fosfato de potássio monobásico anidro, 99%, Synth Hexametildissilazano, 99%, Aldrich
Hexano, grau HPLC, Tedia Hidróxido de sódio, 97%, Ecibra Imazaquim, 99,4% ChemService Isopropanol p.a. Tedia
Levofloxacina, adquirido da Medley Linurom, 99,5%, adquirido da Hoescht Lorazepam, adquirido da Medley Metanol grau HPLC, Tedia N,N-dimetilanilina, 98%, Fluka Naftanelo, reagente puro Carlo Erba Nortriptilina, 98%, Sigma
O-terfenila, 995, Merck Pentilbenzeno, 98%, Merck
23 Propilbenzeno, 98%, Aldrich
Tetraidrofurado, grau HPLC, Tedia Tolueno p.a., Merk
Trifenileno, 98%, Fluka
Trimetilclorossilano, 98%, Aldrich Uracila, 98%, Aldrich
3.2 Equipamentos
Agitador magnético, Corning modelo PC351
Agitador roto-torque, Cole-Parmer modelo 7637-01 Agitador Vórtex, Phoenix modelo AP56
Analisador elementar, Perkin-Elmer modelo 2400
Analisador termogravimétrico, TA instruments modelo TGA-2050.
Balança analítica, Fischer Scientific modelo A-250, precisão de 0,0001g Banho ultrassom, Thornton modelo T14
Bomba para enchimento de colunas, Haskel modelo 51769 Centrífuga, Fischer Scientific modelo 225
Cromatográfo a líquido, Shimadzu, composto de uma bomba de alta pressão, Shimadzu modelo LC-10 AD; detector UV-Vis , Shimadzu modelo SPD-10A utilizado em λ = 254 nm; válvula de injeção (alça de amostragem de 5 µL), Rheodyne modelo 8125; os dados foram adquiridos e processados empregando o software ChromPerfect for Windows 3.52 e Report Write Plus (Justice Innovations)
Cromatógrafo a líquido, Shimadzu, equipado com uma bomba de alta pressão, Shimadzu modelo LC-10AD, detector UV-Vis, Shimadzu modelo SPD-10ª utilizado em λ = 254 nm; forno de coluna CTO-10AS; injetor automático SIL-10AD e um sistema controlador SCL-10A. Os dados foram adquiridos e processados empregando o software CLASS-VP da Shimadzu
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Espectrômetro de absorção no infravermelho, Perkin-Elmer modelo FTIR 1600
Espectrômetro de ressonância magnética nuclear, Varian modelo INOVA 500
Estufa à vácuo, Yamato modelo ADP21 Forno tubular, EDG modelo 10P-S pHmetro, Digimed modelo DM 21 Porosímetro, Micromeritics ASAP 2010
Sistema de deionização de água, Milli-Q plus, Millipore
Sistema para extração do excesso de polímero, composto por uma bomba cromatográfica Waters modelo 510
3.3 Coluna cromatográfica comercial
Coluna analítica C18 Nova Pak, capeada, fabricada pela Waters, tamanho de partícula 5 µm, comprimento de 150 mm, diâmetro interno de 3,9 mm.
3.4 Suporte Cromatográfico
Como suporte cromatográfico foi utilizado a sílica porosa Kromasil®, tipo B, forma esférica, área superficial de 295 m2g-1, tamanho de partícula médio de 5 µm, tamanho de poro 11,5 nm e lote 5052.
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3.5 Fase Estacionária Líquida
Como fase estacionária líquida foi utilizado o polímero poli(metil-3,3,3-trifluorpropilsiloxano) (PMTFS), produzido pela Gelest, Inc.®, lote 3C-2623, código 215-547-1015.Este polímero apresenta viscosidade de 1000 cSt. Sua estrutura química está mostrada na Figura 8.
Si O CH3 CH3 CH3 Si CH2 CH3 O CH2 Si CF3 CH3 CH3 CH3
Figura 8 - Estrutura química do polímero poli(metil-3,3,3-trifluropropilsiloxano).
3.6 Colunas Cromatográficas
O material utilizado para construir as colunas cromatográficas é de fundamental importância, pois pode comprometer o desempenho cromatográfico durante uma separação. Para resistir as altas pressões aplicadas pelas bombas cromatográficas, assim como apresentar resistência química aos solventes orgânicos utilizados como fase móvel, as colunasempregadasneste trabalho foram constituídascom aço inoxidável 316, sem costura. Este material é descrito como rígido e com força mecânica apropriada para as condições em que será submetido.
Tomando como base a equaçãoque calcula a eficiência da coluna, é possível observar que o tamanho da coluna é de fundamental importância para a obtenção de boas eficiências.Colunas maiores apresentam maiores eficiências, no
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entanto, o tempo de análise é superior àquelas de menores tamanhos. Em geral, colunas curtas são utilizadas em separações simples.72
Outro fator que influencia no desempenho da coluna é seu diâmetro interno.Colunas de diâmetros internos maiores amplificam a capacidade de aceitação de amostra, bem como a vazão da fase móvel. Entretanto, o aumento do diâmetro leva a picos mais largos, o que gera piora na detectabilidade.72
Para economia do material utilizado para o desenvolvimento das FE, foram utilizadas colunas com comprimento de 60 mm e diâmetro interno de 3,9 mm. Essas colunas foram confeccionadas na oficina mecânica da UNICAMP, a partir de tubos de aço inoxidável 316, sem costuras. A coluna é seguida por acessórios:2 mangas com filtros, 2 redutores de volume, 2 porcas terminais e 2 tampas são conectadasem cada uma das extremidades. O esquema da coluna está apresentado na Figura 9.
Figura 9-Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada no estudo (a)
porcas terminais; (b) redutor de volume; (c) manga com filtro; (d) corpo da coluna.
Os tubos adquiridos apresentavam superfície interna rugosas, dessa forma se fez necessário o uso do método de polimento utilizado no grupo de pesquisa LabCrom.73
27
3.7 Polimento das colunas
Para o polimento da superfície interna da colunafoi utilizado a técnica desenvolvida no LabCrom.73 O procedimento consiste em fixar em um mandril uma haste de ferrode diâmetro interno menor que o tubo da coluna envolto com lã de aço e pasta de polimento com partículas abrasivas e passá-lo, inúmeras vezes, em movimentos exaustivos de sobe e desceatravés do tubo da coluna (Figura 10). Esse processo foi repetido até a obtenção de uma superfície interna lisa e perfeita. Após o polimento, os tubos foram lavados com detergente e água. Finalmente, a coluna foi deixada em ácido nítrico 50% (v/v) por 24 horas e lavada com água e etanol.
Figura 10-Representação esquemática do sistema de polimento desenvolvido no
LabCrom.
3.8 Preparo das Fases Estacionárias
As fases estacionárias foram preparadas empregando as etapas de sorção e imobilização do polímero na sílica nua, seguido da extração do polímero não imobilizado.
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3.8.1 Sorção da Fase Líquida ao Suporte
O preparo foi baseado no trabalho publicado por Maldaner e Jardim50 que descreveram o desenvolvimento da FE Si(PMTFS) imobilizada termicamente. Antes da etapa de imobilização foi feito o procedimento de sorção. É valido ressaltar que a etapa de imobilização é indispensável, pois aumenta a intensidade da interação do polímero com o suporte, evitando a lixiviação do mesmo com a passagem de fase móvel.
Primeiramente, a sílicaKromasil foi seca a 140 ºC por no mínimo 12 horas, para a sua ativação. Em um béquer foram pesadosaproximadamente 1,13 g de PMTFS, com ajuda de uma pipeta de Pauster, e em seguida foram adicionados 11 mL de diclorometano para obter uma solução 10%(m/v). Subsequentemente, foi adicionado 1,0 g de sílica seca.Essas massas foram pesadas para alcançar a proporção de 53% de PMTFS e 47% de sílica, quantidade necessária para o preenchimento completo dos poros da sílica.
A solução foi mantida sob agitação em capela por 3 horas e deixada na mesma por 6 dias para a evaporação do solvente e para a obtenção da fase estacionária sorvida. Depois das etapas iniciais, a FE sorvida foi submetida ao tratamento térmico para promover a máxima interação do polímero com a sílica.
3.8.2 Imobilização por Tratamento Térmico
A FE sorvida foi transferida para tubos de aço inoxidável(comprimento 100 mm e diâmetro interno 10mm) e conectada a umforno tubular, de maneira a obter um fluxo de nitrogênio através do tubo, como mostrado na Figura 11.O tempo e a temperatura de imobilização foram de 226 °C por 12 horas, condições nas quais se obtiveram maior porcentagem de carbono imobilizada, bem como melhores
29
valores dos parâmetros cromatográficos.50Para alcançar a temperatura desejada, o programador foi ajustado para um aquecimento gradual, isto é,a taxa de aquecimento programada foi de 5 °C por minuto.Após a imobilização, o polímero não imobilizado foi extraído.
Figura 11- Representação esquemática do sistema de imobilização térmica para a FE.
3.8.3 Extração do Polímero não Imobilizado
O excesso de polímero que não interagiu com a sílica foi extraído para não comprometer o desempenho cromatográfico da fase estacionária, decorrente da redução da velocidade de transferência de massa do soluto entre a fase estacionária e a fase móvel. Bombas de alta pressão, tipo recíproca de pistão duplo (Water modelo 486) foram utilizadas, empregando o diclorometano como solvente extrator.O solvente foi bombeado por 4 horas em uma vazão de 0,5 mL
30
min-1através da fase estacionária contida em tubos de aço inoxidável(comprimento 100 mm e diâmetro interno 10mm), como mostrado na Figura 12. Após o período de extração, a fase estacionária foi retirada do tubo de aço inoxidável, transferida para um béquer e recoberto com papel alumínio com pequenos furos, para secagem.
Figura 12- Representação esquemática do sistema de extração do excesso de polímero
imobilizado.
3.8.4 Capeamento
A reação de capeamento foi feita nas fases estacionárias após a imobilização do PMTFS sobre a sílica, com o intuito de reduzir os grupos silanóis residuais, isto é, diminuir os silanóis que não foram recobertos pelo polímero.
Primeiramente, a fase Si(PMTFS), imobilizada termicamente, foi seca a 120ºC por 12 horas. Cerca de 5,0 g da FE foram transferidas para um balão de
31
fundo redondo e acrescentado 100 mL de tolueno anidro(seco em peneira molecular).Respectivamente, foram adicionados 35 mL de hexametildissilazano e o 15 mL de trimetilclorossilano. A reação foi mantida em refluxo por 48 horas a 110°C (Figura 13). Após este tempo, foi obtida a fase estacionária Si(PMTFS) capeada, simbolizada por [Si(PMTFS)ec].
A FE Si(PMTFS)ec foi lavada com 20 mL de tolueno, 20 mL de isopropanol, 20 mL de metanol:água (50:50 v/v) para a remoção dos resíduos dos reagentes.A FE capeada foi transferida para um béquer e seca em estufa por 6 horas a 110 °C para a evaporação dos solventes.
32
3.9 Caracterização Físico-Química das Fases Estacionárias
Amostras de FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec foram coletadas e caracterizadas físico e quimicamente para comprovar a imobilização do polímero sobre a sílica, bem como verificar se a reação de capeamento foi efetiva. As técnicas utilizadas para caracterização físico-químicas e seus procedimentos serão descritos a seguir.
3.9.1 Análise Elementar
A análise elementar foi utilizada para adquirir informações a respeito da porcentagem de carbono que foi imobilizado sobre a FE, bem como a quantidade de carbono inserida após a reação de capeamento.
A análise elementar foi realizada no Analisador de Carbono, Hidrogênio e Nitrogênio da marca Perkin Elmer, modelo 2400. Foram pesados cerca de 2 a 3 mg da amostra em uma cápsula de estanho. A cápsula de estanho que continha a amostra foi levada ao aquecimento à temperatura elevada, 900-1200 ºC. Durante o aquecimento a matéria orgânica foiconvertida em gases como CO2, NOx e vapores de H2O, que por sua vez foram reduzidos a CO2, N2 e H2 com ajuda de uma catalisador de cobre. A medição foi feita por condução térmica que fornece dado a respeito da quantidade de carbono, hidrogênio e nitrogênio na amostra. As análises foram feitas em triplicata, a porcentagem foi obtida com um erro de 1%, inerente ao equipamento.74
Através das informações adquiridas sobre a porcentagem de carbono do PMTFS da FE imobilizada, bem como os grupos trimetilsilanos inseridos na mesma, foi calculado a espessura do filme do polímero na superfície do suporte.
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Sabendo-se que o PMTFS contém 31% (m/m) de carbono, as porcentagens de carbono obtidas por análise elementar foram convertidas em massa específica do PMTFS (m PMTFS retido) sobre a sílica pela Equação1.
m PMTFS retido =
Equação (1)
A massa específica do PMTFS nos poros da sílica, m PMTFS poros_cheios,foi obtida a partir do volume específico de poros da sílica,νp sílica, e da densidade do PMTFS, p PMTFS, conforme a Equação 2.
m PMTFS poros_cheios = νp sílica (mL/g) x p PMTFS (g/mL) Equação (2)
Assumindo-se que os poros da sílica têm diâmetro (d) constantes e que o recobrimento do PMTFS é caracterizado por uma espessura de camada de polímero (Ƭ) constante nas paredes dos poros do suporte, esta pode ser calculada a partir das porcentagens de carbono pela Equação3.
τ = (√ ) Equação (3)
O valor de F (fração do polímero imobilizado) foi determinado a partir da Equação 4:
F =
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3.9.2 Área Superficial Específica, Volume Específico e Diâmetro
de Poros
Para determinar as propriedades da superfície e dos poros foi utilizado um método em que as medidas se baseiam nas isotermas de adsorção e dessorção de nitrogênio.
Inicialmente, o material foi colocado em uma estufa, que se encontrava a temperatura de 120 ºC,e foi mantida por 24 horas sob vácuo, para desgaseificação a amostra.A área superficial foi calculada de acordo com o método deBrunaer,Emmett,Teller (BET).75 Para a obtenção do tamanho e volume de poros, utilizou-se o método Barret, Joyner e Halenda (BJH)76que foi desenvolvido em 1951. Estes métodossão utilizados até hoje para execução desses cálculos.77
3.9.3 Espectrometria de Absorção no Infravermelho
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos para sílica pura e para FE Si(PMTFS) antes e após o capeamento.
Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram obtidos na região de 400 a 4000 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e uma taxa de 20 varreduras por minutos. Os espectros das amostras de sílica e das FE, imobilizadas e capeadas, foram obtidos pesando-se as amostras de FE e do suporte
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cromatográfico com brometo de potássio (KBr), numa proporção de 10:1(KBr:Amostra) para formar pastilhas homogêneas.
3.9.4 Ressonância Magnética Nuclear de Silício 29 (
29Si)
Os espectros de RMN 29Si e 13C com CP/MAS (polarização cruzada segundo rotação em ângulo mágico) foram obtidos em um espectrômetro Bruker 400 MHz Anvacell, usando um rotor de zircônia, em velocidade de rotação de 3500 Hz, contendo amostras de 200 mg. O tempo de contato foi de 5 ms e o intervalo entre os pulsos de 1,5 s. O alargamento de banda usado foi de 30 Hz e a largura espectral para todos os espectros foi de aproximadamente 25 kHz.
Os espectros foram obtidos para a sílica pura e para as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec, como o intuito de identificar as funcionalidades dos grupos silanóis e os tipos de ligações, através dos espectros de RMN de 29Si.
3.10 Enchimento da Coluna
A suspensão da fase estacionária foi preparada em um solvente adequado denominado de solvente de suspensão, que possui duas funções: impedir que as partículas da fase estacionária se aglomerem e evitar sedimentação das mesmas. O solvente empregado foi o tetraidrofurano, utilizadopor apresentar melhores resultados comparado a outros solventes que também foram estudados (acetonitrila, metanol, isopropanol).
Foi pesado cerca de 1,0 g de FE Si(PMTFS)ec e transferida para um tubo de ensaio e depois foram adicionados cerca de 20 mL de tetraidrofurano para formar uma suspensão de 5 % (m/v). A suspensão de 10% (m/v) também foi usada, no entanto, a proporção de 5 % (m/v) mostrou melhor resultado. O tubo de
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ensaio com a suspensão foi agitado usando um agitador roto-torque, por um período mínimo de 12 horas.
3.10.1
Recheio das colunas com a fase estacionária
O sistema utilizado para o recheio das colunas está apresentado, esquematicamente, na Figura 15.
Figura 14- Representação esquemática do sistema de enchimento de coluna.
As colunas foram recheadas com as FE preparadas utilizando uma bomba pneumática Haskel para pressurizar o sistema. O procedimento de enchimento está descrito passo a passo da seguinte forma:
Primeiramente, foi observado se o reservatório de solvente (1) estava devidamente preenchido, pois este recipiente, preferencialmente, deve ser
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mantido sempre cheio. O metanol foi o solvente propulsor para o enchimento de colunas e caso o reservatório estivesse vazio,fazia-se o abastecimento com metanol previamente filtrado.
Etapas sucessivas para o enchimento:
1. Fechar a válvula do solvente (4), abrir a válvula do nitrogênio e, em seguida, abrir a válvula de segurança(9).
2. Fechar a válvula de controle de pressão do gás nitrogênio (3) até alcançar a pressão de 6000 psi (41,4 MPa).
3. Conectar na parte inferior do reservatório de suspensão (6) a coluna (7).Equipar a extremidade oposta àquela que a coluna está conectada ao reservatório de suspensão, com seus acessórios, mangacom filtro, redutor de fluxo e porcas, para evitar a perda da FE durante o enchimento.
4. Transferir a suspensão de fase estacionária (5) para o reservatório (6) e completar o volume do reservatório com metanol e imediatamente fechar a sua entrada superior.
5. Abrir a válvula do solvente (4) e deixar passar 80 mL do solvente propulsor. A medição foi feita utilizando uma proveta(8)na saída do reservatório de suspensão, posterior a coluna que estavaconectada ao sistema.
6. Fechar a válvula do solvente (4) após a passagem de 80 mL de metanol. 7. Desconectar a coluna do reservatório e imediatamente conectar os
acessórios remanescentes da coluna na extremidade que estava conectada no sistema de enchimento.
8. Fechar, em sequência, as válvulas de controle de pressão do gás (3), de segurança (9) e de nitrogênio (2).
Como o enchimento é uma etapa difícil de controlar, para adquirir uma coluna com excelentes eficiências e bons fatores de assimetria, vários recheios de coluna com a FE foram feitos até a obtenção de parâmetros cromatográficos aceitáveis.
